KR20210025007A - 시알릴락토스의 정제를 위한 간단한 방법 - Google Patents

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스테판 제네바인
마커스 헬프리히
베네딕트 엥겔스
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젠와인 바이오테크놀로지 게엠바하
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Abstract

다른 탄수화물로부터 시알릴락토스를 정제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 시알릴락토스를 함유하는 수용액을 상이한 막, 약 300 달톤 내지 약 500 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 막 및 약 600 달톤 내지 약 800 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 막을 사용한 두 개의 막 여과 단계에 적용하는 단계를 포함함을 특징으로 한다.

Description

시알릴락토스의 정제를 위한 간단한 방법
본 발명은 시알릴락토스의 정제 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 락토스 및 단당류와 같은 다른 탄수화물 뿐만 아니라 상기 시알릴락토스가 미생물 발효에 의해 생성되는 경우 발효 브로스(broth)에서 오염 탄수화물로서 존재할 수 있는 디시알릴락토스와 같은 더 큰 올리고당으로부터 시알릴락토스를 분리하기 위한 간단하고 경제적인 방법에 관한 것이다.
모유(human milk)는 유아 발달을 위한 최고의 식이(diet)로 간주된다. 이것은 지방, 단백질, 비타민, 미네랄, 미량 원소 및 복합 올리고당으로 구성된다. 락토스 외에도, 모유 - 뿐만 아니라 다른 포유류의 젖 - 는 모유 올리고당 (HMO)으로도 알려진 각종 구조적으로 다양한 올리고당을 함유한다 (Usashima T. et al., (2011) Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, New York ISBN 978-1-61122-831-1). HMO 중에서, 시알릴화된 HMO (SHMO)는 장병원성 박테리아 및 바이러스에 대한 내성을 지원하는 것으로 관찰되었다. 흥미롭게도, 최근 연구들은 미숙아에서 가장 흔하고 치명적인 질병 중 하나인 괴사성 소장결장염 (necrotizing enterocolitis)에 대한 장쇄 SHMO의 보호 효과를 추가로 입증하였다. 또한, SHMO는 유아의 두뇌 발달 및 이의 인지 능력을 지원하는 것으로 믿어진다. 또한, 시알릴화된 올리고당은 대장균 (Escherichia coli), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) 및 살모넬라 (Salmonella)를 포함한 다양한 병원성 미생물의 장독소를 중화시키는 것으로 나타났다. 추가로, 시알릴화된 올리고당은 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)에 의한 장의 군집화를 방해하여 위 및 십이지장 궤양을 예방 또는 억제하는 것으로 밝혀졌다.
시알릴화된 올리고당 중에서, 3'-시알릴락토스와 6'-시알릴락토스가 모유에서 가장 풍부한 구성분이다.
시알릴화된 올리고당은 복잡한 구조를 갖고 있기 때문에, 이들의 화학적 또는 (화학)효소적 합성이 어려우며 광범위한 어려움, 예를 들어 입체화학 제어, 특정 결합 형성, 공급원료 이용가능성 등과 관련이 있다. 결과적으로, 상업적으로 이용 가능한 시알릴화된 올리고당은 천연 공급원 중의 이들의 적은 양으로 인해 매우 고가이다.
따라서, 시알릴화된 올리고당을 생산하기 위해 미생물의 대사 공학에 대한 노력이 이루어졌는데, 그 이유는 이러한 접근법이 HMO를 산업 규모로 생산하기 위한 가장 유망한 방법이기 때문이다. 미생물 발효에 의한 SHMO의 생산을 위해, 미생물은 전형적으로 외인성 시알산의 존재하에서 배양된다.
국제 공개 제WO 2007/101862 A1호 및 제WO 2014/153252 A1호는 박테리아를 조작하여 시알릴화된 올리고당을 생산하기 위한 방법 및 조성물을 개시한다. 그러나, 6'-시알릴락토스의 발효적 생산은 디시알릴락토스와 같은 다른 탄수화물의 생합성에 의해 연관되는 것으로 알려져 있으며 (Drouillard, S. et al. (2010) Efficient synthesis of 6'-sialyllactose, 6,6'-disialyllactose, and 6'-KDO-lactose by metabolically engineered E. coli expressing a multifunctional sialyltransferase from the Photobacterium sp. JT-ISH-224. Carbohydrate Research 345: 1394-1399), 이것은 유전적으로 조작된 박테리아에서 발현되는 시알릴트랜스퍼라제의 활성으로 인해 6'-시알릴락토스로부터 생성된다. 또한, 탄수화물 (예를 들면 락토스)를 고압살균(autoclaving) (열 처리)하면 알돌(aldol) 또는 마이야르 (maillard) 생성물과 같은 바람직하지 않은 부산물의 형성, 또는 재배열 반응 (예를 들어, 락토스에서 락툴로스로의 전환)이 야기된다. 이러한 오염 물질이 특히 다량으로 최종 생성물에 존재하는 것은 바람직하지 않거나 심지어 허용되지 않는다.
