CN116583339A - 带电荷的寡糖的分离 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于分离不同寡糖的方法，所述不同寡糖具有至少一个羧酸基团，也称为带电荷的寡糖。所述方法允许高通量分离在非色谱方法中难以分离的寡糖，该方法涉及使用弱碱性大孔阴离子交换树脂。

Description

带电荷的寡糖的分离
技术领域
本发明涉及一种用于分离具有至少一个羧酸基团的不同寡糖(也称为带电荷的寡糖)的方法。该方法允许高通量分离在非色谱方法中难以分离的寡糖，并涉及使用弱碱性大孔阴离子交换树脂。
背景技术
寡糖，例如人乳寡糖(HMO)，可以通过多种不同的方法制备。这些方法通常包括细菌宿主的发酵，包括发酵液的下游加工。这种发酵方法适用于较小且不太复杂的寡糖，例如3’-唾液酸乳糖(3’-SL)和6’-唾液酸乳糖(6’-SL)，但不适用于较大且较复杂的寡糖。这对于带电荷的寡糖(即含有至少一个羧酸基团的寡糖)尤其如此。
为了制备更大和更复杂的寡糖，已经采用转糖苷酶(trans-glycosidase)反应，其中通过酶促催化将单糖单元从供体转移到受体寡糖。一个这样的实例是通过使用转唾液酸酶(trans-sialidase)将唾液酸单元从供体(例如3’-SL或6’-SL)转移到受体(例如3-FL、LNT或LNnT)(参见例如WO 2016/157108、WO 2016/199071)。然而，这些反应导致起始离析物(educt)和寡糖产物之间的平衡。在带电荷的寡糖的情况下，供体和产物不容易通过本领域已知的方法分离，因为它们都含有至少一个羧酸基团。目前可用的方法是低通量方法，如凝胶色谱法。
因此，本领域需要一种允许高通量分离带电荷的寡糖的方法。
发明内容
一方面，本发明涉及一种从包括至少第一寡糖和第二寡糖的混合物中分离所述第一寡糖的方法，第一寡糖含有至少一个羧酸基团，第二寡糖含有至少一个羧酸基团，其中所述第一寡糖含有比第二寡糖少至少一个的单糖单元，该方法包括以下步骤：
a)在溶剂中提供所述混合物，其pH水平确保第一寡糖和第二寡糖的至少90％的羧酸基团以质子化(游离酸)形式存在，和
b)将混合物应用到弱碱性大孔阴离子交换树脂上或使混合物与弱碱性大孔阴离子交换树脂接触。
在一个实施方式中，所述方法进一步在步骤b)之后包括步骤c)，将来自步骤b)的洗脱液或滤液应用到碱性阴离子交换树脂上或使所述洗脱液或滤液与碱性阴离子交换树脂接触，该碱性阴离子交换树脂例如凝胶型弱碱性阴离子交换树脂。
本发明的方法有效地将含羧酸基团的寡糖彼此分离，使得第一寡糖结合弱碱性大孔阴离子交换树脂而第二寡糖基本上不结合，因此提供高纯度的较大的寡糖。
另一方面，本发明涉及一种从混合物中分离含有至少一个唾液酸基团的第二寡糖的方法，该混合物包含含有至少一个唾液酸基团的第一寡糖、所述第一寡糖和任选的中性寡糖，其中所述第一寡糖含有比第二寡糖少至少一个的单糖单元，该方法包括以下步骤：
a)在溶剂中提供所述混合物，其pH水平确保第一寡糖和第二寡糖的至少90％的唾液酸基团以质子化(游离酸)形式存在，
b)将混合物应用到弱碱性大孔阴离子交换树脂上或使混合物与弱碱性大孔阴离子交换树脂接触，确保第一寡糖与树脂结合，
c)将步骤b)的洗脱液应用到碱性阴离子交换树脂上或使步骤b)的洗脱液与碱性阴离子交换树脂接触，该碱性阴离子交换树脂例如凝胶型弱碱性阴离子交换树脂，确保第二寡糖与树脂结合，
d)从树脂上洗脱第二寡糖，和
e)从步骤d)的洗脱液中分离第二寡糖。
具体实施方式
本发明涉及一种从包括至少第一寡糖和第二寡糖的混合物中分离所述第一寡糖的方法，第一寡糖含有至少一个羧酸基团，第二寡糖含有至少一个羧酸基团，其中所述第一寡糖含有比第二寡糖少至少一个的单糖单元，该方法包括以下步骤：
a)在溶剂中提供所述混合物，其pH水平确保至少90％的羧酸基团以质子化(游离酸)形式存在，
b)将步骤a)得到的混合物应用到弱碱性大孔阴离子交换树脂上或使步骤a)得到的混合物与弱碱性大孔阴离子交换树脂接触。
本发明方法的步骤b)确保与树脂结合的第一寡糖多于第二寡糖，并且第二寡糖在液相(流动)相中积累，因此第一寡糖和第二寡糖彼此分离是可能的。
在一个实施方式中，本发明涉及一种从包括至少第一寡糖和第二寡糖的混合物中分离所述第一寡糖的方法，第一寡糖含有至少一个羧酸基团，第二寡糖含有至少一个羧酸基团，其中所述第一寡糖含有比第二寡糖少至少一个的单糖单元，该方法包括以下步骤：
a)在溶剂中提供所述混合物，其pH水平确保至少90％的羧酸基团以质子化(游离酸)形式存在，
b)将步骤a)得到的混合物应用到弱碱性大孔阴离子交换树脂上或使步骤a)得到的混合物与弱碱性大孔阴离子交换树脂接触，以提供富含第二寡糖的溶液，和
c)将来自步骤b)的富含第二寡糖的溶液应用到碱性阴离子交换树脂上或使所述洗脱液与碱性阴离子交换树脂接触，该碱性阴离子交换树脂例如凝胶型弱碱性阴离子交换树脂。
通过使用该方法的步骤c)，可以获得高纯度的第二寡糖。
因此，本发明还涉及一种从混合物中分离含有至少一个唾液酸基团的第二寡糖的方法，该混合物包括含有至少一个唾液酸基团的第一寡糖、所述第一寡糖和任选的中性寡糖，其中所述第一寡糖含有比第二寡糖少至少一个的单糖单元，该方法包括以下步骤：
a)在溶剂中提供所述混合物，其pH水平确保第一寡糖和第二寡糖的至少90％的唾液酸基团以质子化(游离酸)形式存在，
b)将混合物应用到弱碱性大孔阴离子交换树脂上或使混合物与弱碱性大孔阴离子交换树脂接触，确保第一寡糖与树脂结合，从而提供富含第二寡糖和任选的中性寡糖的溶液，
c)将步骤b)的溶液应用到碱性阴离子交换树脂上或使步骤b)的溶液与碱性阴离子交换树脂接触，该碱性阴离子交换树脂例如凝胶型弱碱性阴离子交换树脂，确保第二寡糖与树脂结合，从而任选地洗脱中性寡糖，
d)从树脂上洗脱第二寡糖，和
e)从步骤d)的洗脱液中分离第二寡糖。
定义
术语“寡糖”优选是指具有直链或支链结构的碳水化合物聚合物，其含有多个但至少两个通过糖苷间键连接在一起的单糖单元。在本发明的上下文中，寡糖还包括二糖。在本发明上下文中的寡糖优选为游离形式，即它们在其任何游离异头、伯和仲OH-基团(例如醚、酯、缩醛等)上不含有保护基团，并且——在氨基脱氧糖中——它们的游离NH2-基团不含除乙酰基外的保护基团。寡糖优选是二糖、三糖、四糖、五糖或六糖。术语“单糖”优选是指具有5-9个碳原子的糖(碳水化合物)，它是醛糖(例如D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖等)、酮糖(如D-果糖、D-山梨糖、D-塔格糖等)、脱氧糖(如L-鼠李糖、L-岩藻糖等)、脱氧氨基糖(如N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺等)、糖醛酸、醛糖酸、酮醛糖酸(如唾液酸)、醛糖二酸或糖醇。
