KR20230121836A - 하전된 올리고사카라이드의 분리 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 적어도 하나의 카복실산 기를 갖는 상이한 올리고사카라이드(하전된 올리고사카라이드로도 지칭됨)의 분리 방법에 관한 것이다. 이 방법은, 그렇지 않은 경우에는 비-크로마토그래피 방법에서 분리하기 어려운 올리고사카라이드의 대량-처리 분리를 허용하며, 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지의 사용을 수반한다.
Description
본 발명은, 적어도 하나의 카복실산 기를 갖는 상이한 올리고사카라이드(하전된 올리고사카라이드로도 지칭됨)의 분리 방법에 관한 것이다. 이 방법은 비-크로마토그래피 방법에서 달리 분리하기 어려운 올리고사카라이드의 대량-처리 분리를 허용하며, 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지의 사용을 수반한다.
모유 올리고사카라이드(HMO)과 같은 올리고사카라이드는 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 발효 브로쓰의 하류 가공을 포함하여 세균 숙주의 발효를 포함한다. 이러한 발효 방법은 3'-시알릴락토오스(3'-SL) 및 6'-시알릴락토오스(6'-SL)와 같은 더 작고 덜 복잡한 올리고사카라이드에는 적합하지만 더 크고 더 복잡한 올리고사카라이드에는 적합하지 않다. 이는 하전된 올리고사카라이드, 즉 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 올리고사카라이드에 대해 특히 사실이다.
더 크고 더 복잡한 올리고사카라이드를 제조하기 위해, 모노사카라이드 단위가 공여체로부터 수용체 올리고사카라이드로의 효소적 촉매작용에 의해 전달되는 트랜스-글리코시다제 반응이 사용되어 왔다. 이러한 예 중 하나는 트랜스-시알리다제 효소를 사용하여 3'-SL 또는 6'-SL과 같은 공여체에서 3-FL, LNT 또는 LNnT와 같은 수용체로 시알산 단위를 전달하는 것이다(예를 들어 WO 2016/157108, WO 2016/199071을 참조하시오). 그러나 이러한 반응은 출발 추출물과 올리고사카라이드 생성물 간에 평형을 초래한다. 하전된 올리고사카라이드의 경우, 공여체와 생성물 모두 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하고 있어 당업계에 공지된 방법으로는 쉽게 분리되지 않는다. 현재 사용 가능한 방법은 젤 크로마토그래피 방법과 같은 처리량이 적은 방법이다.
따라서, 당업계에서는 하전된 올리고사카라이드의 대량-처리 분리를 가능하게 하는 방법이 필요하다.
하나의 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제1 올리고사카라이드를, 적어도 상기 제1 올리고사카라이드 및 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제2 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물로부터 분리시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 제1 올리고사카라이드는 상기 제2 올리고사카라이드보다 적어도 하나 적게 모노사카라이드 단위를 함유하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 용매 중의 상기 혼합물에, 상기 제1 및 제2 올리고사카라이드의 카복실산 기의 적어도 90%가 양성자화된 (자유 산) 형태로 존재하도록 하는 pH 수준을 제공하는 단계, 및
b) 상기 혼합물을 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 혼합물을 상기 수지와 접촉시키는 단계.
하나의 실시양태에서, 방법은 단계 b)에 이어서 단계 b)로부터의 용출물 또는 여액을 염기성 음이온 교환 수지, 예를 들어 겔 유형의 약염기성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 용출물 또는 여액을 상기 수지와 접촉시키는 단계 c)를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법은 카복실산 기를 함유하는 올리고사카라이드들을 서로 분리하는 데 효율적이며, 따라서 제1 올리고사카라이드는 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 결합하는 반면 제2 올리고사카라이드는 실질적으로 결합하지 않고, 높은 순도 수준의 보다 큰 올리고사카라이드를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 시알릴 기를 함유하는 제2 올리고사카라이드를, 적어도 하나의 시알릴 기를 함유하는 제1 올리고사카라이드, 상기 제1 올리고사카라이드 및 임의로 중성 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물로부터 분리시키는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 제1 올리고사카라이드는 상기 제2 올리고사카라이드보다 적어도 하나 적게 모노사카라이드 단위를 함유하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 용매 중의 상기 혼합물에, 상기 제1 및 제2 올리고사카라이드의 시알릴 기의 적어도 90%가 양성자화된 (자유 산) 형태로 존재하도록 하는 pH 수준을 제공하는 단계,
b) 상기 혼합물을 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 혼합물을 상기 수지와 접촉시켜, 상기 제1 올리고사카라이드가 상기 수지에 결합되는 것을 보장하는 단계,
c) 단계 b)의 용출물을 염기성 음이온 교환 수지, 예를 들어 겔 유형의 약염기성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 단계 b)의 용출물을 상기 수지와 접촉시켜, 상기 제2 올리고사카라이드가 상기 수지에 결합되는 것을 보장하는 단계,
d) 상기 제2 올리고사카라이드를 상기 수지로부터 용출시키는 단계, 및
e) 상기 단계 d)의 용출물로부터 상기 제2 올리고사카라이드를 단리시키는 단계.
본 발명은 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제1 올리고사카라이드를, 적어도 상기 제1 올리고사카라이드 및 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제2 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물로부터 분리시키는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 제1 올리고사카라이드는 상기 제2 올리고사카라이드보다 적어도 하나 적게 모노사카라이드 단위를 함유하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 용매 중의 상기 혼합물에, 상기 카복실산 기의 적어도 90%가 양성자화된 (자유 산) 형태로 존재하도록 하는 pH 수준을 제공하는 단계, 및
b) 상기 단계 a)에서 수득된 혼합물을 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 단계 a)에서 수득된 혼합물을 상기 수지와 접촉시키는 단계.
본 발명의 방법의 단계 b)는 제1 올리고사카라이드가 제2 올리고사카라이드보다 더 많이 수지에 결합하게 하고 상기 제2 올리고사카라이드가 액체(이동) 상에 축적되게 하며, 따라서 상기 제1 및 제2 올리고사카라이드를 서로 분리시키는 것이 가능하다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제1 올리고사카라이드를, 적어도 상기 제1 올리고사카라이드 및 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제2 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물로부터 분리시키는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 제1 올리고사카라이드는 상기 제2 올리고사카라이드보다 적어도 하나 적게 모노사카라이드 단위를 함유하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 용매 중의 상기 혼합물에, 상기 카복실산 기의 적어도 90%가 양성자화된 (자유 산) 형태로 존재하도록 하는 pH 수준을 제공하는 단계,
b) 상기 단계 a)에서 수득된 혼합물을 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 단계 a)에서 수득된 혼합물을 상기 수지와 접촉시켜, 상기 제2 올리고사카라이드-풍부 용액을 제공하는 단계, 및
c) 상기 단계 b)로부터의 제2 올리고사카라이드-풍부 용액을 염기성 음이온 교환 수지, 예를 들어 겔 유형의 약염기성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 용출물을 상기 수지와 접촉시키는 단계.
상기 방법의 단계 c)를 사용함으로써, 상기 제2 올리고사카라이드를 고순도로 수득할 수 있다.
상응하게, 본 발명은 또한 적어도 하나의 시알릴 기를 함유하는 제2 올리고사카라이드를, 적어도 하나의 시알릴 기를 함유하는 제1 올리고사카라이드, 상기 제1 올리고사카라이드 및 임의로 중성 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물로부터 분리시키는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 제1 올리고사카라이드는 상기 제2 올리고사카라이드보다 적어도 하나 적게 모노사카라이드 단위를 함유하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 용매 중의 상기 혼합물에, 상기 제1 및 제2 올리고사카라이드의 시알릴 기의 적어도 90%가 양성자화된 (자유 산) 형태로 존재하도록 하는 pH 수준을 제공하는 단계,
b) 상기 혼합물을 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 혼합물을 상기 수지와 접촉시켜, 상기 제1 올리고사카라이드가 상기 수지에 결합되는 것을 보장하고, 이에 의해 상기 제2 올리고사카라이드 및 임의로 상기 중성 올리고사카라이드-풍부 용액을 제공하는 단계,
c) 상기 단계 b)의 용액을 염기성 음이온 교환 수지, 예를 들어 겔 유형의 약염기성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 단계 b)의 용액을 상기 수지와 접촉시켜, 상기 제2 올리고사카라이드가 상기 수지에 결합되는 것을 보장하고, 이에 의해 임의로 상기 중성 올리고사카라이드를 용출시키는 단계,
d) 상기 제2 올리고사카라이드를 상기 수지로부터 용출시키는 단계, 및
e) 상기 단계 d)의 용출물로부터 상기 제2 올리고사카라이드를 단리시키는 단계.