또한, 올리고당을 생산하기 위해 유전자 조작된 박테리아를 사용하면 미생물로부터 생성된 핵산 분자 또는 폴리펩티드와 같은 재조합 물질로 발효 브로스가 오염된다. 그러나, 재조합 DNA 또는 단백질로 인간 소비용 제품이 오염되는 것은 오늘날 규제 당국에 의해서도 소비자에 의해서도 허용되지 않는다. 따라서, 재조합 미생물로부터 생성되는 모든 핵산과 단백질은 원하는 모유 올리고당으로부터 제거되어야 한다. 오늘날 재조합 DNA 분자의 검출 한계는 매우 낮아 철저한 정제 체계가 필요하다. qPCR 기반 DNA 검출의 경우, 단일 DNA 분자만큼 작더라도 샘플에서 검출될 수 있다.
발효 브로스로부터 개별 올리고당을 정제하기 위한 "최첨단" 공정은 특히 상기 올리고당이 식품 분야에 사용하기 위해 의도된 경우 기술적으로 복잡하고 종종 비경제적이다. 유청 또는 당밀과 같은 복잡한 혼합물로부터 이당류 락토스 또는 수크로스를 정제하기 위해, 다중 결정화 단계를 포함하는 산업 규모의 공정이 개발되었다. 그러나, 상기 방법은 정교하며 단지 낮은 수율을 야기한다. 또한, 이러한 발효 브로스 - 유청(whey)과 당밀 이외의 것 - 는 이미 식품이 아니기 때문에 이러한 공정은 식품 산업에서 사용하기에 적합한 미생물 발효에 의해 수득된 올리고당을 제공하기 위해 적용할 수 없다.
그러나, 한외여과, 미세여과 및 나노여과와 같은 여과 공정은, 모든 공정 매개변수가 알려져 있고 최적화된 경우, 기술적으로 수행하기 쉽다. 막 투과성 성분을 제거하기 위해 용액에 담수를 첨가함을 포함하는 정용여과 (diafiltration)가 또 다른 적절한 공정이다. 한외여과 및 미세여과는 통상적으로 발효 브로스 또는 수용액으로부터 단백질 또는 세포와 같은 훨씬 더 큰 분자를 분리하는데 사용된다. 또한, 나노여과에 의한 물, 미네랄 및 매우 작은 분자의 제거는 잘 알려져 있으며 유청의 농축 및 탈염을 위해 낙농업에서 사용된다. 대부분의 경우 나노- 및 한외여과용 막 재료는 피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리에틸렌 글리콜 및 세라믹과 같은 재료를 기본으로 한다. 막은 예를 들어 중공 섬유 모듈(hollow fibre module), 나선형 권취 모듈(spiral wound module) 및 평평한 시트 막(flat sheet membrane)으로서 조립될 수 있으며 조립체는 상이한 분리 성능을 생성할 수 있다. 일반적으로, 나노여과 막은 150-300 달톤 범위의 분자량 컷오프(molecular weight cut-off)를 갖는다. 400-600 달톤 범위의 분자량 컷오프를 갖는 막은 특히 대규모 산업적 생산을 위해서는 매우 드물다. 이것은 배치식(batch-wise) 또는 연속식 중의 어느 하나의 크로마토그래피와 같은 다른 분리 기술이 필요하기 때문에 올리고당의 분리를 여전히 복잡하게 만든다.
겔 여과 크로마토그래피가 편리한 실험실 규모 방법이기는 하지만, 모사 이동상 크로마토그래피 (simulated moving bed chromatography)가 식품 생산에 적합한 규모로 6-SL를 정제하는데 적합한 방법을 나타낸다. 그러나, 다른 모든 공개된 공정들은 오염 탄수화물이 원하는 생성물로부터 효과적으로 제거될 수 없다는 문제를 안고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 미생물 발효로부터 시알릴락토스를 정제하기 위한 간단하고 비용-효율적인 방법을 제공하는 것이었으며, 여기서는 재조합 미생물로부터 유래된 핵산 및 폴리펩티드가 원하는 올리고당 뿐만 아니라 상기 다른 탄수화물로부터 제거될 수 있다.
간단하고 비용-효율적이며 확장 가능한 시알릴락토스의 정제 방법이 제공된다. 시알릴락토스의 정제를 위한 방법은 상기 시알릴락토스의 결정화를 위해 유기 용매를 사용하지 않고 수행될 수 있다. 또한, 시알릴락토스의 정제를 위한 방법은 불연속적인 크로마토그래피 단계없이 수행될 수 있다.