术语“含有至少一个羧酸基团的寡糖”优选是指具有含有羧酸基团的单糖单元的寡糖。含有羧酸基团的单糖单元优选糖醛酸、醛糖酸、酮醛糖酸或醛糖二酸，更优选酮醛糖酸。酮醛糖酸优选是神经氨酸例如N-乙酰基-、羟乙酰基-(glycolyl-)或脱氨基-神经氨酸(KDN)，更优选N-乙酰基-神经氨酸(NANA、唾液酸、Neu5Ac)。因此，含NANA的寡糖也可称为“唾液酸化寡糖”。因此，在一个实施方式中，含有至少一个羧酸基团的第一寡糖和第二寡糖是唾液酸化寡糖。优选地，第一寡糖和第二寡糖均仅含有一个羧酸基团，更优选仅含有一个唾液酸单元。
除非另有说明，否则本文所用的术语“人乳寡糖”或“HMO”通常是指在人乳中发现的多种复合碳水化合物(参见例如(Urashima等:Milk Oligosaccharides,NovaBiomedical Books,New York,2011；Chen Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.72,113(2015)))，其可以为酸性或中性形式。酸性HMO也称为“唾液酸化人乳寡糖”或“唾液酸化HMO”或“带电荷的HMO”，含有至少一个唾液酸单元，优选仅一个唾液酸单元。实例包括3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、唾液酸乳-N-四糖-a(LST-a)、唾液酸乳-N-四糖-b(LST-b)、唾液酸乳-N-四糖-c(LST-c)和3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖(FSL)。
在整个本文中，术语“含有至少一个羧酸基团的第一寡糖”和“第一寡糖”可互换使用。这同样适用于术语“含有至少一个羧酸基团的第二寡糖”和“第二寡糖”。
包含至少第一寡糖和第二寡糖的混合物，两者均含有至少一个羧酸基团
本发明方法中的第二寡糖比第一寡糖含有至少一个额外的单糖，换句话说，第二寡糖的聚合度高于第一寡糖的聚合度。在一个实施方式中，第一寡糖是二糖并且第二寡糖是三糖、四糖、五糖、六糖或更高级的寡糖。在其它实施方式中，第一寡糖是三糖并且第二寡糖是四糖、五糖、六糖或更高级的寡糖。在其它实施方式中，第一寡糖是四糖并且第二寡糖是五糖、六糖或更高级的寡糖。在其它实施方式中，第一寡糖是五糖并且第二寡糖是六糖或更高级的寡糖。此外，在更优选的实施方式中，与第一寡糖相比，第二寡糖含有仅(恰好)一个额外的单糖。在这方面，当第一寡糖是二糖时，第二寡糖是三糖；当第一寡糖是三糖时，第二寡糖是四糖；当第一寡糖是四糖时，第二寡糖是五糖；或者当第一寡糖是五糖时，第二寡糖是六糖；等等。在其它优选的实施方式中，与第一寡糖相比，第二寡糖含有恰好两个额外的单糖。在这方面，当第一寡糖是二糖时，第二寡糖是四糖；当第一寡糖是三糖时，第二寡糖是五糖；当第一寡糖是四糖时，第二寡糖是六糖；等等。在其它优选的实施方式中，与第一寡糖相比，第二寡糖含有恰好三个额外的单糖。在这方面，当第一寡糖是二糖时，第二寡糖是五糖；当第一寡糖是三糖时，第二寡糖是六糖；等等。甚至更优选地，在任何上述优选或更优选的实施方式中，第一寡糖和第二寡糖仅含有一个羧酸基团，特别是仅一个唾液酸单元。
当第二寡糖是唾液酸单元通过转唾液酸酶从唾液酸化的二糖、三糖或更高级的糖供体(作为第一寡糖)不完全转移到二糖、三糖、四糖或更高级的寡糖受体的产物，其中受体寡糖优选为中性寡糖(不含唾液酸)时，本发明的方法通常是有用的。因此，在一个实施方式中，第一寡糖是二糖或三糖。在另一个实施方式中，第一寡糖选自3’-唾液酸乳糖(3’-SL)和6’-唾液酸乳糖(6’-SL)。
在一个实施方式中，可通过发酵产生包含至少第一寡糖和第二寡糖的混合物，两者均含有至少一个羧酸基团。
在上述转唾液酸酶介导的酶促反应中，接受唾液酸单元的寡糖通常是优选不含有唾液酸单元的二、三、四、五或更高级的寡糖。通常，唾液酸化寡糖供体(即本发明上下文中的第一寡糖)所含的单糖单元不多于受体寡糖。因此，反应产物(即本发明上下文中的第二寡糖)是含有比受体寡糖恰好多一个单糖单元(其为唾液酸单元)的寡糖；在这方面，第二寡糖包含寡糖受体的结构。
因此，本发明上下文中的第一寡糖和第二寡糖的混合物通常是唾液酸单元通过转唾液酸酶从唾液酸化寡糖供体到中性寡糖受体的不完全转移的结果。因此，在根据本发明方法的一个实施方式中，第一寡糖和第二寡糖的混合物通过将转唾液酸酶添加到包含第一寡糖和不含羧基或唾液酸基团的前体寡糖底物(受体)的混合物中，从而将唾液酸单元从第一寡糖转移到受体上，从而制备第二寡糖来制备。转唾液酸酶介导的酶促反应可描述如下：
其中Sia-A是第一寡糖的一个实施方式并且是二糖、三糖、或更高级的唾液酸化寡糖，Sia是唾液酸单元或部分(moiety)，化合物B是优选不含有唾液酸单元的二糖、三糖、四糖、五糖或更高级的寡糖受体，Sia-B是第二寡糖的一个实施方式并且是三糖、四糖、五糖或更高级的唾液酸化寡糖，并且化合物A是来自Sia-A的离去单糖或寡糖，即去唾液酸化的Sia-A。通常，转唾液酸酶能够将Sia残基从新形成的Sia-B转移回先前由Sia-A产生的化合物A，因此达到平衡： 在上述酶促反应体系中，如果Sia-A和化合物B在结构上具有相同的单糖单元，则Sia-B恰好比Sia-A多一个单糖单元(因此，如果Sia-A和化合物B均为三糖，Sia-B是一种四糖，等等)。如果Sia-A和化合物B在其结构中具有相同的单糖单元，则Sia-B恰好比Sia-A多一个单糖单元(因此，如果Sia-A和化合物B均为三糖，Sia-B是一种四糖，等等)。如果Sia-A恰好比化合物B少一个单糖单元，Sia-B恰好比Sia-A多两个单糖单元(因此，如果Sia-A是三糖，化合物B是四糖，则Sia-B是五糖，等等)。如果Sia-A恰好比化合物B少两个单糖单元，则Sia-B恰好比Sia-A多三个单糖单元(因此，如果Sia-A是三糖，化合物B是五糖，则Sia-B是六糖，等等)。
