CN114703242A - 一种尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种尿苷二磷酸‑N‑乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法。以N‑乙酰氨基葡萄糖或N‑乙酰氨基葡萄糖衍生物为底物，以N‑乙酰己糖胺‑1‑激酶和UDP‑GalNAc焦磷酸化酶共固定化酶制剂为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸‑N‑乙酰氨基葡萄糖及其衍生物。本发明中的生物合成方法以N‑乙酰己糖胺‑1‑激酶和UDP‑GalNAc焦磷酸化酶为催化剂，根据不同的糖类底物，实现了尿苷二磷酸‑N‑乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的量产。且不需要昂贵辅料ATP的加入，极大地降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及了一种尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法， 属于生物合成技术领域。
背景技术
糖核苷酸作为功能性糖缀合物和碳水化合物生物合成中的天然糖基供体，参与了对生物体的功能和生存至关重要的过程，也是体外利用Leloir型糖基转移酶合成碳水化合物不可或缺的组成元件。糖核苷酸还可以通过调节作用决定糖蛋白在细胞表面的整体分布。以糖核苷酸为底物合成寡糖和多糖是近年来的研究热点，例如多糖产物中的肝素具有抗凝、抗炎、调节血脂、抗过敏等功效，在治疗哮喘和慢性阻塞性肺病方面具有潜在的应用价值。
尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)作为GlcNAc的活化形式是Leloir型糖基化酶促反应合成生理活性糖链的普遍供体，参与体内的O-GlcNAc循环，也是内膜系统中糖脂、O-连接的GalNAc和N-连接的糖蛋白的前体，帮助内质网和高尔基体的内膜糖基化。UDP-GlcNAc是真核生物内质网中脂质连接寡糖组装所需的第一个糖核苷酸。很多重要的多糖或糖复合物如糖胺聚糖的基本构成单元广泛需要UDP-GlcNAc作为供体。因此研究有效制备UDP-GlcNAc及其衍生物的方法在合成、生物和药物化学中都具有相当重要的意义。
糖核苷酸的合成方法主要包括化学法和酶法合成。由于在有机溶剂中糖核苷酸的溶解度较低，且糖苷键和焦磷酸键不耐水解，加上多糖结构的复杂性，通过化学法合成糖核苷酸十分艰难。化学合成需要用到吡啶、N,N’-二环己基碳二亚胺等许多有机试剂和活化剂，通常包括多步保护基操作和异构体分离，操作过程繁琐、副产物较多、产物纯化困难，不仅会造成环境污染，而且长时间的化学反应可能会导致糖核苷酸的降解，从而降低反应产率。酶法合成利用酶的高效专一的特异性，具有高立体选择性和高区域选择性，能够模拟糖核苷酸的生物合成途径，催化效率高，反应条件温和，对环境十分友好。但是在极端条件下酶的稳定性差，高温或强酸强碱的条件下易失活，游离酶在反应体系中无法回收利用导致生产成本高，这些限制性因素限制了一些酶在工业生产中的应用。中国专利文献CN101230372A公开了一种全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法。该合成方法以果糖、尿苷酸、葡糖胺和磷酸根为底物，以有透性的酵母细胞为载体全细胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。但是该专利通过加入谷氨酰胺利用酵母细胞自身的UDP-GlcNAc代谢途径进行全细胞催化合成的步骤繁杂、中间产物多不易控制、产物得率较低、无法做到酶的重复利用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双 酶共固定化合成方法。该方法包括一条全新的UDP-GlcNAc合成路径，在无需ATP的加入下 合成UDP-GlcNAc，降低生产成本；并且双酶共固定化合成方法，提高了酶的稳定性，实现 了酶的可重复利用，是一种简单高效、经济环保的UDP-GlcNAc及其衍生物的生物合成方法。
本发明的技术方案如下：
一种尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法，步骤如下：
以N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物为底物，向底物中加入腺苷三磷酸、尿苷三磷酸、Tris-HCl缓冲液、无机离子和无机焦磷酸酶，然后以N-乙酰己糖胺 -1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)或尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖衍生物。
根据本发明优选的，所述N-乙酰氨基葡萄糖衍生物为N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、叠氮化N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAz)、N-乙酰-6-O-磺酸基-葡糖胺(GlcNAc6S)、N-三氟乙酰葡糖胺(GlcNTFA)或N-三氟乙酰半乳糖胺(GalNTFA)之一；
所述尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖衍生物为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基半乳糖(UDP-GalNAc)、尿苷二磷酸-叠氮化N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAz)、尿苷二磷酸-N- 乙酰-6-O-磺酸基-葡糖胺(UDP-GlcNAc6S)、尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)或尿苷二磷酸-N-三氟乙酰半乳糖胺(UDP-GalNTFA)，与底物相对应。
根据本发明优选的，所述N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的终浓度均为1.0～1.5mM。
进一步优选的，所述N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的终浓度均为1.0mM。
根据本发明优选的，所述腺苷三磷酸的终浓度为1.0～1.5mM。
进一步优选的，所述腺苷三磷酸的终浓度为1.2mM。
根据本发明优选的，所述尿苷三磷酸的终浓度为1.0～1.5mM。
进一步优选的，所述尿苷三磷酸的终浓度为1.2mM。
根据本发明优选的，所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为100mM。