정의
용어 "올리고사카라이드"는 바람직하게는 글리코사이드 간 결합에 의해 함께 연결된 다수의, 그러나 적어도 2개의 모노사카라이드 단위를 함유하는 선형 또는 분지형 구조를 갖는 탄수화물 중합체를 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 올리고사카라이드는 또한 다이사카라이드를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 올리고사카라이드는 바람직하게는 자유 형태이고, 즉 상기는 그의 자유 아노머, 1차 및 2차 OH-기(예를 들어, 에테르, 에스테르, 아세탈 등) 중 어느 하나에 보호기를 함유하지 않고, -아미노데옥시 당에서- 아세틸 이외의 자유 NH2-기에 보호 기를 함유하지 않는다. 올리고사카라이드는 바람직하게는 다이-, 트라이-, 테트라-, 펜타- 또는 헥사사카라이드이다. 용어 "모노사카라이드"는 바람직하게는 알도스(예를 들어, D-글루코스, D-갈락토오스, D-만노스, D-리보스, D-아라비노스, L-아라비노스, D-자일로스 등), 케토스(예를 들어, D-프럭토스, D-소르보스, D-타가토스 등), 데옥시당(예를 들어, L-람노스, L-푸코스 등), 데옥시-아미노당(예를 들어, N-아세틸글루코스아민, N-아세틸만노스아민, N-아세틸갈락토오스아민 등), 유론산, 알돈산, 케토알돈산(예를 들어, 시알산), 알다르산 또는 당 알콜인 5 내지 9개 탄소 원자의 당(탄수화물)을 의미한다.
용어 "적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 올리고사카라이드"는 바람직하게는 카복실산 기를 함유하는 모노사카라이드 단위를 갖는 올리고사카라이드를 의미한다. 카복실산 기를 함유하는 모노사카라이드 단위는 바람직하게는 유론산, 알돈산, 케토알돈산 또는 알다르산, 보다 바람직하게는 케토알돈산이다. 케토알돈산은 바람직하게는 N-아세틸-, 글리콜릴- 또는 데아미노-뉴라민산(KDN)과 같은 뉴라민산, 보다 바람직하게는 N-아세틸-뉴라민산(NANA, 시알산, Neu5Ac)이다. 따라서, NANA-함유 올리고사카라이드는 또한 "시알릴화된 올리고사카라이드"로도 지칭될 수 있다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제1 및 제2 올리고사카라이드는 시알릴화된 올리고사카라이드이다. 바람직하게, 제1 및 제2 올리고사카라이드는 둘 다 단지 하나의 카복실산 기, 및 보다 바람직하게는 단지 하나의 시알산 단위를 함유한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "모유 올리고사카라이드" 또는 "HMO"는 산성 또는 중성 형태일 수 있는, 일반적으로 모유에서 발견되는 다수의 복합 탄수화물을 지칭한다(예를 들어 문헌[Urashima et al.: Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, New York, 2011]; 문헌[Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)]을 참조하시오). 산성 HMO(또한 "시알릴화된 모유 올리고사카라이드" 또는 "시알릴화된 HMO" 또는 "하전된 HMO"라고도 지칭됨)는 적어도 하나의 시알산 단위, 바람직하게는 단지 하나의 시알산 단위를 함유한다. 예로는 3'-시알릴락토오스(3'-SL), 6'-시알릴락토오스(6'-SL), 시알릴락토-N-테트라오스-a(LST-a), 시알릴락토-N-테트라오스-b(LST-b), 시알릴락토-N-테트라오스-c(LST-c) 및 3-푸코실-3'-시알릴-락토오스(FSL)가 있다.
본문 전체에서, 용어 "적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제1 올리고사카라이드" 및 "제1 올리고사카라이드"는 상호교환적으로 사용된다. "적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제2 올리고사카라이드" 및 "제2 올리고사카라이드"에 대해서도 마찬가지이다.
적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는, 적어도 제1 올리고사카라이드 및 제2 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물
본 발명의 방법에서 제2 올리고사카라이드는 제1 올리고사카라이드와 비교하여 모노사카라이드를 적어도 하나 더 함유한다, 즉 제2 올리고사카라이드의 중합도가 제1 올리고사카라이드의 경우보다 더 높다. 하나의 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드는 다이사카라이드이고 제2 올리고사카라이드는 트라이-, 테트라-, 펜타-, 헥사- 또는 그 이상의 올리고사카라이드이다. 다른 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드는 트라이사카라이드이고 제2 올리고사카라이드는 테트라-, 펜타-, 헥사- 또는 그 이상의 올리고사카라이드이다. 다른 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드는 테트라사카라이드이고 제2 올리고사카라이드는 펜타-, 헥사- 또는 그 이상의 올리고사카라이드이다. 다른 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드는 펜타사카라이드이고 제2 올리고사카라이드는 헥사- 또는 그 이상의 올리고사카라이드이다. 더욱이, 더 바람직한 실시양태에서, 제2 올리고사카라이드는 제1 올리고사카라이드와 비교하여 단지 (정확히) 하나의 추가의 모노사카라이드를 함유한다. 이에 관하여, 제1 올리고사카라이드가 다이사카라이드인 경우, 제2 올리고사카라이드는 트라이사카라이드이고; 제1 올리고사카라이드가 트라이사카라이드인 경우, 제2 올리고사카라이드는 테트라사카라이드이고; 제1 올리고사카라이드가 테트라사카라이드인 경우, 제2 올리고사카라이드는 펜타사카라이드이거나; 또는 제1 올리고사카라이드가 펜타사카라이드인 경우, 제2 올리고사카라이드는 헥사사카리아드 등이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 제2 올리고사카라이드는 제1 올리고사카라이드와 비교하여 정확히 2개의 추가의 모노사카라이드를 함유한다. 이와 관련하여, 제1 올리고사카라이드가 다이사카라이드인 경우, 제2 올리고사카라이드는 테트라사카라이드이고; 제1 올리고사카라이드가 트라이사카라이드인 경우, 제2 올리고사카라이드는 펜타사카라이드이고; 제1 올리고사카라이드가 테트라사카라이드인 경우, 제2 올리고사카라이드는 헥사사카리아드 등이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 제2 올리고사카라이드는 제1 올리고사카라이드와 비교하여 정확히 3개의 추가의 모노사카라이드를 함유한다. 이와 관련하여, 제1 올리고사카라이드가 다이사카라이드인 경우, 제2 올리고사카라이드는 펜타사카라이드이고; 제1 올리고사카라이드가 트라이사카라이드인 경우, 제2 올리고사카라이드는 헥사사카리아드 등이다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 인용된 바람직한 또는 더욱 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 제1 및 제2 올리고사카라이드는 단지 하나의 카복실산 기, 특히 단지 하나의 시알산 단위를 함유한다.
본 발명의 방법은 전형적으로, 제2 올리고사카라이드가 트랜스-시알리다제의 사용에 의해, 시알릴화된 다이-, 트라이- 또는 그 이상의 사카라이드 공여체(제1 올리고사카라이드로서)로부터 다이-, 트라이-, 테트라- 또는 그 이상의 올리고사카라이드 수용체로의 시알산 단위의 불완전한 전달의 생성물인 경우 유용하며, 여기서 수용체 올리고사카라이드는 바람직하게는 중성 올리고사카라이드(시알산을 함유하지 않음)이다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드는 다이사카라이드 또는 트라이사카라이드이다. 또 다른 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드는 3'-시알릴락토오스(3'-SL) 및 6'-시알릴락토오스(6'-SL) 중에서 선택된다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는, 적어도 제1 올리고사카라이드 및 제2 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물을 발효에 의해 생성시킬 수 있다.
상기 언급된 트랜스-시알리다제 매개된 효소 반응에서, 시알산 단위를 수용하는 올리고사카라이드는 전형적으로 바람직하게는 시알산 단위를 함유하지 않는 다이-, 트라이-, 테트라-, 펜타- 또는 그 이상의 올리고사카라이드이다. 일반적으로, 시알릴화된 올리고사카라이드 공여체(즉, 본 발명의 맥락에서 제1 올리고사카라이드)는 수용체 올리고사카라이드보다 더 많은 모노사카라이드 단위를 함유하지 않는다. 따라서, 반응 생성물(즉, 본 발명의 맥락에서 제2 올리고사카라이드)은 수용체 올리고사카라이드보다 정확히 하나의 모노사카라이드 단위(시알산 단위이다)를 더 많이 함유하는 올리고사카라이드이며; 이와 관련하여 제2 올리고사카라이드는 올리고사카라이드 수용체의 구조를 포함한다.