转唾液酸酶显示出对供体和产物的选择性。因此，α2,3-转唾液酸酶有利地将唾液酸基团从α2,3-唾液酸化供体转移并优选产生α2,3-唾液酸化产物。因此，术语“α2,3-转唾液酸酶”优选指能够将优选α2,3-唾液酸化供体的唾液酸残基转移至寡糖受体中的半乳糖单元的3-位、优选末端的任何野生型或工程化唾液酸酶。这种转唾液酸酶优选是来自克氏锥虫(Trypanosoma cruzi，TcTS)的α2,3-转唾液酸酶。类似地，α2,6-转唾液酸酶有利地将唾液酸基团从α2,6-唾液酸化供体转移并优选产生α2,6-唾液酸化产物。因此，术语“α2,6-转唾液酸酶”优选指能够将优选α2,6-唾液酸化供体的唾液酸残基转移到寡糖受体中的半乳糖单元的6位、优选末端的任何野生型或工程化唾液酸酶。这样的转唾液酸酶优选是WO2016/199069中公开的那些，其内容整体并入本文以供参考。
在一个实施方式中，本发明提供一种从包含Sia-A、Sia-B、A和B的反应环境中分离Sia-A，随后任选地从中性寡糖A和B中分离Sia-B的便利方法。
可以制备至少包括含有唾液酸单元的第一寡糖(Sia-A)和含有唾液酸单元的第二寡糖(Sia-B)的混合物，例如根据WO 2016/157108或WO 2016/199071，其内容整体并入本文以供参考。
优选地，为了在转唾液酸酶介导的酶促反应中制备第一寡糖和第二寡糖的混合物，前体寡糖底物(受体，化合物B)是中性HMO。有利地，前体寡糖底物(受体)是3-FL、LNT、LNnT、LNFP-II或LNFP-VI。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种从包括含有唾液酸单元的第一寡糖(称为Sia-A)和含有唾液酸单元的第二寡糖(称为Sia-B)、化合物A和化合物B的混合物中分离所述第一寡糖的方法，其中所述第一寡糖含有比第二寡糖少至少一个的单糖单元，该方法包括以下步骤：
a)在溶剂中提供所述混合物，其pH值确保Sia-A和Sia-B的至少90％的唾液酸单元以质子化(酸)形式存在，和
b)将步骤a)的混合物应用到弱碱性大孔阴离子交换树脂上或使步骤a)的混合物与弱碱性大孔阴离子交换树脂接触，优选结合Sia-A并提供富含Sia-B和含有化合物A和B的水溶液。
在一个实施方式中，该方法进一步包括步骤c)：将来自步骤b)的水溶液应用到碱性阴离子交换树脂上或使所述溶液与碱性阴离子交换树脂接触，该碱性阴离子交换树脂例如凝胶型弱碱性阴离子交换树脂，优选结合Sia-B并提供富含化合物A和B的水溶液。
在一个实施方式中，Sia-A选自3’-SL和6’-SL。
在一个实施方式中，Sia-B选自FSL(3-O-岩藻糖基-3’-O-唾液酸乳糖，Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3)-]Glc)、LST-a(唾液酸乳-N-四糖a，Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)、LST-c( 唾 液 酸 乳 -N- 四 糖 c ，Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc ) 、Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc 、Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc、 F-LST-a(Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-[Fucα(1-4)-]GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)和F-LST-c
(Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3)-]Glc)。
在一个实施方式中，Sia-A选自3’-SL和6’-SL，并且Sia-B选自FSL(3-O-岩藻糖基-3’-O-唾液酸乳糖，Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3)-]Glc)、LST-a(唾液酸乳-N-四糖a，Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)、LST-c(唾液酸乳-N-四糖c，Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)、Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc 、Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc、 F-LST-a(Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-[Fucα(1-4)-]GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)和F-LST-c
(Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3)-]Glc)。
在一个实施方式中，第一寡糖(Sia-A)是6’-SL，第二寡糖(Sia-B)是LST-c(唾液酸乳-N-四糖c，Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)，优选从以下α2,6-转唾液酸酶催化的反应中获得：
在一个实施方式中，第一寡糖(Sia-A)是3’-SL，第二寡糖(Sia-B)是LST-a(唾液酸乳-N-四糖a，Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)，优选从以下α2,3-转唾液酸酶催化的反应中获得：
在一个实施方式中，第一寡糖(Sia-A)是3’-SL，第二寡糖(Sia-B)是FSL(3-O-岩藻糖基-3’-O-唾液酸乳糖，Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3)-]Glc)，优选从以下α2,3-转唾液酸酶催化的反应中获得：
在一个实施方式中，第一寡糖(Sia-A)是3’-SL，第二寡糖(Sia-B)是F-LST-a(Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-[Fucα(1-4)-]GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)，优选从以下α2,3-转唾液酸酶催化的反应中获得：