根据本发明优选的，所述无机离子为镁离子。
进一步优选的，所述镁离子由氯化镁水解产生，镁离子的终浓度为10～20mM。
根据本发明优选的，所述无机焦磷酸酶(PmPPA酶)的终浓度为0.4～0.8mg/mL。
根据本发明优选的，所述生物合成的反应温度为27～47℃，转速为900～1100rpm/min，反应时间为50～70min。
进一步优选的，所述生物合成的反应温度为32℃，转速为1000rpm/min，反应时间为 60min。
根据本发明优选的，所述N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶 Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的制备方法如下：
1)分别以N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1为目的基因，以pET-21a(+)为载体质粒，构建重组质粒，然后分别将重组质粒转化至大肠杆菌中，得到含有N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和含有 UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌；
2)选择转化成功的重组大肠杆菌扩大培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，收集菌液后进行破碎和离心，分别得到含有N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的上清液；
3)将含有N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的上清液一起加入到阳离子交换树脂中，在4℃，1000 rpm/min下孵育2～3h，得到N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶 Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂。
根据本发明优选的，步骤1)中，所述N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK的GenBank 登录号为69578838，所述UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因AGX1的GenBank登录号为6675。
根据本发明优选的，步骤3)中，所述N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc 焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂中Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1的酶负载量比为 (0.5～2.0)：1；
进一步优选的，所述Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂中N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK的负载量为0.5～2.2mg/g，UDP-GalNAc焦磷酸化酶 AGX1的负载量为0.2～0.8mg/g，单位：蛋白mg/树脂g。
最优选的，所述Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1的酶负载量比为(1.0～1.5)：1。
根据本发明优选的，步骤3)中，所述阳离子交换树脂为purolite chromalite MS/C树脂。
一种扩大化生产尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的方法，步骤如下：
按照上述方法在组装的流动合成装置中连续合成，得到尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖 (UDP-GlcNAc)及其衍生物；
所述N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的终浓度均为10～12mM；
所述腺苷三磷酸的终浓度为12～15mM；
所述尿苷三磷酸的终浓度为12～15mM；
所述缓冲液中Tris的终浓度为100mM；
所述无机离子为镁离子，终浓度为10～20mM；
所述无机焦磷酸酶的终浓度为0.4～0.8mg/mL；
所述N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的质量为2.0～3.0mg，总体积为0.8～1.2mL；
所述流动合成装置包括通过管道依次连接的底物槽，恒流泵和催化剂槽，底物位于底物槽内，催化剂槽内设置有N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，然后通过恒流泵将反应底物泵入催化剂槽内进行生物合成，合成后再将产物泵回至反应槽内；
所述流动合成装置的流速为1.0～1.8mL/min。
根据本发明优选的，所述N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的终浓度均为12mM。
根据本发明优选的，所述腺苷三磷酸的终浓度为14mM。
根据本发明优选的，所述尿苷三磷酸的终浓度为14mM。
根据本发明优选的，所述N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶 Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的质量为2.79mg，总体积为1.0mL。
根据本发明优选的，所述流动合成装置的流速为1.2mL/min。
本发明的技术特点：
如图1所示，本发明以N-乙酰己糖胺-1-激酶NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶AGX1为催化剂，首先催N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物和腺苷三磷酸反应，得到相应的糖-1-磷酸，然后再加入尿苷三磷酸和无机焦磷酸酶，得到尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)及其衍生物。
有益效果：
1、本发明中的生物合成方法以N-乙酰己糖胺-1-激酶NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶AGX1为催化剂，根据不同的糖类底物，实现了尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的量产，并且不需要昂贵辅料ATP的加入，极大地降低了生产成本。