따라서 본 발명의 맥락에서 제1 및 제2 올리고사카라이드의 혼합물은 전형적으로, 시알릴화된 올리고사카라이드 공여자로부터 중성 올리고사카라이드 수용체로의 시알산 단위의 트랜스-시알리다제에 의한 불완전한 전달의 결과이다. 따라서, 본 발명에 따른 방법의 하나의 실시양태에서, 제1 및 제2 올리고사카라이드의 혼합물은, 제1 올리고사카라이드 및 카복실산 또는 시알산 기를 함유하지 않는 전구체 올리고사카라이드 기질(수용체)을 함유하는 혼합물에 트랜스-시알리다제를 첨가하여, 상기 제1 올리고사카라이드로부터 수용체로 시알릴 산 단위를 전달하고 따라서 제2 올리고사카라이드를 생성시킴으로써 제조된다. 트랜스-시알리다제 매개된 효소 반응을 하기와 같이 묘사할 수 있다:
여기서 Sia-A는 제1 올리고사카라이드의 실시양태이고 다이-, 트라이- 또는 그 이상의 시알릴화된 올리고사카라이드이며, Sia는 시알산 단위 또는 잔기이고, 화합물 B는, 바람직하게는 시알산 단위를 함유하지 않는 다이-, 트라이-, 테트라-, 펜타- 또는 그 이상의 올리고사카라이드이고, Sia-B는 제2 올리고사카라이드의 실시양태이고 트라이-, 테트라-, 펜타- 또는 그 이상의 시알릴화된 올리고사카라이드이고, 화합물 A는 탈시알릴화된 Sia-A인 Sia-A로부터 이탈하는 모노- 또는 올리고사카라이드이다. 트랜스시알리다제는 일반적으로, 새로 형성된 Sia-B의 Sia 잔기를, 이전에 Sia-A로부터 생성된 화합물 A로 다시 전달할 수 있으므로, 하기와 같은 평형에 도달한다: B + Sia-A ⇔ Sia-B + A. 상기 효소 반응 시스템에서, Sia-A와 화합물 B가 그들의 구조 내에 동일한 모노사카라이드 단위를 갖는 경우, Sia-B는 Sia-A보다 정확히 하나의 모노사카라이드 단위를 더 많이 함유한다(따라서, Sia-A와 화합물 B가 모두 트라이사카라이드인 경우, Sia-B는 테트라사카라이드 등이다). Sia-A와 화합물 B가 그들의 구조 내에 동일한 모노사카라이드 단위를 갖는 경우, Sia-B는 Sia-A보다 정확히 하나의 모노사카라이드 단위를 더 많이 함유한다(따라서 Sia-A와 화합물 B가 모두 트라이사카라이드인 경우, Sia-B는 테트라사카라이드 등이다). Sia-A가 화합물 B보다 정확히 하나의 모노사카라이드 단위를 적게 함유하는 경우, Sia-B는 Sia-A보다 정확히 2개의 모노사카라이드 단위를 더 많이 함유한다(따라서 Sia-A가 트라이사카라이드이고 화합물 B가 테트라사카라이드인 경우, Sia-B는 펜타사카라이드 등이다). Sia-A가 화합물 B보다 정확히 2개의 모노사카라이드 단위를 적게 함유하는 경우, Sia-B는 Sia-A보다 정확히 3개의 모노사카라이드 단위를 더 많이 함유한다(따라서 Sia-A가 트라이사카라이드이고 화합물 B가 펜타사카라이드인 경우, Sia-B는 헥사사카라이드 등이다).
트랜스시알리다제는 공여체 및 생성물에 대한 선택성을 나타낸다. 따라서, α2,3-트랜스시알리다제는 유리하게는 α2,3-시알릴화된 공여체로부터 시알산 기를 전달하고, 바람직하게는 α2,3-시알릴화된 생성물을 생성시킨다. 따라서, 용어 "α2,3-트랜스시알리다제"는 바람직하게는 α2,3-시알릴화된 공여체의 시알릴 잔기를 올리고사카라이드 수용체 중의, 바람직하게는 말단의, 갈락토오스 단위의 3번-위치로 전달할 수 있는 임의의 야생형 또는 조작된 시알리다제를 의미한다. 그러한 트랜스시알리다제는 바람직하게는 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)(TcTS)로부터의 α2,3-트랜스시알리다제이다. 유사하게, α2,6-트랜스시알리다제는 유리하게는 α2,6-시알릴화된 공여체로부터 시알산 기를 전달하고 바람직하게는 α2,6-시알릴화된 생성물을 생성시킨다. 따라서, 용어 "α2,6-트랜스시알리다제"는 바람직하게는 α2,6-시알릴화된 공여체의 시알릴 잔기를 올리고사카라이드 수용체 중의, 바람직하게는 말단의, 갈락토오스 단위의 6번-위치로 전달할 수 있는 임의의 야생형 또는 조작된 시알리다제를 의미한다. 이러한 트랜스시알리다제는 바람직하게는 WO 2016/199069에 개시된 것들이고, 그 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 하나의 실시양태에서 Sia-A, Sia-B, A 및 B를 포함하는 반응 환경으로부터 Sia-A를 분리한 다음, 임의로 중성 올리고사카라이드 A 및 B로부터 Sia-B를 분리하는 편리한 방법을 제공한다.
적어도 시알산 단위를 함유하는 제1 올리고사카라이드(Sia-A) 및 시알산 단위를 함유하는 제2 올리고사카라이드(Sia-B)를 포함하는 혼합물을 예를 들어 WO 2016/157108 또는 WO 2016/199071에 따라 생성시킬 수 있으며, 그 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
바람직하게는, 트랜스-시알리다제 매개된 효소 반응에서 제1 및 제2 올리고사카라이드의 혼합물을 제조하기 위해서, 전구체 올리고사카라이드 기질(수용체, 화합물 B)은 중성 HMO이다. 유리하게는, 전구체 올리고사카라이드 기질(수용체)은 3-FL, LNT, LNnT, LNFP-II 또는 LNFP-VI이다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명은 시알산 단위를 함유하는 제1 올리고사카라이드(Sia-A로서 지칭됨)를, 상기 제1 올리고사카라이드 및 시알산 단위를 함유하는 제2 올리고사카라이드(Sia-B로서 지칭됨), 화합물 A 및 화합물 B를 포함하는 혼합물로부터 분리시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 제1 올리고사카라이드는 상기 제2 올리고사카라이드보다 적어도 하나 적게 모노사카라이드 단위를 함유하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 용매 중의 상기 혼합물에, Sia-A 및 Sia-B의 시알산 단위의 적어도 90%가 양성자화된 (산) 형태로 존재하도록 하는 pH 수준을 제공하는 단계,
b) 상기 단계 a)의 혼합물을 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 단계 a)의 혼합물을 상기 수지와 접촉시켜, 바람직하게는 Sia-A를 결합시키고, Sia-B가 농축되고 화합물 A 및 B를 함유하는 수용액을 제공하는 단계.
하나의 실시양태에서, 방법은 단계 c): 단계 b)로부터의 수용액을 염기성 음이온 교환 수지, 예를 들어 겔 유형의 약염기성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 용액을 상기 수지와 접촉시켜, 바람직하게는 Sia-B를 결합시키고, 화합물 A 및 B가 풍부한 수용액을 제공하는 것을 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, Sia-A는 3'-SL 및 6'-SL로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시양태에서, Sia-B는 FSL(3-O-푸코실-3'-O-시알릴락토오스, Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3))-]Glc), LST-a(시알릴락토-N-테트라오스 a, Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc), LST-c(시알릴락토-N-테트라오스 c, Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc), Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc, Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc, F-LST-a(Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-[Fucα(1-4)-]GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)) 및 F-LST-c(Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3))-]Glc))로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시양태에서, Sia-A는 3'-SL 및 6'-SL로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, Sia-B는 FSL(3-O-푸코실-3'-O-시알릴락토오스, Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3))-]Glc), LST-a(시알릴락토-N-테트라오스 a, Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc), LST-c(시알릴락토-N-테트라오스 c, Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc), Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc, Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc, F-LST-a(Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-[Fucα(1-4)-]GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)) 및 F-LST-c(Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3))-]Glc))로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드 (Sia-A)는 6'-SL이고 제2 올리고사카라이드 (Sia-B)는 LST-c(시알릴락토-N-테트라오스 c, Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)이고, 바람직하게는 하기 α2,6-트랜스시알리다제 촉매 반응으로부터 수득된다: 6'-SL + LNnT ⇔ LST-c + 락토오스.
하나의 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드 (Sia-A)는 3'-SL이고 제2 올리고사카라이드 (Sia-B)는 LST-a(시알릴락토-N-테트라오스 α, Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)이고, 바람직하게는 하기 α2,3-트랜스시알리다제 촉매 반응으로부터 수득된다: 3'-SL + LNT ⇔ LST-a + 락토오스.
하나의 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드 (Sia-A)는 3'-SL이고 제2 올리고사카라이드 (Sia-B)는 FSL(3-O-푸코실-3'-O-시알릴락토오스, Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3)-]Glc)이고, 바람직하게는 하기 α2,3-트랜스시알리다제 촉매 반응으로부터 수득된다: 3'-SL + 3-FL ⇔ FSL + 락토오스.