在一个实施方式中，第一寡糖(Sia-A)是6’-SL，第二寡糖(Sia-B)是F-LST-c(Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3)-]Glc)，优选从以下α2,6-转唾液酸酶催化的反应中获得：
在一个实施方式中，第一寡糖(Sia-A)是6’-SL，第二寡糖(Sia-B)是Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc，优选从以下α2,6-转唾液酸酶催化的反应中获得：
在一个实施方式中，第一寡糖(Sia-A)是3’-SL，第二寡糖(Sia-B)是Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc，优选从以下α2,3-转唾液酸酶催化的反应中获得：
为混合物提供正确的pH(步骤a)
在根据本发明的方法的步骤a)中，为混合物提供适合于在该方法中待分离的特定寡糖的水平的pH。在这方面，混合物优选是水溶液。为了实现最佳分离，第一寡糖和第二寡糖的羧酸基团应主要为质子化形式，即至少90％的羧酸基团应为游离酸形式。技术人员知道如何调节pH以确保质子化游离酸形式的所需水平。例如，可以测定含有羧酸的寡糖的pKa，然后使用Henderson-Hasselbalch方程计算所需的pH。为了获得所需量的质子化形式(90％)，pH计算为pH≈pKa-0.954。
在一种实施方式中，至少92％的羧酸基团呈质子化形式。在另一个实施方式中，至少95％的羧酸基团呈质子化形式。在又一个实施方式中，至少98％的羧酸基团呈质子化形式。
原则上可以通过本领域技术人员已知的任何方法调节pH，例如使用比含有羧酸基团的第一寡糖和第二寡糖更强的酸，优选更强的无机酸，其示例性实施方式可以是HCl-溶液或硫酸溶液。在一个实施方式中，pH被设置为大约1.5-3。
考虑到根据本发明的方法的步骤a)实现pH调节的方便且也优选的方式是使用质子化阳离子交换树脂。因此，在一个实施方式中，步骤a)中提供的设定好pH的混合物(pH-setmixture)通过将第一寡糖和第二寡糖的混合物应用到质子化酸性阳离子交换树脂(H+-形式的酸性阳离子交换树脂)上或使所述混合物与质子化酸性阳离子交换树脂接触来提供。优选地，质子化酸性阳离子交换树脂为质子化强酸性阳离子交换树脂。
在一个实施方式中，步骤a)中提供的水溶液形式的设定好pH的混合物可以通过将含有第一寡糖和第二寡糖的水溶液装载到填充有质子化酸性阳离子交换树脂、优选强酸性阳离子交换树脂的柱的顶部，用水洗脱并收集含有质子化形式的第一和第二酸性寡糖的级分(洗脱液)来获得。酸性阳离子交换树脂的量应足以将第一和第二酸性寡糖，例如从它们相应的盐形式转化为质子化形式。在一个替代的实施方式中，含有第一寡糖和第二寡糖的水溶液在容器中在搅拌下或不搅拌下与质子化酸性阳离子交换树脂、优选强酸性阳离子交换树脂接触，直到基本上所有羧酸基团都转化为质子化形式。然后分离树脂，例如通过过滤(滤液)。步骤a)中可获得的滤液和洗脱液均可称为“设定好pH的混合物”、“设定好pH的(含水)溶液”、“酸性阳离子交换树脂处理的混合物”或“酸性阳离子交换树脂处理的(含水)溶液”。所述设定好pH的溶液已准备好用于本发明的步骤b)。
在以上任一实施方式中，包括至少第一寡糖和第二寡糖(两者都含有至少一个羧酸基团、优选唾液酸单元或部分)的混合物可进一步包含中性寡糖。中性寡糖不与酸性阳离子交换树脂结合，因此在步骤a)后将与酸化(质子化)的第一寡糖和第二寡糖一起收集。
此外，包括至少第一寡糖和第二寡糖(两者都含有至少一个羧酸基团、优选唾液酸单元或部分)和任选的中性寡糖的混合物，可以进一步包含强无机酸的无机阴离子，通常氯化物(chloride)、硫酸盐(sulphate)、硝酸盐(nitrate)、磷酸盐(phosphate)等。它们的存在是可以容忍的，只要它们不显著降低弱碱性大孔阴离子交换树脂对于步骤b)中使用的含有至少羧基的第一寡糖的容量(见下文)。适当地，如果第一寡糖和第二寡糖的混合物都含有至少一个羧酸基团，如从以上公开的那些酶促反应获得，则无机阴离子的量基本上不影响本发明步骤b)中第一寡糖与第二寡糖的分离。在任何情况下，如果不需要这种无机阴离子的存在，在将本发明的步骤应用于混合物之前，可以至少部分地将它们从包含第一寡糖和第二寡糖(两者都含有至少一个羧酸基团、优选唾液酸单元或部分)的混合物中去除，例如通过利用合适的保留第一寡糖和第二寡糖并允许无机阴离子通过的膜，因为无机阴离子的尺寸比第一寡糖和第二寡糖小得多。
在使用比第一寡糖和第二寡糖(两者都含有至少一个羧酸基团、优选唾液酸单元或部分)中的任何一个都强的酸、优选无机酸设定含有第一寡糖和第二寡糖的溶液的pH至所需值的实施方式中，即当第一寡糖和第二寡糖中至少90％的羧酸基团呈质子化形式时，理想的是酸的应用量不要过多，以使酸的量不会显着降低弱碱性大孔阴离子交换树脂对于步骤b)中使用的含有至少羧基的第一寡糖的容量(见下文)。为避免这种过量使用无机酸，建议将pH设定为1.5-3左右。
将步骤a)得到的混合物应用到弱碱性大孔阴离子交换树脂上(步骤b)
在根据本发明的方法的步骤b)中，将步骤a)中提供的水溶液形式的设定好pH的混合物应用到弱碱性大孔阴离子交换树脂或与其接触。
碱性阴离子交换树脂可以是强碱性或弱碱性的，并且可以是大孔的或凝胶型的。大孔离子交换树脂设计为具有允许在三维结构中有更大的孔的交联度，而凝胶型离子交换树脂不含更大的孔。
碱性阴离子交换树脂通常具有聚丙烯酸或聚苯乙烯主链，它们在各个聚合物链之间交联。典型的交联剂是二乙烯基苯(DVB)。因此，在一个优选的实施方式中，弱碱性大孔阴离子交换树脂包括聚苯乙烯主链。在另一个实施方式中，弱碱性大孔阴离子交换树脂包含由二乙烯基苯交联的主链。在又一个优选实施方式中，弱碱性大孔阴离子交换树脂包括二乙烯基苯交联的聚苯乙烯主链。
弱碱性阴离子交换树脂通常包含碱基，其具有孤对电子以吸引质子，例如某些含氮基团。碱基不应为质子化形式，换句话说，它们是游离碱基。因此，在一个实施方式中，弱碱性大孔阴离子交换树脂包含具有孤对电子以吸引质子的碱基。在进一步的实施方式中，弱碱性大孔阴离子交换树脂包含具有孤对电子以吸引质子的氮原子。这些基团包括，例如伯胺、仲胺、叔胺(游离胺基)、胍基或含氮杂芳基(如吡啶基、嘧啶基等)，优选叔胺。在又一个实施方式中，弱碱性大孔阴离子交换树脂在二乙烯基苯交联的聚苯乙烯主链上含有游离胺基。后者的实例包括来自Lanxess的Lewatit MP62、来自Dow的Dowex 77、来自MitsubishiChemical的DIAION WA30和来自Dow的Dowex 66。