2、本发明中的N-乙酰己糖胺-1-激酶NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶AGX1是以共固定化酶制剂的形式参与反应，省去了酶的纯化步骤，提高了酶的pH耐受性和热稳定性，并且共固定化酶的转换数是游离酶的8～12倍，极大地提高了生产效率。
3、本发明还提供了一种扩大化生产尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的方法，步骤简单，条件温和、工艺环保，且共固定化酶制剂可以多次重复使用，前三次反应转化率均达到了100％，UDP-GlcNAc平均产率为66.7％，共固定化酶的转换数高达521.9g/g，由1L Zbasic2-NahK和1L Zbasic2-AGX1菌液可以合成14.56g的UDP-GlcNAc，适合推广应用于工业生产。
附图说明
图1：尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)及其衍生物的双酶共固定化合成方法流程图；
图2：游离酶N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1 的SDS-PAGE分析结果图；
图3：单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的SDS-PAGE分析结果图；
图4：单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂的催化反应活性的TLC检测结果图；
图5：单独固定的Zbasic2-AGX1固定化制剂的催化反应活性的HPLC检测结果图；
图中，横坐标为保留时间，纵坐标为电信号强度；
图6：单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂的最佳酶负载量结果图；
图中，横坐标为载体上酶的负载量，纵坐标为相对活性；
图7：单独固定的Zbasic2-AGX1固定化制剂的最佳酶负载量结果图；
图中，横坐标为载体上酶的负载量，纵坐标为相对活性；
图8：单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂的最适pH结果图；
图中，横坐标为pH值，纵坐标为相对活性；
图9：单独固定的Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适pH结果图；
图中，横坐标为pH值，纵坐标为相对活性；
图10：单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂的最适温度结果图；
图中，横坐标为温度，纵坐标为相对活性；
图11：单独固定的Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适温度结果图；
图中，横坐标为温度，纵坐标为相对活性；
图12：单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂的循环利用次数结果图；
图中，横坐标为循环次数，纵坐标为产率；
图13：单独固定的Zbasic2-AGX1固定化制剂的循环利用次数结果图；
图中，横坐标为循环次数，纵坐标为产率；
图14：Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的SDS-PAGE分析结果图；
图15：Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂催化反应活性的HPLC检测结果图；
图中，横坐标为保留时间，纵坐标为电信号强度；
图16：Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最佳负载量之比结果图；
图中，横坐标为载体上酶的负载量之比，纵坐标为相对活性；
图17：Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最适pH结果图；
图中，横坐标为pH值，纵坐标为相对活性；
图18：Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最适温度结果图；
图中，横坐标为温度，纵坐标为相对活性；
图19：Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的循环利用次数结果图；
图中，横坐标为循环次数，纵坐标为产率；
图20：Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂流动合成循环次数产物的产率结果图；
图中，横坐标为循环次数，纵坐标为产率；
图21：Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂流动合成反应合成的UDP-GlcNAc的MS图谱；
图22：尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化流动合成装置图；
图中：1、底物槽，2、催化剂槽，3、恒流泵，4、Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特殊说明，本发明中所运用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而非限制本发明的保护范围。
实施例中所述purolite chromalite MS/C树脂，苏州汇通色谱分离纯化有限公司有售。
所采用的底物糖类标准品试剂均购自于sigma公司，重组大肠杆菌均为南京金斯瑞生物科技有限公司合成，所用菌株和质粒载体见表1。
表1本发明所用的菌株和质粒载体
本发明所采用的TLC检测方法如下：
硅胶板：TLC Silica gel 60F254硅胶薄层层析板；展开剂：正丁醇：冰醋酸：水＝2：1：1 (v:v:v)；染色剂：酸性茴香醛染色液。
本实验用日本岛津LC-20A高效液相色谱仪，紫外检测器为SPD-20A，色谱柱为YMC-Pack PolyamineⅡ(250×4.6mml)，UDP-Sugar的液相分析程序如表2所示：
表2 UDP-Sugar所用HPLC分析程序
实施例1.重组大肠杆菌Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1的表达与单独固定化
