KR20230148264A - 시알로올리고당의 정제 - Google Patents

시알로올리고당의 정제 Download PDF

Info

Publication number
KR20230148264A
KR20230148264A KR1020237034240A KR20237034240A KR20230148264A KR 20230148264 A KR20230148264 A KR 20230148264A KR 1020237034240 A KR1020237034240 A KR 1020237034240A KR 20237034240 A KR20237034240 A KR 20237034240A KR 20230148264 A KR20230148264 A KR 20230148264A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sialylated
exchange resin
aqueous solution
oligosaccharides
clause
Prior art date
Application number
KR1020237034240A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102669887B1 (ko
Inventor
게타츄 에스 몰라
Original Assignee
글리콤 에이/에스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 글리콤 에이/에스 filed Critical 글리콤 에이/에스
Publication of KR20230148264A publication Critical patent/KR20230148264A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102669887B1 publication Critical patent/KR102669887B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/12—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the preparation of the feed
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/362—Cation-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/02—Reverse osmosis; Hyperfiltration ; Nanofiltration
    • B01D61/027—Nanofiltration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/145—Ultrafiltration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/58—Multistep processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
    • B01D2311/2623—Ion-Exchange
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 시알일화된 올리고당이 생성되는 수성 매질로부터 상기 시알일화된 올리고당을 단리 및 정제하는 것에 관한 것이다.

Description

시알로올리고당의 정제
본 발명은 시알일화(sialylation)된 올리고당이 미생물에 의해 생성되는 발효 브로스(broth)로부터 상기 시알일화된 올리고당을 단리 및 정제하는 것에 관한 것이다.
지난 수십년간, 인간 모유 올리고당(HMO)의 제조 및 상용화에 대한 관심은 꾸준히 증가해왔다. 인간 모유 올리고당의 중요성은 이의 특유의 생물학적 활성과 직결된다. 시알일화된 인간 모유 올리고당, 예컨대, 다이시알일락토-N-테트라오스, 3'-O-시알일-3-O-푸코실락토스, 6'-O-시알일락토스, 3'-O-시알일락토스, 6'-O-시알일화된-락토-N-네오테트라오스 및 3'-O-시알일화된-락토-N-테트라오스는 인간 모유의 주요 성분에 속한다. 이러한 시알일화된 인간 모유 올리고당에서, 시알산 잔기는 α-글리코시드 연결기를 통해 말단 D-갈락토스의 3-O- 및/또는 6-O-위치 또는 비-말단 GlcNAc 잔기의 6-O-위치에 연결된다. 시알일화된 HMO는, 병원체에 대한 내성, 장 성숙, 면역 기능 및 인지 발달을 지원하는 이의 역할에 기인하여, 신생아에게 상당한 건강적 유익을 갖는 것으로 생각된다(문헌[ten Bruggencate et al. Nutr . Rev. 72, 377 (2014)]).
시알일화된 HMO를 비롯한 HMO를 합성하기 위한 공정을 개발하기 위한 노력은 다수의 인간 생물학적 과정에서 이의 역할에 기인하여 지난 10년간 상당히 증가해왔다. 이와 관련하여, 미생물 발효, 효소적 공정, 화학적 합성, 또는 상기 기술들의 조합에 의해 이를 제조하기 위한 공정이 개발되어 왔다. 생산성과 관련하여, 3'-SL 및 6'-SL을 제조하기 위한 실험실 규모에서의 발효 공정이 유망한 것으로 입증되었다.
그러나, 복합 매트릭스(complex matrix), 예컨대, 발효 브로스로부터 시알일화된 락토스 또는 시알일화된 올리고당을 단리하는 것은 어려운 일이다. 최근 개발에 따라, 브로스로부터의 시알일락토스의 정제는 전형적으로 이온교환 크로마토그래피와 조합된 막 여과를 포함하고, 상기 이온교환 크로마토그래피는 시알일락토스-함유 용액을 H+-형태의 강산성 양이온교환기 및 Cl--형태의 강염기성 음이온교환기로 처리하는 것을 포함한다(예컨대, EP-A-3456836, WO 2019/043029, WO 2019/110803, WO 2019/229118 참고).
강염기성 음이온교환기의 적용의 단점은 수지의 상대이온이 용출액에 방출되는 것이다. 따라서, 용출액의 pH는 필요한 값으로 설정되고/되거나 이에 따라 제조된 무기 염은 후속 단계에서 (예컨대, 나노여과에 의해) 제거될 것이다.
따라서, 이온교환 수지 처리가 필요한 순도/검정에서 시알로올리고당을 직접적으로 제공하는 한편, 높은 회수율이 유지되는, 산업적 규모에서, 수성 매질, 예컨대 발효 브로스로부터 시알로올리고당, 바람직하게는 시알일락토스를 단리 및 정제하기 위한 경제적인 방식이 추구되어 왔다.
본 발명은 이온교환 수지에 의한 수용액의 처리를 포함하는, 상기 수용액으로부터 시알일화된 올리고당을 정제하는 방법으로서, 수용액이 시알일화된 올리고당을 함유하는 발효 브로스 또는 효소 반응 혼합물이거나 이로부터 유래하는 방법에 관한 것으로서, 이때,
- 상기 이온교환 처리는 상기 시알일화된 올리고당을 함유하는 수용액을 H+-형태의 강산성 양이온교환 수지에 이어서 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때
- 강산의 무기 음이온이 상기 이온교환 처리 전에 시알일화된 올리고당을 함유하는 수성 매질에, 바람직하게는 상기 시알일화된 올리고당에 대한 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지의 결합능(binding capacity)에 대한 약 1 내지 2 몰당량인 양으로, 첨가된다.
따라서, 본 발명은 수용액으로부터 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 분리하는 방법 또는 공정에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유하는 상기 수용액을 H+-형태의 강산성 양이온교환 수지에 이어서 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지로 처리하는 단계를 포함하고, 상기 수용액은 수지 처리 전에 상기 수용액에 첨가되는 강산의 무기 음이온, 바람직하게는 클로라이드(예컨대, NaCl의 형태)를, 바람직하게는 소정의 양으로, 추가로 포함한다. 또한, 본 발명은 수용액으로부터 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 분리하는 방법 또는 공정에 관한 것으로서, 상기 방법은 발효 브로스 또는 효소 반응 혼합물을 포함하는 수성 매질을, 예컨대, 한외여과, 나노여과, 활성탄 처리, 또는 이들의 임의의 조합을 통해 전처리하여 상기 시알일화된 올리고당을 함유하는 수용액을 생성하는 단계, 및 상기 수용액을 H+-형태의 강산성 양이온교환 수지에 이어서 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지로 처리하는 단계를 포함하고, 상기 수성 매질은 함께 첨가되는 강산의 무기 음이온, 바람직하게는 클로라이드(예컨대, NaCl의 형태)를, 소정의 양으로, 추가로 포함한다.