不受特定理论的束缚，游离碱形式的弱碱性大孔阴离子交换树脂的碱性和孔径允许相对于含有至少一个羧酸基团的第二寡糖选择性结合含有至少一个羧酸基团的第一寡糖。与任何其它树脂一样，弱碱性大孔阴离子交换树脂具有一定的结合能力。因此，树脂上寡糖的负载量有利地根据结合容量/饱和极限向最佳结合寡糖(即根据本发明的方法中的第一寡糖)进行调整。替代地，弱碱性大孔阴离子交换树脂的量有利地进行调整，以根据树脂对最佳结合寡糖(即第一寡糖)的结合容量/饱和极限来匹配寡糖装载到树脂上的量。因此，在根据本发明的方法的一个实施方式中，第一寡糖的量在第一寡糖对于弱碱性大孔阴离子交换树脂的先前确定的饱和极限附近。可以通过使具有相对大量的第一寡糖的样品通过树脂并测量通过树脂的量来确定饱和极限。饱和极限计算为初始量减去通过树脂的量。
在一个实施方式中，混合物中第一寡糖的量为第一寡糖对于弱碱性大孔阴离子交换树脂的先前确定的饱和极限的约80-120％，例如85％、90％、95％、100％、105％、110％或115％。
进料溶液中存在的比第一寡糖强的酸，通常是无机酸，可以占据步骤b)中使用的弱碱性大孔阴离子交换树脂的游离碱官能团。然而，如果它们的量较小，例如，如果第一寡糖和第二寡糖的混合物是从酶促反应(见上文)中获得的，并且步骤a)使用强酸性离子交换树脂(H+形式)进行或步骤a)中使用的以将包含羧酸基团的第一寡糖和第二寡糖转化为质子化形式的强酸不过量应用，则它们的存在基本上不影响本发明步骤b)的分离效果。
在一个实施方式中，可以将步骤a)中获得的水溶液形式的设定好pH的混合物装载到填充有计算量的弱碱性大孔阴离子交换树脂、优选具有二乙烯基苯交联聚苯乙烯主链的弱碱性大孔阴离子交换树脂的柱的顶部并用水洗脱。第一寡糖通过吸附到树脂的游离碱性官能团上而与弱碱性大孔阴离子交换树脂结合，第二寡糖(连同任选存在的其它中性寡糖)穿过树脂并作为洗脱液收集。
在替代实施方式中，步骤a)中获得的水溶液形式的设定好pH的混合物在容器中在搅拌下或不搅拌下与计算量的弱碱性大孔阴离子交换树脂、优选具有二乙烯基苯交联的聚苯乙烯主链的弱碱性大孔阴离子交换树脂接触，直到基本上所有的第一寡糖通过吸附到树脂的游离碱性官能团上而结合到弱碱性大孔阴离子交换树脂上。第二寡糖(连同其它任选存在的中性寡糖)保留在溶液中。然后将结合有第一寡糖的树脂，从含有第二寡糖的溶液(滤液)中分离(例如通过过滤)。在步骤b)中可获得的滤液和洗脱液均可称为富含第二寡糖的(含水)溶液。
任选地，在进行本发明的步骤b)并收集富含第二寡糖的溶液之后，然后可以用合适的第二洗脱溶液，例如，用稀释的氨溶液或比第一寡糖酸性更强的酸溶液，优选无机酸如HCl，以连续或分批模式将第一寡糖从弱碱性大孔阴离子交换树脂洗脱下来。因此，然后可以将第一寡糖以足够的纯度与第二寡糖分离，并且可以以糖浆形式分离或通过例如结晶、沉淀、喷雾干燥、冷冻干燥分离。
技术人员理解，根据条件，一些少量的第一寡糖可能不与弱碱性大孔阴离子交换树脂结合和/或一些少量的第二寡糖可能与弱碱性大孔阴离子交换树脂结合。因此，即使不能实现第一寡糖与第二寡糖的完全分离，但至少大部分的第一寡糖可以与至少大部分的第二寡糖分离。在这方面，可以在步骤b)结束时收集富含第二寡糖的级分，随后可以用第二洗脱溶液从弱碱性大孔阴离子交换树脂上洗下来至少第一寡糖的富集级分。
任选步骤c)
根据本发明的方法用于分离第一寡糖和第二寡糖。虽然第一寡糖通常可从其它来源获得高纯度，但本方法允许以一定程度的纯度分离第二寡糖，否则该程度的纯度将需要低通量色谱法，如凝胶色谱法或制备型HPLC。因此，在本发明方法的一个实施方式中，收集步骤b)产生的含有并富集第二寡糖的溶液，从中可以分离第二寡糖。
在一个实施方式中，第二寡糖可以以糖浆形式或通过本领域已知的方法，包括结晶、沉淀、喷雾干燥、冷冻干燥等，直接从步骤b)中获得的水溶液中分离。
在其它实施方式中，第二寡糖可以进一步纯化，然后从步骤b)中获得的水溶液中分离。因此，将所述溶液应用到阴离子交换树脂上或与碱性阴离子交换树脂，优选碱性形式的弱碱性阴离子交换树脂接触，确保寡糖结合到树脂上。在任选步骤c)中应用的弱碱性离子交换树脂可以与在先步骤b)中应用的弱碱性离子交换树脂相同或不同。优选地，步骤c)中使用的弱碱性离子交换树脂与步骤b)中使用的弱碱性离子交换树脂不同，更优选地，步骤c)中使用的弱碱性阴离子交换树脂为凝胶型。甚至更优选地，凝胶型弱碱性阴离子交换树脂是聚丙烯酸树脂。
根据本发明的方法的初始混合物至少包括含有至少一个羧酸基团的第一寡糖和第二寡糖。该混合物还可以另外含有不含任何羧酸基团的其它寡糖(“中性寡糖”)。在根据本发明的方法的步骤c)中，如果步骤b)中得到的溶液除了第二寡糖之外还包含中性寡糖，中性寡糖不结合树脂而第二寡糖结合树脂，因此中性寡糖可方便地与第二寡糖分离。在收集含有中性寡糖的洗脱液或滤液(取决于步骤c)是以色谱法还是分批模式进行的方式)之后，然后结合的第二寡糖可以用合适的洗脱液，例如，用稀释的氨溶液或比第二寡糖的酸性更强的酸溶液，优选无机酸如HCl，从碱性树脂洗脱。
如果根据本发明的方法的步骤a)使用质子化阳离子交换树脂进行，则步骤a)和b)可以方便地通过将来自步骤a)的洗脱液直接传递至步骤b)中的树脂来进行而无需任何洗脱液级分的中间收集。类似地，如果需要步骤c)，来自步骤b)的洗脱液可以方便地直接传递至步骤c)中的树脂。因此，在根据本发明的方法的一个实施方式中，在没有任何洗脱液级分的中间收集的情况下进行这些步骤。
提供本发明的以下编号方面：
方面1.一种从包括至少第一寡糖和第二寡糖的混合物中分离所述第一寡糖的方法，第一寡糖含有至少一个羧酸基团，第二寡糖含有至少一个羧酸基团，其中所述第一寡糖含有比第二寡糖少至少一个的单糖单元，该方法包括以下步骤：
a)在溶剂、优选水中提供所述混合物，其pH水平确保第一寡糖和第二寡糖的至少90％的羧酸基团以质子化(酸)形式存在，和
b)使步骤a)的混合物与游离碱形式的弱碱性大孔阴离子交换树脂接触，从而提供富含所述第二寡糖的水溶液。
方面2.方面1的方法，其中寡糖是唾液酸化人乳寡糖，优选单唾液酸化人乳寡糖。
方面3.方面1或2的方法，其中大孔树脂包括聚苯乙烯主链结构，优选与二乙烯基苯交联。
方面4.方面1至3中任一项的方法，其中步骤b)中的与弱碱性大孔阴离子交换树脂接触的步骤a)的混合物含有的第一寡糖的量在第一寡糖对于弱碱性大孔阴离子交换树脂的先前确定的饱和极限附近，优选为先前确定的饱和极限的80-120％。
方面5.方面2至4中任一项的方法，其中通过向第一寡糖和不含羧酸基团的前体寡糖底物添加转唾液酸酶来制备第一寡糖和第二寡糖的混合物。