1、分别以N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1为目的基因，以pET-21a(+)为载体质粒，构建重组质粒Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1，然后分别将重组质粒Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，得到含有N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌。以上重组菌的构建均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
所述N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK的GenBank登录号为69578838，所述UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因AGX1的GenBank登录号为6675。
2、将含有N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc 焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌分别接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的30mL LB液体培养基中，37℃，转速为225rpm，活化14h；将活化后的菌液接种到含有100μg/mL 氨苄青霉素的500mL LB培养基中扩大培养，使初始OD600值为0.05；37℃，转速为225rpm，扩大培养至OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，22℃，转速为 225rpm，诱导18～20h，测定重组大肠杆菌菌液的OD600值，含有N-乙酰己糖胺-1-激酶基因 Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值分别为3.2～3.6和3.2～3.4。
收集菌液，4℃，转速为9000rpm/min，离心30min，然后将菌体沉淀用Tris-HCl缓冲液 (20mmol/L Tris，5mmol/L咪唑，0.5mmol/L NaCl，pH为8.0～8.5)进行重悬，重悬后的菌液进行超声破碎。超声破碎的程序为超声8s，停顿25s，能量15000KJ，振幅40％，有效破碎时间15min。随后用低温高速离心机在4℃、9000rpm/min的条件下离心30min，分别获得含有N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的破碎后上清液。
使用Lysis平衡缓冲液对Ni-Sepharose 6Fast Flow柱进行平衡，流速1mL/min，平衡10 个柱体积。所述Lysis平衡缓冲液的组分为50mmol/L NaH2PO4，0.3mol/L NaCl，pH＝8.0。将过滤后的含有N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc 焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的破碎上清液加到平衡好的Ni-Sepharose 6Fast Flow柱中，流速0.5mL/min，；用洗涤缓冲液洗涤Ni柱以除去杂蛋白，流速1mL/min，洗涤8个柱体积或者直到流出液的A280值达到最低且稳定；用洗脱缓冲液洗脱Ni柱，收集洗脱液，当流出液的A280值陡然上升时开始收集洗脱液，直到A280数值降到最低且稳定时停止收集。收集到的洗脱液用SDS-PAGE进行分析，结果如图2所示，目的蛋白分子量与理论值相符，说明纯化得到了目的蛋白N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1。
所述洗涤缓冲液的组分为50mmol/L NaH2PO4，0.3mol/L NaCl，10mol/L咪唑，pH＝8.0。
所述洗脱缓冲液的组分为50mmol/L NaH2PO4，0.3mol/L NaCl，250mol/L咪唑，pH＝8.0。
将含有N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的破碎后上清液分别加入到阳离子交换树脂purolite chromalite MS/C上，4℃，1000rpm/min，孵育3h，进行单独固定化，得到单独固定的 Zbasic2-NahK固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂。孵育结束后取出上清液，用Tris-HCl洗涤树脂，破碎上清液、固定化后的上清液、洗涤液和固定化酶用SDS-PAGE进行分析。结果如图3所示，两种目的蛋白均有选择性地固定到了树脂上。
所述洗涤包括用双蒸水洗涤阳离子交换树脂2次后再用Tris-HCl缓冲液洗涤2次，所述 Tris-HCl缓冲液组分为50mM Tris，250mM NaCl，pH8.0。
实施例3.单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的催化反应
1)Zbasic2-NahK固定化制剂的催化反应活性测定
将实施例1中制备的Zbasic2-NahK固定化制剂加入反应体系中，反应体系如表3所示， 37℃，1000rpm/min反应1h后，煮沸5min终止反应，室温条件下6000rpm/min离心2min，将离心上清液用0.45μm滤膜过滤后进行TLC分析。
表3 Zbasic2-NahK固定化制剂的催化反应体系
TLC结果如图4所示，与负对照相比，反应液中生成了GlcNAc-1-P，说明Zbasic2-NahK固定化制剂具有将N-乙酰氨基葡萄糖转化为GlcNAc-1-P的活性。
2)Zbasic2-AGX1固定化制剂的催化反应活性测定
将实施例1中制备的Zbasic2-AGX1固定化制剂加入反应体系中，反应体系如表4所示， 37℃，1000rpm/min反应1h后，煮沸5min终止反应，室温条件下6000rpm/min离心2min，将离心上清液用0.45μm滤膜过滤后进行HPLC分析。
表4 Zbasic2-AGX1固定化制剂的催化反应体系
HPLC结果如图5所示，反应液中生成了UDP-GlcNAc，说明Zbasic2-AGX1固定化制剂具有将GlcNAc-1-P转化为UDP-GlcNAc的活性。
3)单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最佳酶负载量测定
固定化酶的负载量是指固定在阳离子交换树脂上的蛋白质量除以树脂的质量，也就是加入的破碎上清中蛋白的质量与固定化后上清液中蛋白的质量和两次洗涤液中蛋白的质量之差除以阳离子交换树脂的质量。反应体系如表5所示，每组实验设置三个平行。
表5 Zbasic2-NahK固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的催化反应体系