시알릴락토스는 유아용 조제 분유(infant formula) 및 의료용 식품에 포함시키는 것이 매우 바람직한 모유 올리고당을 나타낸다. 시알릴락토스의 높은 비용은 이것이 특히 유아용 조제 분유에서 널리 사용되는 것을 방해한다. 특히 미생물 발효로부터의 생성물의 정제는 종종 정교하고 비용이 많이 든다. 또한, 유기 용매 및 불연속적인 크로마토그래피 단계의 사용은 6'-시알랄락토스 및 다른 중성 올리고당을 엄청나게 비싸게 만든다. 또한, 에탄올의 사용은 특정 종교적 식품 기준, 예를 들면 할랄 (Halal)에서 허용되지 않는다. 따라서, 본 발명은 재조합 가공 보조제를 사용하여 미생물 발효로부터 시알릴락토스를 정제하여 인간 소비에 적합한, 특히 유아용 식품 및 의료 영양 제품에 적합한 시알릴락토스 제품을 생성하기 위한 간단하고 비용 효과적인 방법에 관한 것이다.
정제 공정은 여과에 의한 오염 탄수화물로부터의 시알릴락토스의 정제/분리를 위해 두 개의 상이한 막의 사용을 기반으로 하며 두 개의 막 여과 단계를 포함하고, 여기서 하나의 막은 약 300 내지 약 500 달톤의 분자량 컷오프를 갖고, 다른 막은 약 600 내지 약 800 달톤의 분자량 컷오프를 갖는다.
상세한 설명
다른 탄수화물로부터 시알릴락토스를 정제하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 시알릴락토스 및 상기 다른 탄수화물을 함유하는 수용액을 상이한 막을 사용한 두 개의 막 여과 단계에 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 하나의 막은 약 300 내지 약 500 달톤의 분자량 컷오프를 갖고, 다른 막은 약 600 내지 약 800 달톤의 분자량 컷오프를 갖는다.
약 300 내지 약 500 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 막은 시알릴락토스보다 작은 분자량을 갖는 대량의 탄수화물을 제거할 수 있다. 여과시, SL 및 SL보다 큰 분자량을 갖는 탄수화물이 잔류물에 보유된다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 약 300 내지 약 500 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 막은 1 내지 2 nm의 기공 크기(pore size)를 갖는다.
SL의 분자량보다 작은 분자량 컷오프를 갖는 적합한 막은 - 예를 들면 - TriSep XN-45 (TriSep Corporation, USA), Dairy DK (Suez Water Technologies, 이전에 GE) 및 Filmtech NF270 (Dow)이다.
약 600 내지 약 800 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 막은 시알릴락토스 및 SL보다 작은 분자량을 갖는 탄수화물에 대한 투과성을 갖는다. 여과시, SL은 여액에 존재하는 반면 SL보다 큰 분자량을 갖는 탄수화물은 잔류물에 남아있다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 약 600 내지 약 800 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 막은 2.5 내지 3 nm의 기공 크기를 갖는다.
6-SL에 대한 투과성을 갖고 잔류물에 6-SL보다 큰 분자량을 갖는 탄수화물을 보유하기에 적합한 막은 - 예를 들면 - TangenX SIUS TFF 0.65kDa 막 (Repligen Corporation), Zirkonia 모듈 3nm (Pervatech BV) 및 S-CUT YSNF-YS600 (CUT/Burkert)이다.
상기 방법은 비용이 많이 드는 불연속 크로마토그래피 단계의 사용을 피하고 또한 유기 용매를 사용하는 침전 또는 결정화 단계를 불필요하게 만든다. 따라서, 추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 불연속 크로마토그래피 단계 및/또는 유기 용매를 사용하여 6-SL을 침전 및/또는 결정화하는 하나 이상의 단계를 포함하지 않는다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 수용액은 시알릴락토스의 생산을 위한 발효 또는 효소 공정으로부터 수득된다.