하나의 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드 (Sia-A)는 3'-SL이고 제2 올리고사카라이드 (Sia-B)는 F-LST-a(Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-[Fucα(1-4)-]GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc))이고, 바람직하게는 하기 α2,3-트랜스시알리다제 촉매 반응으로부터 수득된다: 3'-SL + LNFP-II ⇔ F- LST-a + 락토오스.
하나의 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드 (Sia-A)는 6'-SL이고 제2 올리고사카라이드 (Sia-B)는 F-LST-c(Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3)-]Glc))이고, 바람직하게는 하기 α2,6-트랜스시알리다제 촉매 반응으로부터 수득된다: 6'-SL + LNFP-VI ⇔ F- LST-c + 락토오스.
하나의 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드 (Sia-A)는 6'-SL이고 제2 올리고사카라이드 (Sia-B)는 Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc이고, 바람직하게는 하기 α2,6-트랜스시알리다제 촉매 반응으로부터 수득된다: 6'-SL + LNT ⇔ Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc + 락토오스.
하나의 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드 (Sia-A)는 3'-SL이고 제2 올리고사카라이드 (Sia-B)는 Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc이고, 바람직하게는 하기 α2,3-트랜스시알리다제 촉매 반응으로부터 수득된다: 3'-SL + LNnT ⇔ Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc + 락토오스.
혼합물에 올바른 pH를를 제공하는 단계(단계 a)
본 발명에 따른 방법의 단계 a)에서, 혼합물에, 상기 방법에서 분리되는 특정한 올리고사카라이드에 적합한 수준의 pH를 제공한다. 이에 관하여, 혼합물은 바람직하게는 수용액이다. 최적의 분리를 위해, 제1 및 제2 올리고사카라이드의 카복실산 기는 주로 양성자화된 형태이어야 한다, 즉 카복실산 기의 적어도 90%는 자유 산 형태이어야 한다. 당업자는 필요한 수준의 양성자화된 자유 산 형태를 보장하기 위해 pH를 조절하는 방법을 알고 있다. 일례로, 카복실산 함유 올리고사카라이드의 pKa를 결정할 수 있으며, 이어서 필요한 pH를 Henderson-Hasselbalch 방정식을 사용하여 계산할 수 있다. 필요한 양의 양성자화된 형태(90%)를 갖기 위해서 pH는 pH 약 pKa-0.954로 계산될 것이다.
하나의 실시양태에서, 카복실산 기의 적어도 92%가 양성자화된 형태이다. 또 다른 실시양태에서, 카복실산 기의 적어도 95%가 양성자화된 형태이다. 더욱 또 다른 실시양태에서, 카복실산 기의 적어도 98%가 양성자화된 형태이다.
pH를 원칙적으로는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 카복실산 기 함유 제1 및 제2 올리고사카라이드보다 더 강한 산, 바람직하게는 더 강한 무기산을 사용하여 조절할 수 있으며, 이의 예시적인 실시양태는 HCl-용액 또는 황산 용액일 수 있다. 하나의 실시양태에서, pH를 약 1.5 내지 3으로 설정한다.
본 발명에 따른 방법의 단계 a)에 비추어 pH 조절을 달성하는 편리하고 또한 바람직한 방법은 양성자화된 양이온 교환 수지를 사용하는 것이다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 단계 a)에서 제공되는 pH-설정된 혼합물은, 상기 제1 및 제2 올리고사카라이드의 혼합물을 양성자화된 산성 양이온 교환 수지(H+-형태의 산성 양이온 교환 수지)상에 적용하거나 또는 상기 혼합물을 상기 수지와 접촉시킴으로써 제공된다. 바람직하게, 양성자화된 산성 양이온 교환 수지는 양성자화된 강산성 양이온 교환 수지이다.
하나의 실시양태에서, 단계 a)에서 제공된 수용액 형태의 pH-설정된 혼합물은, 제1 및 제2 올리고사카라이드를 함유하는 수용액을, 양성자화된 산성 양이온 교환 수지, 바람직하게는 강산성 양이온 교환 수지로 충전된 컬럼 상단에 로딩하고, 물로 용출시키고, 양성자화된 형태의 제1 및 제2 산성 올리고사카라이드를 함유하는 분획(용출물)을 수집함으로써 수득될 수 있다. 산성 양이온 교환 수지의 양은 상기 제1 및 제2 산성 올리고사카라이드를, 예를 들어 이들의 상응하는 염 형태로부터 양성자화된 형태로 전환시키기에 충분해야 한다. 대안적인 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 올리고사카라이드를 함유하는 수용액을, 실질적으로 모든 카복실산 기가 양성자화된 형태로 전환될 때까지 교반 하에서 또는 교반 없이 용기 중에서 양성자화된 산성 양이온 교환 수지, 바람직하게는 강한 산성 양이온 교환 수지와 접촉시킨다. 이어서 상기 수지를, 예를 들어 여과(여액)에 의해 분리시킨다. 상기 단계 a)에서 수득될 수 있는 여액 및 용출물은 모두 "pH-설정된 혼합물", "pH-설정된 (수)용액", "산성 양이온 교환 수지 처리된 혼합물" 또는 "산성 양이온 교환 수지 처리된 (수)용액"으로서 지칭될 수 있다. 상기 pH-설정된 용액은 본 발명의 단계 b)에 사용할 준비가 되어 있다.
상기 실시양태 중 어느 하나에서, 적어도 하나의 카복실산 기, 바람직하게는 시알산 단위 또는 잔기를 함유하는, 적어도 제1 올리고사카라이드 및 제2 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물은 중성 올리고사카라이드를 추가로 포함할 수 있다. 중성 올리고사카라이드는 산성 양이온 교환 수지에 결합하지 않으며, 따라서 단계 a) 후에 산성화된(양성자화된) 제1 및 제2 올리고사카라이드과 함께 수집된다.
더욱 또한, 적어도 하나의 카복실산 기, 바람직하게는 시알산 단위 또는 잔기를 함유하는, 적어도 제1 올리고사카라이드 및 제2 올리고사카라이드, 및 임의로 중성 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물은 강한 무기산의 무기 음이온, 전형적으로 클로라이드, 설페이트, 나이트레이트, 포스페이트 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들의 존재는 이들이 단계 b)에서 사용된 적어도 하나의 카복실 기를 함유하는 제1 올리고사카라이드에 관하여 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지의 용량을 실질적으로 감소시키지 않는 한 허용될 수 있다(하기 참조). 적합하게는, 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는, 제1 및 제2 올리고사카라이드의 혼합물을 상기에 개시된 바와 같은 효소 반응으로부터 수득하는 경우, 무기 음이온의 양은 본 발명의 단계 b)에서의 제2 올리고사카라이드로부터 제1 올리고사카라이드의 분리에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 어쨌든, 이러한 무기 음이온의 존재가 바람직하지 않은 경우, 이는 예를 들어, 제1 및 제2 올리고사카라이드를 유지하고 무기 음이온을, 제1 및 제2 올리고사카라이드와 비교하여 실질적으로 더 작은 크기로 인해 통과되게 하는 적합한 멤브레인을 사용함으로써, 혼합물에 본 발명의 단계를 적용하기 전에, 적어도 하나의 카복실산 기, 바람직하게는 시알산 단위 또는 잔기를 함유하는, 제1 올리고사카라이드 및 제2 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물로부터 적어도 부분적으로 제거될 수 있다.
적어도 하나의 카복실산 기, 바람직하게는 시알산 단위 또는 잔기를 함유하는, 제1 및 제2 올리고사카라이드 중 어느 하나보다 강한 산, 바람직하게는 무기산이, 상기 제1 및 제2 올리고사카라이드를 함유하는 용액의 pH를 목적하는 값으로, 즉 상기 제1 및 제2 올리고사카라이드 중의 카복실산 기의 적어도 90%가 양성자화된 형태인 경우로 설정하는 데 사용되는 실시양태에서, 상기 산의 양이 단계 b)에서 사용된 적어도 하나의 카복실 기를 함유하는 제1 올리고사카라이드에 관하여 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지의 용량을 실질적으로 감소시키지 않도록 상기 산이 너무 많은 과잉으로 적용되지 않는 것이 바람직하다(하기 참조). 이와 같은 무기산의 과잉 사용을 피하기 위해서는 pH를 약 1.5 내지 3으로 설정하는 것이 바람직할 수 있다.
단계 a)에서 수득된 혼합물을 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지 상에 적용하는 단계(단계 b)
본 발명에 따른 방법의 단계 b)에서, 단계 a)에서 제공된 수용액 형태의 pH-설정된 혼합물을 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 적용하거나 이와 접촉시킨다.
염기성 음이온 교환 수지는 강염기성 또는 약염기성일 수 있으며 거대다공성이거나 또는 겔 유형의 것일 수 있다. 거대다공성 이온 교환 수지는 3차원 구조 중에 더 큰 기공을 허용하는 가교결합도를 갖도록 설계되는 반면, 겔 유형의 이온 교환 수지는 더 큰 기공을 함유하지 않는다.