结果如图6和图7所示，单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最佳酶负载量分别为0.8mg/g和0.5mg/g(蛋白mg/树脂g)。
4)单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适pH测定
反应体系如表5所示，设置六个pH梯度：pH5.5/6.5/7.5/8.5/9.5/10.5，同时用游离酶做对照，比较单独固定化酶和游离酶在不同pH反应条件下的活性差异，每组实验设置三个平行。
结果如图8和图9所示，单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适反应pH均为9.5。
5)单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适温度测定
反应体系如表5所示，设置反应温度分别为27℃、32℃、37℃、45℃、55℃，同时用游离酶做对照，比较单独固定化酶和游离酶在不同温度反应条件下的活性差异，每组实验设置三个平行。
结果如图10和图11所示，单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适反应温度均为27℃。
6)单独固定的Zbasic2-NahK固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的循环利用次数测定
反应体系如表5所示，按已测得的最适pH和温度进行测定，每组实验设置三个平行。
结果如图12和图13所示，Zbasic2-NahK固定化制剂重复利用20次后合成UDP-GlcNAc的产率由初始的70％降为63％，Zbasic2-AGX1固定化制剂重复利用19次后合成UDP-GlcNAc的产率由初始的78％降为50％。
实施例4.N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂
1、Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的制备
取实施例1中的含有N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和含有 UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的破碎上清液，混合后加入到阳离子交换树脂purolite chromalite MS/C上，在4℃，1000rpm/min下孵育3h，进行共固定化。孵育结束后取出上清液，用Tris-HCl洗涤树脂，固定化酶用SDS-PAGE进行分析。
结果如图14所示，固体载体上结合了两种蛋白，与相应蛋白的分子量一致，说明Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化到了树脂上，得到了N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂(Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂)。
2、Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的催化反应活性测定
取步骤1得到的Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，按表6所示的反应体系进行催化反应，37℃反应1h后用HPLC检测。
表6 Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的催化反应体系
结果如图15所示，反应生成了UDP-GlcNAc，说明Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂具有合成UDP-GlcNAc的活性。
3、Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最佳酶负载量之比的测定
取步骤1得到的Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，设置Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1的酶量比为1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1，按表6所示的反应体系，37℃反应1h，每组实验设置三个平行，HPLC分析反应产物。
结果如图16所示，Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1的酶量比为1～1.5时，UDP-GlcNAc产率最高。
4、Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最适pH测定
取步骤1得到的Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，按表6所示的反应体系进行催化反应，设置六个pH梯度：pH5.5/6.5/7.5/8.5/9.5/10.5，同时用游离酶做对照，比较 Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂和游离酶在不同pH反应条件下的活性差异，每组实验设置三个平行。
结果如图14所示，Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂在pH为8.5～10.5时UDP-GlcNAc产率均在60％以上，在pH为9.5时UDP-GlcNAc产率为80％，所以Zbasic2-NahK 和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂最适反应pH为9.5。
5、Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最适温度测定
取步骤1得到的Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，按表6所示的反应体系进行催化反应，设置反应温度分别为27℃、32℃、37℃、45℃、55℃，同时用游离酶做对照，比较Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂和游离酶在不同温度反应条件下的活性差异，每组实验设置三个平行。
结果如图18所示，Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂在27～45℃时UDP-GlcNAc 产率在75％以上，在32℃时UDP-GlcNAc产率最高，所以Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最适温度为32℃。
