JP7356460B2 - シアリルラクトースの簡素な精製法 - Google Patents
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Description
シアル化オリゴ糖は複雑な構造を有しているので、それらの化学合成又は(化学)酵素合成には課題も多く、立体化学の制御、特異的結合の形成、原料の入手性など、広範囲にわたる困難を伴う。その結果、市販のシアル化オリゴ糖は、天然物の量が少ないために非常に高価であった。
SLの分子量より小さい分子量カットオフを有する適切な膜は、例えば、TriSep XN-45(TriSep Corporation社、米国)、Dairy DK(Suez Water Technologies社、旧GE社)及びFilmtech NF270(Dow社)である。
6-SLに対する透過性を有し、6-SLより大きい分子量を有する炭水化物を保持液中に保持するための適切な膜は、例えば、TangenX SIUS TFF 0.65kDa膜(Repligen Corporation社)、Zirkoniaモジュール 3nm(Pervatech BV社)及びS-CUT YSNF-YS600(CUT/Burkert社)である。
本明細書中に記載の方法は、経済的に実現可能であり規模拡大可能であるので、ヒトミルクオリゴ糖の3’-シアリルラクトース又は6’-シアリルラクトースを微生物発酵又は生体触媒反応から数トン量で精製するのに適切である。
当該方法は3’-シアリルラクトース又は6’-シアリルラクトースの精製、すなわち他の炭水化物からの3-SL又は6-SLの分離を可能にする。ここで、水溶液中のシアリルラクトースの純度は精製前に≦70%、≦60%、≦50%、≦40%、≦30%、≦20%、≦10%又は≦5%であり、及び/又は、該水溶液はシアリルラクトースを精製後に≧80%、好ましくは≧85%又はさらに好ましくは≧90%の純度で含有する。
i.)バイオマスを発酵ブロスから分離し;
ii.)荷電物質を除去するために、無細胞発酵ブロスを少なくとも一つのイオン交換樹脂処理、好ましくは陰イオン交換樹脂処理及び陽イオン交換樹脂処理に付し;
iii.)工程ii.で得られた水溶液を、約300~約500ドルトンの分子量カットオフを有する膜を用いる膜濾過工程に付してシアリルラクトースより小さい分子量を有する炭水化物を除去し;
iv.)工程iii.で得られた保持液を、約600~約800ドルトンの分子量カットオフを有する膜を用いる膜濾過工程に付してシアリルラクトースより大きい分子量を有する炭水化物を除去し;そして、任意に
v.)工程iv.の濾液中に存在するシアリルラクトースの濃度を増大させる。
態様1 シアリルラクトースを他の炭水化物から精製するための方法であって、該方法は、シアリルラクトースと他の炭水化物を含有する水溶液を異なる膜を用いる二つの膜濾過工程に付す工程を含み、ここで、
- 一つの膜は約300~約500ドルトン(Dalton)の分子量カットオフを有し、そして
- 他の膜は約600~約800ドルトンの分子量カットオフを有する
ことを特徴とする方法。
態様2 該水溶液が、シアリルラクトースを製造するための発酵又は酵素法から得られる、態様1に記載の方法。
態様3 該水溶液が、発酵ブロスからバイオマスを分離することによって発酵から得られる、態様1又は2に記載の方法。
態様4 発酵ブロスからのバイオマスの分離が、少なくとも一つの限外濾過工程、好ましくは二つの限外濾過工程、さらに好ましくは約500kDaの分子量カットオフを有する膜を用いる第一の限外濾過と約150kDaの分子量カットオフを有する膜を用いる第二の限外濾過を含む、態様3に記載の方法。
態様5 シアリルラクトースを含有する水溶液が、好ましくはH + 形の、陽イオン交換樹脂と、好ましくはCl - 形の、陰イオン交換樹脂とにより、さらに好ましくは該水溶液を膜濾過工程に付す前に処理される、態様1~5のいずれかに記載の方法。
態様6 方法が、透析、好ましくは電気透析の工程をさらに含む、態様1~6のいずれかに記載の方法。
態様7 該水溶液中のシアリルラクトースの純度が、精製前に≦70%、≦60%、≦50%、≦40%、≦30%、≦20%、≦10%又は≦5%であり、及び/又は、該水溶液がシアリルラクトースを精製後に≧80%、好ましくは≧85%又はさらに好ましくは≧90%の純度で含有する、態様1~6のいずれかに記載の方法。
態様8 シアリルラクトースが3’-シアリルラクトース又は6’-シアリルラクトースである、態様1~7のいずれかに記載の方法。
