BR112020024463A2

BR112020024463A2 - Método simples para a purificação de uma sialil-lactose

Info

Publication number: BR112020024463A2
Application number: BR112020024463-5A
Authority: BR
Inventors: Stefan Jennewein; Markus HELFRICH; Benedikt Engels
Original assignee: Jennewein Biotechnologie Gmbh
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2021-03-16
Also published as: JP7356460B2; SG11202011734QA; AU2019276095A1; EP3801037A1; FI3801037T3; WO2019229118A1; JP2021526024A; CN112203519A; KR20210025007A; EP3801037B1; PL3801037T3; PH12020552067A1; US20210212335A1; CN112203519B; ES2933959T3; MX2020012855A; AU2019276095B2

Abstract

método simples para a purificação de uma sialil-lactose. é fornecido um método para a purificação de uma sialil-lactose de outros carboidratos, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de submeter uma solução aquosa contendo a sialil-lactose à duas etapas de filtração por membrana usando diferentes membranas, uma membrana tendo um corte de peso molecular entre cerca de 300 dalton a cerca de 500 dalton e uma membrana tendo um corte de peso molecular entre cerca de 600 dalton a cerca de 800 dalton.

Description

MÉTODO SIMPLES PARA A PURIFICAÇÃO DE UMA SIALIL-LACTOSE CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um processo para a purificação de uma sialil-lactose. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um processo simples e econômico para separar uma sialil-lactose de outros carboidratos tais como lactose e monossacarídeos bem como oligossacarídeos maiores, tais como disialil-lactose, que podem estar presentes como carboidratos contaminantes em um caldo de fermentação, se a referida sialil- lactose for produzida por fermentação microbiana.

ANTECEDENTES

[002] O leite humano é considerado como a melhor dieta para o desenvolvimento de um bebê. O mesmo é composto de gorduras, proteínas, vitaminas, minerais, vestígios de elementos e oligossacarídeos complexos. Além de lactose, o leite humano - bem como leite de outros mamíferos - contém vários oligossacarídeos estruturalmente diversos que são também conhecidos como oligossacarídeos de leite humano (HMOs) (Usashima T. et al., (2011) Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, New York, ISBN 978-1-61122-831-1). Dentre os HMOs, os HMOs sialilados (SHMOs) foram observados como suporte para a resistência às bactérias e vírus enteropatogênicos. Interessantemente, estudos recentes demonstraram adicionalmente um efeito protetor de SHMOs de cadeia longa contra enterocolite necrosante, que é uma das doenças mais comuns e letais em bebês prematuros. Além disso, acredita-se que os SHMOs dão suporte a um desenvolvimento cerebral do bebê e suas capacidades cognitivas. Ademais, os oligossacarídeos sialilados demonstraram neutralizar as enterotoxinas de vários micróbios patogênicos incluindo Escherichia coli, Vibrio cholerae e Salmonella. Adicionalmente, foi constatado que os oligossacarídeos sialilados interferem na colonização do intestino por Helicobacter pylori e, por meio disso, impedem ou inibem úlceras gástricas e duodenais.

[003] Dentre os oligossacarídeos sialilados, a 3’-sialil-lactose e a 6’-sialil- lactose são os membros mais abundantes em leite humano.

[004] Uma vez que os oligossacarídeos sialilados têm uma estrutura complexa, suas sínteses químicas ou (quimio)enzimáticas são desafiadoras e associadas à dificuldades extensivas, por exemplo controle de estereoquímica, formação de ligações específicas, disponibilidade de matérias-primas etc. Como uma consequência, os oligossacarídeos sialilados comercialmente disponíveis têm sido muito dispendiosos devido à sua baixa quantidade em recursos naturais.

[005] Desse modo, têm sido empregados esforços em engenharia metabólica de microrganismos para produzir oligossacarídeos sialilados, uma vez que essa abordagem é a maneira mais promissora para produzir HMOs em uma escala industrial. Para a produção de SHMOs por fermentação microbiana, o microrganismo é tipicamente cultivado na presença de ácido siálico exógeno.