본원에 기술된 방법은, 경제적으로 실행 가능하고 확장 가능하기 때문에, 미생물 발효 또는 생물촉매 반응으로부터 모유 올리고당 3'시알릴락토스 또는 6'-시알릴락토스를 다톤 (multi-ton) 양으로 정제하는데 적합하다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 수용액은 발효로부터 수득되며, 즉, 발효 브로스로부터 바이오매스를 분리함으로써 배양 배지 (발효 브로스)에서 및 미생물 세포가 시알릴락토스를 생산하기에 허용될 수 있는 조건하에서 시알릴락토스를 생산할 수 있는 미생물 세포를 배양하여 수득된다. 바람직하게는, 발효 브로스로부터 바이오매스를 분리하는 것은 적어도 하나의 한외여과 단계, 바람직하게는 두 개의 한외여과 단계, 보다 바람직하게는 약 500 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막을 사용한 제1 한외여과 및 약 150 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막을 사용한 제2 한외여과를 포함한다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 수용액은 바람직하게는 H+ 형태의 양이온 교환 수지 및 바람직하게는 Cl- 형태의 음이온 교환 수지로 처리된다. 바람직하게는, 시알릴락토스 및 기타 탄수화물을 함유하는 수용액은 다른 탄수화물의 제거를 위한 막 여과 단계에 적용하기 전에 이온 교환 수지로 처리된다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 상기 방법은 이온 제거를 위한 투석 단계, 바람직하게는 전기투석 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 시알릴락토스를 함유하는 수용액은 상기 다른 탄수화물이 수용액으로부터 제거된 후 투석 및/또는 전기투석에 적용된다.
제품은 가장 편리하게는 멸균 농축물로서 또는 분무-건조 제품으로서 공급될 수 있다.
상기 방법은 3'-시알릴락토스 또는 6'-시알릴락토스를 정제할 수 있고, 즉 다른 탄수화물로부터 3-SL 또는 6-SL을 분리할 수 있으며, 여기서 수용액에서의 시알릴락토스의 순도는 정제 전에 ≤ 70%, ≤ 60%, ≤ 50%, ≤ 40%, ≤ 30%, ≤ 20%, ≤ 10% 또는 ≤ 5%이고/이거나 수용액은 정제 후 시알릴락토스를 ≥ 80%, 바람직하게는 ≥ 85% 또는 보다 바람직하게는 ≥ 90%의 순도로 함유한다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 정제는 다음의 단계들을 포함한다:
i.) 발효 브로스로부터 바이오매스를 분리하는 단계;
ii.) 하전 물질(charged material)의 제거를 위해 무세포(cell-free) 발효 브로스를 적어도 하나의 이온-교환 수지 처리에, 바람직하게는 음이온-교환 수지 처리 및 양이온-교환 수지 처리에 적용하는 단계;
iii.) 단계 ii.에서 수득된 수용액을 시알릴락토스보다 작은 분자량을 갖는 탄수화물을 제거하기 위해 약 300 내지 약 500 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 막을 사용한 막 여과 단계에 적용하는 단계;
iv.) 단계 iii.에서 수득된 잔류물을 시알릴락토스보다 큰 분자량을 갖는 탄수화물을 제거하기 위해 약 600 내지 약 800 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 막을 사용한 막 여과 단계에 적용하는 단계; 및 - 임의로 -
v.) 단계 iv.의 여액에 존재하는 시알릴락토스의 농도를 증가시키는 단계.
시알릴락토스의 정제에 사용되는 다른 절차들은 다소 복잡하고 이에 따라 비용이 많이 드는 반면 이전에 본원에 기술된 방법은 주로 두 개의 막 여과 단계의 사용에 의존한다.
특정 실시양태는 (염의 제거를 위한) 투석 단계, (하전 분자의 제거를 위한) 전기투석, (생성물 용액의 탈색을 위한) 활성탄 처리 및/또는 (내독소 제거 및/또는 멸균 여과와 같은) 기타 여과 공정과 같은 하나 이상의 추가 단계를 포함한다. 필요하지는 않지만, 공정은 오염 올리고당의 침전을 위해 또는 단쇄 알콜 및 물 혼합물로 활성탄에 흡착 후 용출을 위해 및/또는 시알릴락토스의 결정화를 위해 유기 용매 (예를 들어, 메탄올과 같은 단쇄 알콜)로 시알릴락토스를 함유하는 수용액을 처리하는 것을 포함할 수 있다.
상기 방법으로부터 생성된 수용액은 시알릴락토스를 함유하지만 미생물 세포의 핵산과 폴리펩티드는 포함하지 않는다. 또한, 상기 수용액은 단당류 및/또는 디시알릴락토스를 거의 - 전혀 - 함유하지 않는다.