한 양태에서, 분리/정제 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
- 바람직하게는 수성 매질로부터 바이오매스 및/또는 효소를 분리하기 위한 한외여과(UF),
- 바람직하게는 전처리된 수성 매질 중 시알일화된 올리고당을 농축하고/하거나, 전처리된 수성 매질의 무기 염 함량을 감소시키고/시키거나, 전처리된 수성 매질 중 시알일화된 올리고당으로부터 저분자량 유기 화합물, 예컨대 단당류 또는 락토스를 분리하기 위한 나노여과(NF), 및/또는
- 바람직하게는 임의적으로 전처리된 수성 매질을 탈색하기 위한 활성탄(AC) 처리.
바람직하게는, UF 단계는 NF 및 AC 단계 및 이온교환 수지 처리 중 임의의 것 전에 수행된다. 시알일화된 올리고당은 이온교환 수지 처리 후에 수집될 수 있다.
또한, 바람직하게는, 수성 매질은 내재화된 탄수화물 전구체로부터 시알일화된 올리고당을 생성할 수 있는 유전자 변형된(genetically modified) 미생물을 배양하는 발효 브로스이다.
또한, 바람직하게는, 상기 방법은 시알일화된 올리고당을 함유하는 수성 매질에서 적용되어 하기 순서로 수행된다: UF 단계, NF 단계, 임의적인 AC 처리, 및 H+-형태의 강산성 양이온교환 수지에 이어서 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지에 의한 처리, 수성 매질은 함께 첨가되는 강산의 무기 음이온, 바람직하게는 클로라이드, 예컨대, NaCl을 소정의 양으로 추가로 포함한다.
본 발명의 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 발효 브로스로부터 시알일화된 올리고당을 분리 및 정제하는 방법으로서, 상기 시알일화된 올리고당이 내재화된 탄수화물 전구체로부터 시알일화된 올리고당을 생성할 수 있는 유전자 변형된 미생물을 배양함으로써 생성되는, 방법에 관한 것이다:
a) 발효 브로스를 한외여과(UF)하고 UF 투과물(permeate)(UFP)을 수득하는 단계,
b) 상기 UFP를 나노여과(NF)하고 NF 잔류물(retentate)(NFR)을 수집하는 단계,
c) 임의적으로, 상기 UFP 및/또는 NFR을 활성탄으로 처리하고, 활성탄 용출액(CE)을 수득하는 단계,
d) 강산의 무기 음이온, 바람직하게는 클로라이드, 예컨대, NaCl을, 소정의 양으로, NFR 또는 CE에 첨가하는 단계, 및
e) 상기 단계 d)에서 수득된 수용액을 H+-형태의 강산성 양이온교환 수지에 이어서 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지로 처리하는 단계.
바람직하게는, 상기 단계는 하기 순서로 수행된다: 단계 a), 단계 b), 임의적인 단계 c), 단계 d), 단계 e).
바람직하게는, 시알일화된 올리고당은 이의 구조 내에 단 하나의 시알일 모이어티를 포함한다(또한, 모노시알일화된 올리고당으로 지칭될 수 있음).
바람직하게는, 시알일화된 올리고당은 산성 인간 모유 올리고당(HMO)이다(또한 시알일화된 HMO로 지칭될 수 있음).
바람직하게는, 시알일화된 HMO는 이의 구조 내에 단 하나의 시알일 모이어티를 포함한다(또한, 모노시알일화된 HMO로 지칭될 수 있음).
바람직하게는, 모노시알일화된 HMO는 시알일락토스, 예컨대, 3'-SL 또는 6'-SL이다.
본 발명에 따라, 용어 "시알일화된 올리고당"은 바람직하게는 2개 이상의 단당류 단위(이 중 하나 이상은 시알일(N-아세틸뉴라민일) 모이어티임)를 함유하는 당 중합체를 의미한다. 시알일화된 올리고당은 글리코시드간 연결기(interglycosidic linkage)에 의해 서로 연결된 단당류 단위를 함유하는 선형 또는 분지형 구조를 가질 수 있다. 유리하게는, 시알일화된 올리고당은 산성 인간 모유 올리고당이다.
용어 "산성 인간 모유 올리고당", "산성 HMO" 또는 "시알일 HMO"는 바람직하게는 하나 이상의 β-N-아세틸-락토사민일 및/또는 하나 이상의 β-락토-N-바이오실 단위에 의해 연장될 수 있는 환원성 말단에서 락토스 단위인 코어 구조를 포함하는 인간 모유에서 발견되는 복합 시알일화된 올리고당을 의미하고(문헌[Urashima et al.: Milk Oligosaccharides. Nova Science Publishers, 2011; Chen Adv . Carbohydr. Chem . Biochem . 72, 113 (2015)]), 상기 코어 구조는 α-N-아세틸-뉴라민일(시알일) 모이어티로 치환될 수 있고, α-L-푸코피라노실 모이어티로 임의적으로 치환될 수 있다. 이와 관련하여, 산성 HMO는 이의 구조 내에 하나 이상의 시알일 잔기를 갖는다. 산성 HMO의 예는 3'-시알일락토스(3'-SL), 6'-시알일락토스(6'-SL), 3-푸코실-3'-시알일락토스(FSL), LST a, 푸코실-LST a(FLST a), LST b, 푸코실-LST b(FLST b), LST c, 푸코실-LST c(FLST c), 시알일-LNH(SLNH), 시알일-락토-N-헥사오스(SLNH), 시알일-락토-N-네오헥사오스 I(SLNH-I), 시알일-락토-N-네오헥사오스 II(SLNH-II) 및 다이시알일-락토-N-테트라오스(DS-LNT)를 포함한다. 용어 "시알일화된 락토스"는 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을 나타낸다.
용어 "유전자 변형된 세포" 또는 "유전자 변형된 미생물"은 바람직하게는 이의 DNA 서열 내에 하나 이상의 변경이 존재하는 세포 또는 미생물, 예컨대 박테리아 세포, 예컨대, 대장균 세포를 의미한다. 상기 변경은 야생형 세포의 원래 특성의 변화를 야기할 수 있고, 예컨대, 변형된 세포는 야생형 세포에 존재하지 않는 효소의 발현을 인코딩하는 도입된 새로운 유전 물질에 기인하여 추가적인 화학적 형질전환을 수행할 수 있거나, 유전자/유전자들의 제거(넉아웃(knockout))에 기인하여 퇴화와 같은 형질전환을 수행할 수 없다. 유전자 변형된 세포는 당업자에게 주지된 유전자 조작 기법(genetic engineering technique)에 의해 통상적인 방식으로 제조될 수 있다.