[006] As Publicações Internacionais WO 2007/101862 A1 e WO 2014/153252 A1 revelam métodos e composições para engenharia de bactéria para produzir oligossacarídeos sialilados. No entanto, a produção fermentativa de 6'-sialil-lactose é conhecida por ser associada pela biossíntese de outros carboidratos tais como disialil-lactose (Drouillard, S. et al. (2010) Efficient synthesis of 6'-sialyllactose, 6,6'-disialyllactose, and 6'-KDO-lactose by metabolically engineered E. coli expressing a multifunctional sialyltransferase from the Photobacterium sp. JT-ISH-224. Carbohydrate Research 345: 1394- 1399), que é gerada de 6'-sialil-lactose devido à atividade da sialiltransferase sendo expressa nas bactérias geneticamente modificadas. Além disso, a autoclave (termotratramento) de carboidratos (por exemplo, lactose) leva à formação de subprodutos indesejados tais como produtos de aldol ou Maillard,

ou reações de rearranjo (por exemplo, conversão de lactose à lactulose). A presença de tais contaminantes no produto final, em particular, em quantidades maiores, é indesejada ou ainda inaceitável.

[007] Além disso, o uso de bactérias geneticamente modificadas para produzir oligossacarídeos resulta na contaminação do caldo de fermentação com material recombinante tal como moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos resultantes do microrganismo. No entanto, a contaminação de um produto para consumo humano com DNA recombinante ou proteínas não é aceitável por autoridades regulatórias nem por consumidores atualmente. Desse modo, quaisquer ácidos nucleicos e proteínas resultantes do microrganismo recombinante precisam ser removidos do oligossacarídeo de leite humano desejado. Os limites de detecção para moléculas de DNA recombinante são muito baixos atualmente, o que requer esquemas de purificação completa. No caso de detecção de DNA à base de qPCR, até mesmo tão pouco quanto uma única molécula de DNA pode ser detectada em uma amostra.

[008] Os processos do “estado da técnica” para purificar oligossacarídeos individuais de um caldo de fermentação são tecnicamente complexos e frequentemente dispendiosos, em particular, quando o referido oligossacarídeo é destinado para uso em aplicações alimentícias. Para a purificação da lactose ou sacarose de dissacarídeo demisturas complexas tais como soro do leite ou melaços, processos em escala industrial têm sido desenvolvidos, os quais envolvem múltiplas etapas de cristalização. No entanto, os referidos métodos são elaborados e conduzem apenas a baixos rendimentos. Ademais, esses processos não são aplicáveis para renderizar um oligossacarídeo obtido por fermentação microbiana adequado para uso na indústria alimentícia, tal como um caldo de fermentação - além de soro do leite e melaços - já não é um produto alimentício.

[009] No entanto, os processos de filtração como ultrafiltração,

microfiltração e nanofiltração são tecnicamente fáceis de realizar, se todos os parâmetros de processo forem conhecidos e otimizados. A diafiltração é um outro processo adequado que envolve a adição de água fresca a uma solução a fim de remover componentes permeáveis à membrana. A ultrafiltração e a microfiltração são geralmente usadas para separar moléculas muito maiores como proteínas ou células de um caldo de fermentação ou uma solução aquosa. Adicionalmente, a remoção de água, minerais e moléculas muito pequenas por nanofiltração é bem conhecida e usada na indústria de laticínios para a concentração e a desmineralização de soro do leite. Na maioria dos casos, os materiais de membrana para base de nano e ultrafiltração em materiais como piperazina, poliamida, polietersulfona, polietilenoglicol e cerâmica. As membranas podem ser montadas, por exemplo, como módulos de fibra oca, módulos enrolados em espiral e membranas de lâmina lisa e a montagem pode levar a diferentes desempenhos de separação. Em geral, as membranas de nanofiltração possuem um corte de peso molecular na faixa de 150-300 Daltons. As membranas com corte de peso molecular na faixa de 400-600 Daltons são muito raras, especialmente para a produção industrial em larga escala. Isso torna a separação de oligossacarídeos ainda complexa devido ao fato de que outras técnicas de separação como uma cromatografia, seja em batelada ou continuamente, são necessárias.

[010] Enquanto a cromatografia por filtração com gel é um método em escala laboratorial conveniente, apenas a cromatografia de leito móvel simulada representa um método adequado para purificação de 6-SL em escalas compatíveis com a produção de alimento. No entanto, todos os outros processos publicados sofrem do problema em que os carboidratos contaminantes não podem ser removidos do produto desejado de modo eficaz.

[011] Portanto, foi um objetivo da presente invenção fornecer um método simples e custo-eficiente para a purificação de uma sialil-lactose de fermentações microbianas, em que os ácidos nucleicos e os polipeptídeos originados do microrganismo recombinante podem ser removidos do oligossacarídeo desejado bem como dos outros carboidratos referidos.

SUMÁRIO

[012] É fornecido um método para a purificação de uma sialil-lactose que é simples, custo-eficiente e escalonável. O método para a purificação de uma sialil- lactose pode ser realizado sem o uso de um solvente orgânico para cristalização da referida sialil-lactose. Além disso, o método para a purificação de uma sialil- lactose pode ser realizado sem uma etapa cromatográfica descontínua.