方面6.方面5的方法，其中，在步骤c)中，将步骤b)中得到的富含第二寡糖且含有前体寡糖的水溶液与阴离子交换树脂、优选与游离碱形式的弱碱性阴离子交换树脂接触。
方面7.方面6的方法，其中弱碱性阴离子交换树脂为凝胶型。
方面8.前述方面中任一项的方法，其中步骤a)中的pH为1.5-3。
方面9.前述方面中任一项的方法，其中第一寡糖是3’-唾液酸乳糖并且第二寡糖是FSL(3-O-岩藻糖基-3’-O-唾液酸乳糖)、LST-a(唾液酸乳-N-四糖a)、F-LST-a(Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-3)-[Fucα(1-4)-]GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc)或Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc。
方面10.方面1至8中任一项的方法，其中第一寡糖是6’-唾液酸乳糖并且第二寡糖是LST-c(唾液酸乳-N-四糖c)、F-LST-c(Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-[Fucα(1-3)-]Glc)或Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc。
实施例
实施例1–LST-c的酶促反应和纯化
基本上根据WO 2016/199071的实施例1，LNnT(136mmol)和6’-SL(72mmol)在其中公开的被其信号肽(Δ2-15)截短的鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)JT-SHIZ-119转唾液酸酶的A218Y-N222R-G349S-S412P-D451K突变体的存在下反应。纯化和冷冻干燥后，获得以下混合物：LNnT(45.2w％)、6’-SL(16.3w％)、LST-c(31.4w％)和乳糖(9.6w％)。将混合物溶解在水中得到3.6白利糖度(°Bx)的溶液，并通过三个相互连接的填充有不同离子交换树脂的柱，使得树脂1的洗脱液直接引至树脂2的柱的顶部，并且其洗脱液直接引至树脂3的柱的顶部。树脂1为Dowex88(H+型强酸性阳离子交换树脂(SAC))，而树脂2和3为弱碱性阴离子交换树脂(WBA1:Dowex66，其是大孔聚苯乙烯-DVB树脂，WBA2:AmberliteFPA53，其是聚丙烯酸凝胶型树脂；两者均为游离碱形式)。LNnT和乳糖不与任何树脂结合。使用WBA1树脂使其对应于5mmol 6’-SL/100ml树脂。6’-SL选择性地结合WBA1，而LST-c选择性地结合WBA2。随后，柱断开连接。使用0.5M HCl溶液从WBA2洗脱LST-c，并使用NaOH溶液将pH调节至4.8。溶液通过纳滤脱盐。LST-c通过冷冻干燥分离(24.5g)，纯度为91.4％(LNnT0.3w％，6’-SL 2.9w％，无乳糖)。
实施例2–LST-a的酶促反应和纯化
基本上根据WO 2016/157108，LNT(134mmol)和3’-SL(70mmol)在来自克氏锥虫(T.cruzi)(TcTS)的α2,3-转唾液酸酶的存在下反应。纯化后，以白利糖度4.0溶液的形式获得以下混合物：LNT(42.1w％)、3’-SL(10.3w％)、LST-a(24.2w％)和乳糖(10.3w％)。该溶液通过三个相互连接的填充有不同离子交换树脂的柱，使得树脂1的洗脱液直接引至树脂2的柱的顶部，并且其洗脱液直接引至树脂3的柱的顶部。树脂1为Dowex88(H+型强酸性阳离子交换树脂(SAC))，而树脂2和3为弱碱性阴离子交换树脂(WBA1:Dowex66，其是大孔聚苯乙烯-DVB树脂，WBA2:Amberlite FPA53，其是聚丙烯酸凝胶型树脂；两者均为游离碱形式)。LNT和乳糖不与任何树脂结合。使用WBA树脂使其对应于5mmol 3’-SL/100ml树脂。3’-SL选择性地结合WBA1，而LST-a选择性地结合WBA2。随后，柱断开连接。使用0.5M HCl溶液从WBA2洗脱LST-a，并使用NaOH溶液将pH调节至约6。溶液通过纳滤脱盐。LST-a通过冷冻干燥分离(38.4g)，纯度为91.4％(LNT 0.5w％，3’-SL 0.6w％，无乳糖)。
实施例3–使用大孔聚苯乙烯-DVB弱碱性阴离子(游离胺)树脂从LST-c、6’-SL、LNnT和乳糖的混合物中富集LST-c
将10g含有LST-c 13.09g/l、6’-SL 5.92g/l、LNnT 17.74g/l和乳糖4.64g/l的冻干混合物用水(240ml)溶解以获得<5°Bx的溶液。对进料组合物进行取样并通过HPLC进行分析以确定每种成分的量。
强酸性离子交换树脂DOWEX88H(40ml)和弱碱性大孔阴离子交换树脂(游离碱)LEWATIT MP62(40ml)串联偶联，并负载进料溶液。收集50ml的级分，使用纯水作为洗脱液收集总共16个级分。
通过TLC对级分进行点样，并使用AcCN:NH3:水(6:3:1)作为洗脱液进行评估。级分2-5不含LST-c，并单独合并。级分6-8表明含有LST-c、LNnT和乳糖的混合物，并单独合并。级分9-13表明含有纯LST-c并单独合并。
检查合并的级分的pH值，通常用1M NaOH溶液将其调节至4-5.5。合并级分的HPLC分析结果总结如下：
实施例4–使用大孔聚苯乙烯-DVB弱碱性阴离子(游离胺)树脂从LST-c、6’-SL、LNnT和乳糖的混合物中富集LST-c
使用Dowex 88H(50ml)和弱碱性大孔阴离子交换树脂(游离碱)Dowex 77(50ml)，用12g冻干混合物在240ml水中重复实施例3。使用相同的洗脱液进行TLC，其中级分1-4表明只有少量的LST-c，并单独合并。级分5-16表明含有LST-c、LNnT和乳糖的混合物，并单独合并。
检查合并的级分中的pH并用1M NaOH将其调节至4-5.5。合并级分的HPLC分析结果总结如下：
实施例5–使用大孔聚苯乙烯-DVB弱碱性阴离子(游离胺)树脂从LST-c、6’-SL、LNnT和乳糖的混合物中富集LST-c
使用Dowex 88H(50ml)和弱碱性大孔阴离子交换树脂(游离碱)DIAION WA 30(50ml)，用12g冻干混合物在240ml水中重复实施例3。使用相同的洗脱液进行TLC，其中级分2-6表明不存在LST-c，并单独合并。级分7-14表明含有LST-c、LNnT和乳糖的混合物，并单独合并。