염기성 음이온 교환 수지는 전형적으로 폴리아크릴 또는 폴리스티렌 주쇄를 가지며, 이들은 개별적인 중합체 쇄 사이에서 가교결합된다. 전형적인 가교제는 다이비닐벤젠(DVB)이다. 따라서, 바람직한 하나의 실시양태에서, 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지는 폴리스티렌 주쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지는 다이비닐벤젠에 의해 가교결합된 주쇄를 포함한다. 더욱 또 다른 바람직한 실시양태에서, 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지는 다이비닐벤젠-가교결합된 폴리스티렌 주쇄를 포함한다.
약염기성 음이온 교환 수지는 전형적으로 특정 질소 함유 기와 같이, 양성자를 끌어당기는 고립 전자쌍을 갖는 염기 기를 함유한다. 염기 기는 양성자화된 형태가 아니어야 한다, 즉 상기 기는 자유 염기이다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지는 양성자를 끌어당기는 고립 전자쌍을 갖는 염기 기를 함유한다. 추가의 실시양태에서, 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지는 양성자를 끌어당기는 고립 전자쌍을 갖는 질소 원자를 함유한다. 이러한 기는 예를 들어 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민(자유 아민 기), 구아니디노 또는 질소 함유 헤테로방향족 기(예를 들어, 피리디노, 피리미디노 등), 바람직하게는 3차 아민을 포함한다. 더욱 추가의 실시양태에서, 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지는 다이비닐벤젠-가교결합된 폴리스티렌 주쇄 상에 자유 아민기를 함유한다. 후자의 예로는 Lanxess의 Lewatit MP62, Dow의 Dowex 77, Mitsubishi Chemical의 DIAION WA30 및 Dow의 Dowex 66이 있다.
특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 자유 염기 형태의 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지의 염기도(basicity) 및 기공 크기는 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제2 올리고사카라이드와 비교하여 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제1 올리고사카라이드의 선택적 결합을 허용한다. 임의의 다른 수지와 마찬가지로, 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지는 특정한 결합 능력을 가지고 있다. 따라서, 수지 상에 로딩된 올리고사카라이드의 양은 유리하게는 가장 잘 결합하는 올리고사카라이드, 즉 본 발명에 따른 방법에서 제1 올리고사카라이드에 대한 결합 능력/포화 한계에 따라 조절된다. 대안적으로, 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지의 양은 유리하게는, 가장 잘 결합하는 올리고사카라이드, 즉 제1 올리고사카라이드에 대한 수지의 결합 용량/포화 한계에 따라 상기 수지에 로딩된 올리고사카라이드의 양과 일치하도록 조절된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법의 하나의 실시양태에서, 제1 올리고사카라이드의 양은 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 관한 제1 올리고사카라이드에 대해 사전-결정된 포화 한계 부근이다. 포화 한계는 비교적 많은 양의 제1 올리고사카라이드를 함유한 샘플을 수지에 통과시켜, 상기 샘플이 수지를 얼마나 많이 통과하는지를 측정하여 결정할 수 있다. 포화 한계는 초기 양에서 수지를 통과하는 양을 뺀 값으로 계산된다.
하나의 실시양태에서, 혼합물 중의 제1 올리고사카라이드의 양은 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 관하여 제1 올리고사카라이드에 대해 사전-결정된 포화 한계의 약 80-120%, 예를 들어 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110% 또는 115%이다.
공급 용액 중의 제1 올리고사카라이드보다 더 강한 산, 전형적으로 무기산의 존재는 단계 b)에서 사용되는 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지의 자유 염기 작용기를 차지할 수 있다. 그러나, 상기의 존재는 상기 량이 소량인 경우 본 발명의 단계 b)의 분리 효과에 실질적으로 영향을 미치지 않는다, 예를 들어 제1 및 제2 올리고사카라이드의 혼합물이 효소 반응(상기 참조)으로부터 수득되고, 단계 a)를 강산성 이온 교환 수지(H+-형태) 또는 단계 a)에서 사용된 강산을 사용하여, 카복실산 기를 포함하는 제1 및 제2 올리고사카라이드를 양성자화된 형태로 전환하여 실시하는 것은 과량으로 적용되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 단계 a)에서 수득된 수용액 형태의 pH-설정된 혼합물을, 계산된 양의 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지, 바람직하게는 다이비닐벤젠-가교결합된 폴리스티렌 주쇄를 갖고 물로 용출되는 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지로 충전된 컬럼의 상단에 로딩할 수 있다. 제1 올리고사카라이드는 수지의 자유 염기성 작용기에 대한 흡착에 의해 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 결합하고, 제2 올리고사카라이드(임의로 존재하는 다른 중성 올리고사카라이드와 함께)는 수지를 통과하여 용출물로서 수집된다.
대안적인 실시양태에서, 단계 a)에서 수득된 수용액 형태의 pH-설정된 혼합물을, 계산된 양의 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지, 바람직하게는 다이비닐벤젠-가교결합된 폴리스티렌 주쇄를 갖는 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지와, 실질적으로 모든 제1 올리고사카라이드가 수지의 자유 염기성 작용기에 대한 흡착에 의해 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 결합할 때까지 교반 하에서 또는 교반하지 않고 용기 중에서 접촉시킨다. 제2 올리고사카라이드(임의로 존재하는 다른 중성 올리고사카라이드와 함께)는 용액에 남아 있는다. 이어서 제1 올리고사카라이드가 결합된 수지를, 예를 들어 여과에 의해 제2 올리고사카라이드를 함유하는 용액(여액)으로부터 분리시킨다. 단계 b)에서 수득될 수 있는 여액 및 용출물은 모두 제2 올리고사카라이드-풍부 (수)용액으로서 지칭될 수 있다.
임의로, 본 발명의 단계 b)를 수행하고 제2 올리고사카라이드-풍부 용액을 수집한 후, 제1 올리고사카라이드를 적절한 제2 용출 용액, 예를 들어 희석된 암모니아 용액, 또는 제1 올리고사카라이드보다 강한 산, 바람직하게는 HCl과 같은 무기산의 용액으로 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지로부터 연속 또는 배치 모드로 용출시킬 수 있다. 이어서, 상응하게 제1 올리고사카라이드를 충분한 순도로 제2 올리고사카라이드로부터 분리시킬 수 있고, 시럽 형태로 또는 예를 들어 결정화, 침전, 분무-건조, 동결-건조에 의해 단리할 수 있다.
당업자는 조건에 따라 일부 소량의 제1 올리고사카라이드가 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 결합하지 않을 수 있고/있거나 일부 소량의 제2 올리고사카라이드가 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 결합할 수 있음을 이해한다. 따라서, 제2 올리고사카라이드로부터 제1 올리고사카라이드의 완전한 분리가 달성되지 않는 경우, 적어도 제1 올리고사카라이드의 대부분이 적어도 제2 올리고사카라이드의 대부분으로부터 분리될 수 있다. 이와 관련하여, 제2 올리고사카라이드-풍부 분획은 단계 b)의 끝에서 수집될 수 있고, 후속적으로 적어도 제1 올리고사카라이드의 농축된 분획은 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지로부터 제2 용출 용액에 의해 세척 제거될 수 있다.
임의적 단계 c)
본 발명에 따른 방법은 제1 올리고사카라이드와 제2 올리고사카라이드의 분리를 제공한다. 제1 올리고사카라이드를 전형적으로는 다른 공급원으로부터 고순도로 입수할 수 있지만, 본 발명의 방법은, 달리 젤 크로마토그래피 또는 예비 HPLC와 같은 처리량이 낮은 크로마토그래피 방법을 필요로 하는 정도의 순도로 제2 올리고사카라이드를 단리할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명의 방법의 하나의 실시양태에서, 단계 b)로부터 생성된 제2 올리고사카라이드를 함유하고 이것이 풍부한 용액을 수집하고, 이로부터 제2 올리고사카라이드를 단리할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 제2 올리고사카라이드를 시럽 형태로, 또는 결정화, 침전, 분무-건조, 동결-건조 등을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해, 단계 b)에서 수득된 수용액으로부터 직접 단리할 수 있다.
다른 실시양태에서, 제2 올리고사카라이드를 추가로 정제하고 이어서 단계 b)에서 수득된 수용액으로부터 단리할 수 있다. 상응하게, 상기 용액을 염기성 음이온 교환 수지, 바람직하게는 염기 형태의 약염기성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 수지와 접촉시켜, 상기 올리고사카라이드가 상기 수지에 결합되는 것을 보장한다. 임의의 단계 c)에서 적용된 약염기성 이온 교환 수지는 선행 단계 b)에서 적용된 약염기성 이온 교환 수지와 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 바람직하게, 단계 c)에서 적용되는 약염기성 이온 교환 수지는 단계 b)에서 적용되는 약염기성 이온 교환 수지와 동일하지 않으며, 더욱 바람직하게, 단계 c)에서 적용되는 약염기성 음이온 교환 수지는 겔 유형의 것이다. 훨씬 더 바람직하게, 겔 유형의 약염기성 음이온 교환 수지는 폴리아크릴 수지이다.