[013] As sialil-lactoses representam oligossacarídeos de leite humano cuja inclusão em fórmula para bebês e alimento medicinal é altamente desejável. O alto custo de sialil-lactoses impede seu uso generalizado, em particular, em fórmula para bebês. Em particular, a purificação de produtos de fermentação microbiana é frequentemente elaborada e dispendiosa. Ademais, o uso de solventes orgânicos e etapas de cromatografia descontínuas tornam a 6'-sialil- lactose e outros oligossacarídeos neutros inviavelmente dispendiosos. Ademais, o uso de etanol não é aceitável por certos padrões alimentares religiosos, por exemplo, Halal. Desse modo, a invenção se refere a um método simples e custo- eficiente para purificar uma sialil-lactose de fermentação microbiana usando um auxiliar de processamento recombinante, produzindo um produto de sialil- lactose adequado para consumo humano, em particular, adequado para alimento para bebês e produtos nutricionais médicos.

[014] O processo de purificação é baseado no uso de duas membranas diferentes para a purificação/separação de uma sialil-lactose de contaminantes de carboidratos por meio de filtração e compreende duas etapas de filtração por membrana, em que uma membrana tem um corte de peso molecular entre cerca de 300 e cerca de 500 Dalton, e em que a outra membrana tem um corte de peso molecular entre cerca de 600 a cerca de 800 Dalton.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[015] É fornecido um método para a purificação de uma sialil-lactose de outros carboidratos, em que o método compreende as etapas de submeter uma solução aquosa contendo uma sialil-lactose e os outros carboidratos referidos à duas etapas de filtração por membrana usando diferentes membranas, em que uma membrana tem um corte de peso molecular entre cerca de 300 a cerca de 500 Dalton, e em que a outra membrana como um corte de peso molecular entre cerca de 600 a cerca de 800 Dalton.

[016] A membrana tendo um corte de peso molecular entre cerca de 300 a cerca de 500 Dalton permite a remoção do volume de carboidratos tendo um peso molecular que é menor que o peso molecular de uma sialil-lactose. Mediante a filtração, SL e carboidratos tendo um peso molecular maior que o peso molecular de SL são retidos no retentado.

[017] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a membrana tendo um corte de peso molecular entre cerca de 300 a cerca de 500 Dalton tem um tamanho de poro de 1 a 2 nm.

[018] Membranas adequadas tendo um corte de peso molecular que é menor que o peso molecular de SL são - por exemplo - TriSep XN-45 (TriSep Corporation, EUA), Dairy DK (Suez Water Technologies, anteriormente, GE) e Filmtech NF270 (Dow).

[019] A membrana tendo um corte de peso molecular entre cerca de 600 a cerca de 800 Dalton possui permeabilidade para sialil-lactose e carboidratos tendo um peso molecular menor que o peso molecular de SL. Mediante a filtração, SL está presente no filtrado enquanto carboidratos tendo um peso molecular maior que o peso molecular de SL permanecem no retentado.

[020] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a membrana tendo um corte de peso molecular entre cerca de 600 a cerca de 800 Dalton tem um tamanho de poro de 2,5 a 3 nm.

[021] Membranas adequadas por possuir permeabilidade para 6-SL e que retêm carboidratos tendo um peso molecular maior que o peso molecular de 6- SL no retentado são - por exemplo - membrana de 0,65 kDa TangenX SIUS TFF (Repligen Corporation), módulos de Zircônia de 3 nm (Pervatech BV) e S-CUT YSNF-YS600 (CUT/Bürkert).

[022] O método abrange o uso de etapas cromatográficas dispendiosas e descontínuas e também torna etapas de precipitação ou cristalização usando solventes orgânicos desnecessários. Desse modo, em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o método não compreende uma ou mais etapas de cromatografia descontínuas e/ou uma ou mais etapas de precipitação e/ou cristalização de 6-SL através do uso de um solvente orgânico.

[023] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a solução aquosa é obtida de uma fermentação ou processo enzimático para a produção de uma sialil-lactose.

[024] O método descrito na presente invenção é adequado para a purificação dos oligossacarídeos 3’-sialil-lactose ou 6'-sialil-lactose de leite humano de uma fermentação microbiana ou reação de biocatálise em quantidades de múltiplas toneladas, devido ao fato de que é economicamente viável e escalonável.