본 발명은 특정 실시양태와 관련하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 제한되지 않고 청구 범위에 의해서만 제한된다. 더욱이, 설명 및 청구 범위에서 용어 제1, 제2 등은 유사한 요소를 구별하기 위해 사용되며 반드시 시간적으로, 공간적으로, 순위로 또는 임의의 다른 방식으로 순서를 설명하기 위한 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어는 적절한 상황하에서 상호교환 가능하며 본원에 기술된 본 발명의 실시양태는 본원에 기술되거나 예시된 것과는 다른 순서로 작동할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
청구 범위에 사용된 "포함하는 (comprising)"이라는 용어는 이후에 나열된 수단으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 주지해야 한다; 이것은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 따라서 이것은 언급된 바와 같이 진술된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재를 명시하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 구성요소, 또는 이의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 따라서, "수단 A와 B를 포함하는 장치"라는 표현의 범위는 구성요소 A와 B로만 구성된 장치로 제한되어서는 안된다. 이것은 본 발명과 관련하여 장치의 유일한 관련 구성요소가 A와 B임을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "하나의 실시양태 (one embodiment)" 또는 "실시양태 (an embodiment)"에 대한 언급은 실시양태와 관련하여 기술된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서 "하나의 실시양태에서 (in one embodiment)" 또는 "실시양태에서 (in an embodiment)"라는 문구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니지만, 그럴 수도 있다. 더욱이, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시양태에서 본 개시내용으로부터 당업계의 통상의 숙련가에게 명백한 바와 같이 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
유사하게 본 발명의 예시적인 실시양태들의 설명에서, 본 발명의 다양한 특징들은 때때로 개시내용을 간소화하고 하나 이상의 다양한 발명적 측면의 이해를 돕기 위해 단일 실시양태, 도면 또는 설명으로 함께 그룹화된다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 이러한 개시내용의 방법은 청구된 발명이 각 청구 범위에 명시적으로 언급된 것보다 더 많은 특징을 필요로 한다는 의도를 반영하는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 다음의 청구 범위가 반영하는 바와 같이, 발명적 측면은 하나의 전술한 개시된 실시양태의 모든 특징보다 적다. 따라서, 상세한 설명에 뒤따르는 청구 범위는 이 상세한 설명에 명시적으로 통합되며, 각 청구항은 본 발명의 개별 실시양태로서 그 자체로 존재한다.
또한, 본원에 기술된 일부 실시양태는 다른 실시양태에 포함된 일부 특징은 포함하고 다른 특징은 포함하지 않지만, 상이한 실시양태의 특징들의 조합은 본 발명의 범위 내에 있으며 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 상이한 실시양태를 형성하는 것을 의미한다. 예를 들면, 하기 청구항에서, 청구된 실시양태 중 임의의 것은 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
더욱이, 실시양태 중 일부는 컴퓨터 시스템의 프로세서에 의해 또는 기능을 수행하는 다른 수단에 의해 구현될 수 있는 방법으로서 또는 방법의 요소의 조합으로서 본원에 기술된다. 따라서, 이러한 방법 또는 방법의 요소를 수행하는데 필요한 명령을 가진 프로세서는 방법 또는 방법의 요소를 수행하기 위한 수단을 형성한다. 또한, 장치 실시양태의 본원에 기술된 요소는 본 발명을 실시하기 위한 목적으로 요소에 의해 수행되는 기능을 실시하기 위한 수단의 예이다.
본원에 제공된 설명 및 도면에서, 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 그러나, 본 발명의 실시양태는 이러한 특정 세부사항 없이도 실시될 수 있는 것으로 이해된다. 다른 경우, 잘 알려진 방법, 구조 및 기술은 이 설명의 이해를 모호하게 하지 않기 위해 상세히 나타내지 않았다.
본 발명은 이제 본 발명의 몇 가지 실시양태의 상세한 설명에 의해 기술될 것이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 진정한 취지 또는 기술적 교시를 벗어나지 않고 당업계의 숙련가의 지식에 따라 구성될 수 있으며, 본 발명은 첨부된 청구 범위의 조항에 의해서만 제한된다는 것이 자명하다.