용어 "내재화된 탄수화물 전구체로부터 시알일화된 올리고당을 생성할 수 있는 유전자 변형된 세포 또는 미생물"은 바람직하게는 시알일화된 올리고당의 합성에 필요한 시알일 트랜스퍼라제를 인코딩하는 재조합 유전자, 글리코실 트랜스퍼라제에 의해 탄수화물 전구체(억셉터(acceptor))로 전달하기에 적합한 시알산 뉴클레오티드 공여체를 생성하는 생합성 경로, 및/또는 배양 배지로부터, 시알일화되어 관심 대상인 시알일화된 올리고당을 생성하는 세포로의 탄수화물 전구체(억셉터)의 내재화의 메커니즘을 포함하도록 유전자 조작된(genetically manipulated)(상기 참고) 세포 또는 미생물을 의미한다.
용어 "시알일화된 올리고당을 함유하는 수성 매질"은 바람직하게는 시알일화된 올리고당이 생성 또는 합성되고, 수성 반응 또는 생성 혼합물이 반응 또는 생성의 종료 시 수득되는, 수성 반응 또는 생성 혼합물을 의미한다. 이러한 수성 매질은 전형적으로 발효 브로스 또는 생체외 효소 반응 혼합물이다. 따라서, 수성 매질은 합성 반응 또는 생성 방법의 성질에 따라 통상적으로 1차 생성물로서 시알일화된 올리고당 이외에도 다양한 종류의 부산물, 미반응된 반응물 또는 시약, 중간체, 촉매, 첨가제, 용매(물 이외의 용매) 등을 함유한다.
용어 "시알일화된 올리고당을 함유하는 수용액"은 바람직하게는 본 발명에 따른 이온교환 수지 처리를 거치는 시알일화된 올리고당(상기 참고)을 함유하는 임의적으로 전처리된 수성 매질을 의미한다. 이와 관련하여, 시알일화된 올리고당을 함유하는 수성 매질은 본 발명에 따른 이온교환 수지 처리를 직접적으로 거칠 수 있거나, 상기 수성 매질은 본 발명에 따른 이온교환 수지 처리를 적용하기 전에 이온교환 처리 이외의 통상적으로 상이한 하나 이상의 단계에 의해 전처리된다. 상기 정의의 관점에서, 용어 "시알일화된 올리고당을 함유하는 수용액"은 시알일화된 올리고당을 함유하는 수성 매질 및 시알일화된 올리고당을 함유하는 전처리된 수성 매질을 포괄한다. 전처리에 의해, 수성 매질은, 일부 오염물질의 양이 감소하도록 부분적으로 정제된다.
용어 "약"은, 한 양태에서, 지시되는 값으로부터 ± 10% 편차, 또는 또다른 양태에서, ± 5% 편차를 의미한다.
상기 특정된 선행기술의 문제를 극복하기 위해, 본 발명자들은, 강염기성 음이온교환 수지가 약염기성 음이온교환으로 치환되어 다양한 유형의 이온성 불순물, 예컨대, 무기물, 단백질, 아미노산 등이 제거되도록 선행기술의 공정을 변형하였다.
전형적으로, 약염기성 음이온교환 수지는 양성자를 유인하기 위한 한쌍의 전자를 갖는 염기 기, 예컨대 특정 질소-함유 기(이는, 예컨대, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민(자유 아민 기), 구아니디노 또는 질소-함유 헤테로방향족 기(예컨대, 피리디노, 피리미디노 등)을 포함함), 바람직하게는 3차 아민을 함유한다. 자유 염기 형태에서, 염기 기는 양성자화된 형태가 아니고, 즉, 상대-음이온이 염기 기로부터 부재한다. 따라서, 상기 기는 전체 산을 흡착할 수 있고, 즉 산 양이온(H+) 및 산 음이온(X-) 둘 다는 이온교환 없이(상대-이온을 방출함 없이) 공급 용액으로부터 제거된다. 따라서, 자유 염기 형태의 H+-형태의 강산성 양이온교환기에 이어서 약염기성 음이온교환기에 의한 이온교환기 처리는 실제적으로 염이 그 중에 없는 용액을 직접 제공할 수 있고, 따라서 추가로 정제/탈염할 필요가 없다.
이와 관련하여, 강염기성 음이온교환 수지를 약염기성 음이온성 수지로 대체하는 것은 우수한 선택지인 것으로 보인다. 또한, 약염기성 음이온성 수지의 재생은 강염기성 음이온교환기의 재생보다 용이하고 저렴하다. 그러나, 본 발명자들은 약한 음이온성 수지가 Cl--형태의 강염기성 음이온교환기보다 더 많은 양의 시알일화된 올리고당/시알일락토스에 결합하는 경향이 있어, 시알일화된 올리고당/시알일락토스의 전체적인 회수율이 약 10 내지 15% 더 낮을 수 있는 것을 발견하였다.
놀랍게도, 본 발명자들은 선행기술의 높은 회수율을 갖는 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지의 적용과 연관된 유리한 효과를 조합하는 공정/방법을 발견하였다. 이와 관련하여, 이온교환 수지에 의한 수용액의 처리를 포함하는, 상기 수용액으로부터 시알일화된 올리고당을 정제하는 방법으로서, 상기 수용액이 임의적으로 전처리된 시알일화된 올리고당을 함유하는 발효 브로스 또는 효소 반응 혼합물이거나 이로부터 유래하는, 방법이 제공되고, 이때,
- 상기 이온교환 처리는 상기 시알일화된 올리고당을 함유하는 수용액을 H+-형태의 강산성 양이온교환 수지에 이어서 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때,
- 강산의 무기 음이온, 바람직하게는 클로라이드, 예컨대, NaCl이 수지 처리 전에 상기 시알일화된 올리고당을 함유하는 수용액에 첨가된다.
한 양태에서, 첨가되는 음이온의 양은 시알일화된 올리고당 대한 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지의 결합능에 대해 약 1 내지 2 몰당량이다.
따라서, 본 발명은 수용액, 예컨대 내재화된 탄수화물 전구체로부터 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 생성할 수 있는 유전자 변형된 세포 또는 미생물에 의해 수득되는 발효 브로스, 또는 효소 반응 혼합물에 존재하는 기타 화합물로부터 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스로 고도로 농후된(enriched) 정제 용액(상기 용액으로부터, 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스가 높은 수율로, 우수한 순도를 갖도록, 특히 매우 낮은 무기 음이온 함량을 갖도록 수득될 수 있음)을 직접적으로 제공한다.
시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유하고, 바람직하게는 발효 또는 생체외 효소 반응 후 수득되는 수용액은 상기 개시된 이온교환 수지 처리를 직접 거칠 수 있지만, 바람직하게는 나중에 개시된 바와 같이 이온교환 수지 처리 전에 전처리될 수 있다.
시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유하는 수용액을 이온교환 수지 처리하기 전에, 음이온이 공급물에 첨가된다. 전술한 바와 같이, 약염기성 음이온교환 수지는 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스에 대한 특정 결합능을 갖는다. 특정 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 본 발명자들은 공급물에 첨가되는 공-음이온(co-anion)이 약염기성 음이온교환 수지의 작용기에 경쟁적으로 결합함에 따라, 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스가 상기 용액 중 잔류하게 되고, 수지에 결합함 없이 이를 통과하는 것으로 생각한다. 결과적으로, 수지에서의 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 손실이 최소화될 수 있고, 이의 더 많은 양이 용출액에서 수집될 수 있다.