[025] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a solução aquosa é obtida de uma fermentação, isto é, cultivando células microbianas que são capazes de produzir uma sialil-lactose em um meio de cultura (caldo de fermentação) e sob condições que são permissivas para as células microbianas para produzir a sialil-lactose, ao separar a biomassa do caldo de fermentação.

Preferencialmente, separar a biomassa do caldo de fermentação compreende pelo menos uma etapa de ultrafiltração, preferencialmente duas etapas de ultrafiltração, mais preferencialmente uma primeira ultrafiltração usando uma membrana tendo um corte de peso molecular de cerca de 500 kDa e uma segunda ultrafiltração usando uma membrana tendo um corte de peso molecular de cerca de 150 kDa.

[026] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a solução aquosa é tratada com uma resina de troca catiônica, preferencialmente na forma de H+, e com uma resina de troca aniônica, preferencialmente na forma de Cl-. Preferencialmente, a solução aquosa contendo a sialil-lactose e outros carboidratos é tratada com resinas de troca iônica antes de ser submetida a etapas de filtração por membrana para remoção de outros carboidratos.

[027] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o método compreende adicionalmente uma etapa de diálise, preferencialmente, uma etapa de eletrodiálise, para remoção de íons. Preferencialmente, a solução aquosa contendo a sialil-lactose é submetida à diálise e/ou eletrodiálise após os outros carboidratos referidos terem sido removidos da solução aquosa.

[028] O produto pode ser suprido mais convenientemente como um concentrado estéril ou como um produto de secagem por pulverização.

[029] O método permite purificar 3’-sialil-lactose ou 6’-sialil-lactose, isto é, separar 3-SL ou 6-SL de outros carboidratos, em que a pureza da sialil-lactose na solução aquosa é ≤ 70 %, ≤ 60 %, ≤ 50 %, ≤ 40 %, ≤ 30 %, ≤ 20 %; ≤ 10 % ou ≤ 5 % antes da purificação e/ou a solução aquosa contém a sialil-lactose a uma pureza de ≥ 80 %, preferencialmente de ≥ 85 % ou mais preferencialmente ≥ 90 % após a purificação.

[030] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a purificação compreende as seguintes etapas:

i.) separar a biomassa do caldo de fermentação; ii.) submeter o caldo de fermentação livre de célula a pelo menos um tratamento de resina de troca iônica para a remoção de material carregado, preferencialmente a um tratamento de resina de troca aniônica e a um tratamento de resina de troca catiônica; iii.) submeter a solução aquosa obtida na etapa ii. a uma etapa de filtração por membrana usando uma membrana tendo um corte de peso molecular de cerca de 300 a cerca de 500 Dalton para remover carboidratos tendo um peso molecular menor que o peso molecular de uma sialil-lactose; iv.) submeter o retentado obtido na etapa iii. a uma etapa de filtração por membrana usando uma membrana tendo um corte de peso molecular de cerca de 600 a cerca de 800 Dalton para remover carboidratos tendo um peso molecular maior que o peso molecular de uma sialil-lactose; e - opcionalmente - v.) aumentar a concentração da sialil-lactose presente no filtrado da etapa iv.

[031] Enquanto outros procedimentos usados para a purificação de sialil- lactose são bastante complexos e, portanto, dispendiosos, o método descrito anteriormente na presente invenção depende principalmente do uso de duas etapas de filtração por membrana.

[032] Certas modalidades compreendem uma ou mais etapas adicionais, tais como etapas de diálise (para a remoção de sais), eletrodiálise (para a remoção de moléculas carregadas), tratamento com carvão ativado (para a descoloração da solução de produto) e/ou outros processo de filtração (como remoção por endotoxina e/ou filtração estéril). Embora não seja necessário, o processo pode compreender tratamento da solução aquosa contendo a sialil- lactose com um solvente orgânico (tais como álcoois de cadeia curta como metanol) para a precipitação de oligossacarídeos contaminantes ou para eluição após adsorção a carvão ativado com álcoois de cadeia curta e misturas de água e/ou para a cristalização da sialil-lactose.

[033] A solução aquosa resultante do método contém a sialil-lactose, mas não ácidos nucleicos e polipeptídeos das células microbianas. Além disso, a referida solução aquosa dificilmente – se de fato – contém monossacarídeos e/ou disialil-lactose.

[034] A presente invenção será descrita em relação a modalidades particulares, mas a invenção não é limitada às mesmas, mas apenas pelas reivindicações. Adicionalmente, os termos primeiro, segundo e similares na descrição e nas reivindicações são usados para distinguir entre elementos similares e, não necessariamente, para descrever uma sequência temporal, espacialmente, em classificação ou de qualquer outra maneira. Deve ser entendido que os termos assim usados são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que as modalidades da presente invenção descritas na presente invenção são capazes de operar em outras sequências que não descritas ou ilustradas na presente invenção.