本発明を、特定の態様に関して説明するが、本発明はそれらに限定されるのではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、説明文及び特許請求の範囲における第一、第二などの用語は、類似の要素を区別するために使用されているのであって、必ずしも、時間的、空間的、ランキング又は任意のその他の様式における順序を記述しているわけではない。そのように使用された用語は、適切な状況下で交換可能であること、そして本明細書中に記載された発明の態様は本明細書中に記載又は例示されている以外の他の順序で操作可能であることは理解されるはずである。
フォトバクテリウム・レイオグナチ(Photobacterium leiognathi)JT-SHIZ-119由来のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子plsT6を発現している組換え6’-シアリルラクトース合成大腸菌株(大腸菌BL21(DE3) ΔlacZ)を用いて6’-シアリルラクトースの流加発酵(feed-batch fermentation)を実施した。CMP-シアル酸の生合成を増強するために、大腸菌由来グルコサミン-6-リン酸シンターゼGlmS、シネコシスティス種(Synechocystis sp.)由来N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼSlr1975、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来グルコサミン6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼGna1、大腸菌由来ホスホエノールピルビン酸シンターゼPpsA、N-アセチルノイラミン酸シンターゼNeuB、及びCMP-シアル酸シンターゼNeuA(後者二つはカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)由来)をコードする遺伝子を大腸菌BL21(DE3)宿主の染色体に組み込んだ。さらに、大腸菌由来ラクトースペルメアーゼLacYをコードする遺伝子、及び大腸菌由来の遺伝子cscB(スクロースペルメアーゼ)、cscK(フルクトキナーゼ)、cscA(スクロースヒドロラーゼ)、及びcscR(転写調節因子)もBL21ゲノムに組み込み、組み込まれた遺伝子の転写が、テトラサイクリンプロモーターPtet又はPT5プロモーターいずれかの構成的プロモーターから開始されるようにした。遺伝子galE(UDP-グルコース-4-エピメラーゼ)、galT(ガラクトース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ)、galK(ガラクトキナーゼ)、及びgalM(ガラクトース-1-エピメラーゼ)からなり、発現している機能的ガル(ガラクトース)オペロンを大腸菌K12からBL21株のゲノムに移した。N-アセチルグルコサミン6-リン酸の分解を防止するため、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸デアセチラーゼ(NagA)、グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ(NagB)、及びN-アセチルグルコサミン特異的PTSタンパク質IIABC(NagE)を細菌染色体から削除した。さらに、マンノース、グルコース、グルコサミン及びN-アセチルグルコサミンのための大腸菌PTS系の糖輸送体をコードするオペロンmanXYZのほか、N-アセチルノイラミン酸リアーゼ、N-アセチルマンノサミンキナーゼ、N-アセチルマンノサミン-6-リン酸エピメラーゼ、及びシアル酸輸送体をそれぞれコードする遺伝子nanA、nanK、nanE、及びnanTも削除した。N-アセチルガラクトサミン-6-リン酸デアセチラーゼ(AgaA)をコードする遺伝子も削除した。
細胞集団(cell-mass)(発酵ブロスの約10%)を、限外濾過(0.05μmカットオフ)(CUT membrane technology社、ドイツ・エルクラート)と、その後の150kDaのMWCOを有するフィルター(Microdyn-Nadir社、ドイツ・ヴィースバーデン)を用いるクロスフロー濾過によって培地から分離した。