첨가되는 공-음이온은 전형적으로 무기산의 음이온이다. 예시적인 음이온은 강한 무기산의 음이온, 예컨대 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 설페이트, 설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 수소 포스페이트, 포스파이트, 퍼클로로레이트 등, 바람직하게는 클로라이드이다. 공-음이온은 수지 처리 전에 공급 용액에 산으로서 또는 이의 염 형태로, 바람직하게는 염 형태로 첨가될 수 있다. 공-음이온의 염의 양이온은 전형적으로 Be2 +를 제외한 I족 및 II족 이온, 예컨대 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘 또는 마그네슘 이온으로부터 선택되는 강한 무기 염기의 양이온이지만, 약학 염기로부터의 양이온, 예컨대 암모늄, Al3 + 또는 Fe3 + 또한 선택될 수 있다. 바람직한 염은 수용성 중성 염, 보다 바람직하게는 클로라이드, 예컨대 LiCl, NaCl, KCl, MgCl2 또는 CaCl2, 특히 NaCl이다.
함께 첨가되는 음이온의 임의의 양은, 함께 첨가되는 음이온이 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스가 약염기성 음이온교환 수지에 결합하는 것을 억제함에 기인하여, 이온교환 크로마토그래피 후의 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 회수율을 증가시킨다. 바람직하게는, 상업적으로 관련된 회수율 향상을 성취하기 위해, 함께 첨가되는 음이온의 몰량은 (각각 음이온 및 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 전하(charge)와 관련하여) 약염기성 음이온교환 수지에 결합된 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 몰량에 대해 0.5 당량 이상, 예컨대 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 당량이다. 특정 당량의 함께 첨가되는 음이온의 몰량은, 음이온 및 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 전하가 또한 고려되고 이에 따라 정규화되는 것을 의미한다. 함께 첨가되는 음이온의 전하 및 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 전하가 동일할 때, 1 당량은 함께 첨가되는 음이온 몰량과 결합된 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 몰량이 동일한 것을 의미한다. 이러한 경우, 예컨대, 함께 첨가되는 음이온 및 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스 둘 다는 각각 (예컨대, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트 또는 퍼클로레이트, 및 모노시알일화된 올리고당/모노시알일화된 락토스에 대해[단, 올리고당/락토스는 시알일 이외에는 하전된 모이어티를 함유하지 않음]) 1가 또는 (예컨대, 설페이트, 및 다이시알일화된 올리고당/다이시알일화된 락토스에 대해) 2가이다. 함께 첨가되는 음이온의 전하 및 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 전하가 동일하기 않을 때, 예컨대 하기 시나리오가 존재한다:
- 함께 첨가되는 음이온은 2가이고 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스는 1가인, 시나리오: 1 당량의 함께 첨가되는 음이온은 결합된 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스에 대해 이의 1/2 몰량임을 의미함;
- 함께 첨가되는 음이온은 3가(예컨대, 포스페이트)이고 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스는 1가인, 시나리오: 1 당량의 함께 첨가되는 음이온은 결합된 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스에 대해 이의 1/3 몰량임을 의미함;
- 함께 첨가되는 음이온은 1가이고 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스는 2가인, 시나리오: 1 당량의 함께 첨가되는 음이온은 결합된 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스에 대해 이의 2배 몰량임을 의미함.
한 양태에서, 음이온은 1 당량 초과, 예컨대 2 당량 이하, 3 당량 이하, 5 당량 이하 또는 심지어 10 당량 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 공-음이온에 대한 약한 염기성 수지의 결합능(이는 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 결합능과 동일한 값이 아님)에 도달한 후, 공-음이온은 용출액으로 누출된다. 이러한 경우, 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 회수율은 여전히 높지만, 추가적인 단계가, 용출액으로부터 과량의 공-음이온을 제거하기 위해 필요할 수 있다.
이와 관련하여, 바람직한 양태에 따라, 함께 첨가되는 음이온의 몰량은 약 0.5 당량 내지 약 3 당량, 바람직하게는 0.75 내지 2.5 당량, 예컨대 0.75 내지 2 당량, 0.75 내지 1.5 당량, 1 내지 2.5 당량, 1 내지 2 당량 또는 1 내지 1.5 당량의 범위로 설정된다. 이러한 경우, 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 회수율이 충분히 높은 반면, 음이온이 용출액으로 누출되지 않는다. 특히 바람직한 범위는 1 내지 2 당량 또는 1 내지 1.5 당량이다.
시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스에 대한 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지의 결합능을 측정하기 위해, 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유하는 공급 용액이 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지로 충전되고 물에 의해 용출되는 컬럼의 상단에 적용되고, 용출액은 분획으로 수집된다. 하기 실험 부분에 제시된 바와 같이, 수지의 결합능은 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 초기 양에서, 공급 용액 및 용출액의 농도 및 부피, 및 수지의 부피를 아는 수지를 통과하는 양을 제함으로써 계산될 수 있다.
본 발명의 공정에 적용되는 양성자화된(H+) 형태의 강한 양이온교환 수지는, 공급 용액에 존재하는 무기 양이온, 및 임의적으로 이용되는 생산 균주에 의한 발효 동안 대사적으로 제조된 유기 아민에 결합하고, 아미노산 및 짧은 펩티드는 효율적으로 결합되고 제거된다. 수득된 수지 용출액은 산성 형태의 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유한다.
적합한 산성 양이온교환 수지의 비제한적인 예는, 예컨대, AmberliteTM IR100, AmberliteTM IR120, AmberliteTM FPC22, DowexTM 50WX, FinexTM CS16GC, FinexTM CS13GC, FinexTM CS12GC, FinexTM CS11GC, LewatitTM S, DiaionTM SK, DiaionTM UBK, AmberjetTM 1000, AmberjetTM 1200 또는 DowexTM 88일 수 있다.
자유 염기 형태 중 약염기성 음이온교환기는 전체 무기산을 흡착하고 공급 용액으로부터 이를 제거하지만, 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스와 결합하지 않는다. 적합한 약염기성 음이온교환기의 비제한적인 예는 DowexTM 66 또는 AmberliteTM FPA53이다.
상기 개시된 단계 후, 이에 따라 수득된 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스 용액은 분무-건조, 동결-건조 또는 결정화되어 고체 형태의 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스가 수득될 수 있다. 다르게는, 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스는, 예컨대 증류, 바람직하게는 진공 증류 또는 나노여과에 의해 물을 제거함으로써 농축된 수용액 또는 시럼의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유하는 수용액을 상기 개시된 수지 구성에 적용하기 전에 다른 단계를 추가로 포함할 수 있다.