[035] Deve ser notado que o termo “compreender”, usado nas reivindicações, não deve ser interpretado como sendo restrito aos significados listados posteriormente; não exclui outros elementos ou etapas. Desse modo, deve ser interpretado como especificando a presença dos recursos apresentados, números inteiros, etapas ou componentes conforme referidos, mas não impede a presença ou adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas ou componentes ou grupos dos mesmos. Desse modo, o escopo da expressão “um dispositivo compreendendo meios A e B” não deve ser limitado a dispositivos que consistem apenas de componentes A e B. Isso significa que, em relação à presente invenção, apenas os componentes relevantes do dispositivo são A e B.

[036] A referência ao longo deste relatório descritivo à “uma (numeral) modalidade” ou “uma (artigo indefinido) modalidade” significa que um aspecto, estrutura ou característica particular descrito em conjunto com a modalidade é incluído em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Desse modo, a ocorrência das expressões “em uma (numeral) modalidade” ou “em uma (artigo indefinido) modalidade” em vários locais ao longo deste relatório descritivo não estão necessariamente todos se referindo à mesma modalidade, mas podem. Adicionalmente, os aspectos, estruturas ou características particulares podem ser combinados de qualquer maneira adequada, conforme estaria evidente para um elemento de habilidade comum no estado da técnica desta presente invenção, em uma ou mais modalidades.

[037] Similarmente, deve ser observado que, na descrição de modalidades exempliares da presente invenção, vários aspectos da presente invenção são às vezes agrupados juntos em uma única modalidade, figura ou descrição da mesma para o propósito de simplificar a presente invenção e auxiliar no entendimento de um ou mais dos vários aspectos inventivos. Esse método da presente invenção não deve, no entanto, ser interpretado como refletindo uma intenção de que a invenção reivindicada requer mais aspectos do que são expressamente mencionados em cada reivindicação. Preferivelmente, conforme refletido pelas seguintes reivindicações, os aspectos inventivos residem em menos que todos os aspectos de uma única modalidade revelada supracitada. Desse modo, as reivindicações seguintes à descrição detalhada são incorporadas expressamente pela presente invenção nessa descrição detalhada, com cada reivindicação representando a si mesma como uma modalidade separada da presente invenção.

[038] Adicionalmente, embora algumas modalidades descritas na presente invenção incluam alguns, mas não todos os aspectos incluídos em outras modalidades, combinações de aspectos de diferentes modalidades devem estar incluídos escopo da invenção, e formam diferentes modalidades, como poderia ser entendido pelos técnicos no assunto. Por exemplo, nas seguintes reivindicações, qualquer uma das modalidades pode ser usada em qualquer combinação.

[039] Adicionalmente, algumas das modalidades são descritas na presente invenção como um método ou combinação de elementos de um método que pode ser implementado por um processador de um sistema computacional ou por outros meios de execução da função. Desse modo, um processador com as instruções necessárias para executar tal método ou elemento de um método forma um meio para executar o método ou elemento de um método. Adicionalmente, um elemento descrito na presente invenção de uma modalidade de aparelho é um exemplo de um meio para executar a função realizada pelo elemento com o propósito de executar a presente invenção.

[040] Na descrição e nos desenhos fornecidos na presente invenção, inúmeros detalhes específicos são apresentados. No entanto, é entendido que as modalidades da invenção podem ser praticadas sem esses detalhes específicos. Em outros casos, métodos, estruturas e técnicas bem conhecidas não foram mostrados em detalhe a fim de não atrapalhar um entendimento da pesente invenção.

[041] A invenção será descrita agora por uma descrição detalhada de várias modalidades da invenção. É claro que outras modalidades da invenção podem ser configuradas de acordo com o conhecimento de técnicos no assunto sem que se afaste do verdadeiro espírito ou ensinamento técnico da invenção, a invenção sendo limitada apenas pelos termos das reivindicações anexas.

EXEMPLOS Exemplo 1. Produção fermentativa de 6'-sialil-lactose

[042] Uma fermentação por alimentação em batelada de 6'-sialil-lactose que emprega uma 6'-sialil-lactose recombinante que sintetiza cepa de E. coli (E. coli BL21(DE3) ΔlacZ) que expressa o gene de α-2,6-sialiltransferase plsT6 de Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-119 foi realizada.