检查合并的级分中的pH并用1M NaOH将其调节至4-5.5。合并级分的HPLC分析结果总结如下：
实施例6——弱碱性大孔阴离子树脂结合容量的测定
将强酸性离子交换树脂Dowex 88H(200ml)和弱碱性大孔阴离子交换树脂(游离碱)Dowex 66(200ml)串联偶联，并将13.0g 3’-SL和13.0g 6’-SL溶解在1升水中的进料溶液装载到酸性离子交换柱上。总共收集从第二根柱(Dowex 66)洗脱的14个级分，并通过TLC检查。
由于与Dowex 66结合，因此在第一级分中未检测到3’-SL和6’-SL。当达到Dowex66的结合容量时，3’-SL和6’-SL(从级分6)开始洗脱。收集含有洗脱的3’-SL和6’-SL的级分6-14。通过离子色谱法(IC)分析级分。
根据分析，级分6-14含有8g唾液酸乳糖，因此Dowex 66吸附了18g唾液酸乳糖(≈15mmol/100ml Dowex 66)。基于级分6-14的组成，3’-SL与Dowex 66的结合比6’-SL略强。
实施例7–在弱碱性大孔阴离子树脂上分离3’-SL和LST-a
将分别装有强酸性离子交换树脂Dowex 88H(25ml)和弱碱性大孔阴离子交换树脂(游离碱)Dowex 66(25ml)的两根柱串联偶联。
从含有23.6w/w％3’-SL和73.9w/w％LST-a的冻干粉末制备装载溶液，其中3’-SL的量对应于基于实施例6的Dowex 66的结合容量(即≈15mmol/100ml)。在这方面，进料溶液应含有≈3.7mmol的3’-SL。因此，将10.0g上述冻干粉末(因此含有3.7mmol的3’-SL和7.4mmol的LST-a)溶解在190ml水中。将溶液装载到酸性离子交换柱上并收集从第二个柱(Dowex 66)洗脱的级分(45-50ml)。流速为每小时2个床体积。
通过IC分析级分。级分的含量总结在下表中：
在合并的级分2-6中，LST-a/3’-SL比为10:1。因此，LST-a/3’-SL混合物在弱碱性大孔阴离子树脂上的层析将LST-a/3’-SL摩尔比从2:1提高到10:1。
实施例8–在弱碱性大孔阴离子树脂上分离6’-SL和LST-c
将分别装有强酸性离子交换树脂Dowex 88H(25ml)和弱碱性大孔阴离子交换树脂(游离碱)Dowex 66(25ml)的两根柱串联偶联。
通过将15.0g含有22.0w/w％6’-SL(5.2mmol)和33.3w/w％LST-c(5.0mmol)的冻干粉末溶解在285g水中来制备装载溶液。将溶液装载到酸性离子交换柱上并收集从第二个柱(Dowex 66)洗脱的级分(45-50ml)。流速为每小时2个床体积。
通过IC分析级分。级分的含量总结在下表中：
在此实验中，6’-SL(20.8mmol/100ml)的量超过Dowex66的结合容量(15mmol/100ml)约40％。因此，在Dowex 66饱和后，未结合的6’-SL开始洗脱。不过，级分2-6以富集比含有LST-c。
实施例9–在弱碱性大孔阴离子树脂上分离3’-SL和FSL
将分别装有强酸性离子交换树脂Dowex 88H(25ml)和弱碱性大孔阴离子交换树脂(游离碱)Dowex 66(25ml)的两根柱串联偶联。
从含有15.9w/w％3’-SL和27.5w/w％FSL的冻干粉末制备装载溶液，其中3’-SL的量对应于基于实施例6的Dowex 66的结合容量(即≈15mmol/100ml)。在这方面，进料溶液应含有≈3.7mmol的3’-SL。因此，将15.0g上述冻干粉末(因此含有3.8mmol 3’-SL和5.3mmolFSL)溶解在285g水中。将溶液装载到酸性离子交换柱上并收集从第二个柱(Dowex 66)洗脱的级分(45-50ml)。流速为每小时2个床体积。
通过IC分析级分。级分的含量总结在下表中：
在合并级分2-7中，FSL/3’-SL比为5.6:1。因此，FSL/3’-SL混合物在弱碱性大孔阴离子树脂上的层析将FSL/3’-SL摩尔比从2:1提高到5.6:1。

Claims (40)

1.一种从包括至少第一寡糖和第二寡糖的混合物中分离所述第一寡糖的方法，所述第一寡糖含有至少一个羧酸基团，所述第二寡糖含有至少一个羧酸基团，其中所述第一寡糖含有比所述第二寡糖少至少一个的单糖单元，所述方法包括以下步骤：
a)在溶剂、优选水中提供所述混合物，其pH水平确保所述第一寡糖和所述第二寡糖的至少90％的羧酸基团以质子化(酸)形式存在，和
b)将步骤a)的所述混合物应用到弱碱性大孔阴离子交换树脂上或使步骤a)的所述混合物与所述弱碱性大孔阴离子交换树脂接触，所述弱碱性大孔阴离子交换树脂优选为游离碱形式，从而提供富含所述第二寡糖的水溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述羧酸基团包括在神经氨酸单元或部分中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述神经氨酸单元或部分是唾液酸单元或部分：
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一寡糖和所述第二寡糖在其结构中仅含有一个(单个)唾液酸部分或单元。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一寡糖和所述第二寡糖是人乳寡糖(HMO)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述第一寡糖相比，所述第二寡糖含有恰好一个额外的单糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其中：
-所述第一寡糖是二糖，并且所述第二寡糖是三糖，
-所述第一寡糖是三糖，并且所述第二寡糖是四糖，
-所述第一寡糖是四糖，并且所述第二寡糖是五糖，或
-所述第一寡糖是五糖，并且所述第二寡糖是四糖。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一寡糖是三糖，并且所述第二寡糖是四糖。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一寡糖是3’-SL，并且所述第二寡糖是FSL。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与所述第一寡糖相比，所述第二寡糖含有恰好两个额外的单糖。
11.根据权利要求10所述的方法，其中：