실시예
실시예 1. 6'-시알릴락토스의 발효적 생산
포토박테리움 레이오그나티 (photobacterium leiognathi) JT-SHIZ-119로부터 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 유전자 plsT6을 발현하는 재조합 6'-시알릴락토스 합성 대장균 균주 (E. coli BL21 (DE3) △lacZ)를 사용한 6'-시알릴락토스 공급-배치 발효를 수행하였다. CMP-시알산의 생합성을 향상시키기 위해, 대장균으로부터의 글루코사민-6-포스페이트 합성 효소를 암호화하는 유전자 GlmS, 시네코시스티스 균주 (Synechocystis sp.)로부터의 N-아세틸글루코사민 2-에피머라제를 암호화하는 유전자 Slr1975, 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)로부터의 글루코사민 6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자 Gna1, 대장균으로부터의 포스포엔올피루베이트 합성 효소를 암호화하는 유전자 PpsA, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)로부터의 N-아세틸뉴라미네이트 합성 효소를 암호화하는 유전자 NeuB, 및 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)로부터의 CMP-시알산 합성 효소를 암호화하는 유전자 NeuA를 대장균 BL21 (DE3) 숙주에 염색체로 통합시켰다. 또한, 대장균으로부터의 락토스 투과 효소를 암호화하는 유전자 LacY, 대장균 W로부터의 유전자 cscB (수크로스 투과 효소), cscK (프럭토키나제), cscA (수크로스 가수분해 효소) 및 cscR (전사 조절인자)를 통합된 유전자의 전사가 테트라사이클린 프로모터 Ptet 또는 PT5 프로모터로부터의 구성적 프로모터로부터 개시되도록 BL21 게놈에 통합하였다. 유전자 galE (UDP-글루코스-4-에피머라제), galT (갈락토스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제), galK (갈락토키나제), 및 galM (갈락토스-1-에피머라제)로 구성되고 이를 발현하는 기능적 갈-오페론 (gal-operon)을 대장균 K12로부터 BL21 균주의 게놈으로 전달하였다. N-아세틸글루코사민 6-포스페이트의 분해를 방지하기 위해, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제 (NagA), 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 (NagB) 및 N-아세틸글루코사민 특이 PTS 단백질 IIABC (NagE)를 암호화하는 유전자를 박테리아 염색체로부터 결실시켰다. 추가로, 만노스, 글루코스, 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민에 대한 대장균 PTS 시스템의 당 수송체를 암호화하는 오페론 manXYZ 뿐만 아니라 각각 N-아세틸뉴라미네이트 리아제, N-아세틸만노사민 키나제, N-아세틸만노사민-6-포스페이트 에피머라제 및 시알산 수송체를 암호화하는 유전자 nanA, nanK, nanE 및 nanT를 결실시켰다. N-아세틸갈락토사민-6-포스페이트 데아세틸라제를 암호화하는 유전자 (AgaA)를 또한 결실시켰다.
6'-시알릴락토스 생산 대장균 균주를 7 g·l-1 NH4H2PO4, 7 g·l-1 K2HPO4, 2 g·l-1 KOH, 0.3 g·l-1 시트르산, 5 g·l-1 NH4Cl, 1 ml·l-1 소포제(antifoam) (Struktol J673, Schill + Seilacher), 0.1 mM CaCl2, 8 mM MgSO4, 미량 원소 및 탄소 공급원으로서의 2% 수크로스를 포함하는 정의된 무기 염 배지에서 성장시켰다. 미량 원소는 0.101 g·l-1 니트릴로트리아세트산, pH 6.5, 0.056 g·l-1 시트르산철암모늄, 0.01 g·l-1 MnCl2 x 4 H2O, 0.002 g·l-1 CoCl2 x 6 H2O, 0.001 g·l-1 CuCl2 x 2 H2O, 0.002 g·l-1 붕산, 0.009 g·l-1 ZnS04 x 7 H2O, 0.001 g·l-1 Na2Mo04 x 2 H2O, 0.002 g·l-1 Na2Se03, 0.002 g·l-1 NiS04 x 6 H2O로 구성되었다.
수크로스 공급물 (500 g·l- 1)에 8 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, 미량 원소, 및 5 g·l-1 NH4Cl을 보충하였다. 6'-시알릴락토스 형성을 위해, 216 g·l-1의 락토스 공급물을 사용하였다. 배양 배지의 pH는 암모니아 용액 (25 % v/v)을 사용하여 조절하였다. 유가 발효(fed batch fermentation)는 출발 용적을 기준으로 5.5 - 7 ml·l-1·h-1의 수크로스 공급 속도를 적용함으로써 72시간 동안 일정한 통기 및 교반하에 30℃에서 수행하였다. 발효를 시작한지 72시간 후, 첨가된 락토스의 대부분은 6'-시알릴락토스로 전환되었다. 발효 상청액에서 잔류 락토스를 제거하기 위해, β-갈락토시다제를 발효 용기에 첨가하였다.
실시예 2: 무세포 발효 브로스의 제조
세포-매스 (발효 브로스의 약 10%)를 한외여과 (0.05 ㎛ 컷오프) (CUT membrane technology, Erkrath, Germany)에 이은 150kDa의 MWCO를 갖는 필터 (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany)를 사용한 교차-유동 여과(cross-flow filtration)에 의해 배지로부터 분리하였다.