Para melhorar a biossíntese de CMP-ácido siálico, os genes que codificam a glucosamina-6-fosfato sintase GlmS de E. coli, a N-acetilglucosamina 2-epimerase Slr1975 de Synechocystis sp., a glucosamina 6-fosfato N-acetiltransferase Gna1 de Saccharomyces cerevisiae, a fosfoenolpiruvato sintase PpsA de E. coli, a N-acetilneuraminato sintase NeuB e a CMP-ácido siálico sintetase NeuA, as últimas de Campylobacter jejuni, foram cromossomicamente integrados no hospedeiro de E. coli BL21(DE3). Adicionalmente, o gene que codifica a lactose permease LacY de E. coli e os genes cscB (sacarose permease), cscK (frutoquinase), cscA (sacarose hidrolase) e cscR (regulador de transcrição) de E. coli W foram integrados no genoma de BL21 tal que a transcrição dos genes integrados é iniciada de promotores constitutivos, do promotor tetraciclina Ptet ou do promotor PT5. Um operon gal funcional que consiste de e expressão dos genes galE (UDP-glicose-4-epimerase), galT (galactose-1- fosfato uridililtransferase), galK (galactoquinase), e galM (galactose-1-epimerase) foi transferido de E. coli K12 para o genoma da cepa BL21. Para prevenir a degradação de N-acetilglucosamina 6-fosfato, os genes que codificam N-acetilglucosamina-6-fosfato desacetilase (NagA), glucosamina-6- fosfato desaminase (NagB) e a proteína PTS IIABC específica de N- acetilglucosamina (NagE) foram deletados do cromossomo bacteriano.

Outrossim, o operon manXYZ, que codifica um transportador de açúcar do sistema PTS de E. coli para manose, glicose, glucosamina e N-acetilglucosamina, foi deletado, bem como os genes nanA, nanK, nanE e nanT, que codificam a N- acetilneuraminato liase, a N-acetilmanosamina quinase, a N-acetilmanosamina- 6-fosfato epimerase e o transportador de ácido siálico, respectivamente.

O gene que codifica a N-acetilgalactosamina-6-fosfato desacetilase (AgaA) também foi deletado.

[043] A cepa de E. coli que produz 6'-sialil-lactose foi crescida em um meio definido de sais minerais, compreendendo 7 gL-1 de NH4H2PO4, 7 g.L-1 de K2HPO4, 2 gL-1 de KOH, 0,3 gL-1 de ácido cítrico, 5 gL-1 de NH4CI, 1 mLL-1 de antiespumante (Struktol J673, Schill + Seilacher), 0,1 mM de CaCl2, 8 mM de MgSO4, vestígios de elementos e a sacarose a 2% como fonte de carbono. Os vestígios de elementos consistiram em 0,101 gL-1 de ácido nitrilotriacético, pH 6,5, 0,056 gL-1 de citrato férrico de amônio, 0,01 gL-1 de MnCl2 x 4 H2O, 0,002 gL-1 de CoCl2 x 6 H20, 0,001 gL-1 de CuCI2 x 2 H20, 0,002 gL-1 de ácido bórico, 0,009 g.L-1 de ZnSO4 x 7 H20, 0,001 gL-1 de Na2MoO4 x 2 H20, 0,002 gL-1 de Na2SeO3, 0,002 gL-1 de NiSO4 x 6 H20.

[044] A alimentação de sacarose (500 g.L-1) foi suplementada com 8 mM de MgSO4, 0,1 mM de CaCl2, vestígios de elementos e 5 gL-1 de NH4CI. Para formação de 6'-sialil-lactose, uma alimentação de lactose de 216 gL-1 foi empregada. O pH do meio de cultura foi controlado pelo uso de solução de amônia (25% v/v). A fermentação alimentada por batelada foi conduzida a 30 °C sob aeração constante e agitação por 72 horas pela aplicação de uma taxa de alimentação de sacarose de 5,5 - 7 mlL-1h-1, referindo-se ao volume inicial. Em 72 horas após o início da fermentação, a maior parte da lactose adicionada foi convertida em 6'-sialil-lactose. A fim de remover lactose residual no sobrenadante de fermentação, β-galactosidase foi adicionada ao recipiente de fermentação. Exemplo 2: Preparação de um caldo de fermentação livre de célula

[045] A massa celular (cerca de 10% do caldo de fermentação) foi separada do meio por ultrafiltração (0,05 μm de corte) (CUT membrane technology, Erkrath, Alemanha) seguido por filtrações de fluxo cruzado usando um filtro tendo um MWCO de 150 kDa (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Alemanha). Exemplo 3: Tratamento com resina de troca iônica de um caldo de fermentação livre de célula contendo 6'-sialil-lactose