본 발명에 따른 방법의 초기 혼합물은 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는, 제1 및 제2 올리고사카라이드를 적어도 포함한다. 혼합물은 또한 임의의 카복실산 기를 함유하지 않는 추가의 올리고사카라이드("중성 올리고사카라이드")를 추가로 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 단계 c)에서, 단계 b)에서 수득된 용액이 제2올리고사카라이드 외에 중성 올리고사카라이드를 또한 포함하는 경우, 상기 중성 올리고사카라이드는 수지에 결합하지 않는 반면, 상기 제2올리고사카라이드는 수지에 결합하며, 이에 의해 상기 중성 올리고사카라이드는 상기 제2 올리고사카라이드로부터 편리하게 분리된다. 중성 올리고사카라이드를 함유하는 용출물 또는 여액(단계 c)가 크로마토그래피 또는 배치 모드로 수행되는지 여부에 따라)을 수집한 후, 상기 결합된 제2 올리고사카라이드를 적절한 용출제, 예를 들어 희석된 암모니아 용액, 또는 상기 제2 올리고사카라이드보다 강한 산, 바람직하게는 HCl과 같은 무기산의 용액으로 상기 염기성 수지로부터 용출시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 단계 a)를 양성자화된 양이온 교환 수지를 사용하여 수행하는 경우, 단계 a) 및 b)를 편의상, 용출물 분획의 임의의 중간 수집 없이, 단계 a)로부터의 용출물을 단계 b)의 수지로 바로 통과시켜 수행할 수 있다. 유사하게, 단계 c)가 필요한 경우, 단계 b)로부터의 용출물을 편의상 단계 c)의 수지로 바로 통과시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법의 하나의 실시양태에서, 단계들을 용출물 분획의 임의의 중간 수집 없이 수행한다.
하기 번호의 본 발명의 양태를 제공한다:
양태 1. 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제1 올리고사카라이드를, 적어도 상기 제1 올리고사카라이드 및 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제2 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물로부터 분리시키는 방법으로서, 여기서 상기 제1 올리고사카라이드는 상기 제2 올리고사카라이드보다 적어도 하나 적게 모노사카라이드 단위를 함유하고, 상기 방법은, a) 용매, 바람직하게는 물 중의 상기 혼합물에, 상기 제1 및 제2 올리고사카라이드의 카복실산 기의 적어도 90%가 양성자화된 (산) 형태로 존재하도록 하는 pH 수준을 제공하는 단계, 및 b) 상기 단계 a)의 혼합물을 자유 염기 형태의 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지와 접촉시켜, 상기 제2 올리고사카라이드-풍부 수용액을 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
양태 2. 양태 1에 있어서, 올리고사카라이드가 시알릴화된 모유 올리고사카라이드, 바람직하게는 모노시알릴화된 모유 올리고사카라이드인 방법.
양태 3. 양태 1 또는 2에 있어서, 거대다공성 수지가 바람직하게는 다이비닐-벤젠과 가교결합된 폴리스티렌 주쇄 구조를 포함하는 방법.
양태 4. 양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 단계 b)에서 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지와 접촉되는 단계 a)의 혼합물이 제1 올리고사카라이드를, 상기 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 관하여 제1 올리고사카라이드에 대해 사전-결정된 포화 한계 부근의 양, 바람직하게는 상기 사전-결정된 포화 한계의 80-120%의 양으로 함유하는 방법.
양태 5. 양태 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 올리고사카라이드의 혼합물을, 상기 제1 올리고사카라이드 및 카복실산 기를 함유하지 않는 전구체 올리고사카라이드 기질에 트랜스-시알리다제를 첨가함으로써 제조하는 방법.
양태 6. 양태 5에 있어서, 단계 c)에서, 제2 올리고사카라이드가 농축되고 전구체 올리고사카라이드를 함유하는 단계 b)에서 수득된 수용액을 음이온 교환 수지, 바람직하게는 자유 형태의 약염기성 음이온 교환 수지와 접촉시키는 방법.
양태 7. 양태 6에 있어서, 약염기성 음이온 교환 수지가 겔 유형의 것인 방법.
양태 8. 선행 양태 중 어느 하나에 있어서, 단계 a)의 pH가 1.5 내지 3인 방법.
양태 9. 선행 양태 중 어느 하나에 있어서, 제1 올리고사카라이드가 3'-시알릴락토오스이고 제2 올리고사카라이드가 FSL(3-O-푸코실-3'-O-시알릴락토오스), LST-a(시알릴락토-N-테트라오스 a), F-LST-a(Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-[Fucα(1-4)-]GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)) 또는 Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc인 방법.
양태 10. 양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 제1 올리고사카라이드가 6'-시알릴락토오스이고 제2 올리고사카라이드가 LST-c(시알릴락토-N-테트라오스 c), F-LST-c(Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3)-]Glc)) 또는 Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-3) -GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc인 방법.
실시예
실시예 1 - LST-c의 효소 반응 및 정제
필수적으로 WO 2016/199071의 실시예 1에 따라, LNnT(136 mmol) 및 6'-SL(72 mmol)을, 상기 중에 개시된 그의 신호 펩타이드(Δ2-15)에 의해 절두된 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi) JT-SHIZ-119 시알릴 트랜스퍼라제의 A218Y-N222R-G349S-S412P-D451K 돌연변이체의 존재 하에서 반응시켰다. 정제 및 동결 건조 후에, 하기의 혼합물을 수득하였다: LNnT(45.2 중량%), 6'-SL(16.3 중량%), LST-c(31.4 중량%) 및 락토오스(9.6 중량%). 상기 혼합물을 물에 용해시켜 3.6 브릭스(°Bx) 용액을 제공하고, 상이한 이온 교환 수지로 충전된 3개의 상호연결된 컬럼을 통과시켜 수지 1로부터의 용출물이 수지 2 컬럼의 상단으로 직접 유도되게 하고, 그의 용출물은 수지 3 컬럼의 상단으로 직접 유도되게 하였다. 수지 1은 Dowex88(H+-형태의 강산성 양이온 교환 수지(SAC))인 반면, 수지 2 및 3은 약염기성 음이온 교환 수지였다(WBA1: Dowex66, 거대다공성 폴리스티렌-DVB 수지, 및 WBA2: Amberlite FPA53, 폴리아크릴 겔 유형 수지; 둘 다 자유 염기의 형태이다). LNnT 및 락토오스는 어떤 수지에도 결합하지 않았다. WBA1 수지는 5 mmol 6'-SL/100 ㎖ 수지에 상응하도록 사용되었다. 6'-SL은 WBA1에 선택적으로 결합한 반면 LST-c는 WBA2에 선택적으로 결합하였다. 후속적으로, 컬럼을 분리시켰다. LST-c를 0.5 M HCl-용액을 사용하여 WBA2로부터 용출시켰고 pH를 NaOH-용액으로 4.8로 조절하였다. 상기 용액을 나노여과에 의해 탈염시켰다. LST-c를 91.4%의 순도로 동결-건조(24.5 g)에 의해 단리하였다(LNnT 0.3 중량%, 6'-SL 2.9 중량%, 락토오스 없음).
실시예 2 - LST-a의 효소 반응 및 정제
필수적으로 WO 2016/157108에 따라, LNnT(134 mmol) 및 3'-SL(70 mmol)을, 트리파노소마 크루지(T. cruzi)로부터의 α2,3-트랜스시알리다제(TcTS)의 존재 하에서 반응시켰다. 정제 후에, 하기의 혼합물을 브릭스 4.0 용액의 형태로 수득하였다: LNT(42.1 중량%), 3'-SL(10.3 중량%), LST-a(24.2 중량%) 및 락토오스(10.3 중량%). 상기 용액을, 상이한 이온 교환 수지로 충전된 3개의 상호연결된 컬럼을 통과시켜 수지 1로부터의 용출물이 수지 2 컬럼의 상단으로 직접 유도되게 하고, 그의 용출물은 수지 3 컬럼의 상단으로 직접 유도되게 하였다. 수지 1은 Dowex88(H+-형태의 강산성 양이온 교환 수지(SAC))인 반면, 수지 2 및 3은 약염기성 음이온 교환 수지였다(WBA1: Dowex66, 거대다공성 폴리스티렌-DVB 수지, 및 WBA2: Amberlite FPA53, 폴리아크릴 겔 유형 수지; 둘 다 자유 염기의 형태이다). LNT 및 락토오스는 어떤 수지에도 결합하지 않았다. WBA 수지는 5 mmol 3'-SL/100 ㎖ 수지에 상응하도록 사용되었다. 3'-SL은 WBA1에 선택적으로 결합한 반면 LST-a는 WBA2에 선택적으로 결합하였다. 후속적으로, 컬럼을 분리시켰다. LST-a를 0.5 M HCl-용액을 사용하여 WBA2로부터 용출시켰고 pH를 NaOH-용액으로 약 6으로 조절하였다. 상기 용액을 나노여과에 의해 탈염시켰다. LST-a를 91.4%의 순도로 동결-건조(38.4 g)에 의해 단리하였다(LNT 0.5 중량%, 3'-SL 0.6 중량%, 락토오스 없음).