시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스가 발효 또는 생체외 효소적 공정에 의해 생성된 후, 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유하는 수성 매질은 이온교환 처리 전에, 바람직하게는 제1 단계로서, 바람직하게는 전처리된다(예컨대, 한외여과됨). 전형적으로, 발효 브로스는, 생성되는 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스 이외에도, 사용되는 미생물의 세포의 바이오매스와 함께 단백질, 단백질 단편, DNA, 내독소, 생원성(biogenic) 아민, 무기 염, 미반응된 탄수화물 억셉터, 예컨대 락토스, 당-유사 부산물, 시알산, 착색 바디(colorizing body) 등을 함유한다. 전형적으로, 생체외 효소 반응 혼합물은, 생성되는 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스 이외에도, 단백질, 단백질 단편, 무기 염, 미반응된 탄수화물 억셉터, 예컨대 락토스, 당-유사 부산물, 시알산 및 이의 전구체 등을 함유한다. 한외여과 단계는 수성 매질의 가용성 성분(상기 성분은 투과물에서 한외여과 막을 통과함)으로부터 현탁된 바이오매스 및 고분자량 고체를 분리(유지)하기 위한 것이다. 이러한 UF 투과물(UFP)은 생성된 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유하는 수용액이다.
(공급자의 사양에 따라) 약 1 내지 약 500 kDa, 예컨대 10 내지 250 kDa, 50 내지 100 kDa, 200 내지 500 kDa, 100 내지 250 kDa, 1 내지 100 kDa, 1 내지 50 kDa, 10 내지 25 kDa, 1 내지 5 kDa, 또는 임의의 다른 적합한 하위-범위의 분자량 컷-오프(cut-off)(MWCO) 범위를 갖는 임의의 통상적인 한외여과 막이 사용될 수 있다. 상기 막은 세라믹이거나 합성 또는 천연 중합체, 예컨대 폴리설폰, 폴리프로필렌, 셀룰로스 아세테이트 또는 폴리락트산으로 제조될 수 있다. 한외여과 단계는 데드-엔드(dead-end) 또는 교차-유동(cross-flow) 모드로 적용될 수 있다. 이러한 UF 단계는 상이한 MWCO를 갖는 막을 사용하는, 예컨대 2개의 한외여과 분리(이때, 제1 막은 제2 막보다 높은 MWCO를 가짐)를 사용하는 하나 초과의 한외여과 단계를 포함할 수 있다. 이러한 배열은 수성 매질의 더 높은 분자량의 성분의 더 우수한 분리 효율성을 제공할 수 있다. 분리 단계 후, 투과물은 관심 대상인 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 비롯하여, 제2 막의 MWCO보다 낮은 분자량을 갖는 물질을 함유한다.
한 양태에서, 수성 매질, 바람직하게는 발효 브로스는 5 내지 30 kDa, 예컨대 10 내지 25 kDa, 또는 15 또는 20 kDa의 MWCO를 갖는 막을 사용하여 한외여과된다.
바이오매스 분리는 브로스를 한외여과하는 대신 원심분리함으로써 수행될 수 있다.
시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유하는 수성 매질의 전처리는 나노여과(NF) 단계를 포함할 수 있다. NF 단계는 UF 단계 또는 임의적인 단계 활성탄 처리에 후속할 수 있다(하기 참고). 이러한 나노여과 단계는 유리하게는 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유하는 사전 처리된 수성 매질을 농축하고/하거나 이온, 주로 1가 이온, 및 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 분자량보다 낮은 분자량을 갖는 유기 물질, 예컨대 단당류를 제거하는 데 사용될 수 있다. 나노여과 막은 관심 대상인 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 유지를 확보하는 MWCO를 갖고, 이의 MWCO는 단계 a)에서 사용되는 한외여과 막의 것보다 낮고, 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 분자량의 약 25 내지 50%이다. 예컨대, 약 150 내지 300 Da의 MWCO를 갖는 나노여과 막이 시알일화된 락토스를 유지하는 데 적합하다. 이와 관련하여, 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스는 NF 잔류물(NFR)에 축적된다. 나노여과는, 예컨대, 투과물의 전도도가 염의 존재를 전혀 나타내지 않거나 매우 낮게 나타낼 때까지, 투과성 분자를 더 효과적으로 제거하기 위해 물에 의한 정용여과와 조합될 수 있다.
유리하게는, 더 많은 양의 락토스를 함유하는 UF 투과물에 적용가능한 나노여과의 다른 양상에서, 막은 600 내지 3500 Da의 MWCO를 가져 3차 또는 더 고차의 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 유지를 확보하고 락토스의 적어도 일부가 막을 통과할 수 있게 하고, 상기 막의 활성(상단) 층은 폴리이미드로 구성되고, 상기 막에서 MgSO4 탈염률(rejection factor)은 약 20 내지 90%, 바람직하게는 50 내지 90%이다. 이어서, 적용되는 나노여과 막은 3차 또는 더 고차의 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스에 대해, 이의 효율적인 유지를 위해, 투과-불허용성(tight)이다. 이러한 막은 본원에 참고로 혼입되는 WO 2019/003133에 개시되어 있다.
시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유하는 수성 매질의 전처리는 활성탄(AC) 처리의 단계를 포함할 수 있다. AC 단계는 UF 단계 또는 NF 단계에 후속할 수 있다. AC 처리는 필요에 따라 착색제 및/또는 수용성 오염물질, 예컨대 염을 제거하거나 이의 양을 감소시키는 것을 돕는다.
탄수화물 물질, 예컨대, 관심 대상인 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스는 이의 수용액, 예컨대 UF 또는 NF 단계 후 수득되는 수용액으로부터의 차콜(charcoal) 입자의 표면에 결합되는 경향이 있다. 유사하게, 착색제는 또한 차콜에 흡착된다. 탄수화물 및 착색 부여 물질이 흡착될 수 있는 한편, 차콜에 결합되지 않거나 약하게 결합되는 수용성 물질은 물에 의해 용출될 수 있다. 용출액을 물에서 수성 에탄올로 변경하는 것은 흡착되는 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스가 용이하게 용출되고 개별 분획으로 수집되게 할 수 있다. 흡착된 착색 부여 물질이 여전히 차콜에 흡착된 채로 남을 것이고, 따라서, 탈색 및 탈염이 동시에 성취될 수 있다. 차콜 처리는 교반하에 차콜(예컨대, 분말, 펠릿(pellet) 또는 과립)을 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 수성 매질/용액에 첨가하고, 차콜을 여과하여 제거하고, 교반하에 수성 에탄올에 재현탁시키고, 여과에 의해 차콜을 분리함으로써 수행될 수 있다. 더 큰 규모의 정제에서, UF 단계 및/또는 NF 단계 후 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 수용액은 차콜로 패킹(packing)된 컬럼에 로딩되고, 이는 임의적으로 셀라이트와 혼합된 후, 상기 컬럼은 필요한 용리액에 의해 세척된다. 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 함유하는 분획이 수집된다. 상기 분획으로부터, 필요에 따라, 에탄올은, 예컨대 증발에 의해 제거되어 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 수용액이 수득될 수 있다.