[046] O caldo de fermentação livre de célula conforme obtido do Exemplo 2 conteve 6'-sialil-lactose (a uma pureza de 9 % em peso seco) em um volume de 1000 litros e foi passado por um resina de troca iônica catiônica forte (Lewatit® S2568 obtida junto à empresa Lanxess, Alemanha) em forma de H+ a fim de remover contaminantes de carga positiva (tamanho do volume do leito trocador de íon foi 200 L). A eluição de 6-SL da resina de troca iônica foi continuada com água deionizada. A solução obtida foi, então, ajustada para pH 7 pela adição de solução de hidróxido de sódio. A solução foi, então, (sem atraso) passada por uma coluna de trocador iônico aniônico (volume do leito do trocador iônico foi 200 L). O trocador iônico aniônico forte usado Lewatit® S6368 A (Lanxess, Alemanha) estava na forma de cloreto (Cl-). A eluição de 6-SL foi continuada com água deionizada. A solução obtida foi novamente neutralizada para pH 7. Exemplo 4: Primeira filtração para a remoção de moléculas/carboidratos menores

[047] A solução obtida por tratamento com resina de troca iônica apresentado no Exemplo 3 foi diafiltrada usando uma membrana de nanofiltração TriSep XN-45 (TriSep Corporation, EUA) e 500 L de água deionizada. A solução resultante foi adicionalmente concentrada usando a membrana de nanofiltração (RE 8040-BE, CSM-Saehan) em que uma solução de 6'-sialil-lactose com uma pureza de 31 % (em peso seco) e uma condutividade de 8 mS/cm foi obtida. Exemplo 5: Segunda filtração para a remoção de moléculas/carboidratos maiores

[048] Para separar a 6'-sialil-lactose de subproduto disialil-lactose da produção fermentativa, um segundo tratamento com membrana foi empregado. Uma membrana TangenX SIUS TFF com um corte nominal de 0,65kDa (Repligen Corporation) foi usada para filtração. A solução contendo 94,4% de 6'-sialil- lactose e 6,6% de disialil-lactose (razão 15:1) foi filtrada com fluxo cruzado com o sistema descrito e a concentração de 6'-sialil-lactose e disialil-lactose foi determinada dentro do permeado e do retentado. Os resultados mostram uma redução significativa de quantidade de disialil-lactose dentro do permeado de 6,6% a 0,2% (razão de 6'-sialil-lactose para disialilactose foi 55:1) enquanto a razão de 6'-sialil-lactose para disialil-lactose dentro do retentado foi 14:1. Esse resultado mostra que a 6'-sialil-lactose poderia ser separada da disialil-lactose pelo uso de uma etapa de filtração adicional. Essa observação também poderia ser mostrada pelo uso de um segundo tipo de membrana com um corte similar de um fornecedor diferente. pelo uso de uma membrana S-CUT YSNF-YS600- 2540-M46D-ATD (CUT Membrane Technology GmbH) com um corte nominal de 600 a 800 Da, a 6'-sialil-lactose foi também separada de disialil-lactose por filtração de fluxo cruzado. Exemplo 6: Tratamento de eletrodiálise

[049] O permeado obtido no Exemplo 5 foi eletrodialisado para 2 mS/cm usando um aparelho de eletrodiálise PC-Cell 15 (PC-Cell, Heusweiler, Alemanha) equipado com uma pilha de membrana PC-Cell ED 1000H. Essa pilha de membrana foi equipada com as seguintes membranas: membrana de troca catiônica CEM: PK SK e a membrana de troca aniônica AEM:PcAcid60 com um limite de exclusão de tamanho de 60 Da. Uma solução de 0,025 M de ácido sulfâmico (ácido amidossulfônico) foi usada como um eletrólito no processo de eletrodiálise. Após a eletrodiálise, uma solução contendo 6'-sialil-lactose a uma pureza de 83 % (em peso seco) foi obtida. Alternativamente ao tratamento com eletrodiálise, um processo de diafiltração poderia ser empregado.