실시예 3: 6 '- 시알릴락토스 -함유 무세포 발효 브로스의 이온 교환 수지 처리
실시예 2로부터 수득된 바와 같은 무세포 발효 브로스는 (건조 중량 기준 9% 순도의) 6'-시알릴락토스를 1000 리터의 용적으로 함유하였으며 양으로 하전된 오염 물질을 제거하기 위해 H+ 형태의 강력한 양이온 교환 수지 (독일 Lanxess 회사로부터 입수한 Lewatit® S2568) 위에 통과시켰다 (이온 교환체(ion exchanger) 상 용적의 크기는 200L이었음). 탈이온수로 이온 교환 수지로부터의 6-SL의 용출을 계속하였다. 그후 수득된 용액을 수산화나트륨 용액의 첨가에 의해 pH 7로 설정하였다. 그후 용액을 (지연없이) 음이온성 이온 교환체 컬럼 위에 통과시켰다 (이온 교환체의 상 용적은 200L이었음). 사용된 강력한 음이온성 이온 교환체 Lewatit® S6368 A (Lanxess, Germany)는 염화물 (Cl-) 형태였다. 탈이온수로 6-SL의 용출을 계속하였다. 수득된 용액을 다시 pH 7로 중화시켰다.
실시예 4: 보다 작은 분자/탄수화물의 제거를 위한 1차 여과
실시예 3에 제시된 이온 교환 수지 처리에 의해 수득된 용액을 TriSep XN-45 (TriSep Corporation, USA) 나노여과 막 및 500 L의 탈이온수를 사용하여 정용여과하였다. 생성된 용액을 나노여과 막 (RE 8040-BE, CSM-Saehan)을 사용하여 추가로 농축시켰으며, 여기서 31% (건조 중량 기준)의 순도 및 8 mS/cm의 전도도를 갖는 6'-시알릴락토스 용액이 수득되었다.
실시예 5: 보다 큰 분자/탄수화물의 제거를 위한 2차 여과
6'-시알릴락토스를 발효적으로 생산된 부산물인 디시알릴락토스로부터 분리하기 위해 2차 막 처리를 사용하였다. 공칭 컷오프(nominal cut-off)가 0.65kDa인 TangenX SIUS TFF 막 (Repligen Corporation)을 여과에 사용하였다. 94.4% 6'-시알릴락토스 및 6.6% 디시알릴락토스 (비율 15:1)를 함유하는 용액을 기술된 시스템으로 교차-유동 여과하고 6'-시알릴락토스 및 디시알릴락토스의 농도를 투과물 및 잔류물 내부에서 결정하였다. 결과는 투과물 내의 디시알릴락토스 양은 6.6%에서 0.2%로 유의하게 감소 (6'-시알릴락토스 대 디시알릴락토스의 비율은 55:1이었다)한 반면 잔류물 내의 6'-시알릴락토스 대 디시알릴락토스의 비율은 14:1이었음을 보여준다. 이 결과는 6'-시알릴락토스가 추가 여과 단계를 사용함으로써 디시알릴락토스로부터 분리될 수 있음을 보여준다. 이러한 관찰은 또한 다른 공급업체로부터의 유사한 컷오프를 갖는 제2 종류의 막을 사용함으로써 나타날 수 있다. 600-800 Da의 공칭 컷오프를 갖는 S-CUT YSNF-YS600-2540-M46D-ATD 막 (CUT Membrane Technology GmbH)을 사용함으로써 6'-시알릴락토스가 또한 교차-유동 여과에 의해 디시알릴락토스로부터 분리되었다.
실시예 6: 전기투석 처리
실시예 5에서 수득된 투과물을 PC-Cell ED 1000H 막 스택(membrane stack)이 장착된 PC-Cell 15 전기투석 장치 (PC-Cell, Heusweiler, Germany)를 사용하여 2 mS/cm로 전기투석하였다. 이러한 막 스택에는 다음과 같은 막이 장착되었다: 양이온 교환 막 CEM: PK SK 및 크기 배제 한계(size exclusion limit)가 60 Da인 음이온 교환 막 AEM:PcAcid60. 0.025M 설팜산 (아미도설폰산) 용액을 전기투석 공정에서 전해질로서 사용하였다. 전기투석 후 6'시알릴락토스를 83% (건조 중량 기준)의 순도로 함유하는 용액이 수득되었다. 전기투석 처리 대신 정용여과 공정이 사용될 수 있다.
실시예 7: 농축 및 활성탄 처리
역삼투 필터 및 45℃에서의 회전 증발을 사용하여 수용액으로부터 약간의 물을 제거하여 25% (m/v) 6'-시알릴락토스 용액을 수득하였다. 그후 생성된 수용액을 활성탄 (Norit SA2)으로 처리하였다. 1L 25% (m/v) 6'-시알릴락토스에 대해 125g 활성탄이 사용되었다.
실시예 8: 멸균 여과 및 내독소 제거
후속적으로, 실시예 7에서 수득된 용액을 6 kDa 필터 (Pall Microza 한외여과 중공 섬유 모듈 SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Germany)에 통과시켜 멸균 여과에 적용하였다. 그후 멸균 용액을 분무-건조될 때까지 RT에서 저장하였다.