実施例2から得られた無細胞発酵ブロスは、体積1000リットル中に6’-シアリルラクトースを(乾燥重量による純度9%で)含有していた。これを、正に帯電した夾雑物質を除去するために、H+形の強陽イオン交換樹脂(ドイツのLanxess社から入手したLewatit(登録商標)S2568)に通した(イオン交換体の床体積のサイズは200Lであった)。イオン交換樹脂からの6-SLの溶出は脱イオン水を用いて続けられた。次に、得られた溶液を水酸化ナトリウム溶液の添加によりpH7にセットした。次に(遅滞なく)、該溶液を陰イオン交換体カラムに通した(イオン交換体の床体積は200Lであった)。使用された強陰イオン交換体Lewatit(登録商標)S6368A(Lanxess社、ドイツ)は塩化物(Cl-)形であった。6-SLの溶出は脱イオン水を用いて続けられた。得られた溶液を再度pH7に中和した。
実施例3に示されたイオン交換樹脂処理によって得られた溶液を、TriSep XN-45(TriSep Corporation社、米国)ナノ濾過膜と500Lの脱イオン水を用いて透析濾過した。得られた溶液をさらに、ナノ濾過膜(RE 8040-BE、CSM-Saehan社)を用いて濃縮した。ここで、純度31%(乾燥重量による)及び導電率8mS/cmを有する6’-シアリルラクトース溶液が得られた。
発酵生産された副産物のジシアリルラクトースから6’-シアリルラクトースを分離するために第二の膜処理を使用した。濾過のために、公称カットオフ0.65kDaを有するTangenX SIUS TFF膜(Repligen Corporation社)を使用した。94.4%の6’-シアリルラクトースと6.6%のジシアリルラクトース(比率15:1)を含有する溶液を、記載のシステムを用いてクロスフロー濾過し、透過液及び保持液内部の6’-シアリルラクトースとジシアリルラクトースの濃度を決定した。結果は、透過液内部のジシアリルラクトースの量が6.6%から0.2%に著しく減少した(6’-シアリルラクトース対ジシアリルラクトースの比率は55:1であった)が、保持液内部の6’-シアリルラクトース対ジシアリルラクトースの比率は14:1であったことを示している。この結果は、追加の濾過工程を使用することによって6’-シアリルラクトースをジシアリルラクトースから分離できることを示している。このような観察結果は、異なる供給業者から入手した類似のカットオフを有する第二の種類の膜を使用することによっても示すことができる。公称カットオフ600~800Daを有するS-CUT YSNF-YS600-2540-M46D-ATD膜(CUT Membrane Technology GmbH社)を用いることによっても6’-シアリルラクトースはクロスフロー濾過によってジシアリルラクトースから分離された。
実施例5で得られた透過液を、PC-Cell ED 1000H 膜スタックを備えたPC-Cell 15 電気透析装置(PC-Cell、ドイツ・ホイスヴァイラー)を用いて2mS/cmにまで電気透析した。この膜スタックは下記の膜を備えていた。すなわち、陽イオン交換膜CEM:PK SK 及び陰イオン交換膜AEM:60Daのサイズ排除限界を有するPcAcid60。0.025Mのスルファミン酸(アミドスルホン酸)溶液を電気透析法の電解質として使用した。電気透析後、6’-シアリルラクトースを純度83%(乾燥重量による)で含有する溶液が得られた。電気透析処理の代わりに透析濾過法を使用することもできた。
逆浸透フィルターと45℃での回転蒸発を用いて水溶液から多少の水を除去し、25%(m/v)の6’-シアリルラクトース溶液を得た。次に、得られた水溶液を活性炭(Norit SA2)で処理した。1Lの25%(m/v)6’-シアリルラクトースに対し125gの活性炭を使用した。
その後、実施例7で得られた溶液を6kDフィルター(Pall Microza 限外濾過中空糸モジュールSEP-2013、Pall Corporation社、ドイツ・ドライアイヒ)に通すことにより滅菌濾過に付した。次に、該滅菌溶液を噴霧乾燥までRT(室温)で保管した。
このようにして得られた(実施例8)滅菌6’-シアリルラクトースを次に、NUBILOSA LTC-GMP噴霧乾燥機(NUBILOSA社、ドイツ・コンスタンツ)を用いて噴霧乾燥した。6’-シアリルラクトースの噴霧乾燥の場合、溶液を、3.5barの加圧下、130℃にセットされた噴霧乾燥機ノズルに通し、67~69℃の排気温度を維持するように流量を調整した。これらの設定を用いて、9%未満の水分量を有する噴霧乾燥粉末が得られた。水分含量は、カール・フィッシャー滴定によって決定された。