다르게는, 특정 조건하에, 시알일화된 올리고당은 차콜 입자에 전혀 또는 적어도 실질적으로 흡착되지 않고, 물에 의한 용출은 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 수용액을 이의 상당한 손실 없이 생성하는 한편, 착색 부여 물질이 흡착된 채로 유지된다.
시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스는 화학적 합성, 생체외 효소적 합성으로, 또는 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 생성할 수 있는 유전자 변형된 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스를 제조하는 바람직한 방법은 발효이다.
6'-SL의 화학적 합성에 대해서는, 예컨대, WO 2010/116317 또는 WO 2011/100979 참고.
트랜스시알리다제(transsialidase)를 사용한 시알일화된 락토스의 생체외 효소적 합성에 대해서는, 예컨대 문헌[Maru et al. Biosci . Biotech. Biochem . 56, 1557 (1992), Masuda et al. J. Biosci . Bioeng . 89, 119 (2000)] 또는 WO 2012/007588을 참고한다. 시알일 트랜스퍼라제를 사용한 3'-SL의 생체외 효소적 합성에 대해서는, 예컨대 WO 96/32492, 문헌[Gilbert et al. Nature Biotechnol . 16, 769 (1998)], WO 99/31224 또는 문헌[Mine et al. J. Carbohydr . Chem . 29, 51 (2010)]을 참고한다.
유전자 변형된 세포를 포함하는 발효적 제조는 바람직하게는 하기 방식으로 수행된다. 외인성으로 첨가된 억셉터는 배양 배지로부터 세포로 내재화되고, 여기서, 이는 적절한 시알일 트랜스퍼라제에 의해 매개되는 효소적 시알일화를 포함하는 반응에서 관심 대상인 시알일 올리고당으로 전환된다. 한 양태에서, 내재화는 수동 수송 메커니즘을 통해 수행될 수 있고, 이 동안, 외인성 억셉터는 세포의 형질막을 횡단하여 수동적으로 확산된다. 상기 유동은 내재화되는 억셉터 분자에 대해 세포외 또는 세포내 공간에서 농도 차이에 대해 유도되고, 평형에 대한 경향성으로 억셉터는 더 고농도의 위치로부터 더 저농도의 영역으로 통과하게 된다. 또다른 양태에서, 외인성 억셉터는 능동 수송 메커니즘의 보조에 의해 세포 내에 내재화될 수 있고, 이 동안, 외인성 억셉터는 세포의 수송체 단백질 및 투과효소(permease)의 영향하에 세포의 형질막을 횡단하여 확산된다. 락토스 투과효소(LacY)는 갈락토스, N-아세틸-글루코사민, 갈락토실화된 단당류(예컨대 락토스), N-아세틸-글루코사민일화된 단당류 및 이들의 글리코시드 유도체로부터 선택되는 단당류 또는 이당류에 대한 특이성을 갖는다. 모든 이러한 탄수화물 유도체는 능동 수송에 의해, LacY 투과효소를 갖는 세포에 의해 용이하게 흡수될 수 있고, 글리코실화되기 전에 세포 내에 축적된다(WO 01/04341, 문헌[Fort et al. J. Chem . Soc ., Chem . Comm . 2558 (2005)], EP-A-1911850, WO 2013/182206, WO 2014/048439). 이는 세포가 이의 LacY 투과효소를 사용하여 탄수화물 억셉터를 세포로 수송할 수 있고, 세포가 상기 억셉터를 분해할 수 있는 임의의 효소, 특히 LacZ를 결여하기 때문이다. 내재화되는 기질의 당 모미어티에 대한 특이성은 공지된 재조합 DNA 기법에 의한 돌연변이에 의해 변경될 수 있다. 바람직한 양태에서, 외인성으로 첨가되는 억셉터는 락토스이고, 이의 내재화는 세포의 락토스 투과효소, 보다 바람직하게는 LacY에 의해 매개되는 능동 수송 메커니즘을 통해 수행된다. 세포 내에 내재화됨으로써, 억셉터는, 예컨대 세포의 염색체에 통합시킴으로써 또는 발현 벡터를 사용함으로써, 공지된 기법에 의해 세포로 도입되는 이종 유전자 또는 핵산 서열에 의해 발현되는 시알일 트랜스퍼라제에 의해 시알일화된다. 유전자 변형된 세포는 상응하는 시알일 트랜스퍼라제에 의해 전달되기에 적합한 시알산 단당류 뉴클레오티드 공여체(전형적으로 CMP-시알산)를 생성하는 생합성 경로를 포함한다. 유전자 변형된 세포는 CMP-시알산을 두가지 방식으로 생성할 수 있다. 하나의 방식에서, 외인성으로 첨가된 시알산은 능동적으로 또는 수동적으로, 바람직하게는 시알산 투과효소에 의해 능동적으로, 보다 바람직하게는 nanT에 의해 인코딩된 시알산 투과효소에 의해 능동적으로 내재화된 후, 예컨대, 이종 neuA에 의해 인코딩된 CMP-NeuAc 합성효소에 의해 CMP-시알산으로 전환된다. 또다른 방식에서, 내재적으로 이용가능한 UDP-GlcNAc가, 중간체로서 ManNAc 및 시알산을 통해 이를 CMP-시알산으로 전환하는 이종 neuC, neuB 및 neuA를 발현함으로써 이용된다. 그 동안, 시알산 및 이의 전구체에 대한 세포의 이화적 활성은 알돌라제 유전자(nanA) 및/또는 ManNAc 키나제 유전자(nanK)의 비활성화/결실에 의해 억제된다. 내재화된 탄수화물 전구체는 전술한 바와 같이 시알일화되기 전에 시알일화 이외의 글리코실화, 예컨대, N-아세틸글루코사민일화, 갈락토실화및/또는 푸코실화를 거칠 수 있다.
유전자 변형된 미생물에 의한 시알일화된 올리고당/시알일화된 락토스의 제조의 바람직한 양태에서, 시알일화된 올리고당을 생성할 수 있는 미생물은 대장균, 바람직하게는 neuBCA를 보유하는 LacZ- 또는 LacY+LacZ- 유전자형의 대장균이다. 미생물 내의 이종 시알일 트랜스퍼라제 유전자는 바람직하게는 α-2,3- 또는 α-2,6-시알일 트랜스퍼라제이고, 이의 보조에 의해, 탄수화물 억셉터로서 외인성으로 첨가되는 락토스로부터, 각각 3'-SL 또는 6'-SL이 생성된다. 이러한 미생물은, 예컨대, WO 2007/101862, 문헌[Fierfort et al. J. Biotechnol . 134, 261 (2008)], [Drouillard et al. Carbohydr . Res. 345, 1394 (2010)] 또는 WO 2017/101958에 개시되어 있다.