-所述第一寡糖是二糖，并且所述第二寡糖是四糖，
-所述第一寡糖是三糖，并且所述第二寡糖是五糖，
-所述第一寡糖是四糖，并且所述第二寡糖是六糖，或
-所述第一寡糖是五糖，并且所述第二寡糖是五糖。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一寡糖是三糖，并且所述第二寡糖是五糖。
13.根据权利要求12所述的方法，其中：
-所述第一寡糖是3’-SL，并且所述第二寡糖是LST-a，
-所述第一寡糖是6’-SL，并且所述第二寡糖是LST-c，
-所述第一寡糖是3’-SL，并且所述第二寡糖是Neu5Acα(2-3)-Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc，或
-所述第一寡糖是6’-SL，并且所述第二寡糖是Neu5Acα(2-6)-Galβ(1-3)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc。
14.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与所述第一寡糖相比，所述第二寡糖含有恰好三个额外的单糖。
15.根据权利要求14所述的方法，其中：
-所述第一寡糖是双糖，并且所述第二寡糖是五糖，
-所述第一寡糖是三糖，并且所述第二寡糖是六糖，或
-所述第一寡糖是四糖，并且所述第二寡糖是七糖。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一寡糖是三糖，并且所述第二寡糖是六糖。
17.根据权利要求16所述的方法，其中：
-所述第一寡糖是3’-SL，并且所述第二寡糖是F-LST-a，或
-所述第一寡糖是6’-SL，并且所述第二寡糖是F-LST-c。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二寡糖是由转唾液酸酶介导的唾液酸从所述第一寡糖转移到寡糖受体的产物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述寡糖受体的结构不含有唾液酸单元。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述寡糖受体是人乳寡糖(HMO)。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述寡糖受体选自3-FL、LNT、LNnT、LNFP-II或LNFP-VI。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)中提供的所述第一寡糖和所述第二寡糖的所述混合物是水溶液。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述水溶液的pH通过添加比所述第一寡糖和所述第二寡糖中的任何一个都强的无机酸来设定。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述无机酸是HCl或硫酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述水溶液的pH为1.5-3。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述水溶液通过将所述第一寡糖和所述第二寡糖的所述混合物应用到质子化酸性阳离子交换树脂上或使所述混合物与所述质子化酸性阳离子交换树脂接触来提供。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述酸性阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中，在步骤b)中，将步骤a)提供的所述水溶液应用到弱碱性大孔阴离子交换树脂或使所述水溶液与所述弱碱性大孔阴离子交换树脂接触。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述弱碱性大孔阴离子交换树脂为游离碱形式。
30.根据权利要求29所述的方法，其中将所述水溶液应用到弱碱性大孔阴离子交换树脂或使所述水溶液与所述弱碱性大孔阴离子交换树脂接触，以确保所述第一寡糖结合到所述树脂上，从而提供富含所述第二寡糖的水溶液。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述弱碱性大孔阴离子交换树脂包括聚苯乙烯主链结构。
32.根据权利要求31所述的方法，其中聚苯乙烯主链结构与二乙烯基苯交联。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中在步骤b)中应用到所述弱碱性大孔阴离子交换树脂或与所述弱碱性大孔阴离子交换树脂接触的所述水溶液含有的第一寡糖的量在所述第一寡糖对于所述弱碱性大孔阴离子交换树脂的先前确定的饱和极限附近。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述溶液中所述第一寡糖的量为所述先前确定的饱和极限的约80-120％。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中，在步骤c)中，将步骤b)中获得的富含所述第二寡糖的所述水溶液应用到碱性阴离子交换树脂或使所述水溶液与所述碱性阴离子交换树脂接触。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述碱性阴离子交换树脂为碱形式。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中将所述水溶液应用到所述碱性阴离子交换树脂上或使所述水溶液与所述碱性阴离子交换树脂接触，以确保所述第二寡糖结合到所述树脂上。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述阴离子交换树脂是游离碱形式的弱碱性阴离子交换树脂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述弱碱性阴离子交换树脂为凝胶型。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述凝胶型弱碱性阴离子交换树脂是聚丙烯酸树脂。
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