실시예 9: 6'-시알릴락토스의 분무-건조
그후 이렇게 수득된 (실시예 8) 멸균 6'-시알릴락토스를 NUBILOSA LTC-GMP 분무 건조기 (NUBILOSA, Konstanz, Germany)를 사용하여 분무-건조시켰다. 6'-시알릴락토스의 분무-건조를 위해 용액을 130℃로 설정된 분무 건조기 노즐을 통해 3.5 bar의 압력하에 통과시키고 배출 온도를 67℃ 내지 69℃로 유지하도록 유동을 조절하였다. 이러한 설정을 사용하여 수분이 9% 미만인 분무-건조된 분말을 수득할 수 있었다. 수분 함량은 Karl-Fischer 적정에 의해 측정하였다.
실시예 10: 6'-시알릴락토스의 LC-MS/MS 분석
정량화를 위해 LC Triple-Quadrupole MS 검출 시스템을 사용하여 MRM (다중 반응 모니터링)에 의해 질량 분광법 분석을 수행하였다. 전구체 이온을 사중극자 1에서 선택 및 분석하고, 아르곤을 CID 가스로 사용하여 충돌 세포에서 단편화를 일으키고, 단편 이온의 선택을 사중극자 3에서 수행한다. 당류의 크로마토그래피 분리는 XBridge Amide 가드 카트리지(guard catridge) (3.5 ㎛, 2.1 x 10mm) (Waters, USA)를 갖는 XBridge Amide HPLC 컬럼 (3.5 ㎛, 2.1 x 50 mm (Waters, USA)) 상에서 수행하였다. HPLC 시스템의 컬럼 오븐 온도는 50℃였다. 이동상은 아세토니트릴/10mM 아세트산암모늄을 갖는 H2O로 구성되었다. 1 μl 샘플을 기기에 주입하였다; 실행은 400 μl/min의 유속으로 3.60 min 동안 수행하였다. 6'-시알릴락토스를 ESI 양이온화 모드에서 MRM에 의해 분석하였다. 질량 분광계는 단위 분해능(unit resolution)으로 작동하였다. 시알릴락토스는 m/z 656.2 [M+Na]의 이온을 형성한다. 시알릴락토스의 전구체 이온은 충돌 세포에서 단편 이온 m/z 612.15, m/z 365.15 및 m/z 314.15로 추가로 단편화되었다. 충돌 에너지, Q1 및 Q3 Pre Bias를 각 분석물에 대해 개별적으로 최적화하였다. 정량화 방법은 상업적으로 이용 가능한 표준 (Carbosynth, Compton, UK)을 사용하여 확립하였다.

Claims (8)

  1. 시알릴락토스 및 다른 탄수화물을 함유하는 수용액을 상이한 막을 사용한 두 개의 막 여과 단계에 적용하는 단계로서, 여기서,
    - 하나의 막은 약 300 내지 약 500 달톤의 분자량 컷오프를 갖고
    - 다른 막은 약 600 내지 약 800 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 다른 탄수화물로부터 시알릴락토스를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 수용액이 시알릴락토스의 생산을 위한 발효 또는 효소적 공정으로부터 수득되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 수용액이 발효 브로스(fermentation broth)로부터 바이오매스(biomass)를 분리함으로써 발효로부터 수득되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 발효 브로스로부터의 바이오매스의 분리가 적어도 하나의 한외여과 단계, 바람직하게는 두 개의 한외여과 단계, 보다 바람직하게는 약 500 kDa의 분자량 컷오프(molecular weight cut-off)를 갖는 막을 사용한 제1 한외여과 및 약 150 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막을 사용한 제2 한외여과를 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 시알릴락토스를 함유하는 수용액이 바람직하게는 H+ 형태의 양이온 교환 수지 및 바람직하게는 Cl- 형태의 음이온 교환 수지로, 보다 바람직하게는 수용액을 막 여과 단계에 적용하기 전에, 처리되는 방법.
  6. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 투석, 바람직하게는 전기투석 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 수용액에서의 시알릴락토스의 순도가 정제 전에 ≤ 70%, ≤ 60%, ≤ 50%, ≤ 40%, ≤ 30%, ≤ 20%, ≤ 10% 또는 ≤ 5%이고/이거나 수용액이 정제 후 시알릴락토스를 ≥ 80%, 바람직하게는 ≥ 85% 또는 보다 바람직하게는 ≥ 90%의 순도로 함유하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 시알릴락토스가 3'-시알릴락토스 또는 6'-시알릴락토스인 방법.
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