따라서, 본 발명의 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 내재화된 락토스로부터 시알일화된 락토스를 생성할 수 있는 유전자 변형된 미생물을 배양함으로써 수득되는 발효 브로스로부터 시알일화된 락토스를 정제하는 방법이다:
i) 브로스를 한외여과하여 한외여과 투과물을 수득하는 단계,
ii) 상기 한외여과 투과물을 나노여과하여 나노여과 잔류물을 수득하는 단계,
iii) 임의적으로, 상기 나노여과 잔류물을 활성탄으로 처리하여 탈색된 수용액을 수득하는 단계,
iv) 상기 단계 ii) 또는 iii)에서 수득된 용액에 음이온을 첨가하는 단계,
v) 상기 단계 iv)에서 수득된 수용액을 H+-형태의 강한 양이온교환 수지로 처리하는 단계, 및
vi) 상기 단계 v)의 용출액을 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지로 처리하고 용출액을 수집하는 단계.
바람직하게는, 사전-결정된 양의 공-음이온이 단계 iv)에서 첨가된다. 보다 바람직하게는, 공-음이온의 양은 (각각 음이온 및 시알일화된 락토스의 전하와 관련하여) 약염기성 음이온교환 수지에 결합된 시알일화된 락토스의 몰량에 대해 0.5 내지 3 당량이다.
실시예
6'-SL의 제조
WO 2017/101958에 따라, 통합되고 이의 염색체로부터 발현된 α-2,6-시알일 트랜스퍼라제, 및 동일한 플라스미드로부터 발현된 neuBCA 및 nadC를 갖는 LacY+LacZ- 유전자형의 대장균을 사용하는 발효에 의해 6'-SL을 제조하였다. 발효 브로스를 EP-A-3456836에 따라 정제하여(UF, NF) 6'-SL을 함유하는 수용액을 수득하고, 이를 하기 실시예에 사용하였다.
실시예 1
본 실시예는 약염기성 수지에 결합하는 6'-SL의 양의 측정을 나타낸다.
6'-SL을 함유하는 수용액을 상이한 이온교환 수지로 충전된 2개의 상호연결된 컬럼으로 통과시켜 수지 1로부터의 용출액이 수지 2의 컬럼의 상단으로 직접 유도되게 하였다. 수지 1은 DowexTM 88(H+-형태의 강한 산성 양이온교환 수지(SAC))이었고, 수지 2는 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지 DowexTM 66이었다. 수지 2로부터의 용출액에, NaOH-용액을 첨가하여 pH가 약 5가 되도록 설정하였다.
3개의 실험을 병렬로 수행하고, 각각의 처리 조작 매개변수를 하기 표 1에 요약하였다.
#1 #2 #3
DowexTM 88 H + 의 부피(L) 0.9 0.9 0.11
DowexTM 66 자유 염기의 부피(L) 0.63 0.63 0.11
공급 용액의 질량(g) 1995 2285 483
공급 용액 중 6'-SL 의 질량(g) 461 528 84
공급 용액 중 락토스의 질량(g) 16 19 0.5
pH 조정 후 용출액 중 6'-SL 의 질량(g) 367 424 68.5
pH 조정 후 용출액 중 락토스의 질량(g) 24 32 1.0
6'-SL 수율(%) 79.7 80.3 81.3
가수분해에 기인하는 6'-SL 손실의 질량(g) 14 24 1.0
가수분해에 기인하는 6'-SL 손실의 백분율(%) 2.9 4.6 1.2
흡착에 기인하는 6'-SL 손실의 백분율(%) 17.4 15.1 17.5
흡착에 기인하는 6'-SL 손실의 분율(%) 85.5 76.8 93.6
6'-SL에 대한 DowexTM 66의 결합능(수지 중 mol/L) 0.20 0.20 0.21
탄수화물을 HPLC(PAD를 갖는 CarboPac PA200에서의 이온 크로마토그래피)에 의해 측정하였다.
데이터로부터 명확하듯이, 상당량의 6'-SL이 이의 약한 염기성 음이온교환 수지에 대한 결합, 및 가수분해를 통한 더 적은 양에 기인하여 손실되었다(락토스 균형(balance)으로부터 계산됨). 따라서, 1 L(습윤 부피)의 DowexTM 66은 약 0.2 mol의 6'-SL에 결합한다.
실시예 2
동일한 6'-SL의 수용액 및 동일한 수지 구성을 본 실시예에 사용하되, 차이점은 계산된 양의 NaCl이 수지 공급물에 첨가된 것이었다. 실험의 처리 조작 매개변수를 하기 표 2에 요약하였다.
#4 #5 #6
DowexTM 88 H + 의 부피(L) 0.11 0.11 0.30
DowexTM 66 자유 염기의 부피(L) 0.11 0.11 0.21
공급 용액의 질량(g) 483 483 691
공급 용액 중 6'-SL 의 질량(g) 84.2 84.2 152
상기 측정된 DowexTM 66의 결합능에 대해 공급 용액에 첨가된 NaCl(몰당량) 0.99 1.55 10.67
pH 조정 후 용출액 중 6'-SL 의 질량(g) 78.6 81.9 151
6'-SL 수율(%) 93.4 97.2 99.3
용리액으로부터의 샘플을 동결-건조하고 무기 음이온 함량에 대해 모세관 전기영동에 의해 분석하였다.
#4 #5 #6
클로라이드 (wt%) 0.071 0.004 3.42
설페이트 (wt%) < d.l. < d.l. 0.09
포스페이트(wt%) < d.l. < d.l. < d.l.
* < d.l.: 검출 한계 미만
상기 실시예는 1 또는 1.5 몰당량의 NaCl을 수지 공급물에 첨가하는 것(각각 실험 #4 및 #5)이 6'-SL의 회수율을 효율적으로 증대시키는 한편, 단리된 샘플에서 음이온의 양이 매우 낮고 규제 요건에 훨씬 못미치는 것을 입증하였다. 약 10 당량의 NaCl을 첨가하는 경우(실험 #6), 회수율은 높았지만, 실질적인 양의 염이 단리된 6'-SL을 오염시켰다.
결론: 청구되는 변형된 정제 공정은, 특히 음이온 함량에 있어서, EP-A-3456836에 개시된 선행 기술의 공정과 적어도 동일한 수율 및 동일한 순도/검정으로 6'-SL을 제공한다.

Claims (25)

  1. 시알일화(sialylation)된 올리고당을 포함하는 수용액으로부터 상기 시알일화된 올리고당을 정제하는 방법으로서, 상기 방법이 이온교환 수지에 의한 상기 수용액의 처리를 포함하고, 이때,
    - 상기 이온교환 수지 처리가 상기 수용액을 H+-형태의 강산성 양이온교환 수지에 이어서 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때,
    - 강산의 무기 음이온이 상기 이온교환 처리 전에 상기 수용액에 첨가되는,
    방법.