실시예 3 - 거대다공성 폴리스티렌-DVB 약염기성 음이온(자유 아민) 수지를 사용하여 LST-c, 6'-SL, LNnT 및 락토오스의 혼합물로부터 LST-c의 농축
LST-c 13.09 g/l, 6'-SL 5.92 g/l, LNnT 17.74 g/l 및 락토오스 4.64 g/l를 함유하는 동결-건조된 혼합물 10 g을 물(240 ㎖)에 용해시켜 <5 °Bx의 용액을 수득하였다. 공급 조성물을 샘플링하고 HPLC에 의해 분석하여 각 성분의 양을 결정하였다.
강산성 이온 교환 수지 DOWEX88H(40 ㎖) 및 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지(자유 염기) LEWATIT MP62(40 ㎖)를 직렬로 연결하고 공급 용액을 로딩하였다. 50 ㎖의 분획을 수집하였으며, 순수한 물을 용출제로서 사용하여 총 16개의 분획을 수집하였다.
상기 분획을 TLC에 의해 스폿팅하고 용출제로서 AcCN:NH3:수(6:3:1)를 사용 하여 평가하였다. 분획 2 내지 5는 LST-c를 함유하지 않았으며 이들을 별도로 모았다. 분획 6 내지 8은 LST-c, LNnT 및 락토오스의 혼합물을 함유하는 것으로 표시되었으며 이들을 별도로 모았다. 분획 9 내지 13은 순수한 LST-c를 포함하는 것으로 표시되었으며 이들을 별도로 모았다.
pH를 상기 모은 분획에서 확인하고 전형적으로 1 M NaOH-용액을 사용하여 4 내지 5.5로 조절하였다. 상기 모은 분획의 HPLC 분석 결과를 하기에 요약한다:
실시예 4 - 거대다공성 폴리스티렌-DVB 약염기성 음이온(자유 아민) 수지를 사용하여 LST-c, 6'-SL, LNnT 및 락토오스의 혼합물로부터 LST-c의 농축
실시예 3을 Dowex 88H(50 ㎖) 및 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지(자유 염기) Dowex 77(50 ㎖)을 사용하여 수 240 ㎖ 중의 12 g의 동결-건조된 혼합물로 반복하였다. 동일한 용출제를 사용하여 TLC를 수행하였으며, 이때 분획 1 내지 4는 단지 소량의 LST-c만을 가리켰고 이들을 별도로 모았다. 분획 5 내지 16은 LST-c, LNnT 및 락토오스의 혼합물을 함유하는 것으로 표시되었으며 이들을 별도로 모았다.
pH를 상기 모은 분획에서 확인하고 1 M NaOH로 4 내지 5.5로 조절하였다. 상기 모은 분획의 HPLC 분석 결과를 하기에 요약한다:
실시예 5 - 거대다공성 폴리스티렌-DVB 약염기성 음이온(자유 아민) 수지를 사용하여 LST-c, 6'-SL, LNnT 및 락토오스의 혼합물로부터 LST-c의 농축
실시예 3을 Dowex 88H(50 ㎖) 및 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지(자유 염기) DIAION WA 30(50 ㎖)을 사용하여 수 240 ㎖ 중의 12 g의 동결-건조된 혼합물로 반복하였다. 동일한 용출제를 사용하여 TLC를 수행하였으며, 이때 분획 2 내지 6은 LST-c의 부재를 가리켰고 이들을 별도로 모았다. 분획 7 내지 14는 LST-c, LNnT 및 락토오스의 혼합물을 함유하는 것으로 표시되었으며 이들을 별도로 모았다.
pH를 상기 모은 분획에서 확인하고 1 M NaOH로 4 내지 5.5로 조절하였다. 상기 모은 분획의 HPLC 분석 결과를 하기에 요약한다:
실시예 6 - 약염기성 거대다공성 음이온 수지의 결합 용량 결정
강산성 이온 교환 수지 Dowex 88H(200 ㎖) 및 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지(자유 염기) Dowex 66(200 ㎖)을 직렬로 연결하고, 1 l의 물에 용해된 13.0 g의 3'-SL 및 13.0 g의 6'-SL의 공급 용액을 산성 이온 교환 컬럼상에 로딩하였다. 전체적으로, 상기 두 번째 컬럼(Dowex 66)으로부터 용출된 14개 분획을 수집하고 TLC에 의해 검사하였다.
3'-SL 및 6'-SL은 Dowex 66에 결합하였기 때문에 첫 번째 분획에서 검출되지 않았다. Dowex 66의 결합 용량에 도달하였으면, 3'-SL 및 6'-SL이 용출되기 시작하였다(분획 6으로부터). 용출된 3'-SL 및 6'-SL을 함유하는 분획 6 내지 14를 수집하였다. 상기 분획을 이온 크로마토그래피(IC)에 의해 분석하였다.
분석에 따르면, 분획 6 내지 14는 8 g의 시알릴락토오스를 함유하였고, 따라서 18 g의 시알릴락토오스가 Dowex 66에 의해 흡착되었다(Dowex 66 100 ㎖당 약 15 mmol). 분획 6 내지 14의 조성에 기초하여, 3'-SL은 6'-SL보다 Dowex 66에 약간 더 강하게 결합한다.
실시예 7 - 약염기성 거대다공성 음이온성 수지상의 3'-SL 및 LST-a의 분리
강산성 이온 교환 수지 Dowex 88H(25 ㎖) 및 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지(자유 염기) Dowex 66(25 ㎖)이 각각 충전된 2개의 컬럼을 직렬로 연결하였다.
로딩 용액을 23.6 w/w% 3'-SL 및 73.9 w/w% LST-a를 함유하는 동결 건조된 분말로부터 제조하였으며, 여기서 3'-SL의 양은 실시예 6에 기초한 Dowex 66의 결합 용량에 상응하였다(즉 약 15 mmol/100㎖). 이와 관련하여, 공급 용액은 약 3.7 mmol의 3'-SL을 함유해야 한다. 상응하게, 10.0 g의 상기 동결-건조된 분말(따라서 3.7 mmol의 3'-SL 및 7.4 mmol의 LST-a를 함유한다)을 수 190 ㎖에 용해시켰다. 상기 용액을 산성 이온 교환 컬럼상에 로딩하고 두 번째 컬럼(Dowex 66)으로부터 용출된 분획을 수집하였다(45-50 ㎖). 유량은 시간당 2층 부피였다.
분획을 IC에 의해 분석하였다. 분획의 함량을 하기 표에 요약한다:
합친 분획 2 내지 6에서, LST-a/3'-SL 비율은 10:1이었다. 따라서, 약염기성 거대다공성 음이온성 수지상의 LST-a/3'-SL 혼합물의 크로마토그래피는 LST-a/3'-SL 몰비를 2:1에서 10:1로 개선시켰다.
실시예 8 - 약염기성 거대다공성 음이온성 수지상의 6'-SL 및 LST-c의 분리
강산성 이온 교환 수지 Dowex 88H(25 ㎖) 및 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지(자유 염기) Dowex 66(25 ㎖)이 각각 충전된 2개의 컬럼을 직렬로 연결하였다.
로딩 용액을, 285 g의 물에 22.0 w/w% 6'-SL(5.2 mmol) 및 33.3 w/w% LST-c(5.0 mmol)를 함유하는 동결 건조된 분말 15.0 g을 용해시켜 제조하였다. 상기 용액을 산성 이온 교환 컬럼에 로딩하고 두 번째 컬럼(Dowex 66)으로부터 용출된 분획을 수집하였다(45-50 ㎖). 유량은 시간당 2층 부피였다.
분획을 IC에 의해 분석하였다. 분획의 함량을 하기 표에 요약한다:
이 실험에서 6'-SL(20.8 mmol/100 ㎖)의 양은 Dowex 66(15 mmol/100 ㎖)의 결합 용량을 약 40%까지 초과하였다. 따라서, Dowex 66의 포화 후에, 결합되지 않은 6'-SL이 용출되기 시작하였다. 그럼에도 불구하고, 분획 2 내지 6은 농축된 비율로 LST-c를 함유하였다.