定量のため、質量分析をMRM(多重反応モニタリング)により、LCトリプル四重極MS検出システムを用いて実施した。プリカーサイオンは四重極1で選択及び分析し、フラグメンテーションはアルゴンをCIDガスとして用いて衝突室(コリジョンセル)で行い、フラグメントイオンの選択は四重極3で実施する。糖のクロマトグラフィー分離は、XBridge Amideガードカートリッジ(3.5μm、2.1×10mm)(Waters社、米国)付きXBridge Amide HPLCカラム(3.5μm、2.1×50mm(Waters社、米国)で実施した。HPLCシステムのカラムオーブン温度は50℃であった。移動相は、10mM酢酸アンモニウム入りのアセトニトリル/H2Oで構成されていた。1μlのサンプルを機器に注入し;運転(run)は流速400μl/分で3.60分間実施した。6’-シアリルラクトースは、MRMにより、ESIポジティブイオン化モードで分析された。質量分析計はユニット分解能で運転された。シアリルラクトースは、m/z656.2[M+Na]のイオンを形成する。シアリルラクトースのプリカーサイオンをさらに衝突室でフラグメント化し、フラグメントイオンm/z612.15、m/z365.15及びm/z314.15にした。衝突エネルギー、Q1及びQ3のプレバイアス(Pre Bias)は各分析物ごとに個別に最適化された。定量法は市販の標準(Carbosynth社、英国コンプトン)を用いて確立された。
Claims (14)
- シアリルラクトースを他の炭水化物から精製するための方法であって、該方法は、シアリルラクトースと他の炭水化物を含有する水溶液を異なる膜を用いる二つの膜濾過工程に付す工程を含み、ここで、
- 一つの膜は300~500ドルトンの分子量カットオフを有し、そして
- 他の膜は600~800ドルトンの分子量カットオフを有する
ことを特徴とする方法。 - 該水溶液が、シアリルラクトースを製造するための発酵又は酵素法から得られる、請求項1に記載の方法。
- 該水溶液が、発酵ブロスからバイオマスを分離することによって発酵から得られる、請求項1又は2に記載の方法。
- 発酵ブロスからのバイオマスの分離が、少なくとも一つの限外濾過工程を含む、請求項3に記載の方法。
- 発酵ブロスからのバイオマスの分離が、二つの限外濾過工程を含む、請求項4に記載の方法。
- 発酵ブロスからのバイオマスの分離が、500kDaの分子量カットオフを有する膜を用いる第一の限外濾過と150kDaの分子量カットオフを有する膜を用いる第二の限外濾過を含む、請求項5に記載の方法。
- シアリルラクトースを含有する水溶液が、陽イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂とにより処理される、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- シアリルラクトースを含有する水溶液が、H + 形の陽イオン交換樹脂と、Cl - 形の陰イオン交換樹脂とにより処理される、請求項7に記載の方法。
- シアリルラクトースを含有する水溶液が、陽イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂とにより、該水溶液を膜濾過工程に付す前に処理される、請求項7または8に記載の方法。
- 方法が、透析の工程をさらに含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 方法が、電気透析の工程をさらに含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 該水溶液中のシアリルラクトースの純度が、精製前に≦70%、≦60%、≦50%、≦40%、≦30%、≦20%、≦10%又は≦5%であり、及び/又は、該水溶液がシアリルラクトースを精製後に≧80%の純度で含有する、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 該水溶液がシアリルラクトースを精製後に≧90%の純度で含有する、請求項12に記載の方法。
- シアリルラクトースが3’-シアリルラクトース又は6’-シアリルラクトースである、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
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