  2. 제1항에 있어서,
    무기 음이온이 클로라이드인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    클로라이드가 염 형태인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    염이 NaCl인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    무기 음이온이 시알일화된 올리고당을 계산된 몰량으로 함유하는 수용액에 첨가되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    첨가되는 음이온의 몰량이 시알일화된 올리고당에 대한 약염기성 음이온교환 수지의 결합능(binding capacity)에 대해 0.5 당량 이상인, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    첨가되는 음이온의 몰량이 시알일화된 올리고당에 대한 약염기성 음이온교환 수지의 결합능에 대해 3 당량 이하인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    첨가되는 음이온의 몰량이 0.75 내지 2.5 당량인, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    몰량이 1 내지 1.5 당량인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    시알일화된 올리고당을 함유하는 수용액이, 발효 브로스 또는 생체외 효소 반응 혼합물을 포함하는 수성 매질인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    시알일화된 올리고당을 함유하는 수용액이, 발효 브로스 또는 생체외 효소 반응 혼합물을 포함하는 임의적으로 전처리된 수성 매질로부터 유래하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    수성 매질이 발효 브로스를 포함하는, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    시알일화된 올리고당을 함유하는 수용액이, 하나 이상의 정제 단계 후 발효 브로스 또는 효소 반응 혼합물을 포함하는 수성 매질로부터 수득되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    하나 이상의 정제 단계가 원심분리, 한외여과, 나노여과, 활성탄 처리 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    하나 이상의 정제 단계가
    - 발효 브로스를 한외여과하여 한외여과 투과물(permeate)을 수득하는 단계,
    - 상기 한외여과 투과물을 나노여과하여 나노여과 잔류물(retentate)을 수득하는 단계, 및
    - 임의적으로, 상기 나노여과 잔류물을 활성탄 처리하여 시알일화된 올리고당을 함유하는 탈색된 수용액을 수득하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    a) 발효 브로스를 한외여과(UF)하고 UF 투과물(UFP)을 수득하는 단계,
    b) 상기 UFP를 나노여과(NF)하고 NF 잔류물(NFR)을 수집하는 단계,
    c) 임의적으로, 상기 UFP 및/또는 NFR을 활성탄으로 처리하고, 활성탄 용출액(CE)을 수집하는 단계,
    d) 강산의 무기 음이온, 바람직하게는 클로라이드, 예컨대, NaCl을 상기 NFR 또는 CE에 첨가하는 단계, 및
    e) 상기 단계 d)에서 수득된 수용액을 H+-형태의 강산성 양이온교환 수지에 이어서 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지로 처리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    시알일화된 올리고당이 이의 구조 내에 단 하나의 시알일 모이어티를 포함하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    시알일화된 올리고당이 산성 인간 모유 올리고당(HMO)인, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    산성 HMO가 3'-시알일락토스(3'-SL), 6'-시알일락토스(6'-SL), 3-푸코실-3'-시알일락토스(FSL), LST a, 푸코실-LST a(FLST a), LST b, 푸코실-LST b(FLST b), LST c, 푸코실-LST c(FLST c), 시알일-LNH (SLNH), 시알일-락토-N-헥사오스(SLNH), 시알일-락토-N-네오헥사오스 I(SLNH-I), 시알일-락토-N-네오헥사오스 II(SLNH-II) 또는 다이시알일-락토-N-테트라오스(DS-LNT)인, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    산성 HMO가 이의 구조 내에 단 하나의 시알일 모이어티를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    산성 HMO가 3'-SL 또는 6'-SL인, 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    산성 HMO가 유전자 변형된(genetically modified) 미생물에 의해 생성되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    유전자 변형된 미생물이 대장균(E. coli)인, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    대장균이 유전자 클러스터 neuBCA를 보유하는, 방법.
  25. 제21항에 있어서,
    i) 내재화된(internalized) 락토스로부터 3'-SL 또는 6'-SL을 생성할 수 있는 유전자 변형된 미생물을 배양하는 단계,
    ii) 상기 단계 i)의 브로스를 한외여과하여 한외여과 투과물을 수득하는 단계,
    iii) 상기 한외여과 투과물을 나노여과하여 나노여과 잔류물을 수득하는 단계,
    iv) 임의적으로, 나노여과 잔류물을 활성탄 처리하여 탈색된 수용액을 수득하는 단계,
    v) 상기 단계 iii) 또는 iv)에서 수득된 용액에 NaCl을 3'-SL 또는 6'-SL에 대한 약염기성 음이온교환 수지의 결합능에 대해 0.75 내지 2.5 당량, 바람직하게는 1 내지 1.5 당량의 몰량으로 첨가하는 단계,
    vi) 상기 단계 v)에서 수득된 수용액을 H+-형태의 강한 양이온교환 수지로 처리하는 단계, 및
    vii) 상기 단계 vi)의 용출액을 자유 염기 형태의 약염기성 음이온교환 수지로 처리하고 용출액을 수집하는 단계
    를 포함하는 방법.
KR1020237034240A 2021-03-12 2022-03-11 시알로올리고당의 정제 KR102669887B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA202100260 2021-03-12
DKPA202100260A DK181061B1 (en) 2021-03-12 2021-03-12 Purification of sialooligosaccharides
PCT/IB2022/052207 WO2022190055A1 (en) 2021-03-12 2022-03-11 Purification of sialooligosaccharides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230148264A true KR20230148264A (ko) 2023-10-24
KR102669887B1 KR102669887B1 (ko) 2024-05-27

Family

ID=

Also Published As

Publication number Publication date
CN116964066A (zh) 2023-10-27
DK181061B1 (en) 2022-10-31
US20240043889A1 (en) 2024-02-08
WO2022190055A1 (en) 2022-09-15
DK202100260A1 (en) 2022-09-21
BR112023018066A2 (pt) 2023-10-03
EP4305043A1 (en) 2024-01-17
JP2024509776A (ja) 2024-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11312741B2 (en) Separation of oligosaccharides from fermentation broth
US10800802B2 (en) Separation of oligosaccharides from fermentation broth
AU2018373415B2 (en) Process for the purification of a sialic acid from a fermentation broth
EP3456836A1 (en) Separation of sialylated oligosaccharides from fermentation broth
JP2022550680A (ja) 発酵ブロスからの中性オリゴ糖の分離
JP7356460B2 (ja) シアリルラクトースの簡素な精製法
JP2023507247A (ja) 発酵ブロスからのシアリル化オリゴ糖の分離
JP2024509776A (ja) シアロオリゴ糖の精製
EP3897902B1 (en) Separation of oligosaccharides
US20230271992A1 (en) Simple Method for the Purification of Lacto-N-Neotetraose (LNnT) From Carbohydrates Obtained by Microbial Fermentation
KR102669887B1 (ko) 시알로올리고당의 정제
RU2796746C2 (ru) ПРОСТОЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ ЛАКТО-N-НЕОТЕТРАОЗЫ (LNnT) ОТ УГЛЕВОДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ПОСРЕДСТВОМ МИКРОБНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ
EP4222156A1 (en) Process for purifying a human milk oligosaccharide and related compositions

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right