실시예 9 - 약염기성 거대다공성 음이온성 수지상의 3'-SL 및 FSL의 분리
강산성 이온 교환 수지 Dowex 88H(25 ㎖) 및 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지(자유 염기) Dowex 66(25 ㎖)이 각각 충전된 2개의 컬럼을 직렬로 연결하였다.
로딩 용액을 15.9 w/w% 3'-SL 및 27.5 w/w% FSL을 함유하는 동결 건조된 분말로부터 제조하였으며, 여기서 3'-SL의 양은 실시예 6에 기초한 Dowex 66의 결합 용량에 상응하였다(즉 약 15 mmol/100 ㎖). 이와 관련하여, 공급 용액은 약 3.7 mmol의 3'-SL을 함유해야 한다. 상응하게, 15.0 g의 상기 동결-건조된 분말(따라서 3.8 mmol의 3'-SL 및 5.3 mmol의 FSL을 함유한다)을 285 g의 물에 용해시켰다. 상기 용액을 산성 이온 교환 컬럼에 로딩하고 두 번째 컬럼(Dowex 66)으로부터 용출된 분획을 수집하였다(45 내지 50 ㎖). 유량은 시간당 2층 부피였다.
분획을 IC에 의해 분석하였다. 분획의 함량을 하기 표에 요약한다:
합친 분획 2 내지 7에서, FSL/3'-SL 비율은 5.6:1이었다. 따라서, 약염기성 거대다공성 음이온성 수지상의 FSL/3'-SL 혼합물의 크로마토그래피는 FSL/3'-SL 몰비를 2:1에서 5.6:1로 개선시켰다.
Claims (40)
- 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제1 올리고사카라이드를, 적어도 상기 제1 올리고사카라이드 및 적어도 하나의 카복실산 기를 함유하는 제2 올리고사카라이드를 포함하는 혼합물로부터 분리시키는 방법으로서,
상기 제1 올리고사카라이드는 상기 제2 올리고사카라이드보다 적어도 하나 적게 모노사카라이드 단위를 함유하고,
상기 방법은,
a) 용매, 바람직하게는 물 중의 상기 혼합물에, 상기 제1 및 제2 올리고사카라이드의 카복실산 기의 적어도 90%가 양성자화된 (산) 형태로 존재하도록 하는 pH 수준을 제공하는 단계, 및
b) 상기 단계 a)의 혼합물을, 바람직하게는 자유 염기 형태의 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 단계 a)의 혼합물을 상기 수지와 접촉시키는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 카복실산 기가 뉴라민산 단위 또는 잔기 중에 포함되는, 방법. - 제2항에 있어서,
상기 뉴라민산 단위 또는 잔기가 하기 시알산 단위 또는 잔기인, 방법:
.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 올리고사카라이드가 그들의 구조 내에 단지 하나의 (단일) 시알산 잔기 또는 단위를 함유하는, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 올리고사카라이드가 모유 올리고사카라이드(HMO)인, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 올리고사카라이드가 상기 제1 올리고사카라이드와 비교하여 정확히 하나의 추가의 모노사카라이드를 함유하는, 방법. - 제6항에 있어서,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 다이사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 트라이사카라이드이거나,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 트라이사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 테트라사카라이드이거나,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 테트라사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 펜타사카라이드이거나, 또는
- 상기 제1 올리고사카라이드가 펜타사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 테트라사카라이드인,
방법. - 제7항에 있어서,
상기 제1 올리고사카라이드가 트라이사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 테트라사카라이드인, 방법. - 제8항에 있어서,
상기 제1 올리고사카라이드가 3'-SL이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 FSL인, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 올리고사카라이드가 상기 제1 올리고사카라이드와 비교하여 정확히 2개의 추가의 모노사카라이드를 함유하는, 방법. - 제10항에 있어서,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 다이사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 테트라사카라이드이거나,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 트라이사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 펜타사카라이드이거나,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 테트라사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 헥사사카라이드이거나, 또는
- 상기 제1 올리고사카라이드가 펜타사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 펜타사카라이드인,
방법. - 제11항에 있어서,
상기 제1 올리고사카라이드가 트라이사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 펜타사카라이드인, 방법. - 제12항에 있어서,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 3'-SL이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 LST-a이거나,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 6'-SL이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 LST-c이거나,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 3'-SL이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc이거나, 또는
- 상기 제1 올리고사카라이드가 6'-SL이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc인,
방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 올리고사카라이드가 상기 제1 올리고사카라이드와 비교하여 정확히 3개의 추가의 모노사카라이드를 함유하는, 방법. - 제14항에 있어서,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 다이사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 펜타사카라이드이거나,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 트라이사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 헥사사카라이드이거나, 또는
- 상기 제1 올리고사카라이드가 테트라사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 헵타사카라이드인,
방법. - 제15항에 있어서,
상기 제1 올리고사카라이드가 트라이사카라이드이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 헥사사카라이드인, 방법. - 제16항에 있어서,
- 상기 제1 올리고사카라이드가 3'-SL이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 F-LST-a이거나, 또는
- 상기 제1 올리고사카라이드가 6'-SL이고, 상기 제2 올리고사카라이드가 F-LST-c인,
방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 올리고사카라이드가, 트랜스-시알리다제에 의해 매개되는 상기 제1 올리고사카라이드로부터 올리고사카라이드 수용체로의 시알산 전달의 생성물인, 방법. - 제18항에 있어서,
상기 올리고사카라이드 수용체가 그의 구조 내에 시알산 단위를 함유하지 않는, 방법. - 제19항에 있어서,
상기 올리고사카라이드 수용체가 모유 올리고사카라이드(HMO)인, 방법. - 제20항에 있어서,
상기 올리고사카라이드 수용체가 3-FL, LNT, LNnT, LNFP-II 및 LNFP-VI 중에서 선택되는, 방법. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 a)에서 제공된 제1 및 제2 올리고사카라이드의 혼합물이 수용액인, 방법. - 제22항에 있어서,
상기 수용액의 pH가, 제1 및 제2 올리고사카라이드 중 어느 하나보다 더 강한 무기산을 첨가하여 설정되는, 방법. - 제23항에 있어서,
상기 무기산이 HCl 또는 황산인, 방법. - 제24항에 있어서,
상기 수용액의 pH가 1.5 내지 3인, 방법. - 제22항에 있어서,
상기 수용액이, 상기 제1 및 제2 올리고사카라이드의 혼합물을 양성자화된 산성 양이온 교환 수지 상에 적용하거나 또는 상기 혼합물을 상기 수지와 접촉시킴으로써 제공되는, 방법. - 제26항에 있어서,
상기 산성 양이온 교환 수지가 강산성 양이온 교환 수지인, 방법. - 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 b)에서, 단계 a)에서 제공된 수용액이 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 적용되거나 또는 상기 수지와 접촉되는, 방법. - 제28항에 있어서,
상기 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지가 자유 염기 형태인, 방법. - 제29항에 있어서,
상기 수용액이 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 적용되거나 또는 상기 수지와 접촉되어, 상기 제1 올리고사카라이드가 상기 수지에 결합되는 것이 보장됨으로써, 제2 올리고사카라이드-풍부 수용액이 제공되는, 방법. - 제29항 또는 제30항에 있어서,
상기 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지가 폴리스티렌 주쇄 구조를 포함하는, 방법. - 제31항에 있어서,
상기 폴리스티렌 주쇄 구조가 다이비닐-벤젠과 가교결합되는, 방법. - 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 b)에서 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 적용되거나 또는 상기 수지와 접촉되는 수용액이, 상기 약염기성 거대다공성 음이온 교환 수지에 관하여 상기 제1 올리고사카라이드에 대해 사전-결정된 포화 한계 부근의 양으로 제1 올리고사카라이드를 함유하는, 방법. - 제33항에 있어서,
상기 용액 중 상기 제1 올리고사카라이드의 양이 상기 사전-결정된 포화 한계의 약 80 내지 120%인, 방법. - 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)에서, 단계 b)에서 수득된 제2 올리고사카라이드-풍부 수용액이 염기성 음이온 교환 수지에 적용되거나 또는 상기 수지와 접촉되는, 방법. - 제35항에 있어서,
상기 염기성 음이온 교환 수지가 염기 형태인, 방법. - 제35항 또는 제36항에 있어서,
상기 수용액이 염기성 음이온 교환 수지에 적용되거나 또는 상기 수지와 접촉되어, 상기 제2 올리고사카라이드가 상기 수지에 결합되는 것이 보장되는, 방법. - 제36항 또는 제37항에 있어서,
상기 음이온 교환 수지가 자유 염기 형태의 약염기성 음이온 교환 수지인, 방법. - 제38항에 있어서,
상기 약염기성 음이온 교환 수지가 겔 유형의 것인, 방법. - 제39항에 있어서,
상기 겔 유형의 약염기성 음이온 교환 수지가 폴리아크릴 수지인, 방법.
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