Exemplo 7: Concentração e tratamento com carbono ativado

[050] Alguma água foi removida da solução aquosa usando um filtro de osmose reversa e evaporação rotativa a 45 °C para obter uma solução de 6'-sialil- lactose a 25 % (m/v). A solução aquosa resultante foi, então, tratada com carbono ativado (Norit SA2). 125 g de carbono ativado foram empregados para 1L de 6'- sialil-lactose a 25 % (m/v). Exemplo 8: Filtração estéril e remoção de endotoxina

[051] Subsequentemente, a solução obtida no Exemplo 7 foi submetida à filtração estéril ao passar a solução por um filtro de 6 kDa (módulo de fibra oca de ultrafiltração Pall Microza SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Alemanha). A solução estéril foi, então, armazenada à TA até a secagem por pulverização. Exemplo 9: Secagem por pulverização de 6'-sialil-lactose

[052] A 6'-sialil-lactose (exemplo 8) estéril assim obtida foi, então, seca por aspersão usando um secador de aspersão NUBILOSA LTC-GMP (NUBILOSA, Konstanz, Alemanha). Para a secagem por pulverização da 6'-sialil-lactose, a solução foi passada com pressão de 350 KPa (3,5 bar) pelo secador por pulveriação configurado para 130 °C e o fluxo foi ajustado pata manter uma temperatura de exaustão entre 67 °C a 69 °C. Usando essas configurações, um pó seco por pulverização com menos de 9 % de umidade poderia ser obtido. Os teores de unidade foram determinados por filtração de Karl-Fischer. Exemplo 10: Análise de LC-MS/MS de 6'-sialil-lactose

[053] Para quantificação, análise de espectrometria de massa foi realizada por MRM (monitoramento de múltiplas reações) usando sistema de detecção de MS LC Triplo-Quadrupolo. Os íons precursores são selecionados e analisados em quadrupolo 1, a fragmentação ocorre na célula de colisão usando argônio como gás CID, a seleção de fragmentos de íons é realizada em quadrupolo 3. A separação cromatográfica de sacarídeos foi realizada em uma coluna de HPLC

XBridge Amide (3,5 µm, 2,1 x 50 mm (Waters, EUA) com um cartucho de proteção XBridge Amide (3,5 µm, 2,1 x 10 mm) (Waters, EUA). A temperatura de forno de coluna do sistema HPLC foi 50 °C.

A fase móvel foi composta de acetonitrila/H2O com acetato de amônio a 10 mM.

Uma amostra de 1 µL foi injetada no instrumento; a corrida foi realizada por 3,60 min com uma taxa de fluxo de 400 mL/min.

A 6’-sialil-lactose foi analisada por MRM em modo de ionização positiva de ESI.

O espectrômetro de massa foi operado em resolução por unidade.

A sialil- lactose forma um íon de m/z 656,2 [M+Na]. O íon precursor de sialil-lactose foi adicionalmente fragmentado na colisão de células nos fragmentos de íons m/z 612,15, m/z 365,15 e m/z 314,15. A energia de colisão Q1 e Q3 Pre Bias foram otimizadas para cada analito individualmente.

Os métodos de quantificação foram estabelecidos usando padrões comercialmente disponíveis (Carbosint, Compton, Reino Unido).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a purificação de uma sialil-lactose a partir de outros carboidratos, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de submeter uma solução aquosa contendo a sialil-lactose e outros carboidratos à duas etapas de filtração por membrana usando diferentes membranas, em que - uma membrana tem um corte de peso molecular entre cerca de 300 a cerca de 500 Dalton, e - a outra membrana como um corte de peso molecular entre cerca de 600 a cerca de 800 Dalton.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa é obtida de um processo de fermentação ou enzimático para a produção da sialil-lactose.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa é obtida de uma fermentação pela separação da biomassa do caldo de fermentação.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a separação da biomassa do caldo de fermentação compreende pelo menos uma etapa de ultrafiltração, preferencialmente duas etapas de ultrafiltração, mais preferencialmente uma primeira ultrafiltração usando uma membrana tendo um corte de peso molecular de cerca de 500 kDa e uma segunda ultrafiltração usando uma membrana tendo um corte de peso molecular de cerca de 150 kDa.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa contendo a sialil-lactose é tratada com uma resina de troca catiônica, preferencialmente na forma de H+, e uma resina de troca aniônica, preferencialmente na forma de Cl-, mais preferencialmente antes de submeter a solução aquosa às etapas de filtração por membrana.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente uma etapa de diálise, preferencialmente de eletrodiálise.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a pureza de sialil-lactose na solução aquosa é ≤ 70 %, ≤ 60 %, ≤ 50 %, ≤ 40 %, ≤ 30 %, ≤ 20 %; ≤ 10 % ou ≤ 5 % antes da purificação e/ou a solução aquosa contém a sialil-lactose a uma pureza de ≥ 80 %, preferencialmente de ≥ 85 % ou mais preferencialmente ≥90 % após a purificação.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sialil-lactose é 3’-sialil-lactose de 6’-sialil- lactose.

9. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.