6、Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的循环利用次数测定
取步骤1得到的Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，按表6所示的反应体系进行催化反应，一次反应结束后回收利用共固定化酶，进行新一轮循环，每组实验设置三个平行。
结果如图19所示，Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂共循环利用15次，平均UDP-GlcNAc产率为71.2％。说明本发明提供的共固定化酶制剂可以多次重复使用，进一步降低了成本。
实施例5.利用Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂流动合成UDP-GlcNAc
流动合成装置如图22所示，所述流动合成装置包括通过管道依次连接的底物槽，恒流泵和催化剂槽，底物位于底物槽内，催化剂槽内设置有Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，然后通过恒流泵将反应底物泵入催化剂槽内进行生物合成，合成后再将产物泵回至反应槽内，流速1.2mL/min，Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂体积为1mL，反应体系如表7所示，一次循环反应16h，经HPLC进行测定。
表7 Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂流动合成反应体系
流动合成循环反应的UDP-GlcNAc产率如图20所示，前三次循环反应的转换率均为100％，共进行6次循环，平均每次循环反应的产率为66.7％，酶的转换数高达521.9g/g，1L的Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂可以合成14.56g的UDP-GlcNAc。
将反应液经Bio-Gel P2纯化后，进行MS检测，MS结果图见图21。质谱条件为负离子，得到了与UDP-GlcNAc(Mw＝607.4)脱去一个质子后分子量相符合的峰(605.96)，证明目标产物UDP-GlcNAc合成成功。
实施例6.Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂合成UDP-GlcNAc衍生物
按表7反应体系，以Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂为催化剂，催化底物为 GalNAc、GlcNAz、GlcNTFA、GalNTFA、GlcNAc6S进行循环反应，同时用游离酶做对照，每组实验设置三个平行，结果如表8所示，
所述尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)的衍生物包括尿苷二磷酸-N-乙酰氨基半乳糖(UDP-GalNAc)、尿苷二磷酸-叠氮化N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAz)、尿苷二磷酸-N-乙酰-6-O-磺酸基-葡糖胺(UDP-GlcNAc6S)、尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)、尿苷二磷酸-N-三氟乙酰半乳糖胺(UDP-GalNTFA)。
表8游离酶和Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂合成UDP-GlcNAc衍生物的产率
由表8可知，利用Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂合成UDP-GlcNAc衍生物的平均产率在23.9％～75.9％，酶的转换数是游离酶的2～8.4倍。因此，目前为止Zbasic2-NahK 和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂具有合成尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)及其6种衍生物的能力，且酶的效力要明显高于游离酶。说明本发明提供的方法可以根据不同的糖类底物，同时实现了尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的量产。
Claims (10)
1.一种尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法，其特征在于，步骤如下：
以N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物为底物，向底物中加入腺苷三磷酸、尿苷三磷酸、Tris-HCl缓冲液、无机离子和无机焦磷酸酶，然后以N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖或尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖衍生物。
2.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法，其特征在于，所述N-乙酰氨基葡萄糖衍生物为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基半乳糖、尿苷二磷酸-叠氮化N-乙酰氨基葡萄糖、尿苷二磷酸-N-乙酰-6-O-磺酸基-葡糖胺、尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺或尿苷二磷酸-N-三氟乙酰半乳糖胺之一；
所述尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖衍生物为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基半乳糖、尿苷二磷酸-叠氮化N-乙酰氨基葡萄糖、尿苷二磷酸-N-乙酰-6-O-磺酸基-葡糖胺、尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺或尿苷二磷酸-N-三氟乙酰半乳糖胺，与底物相对应。
3.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法，其特征在于，所述N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的终浓度均为1.0～1.5mM；
进一步优选的，所述N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的终浓度均为1.0mM。
4.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法，其特征在于，所述腺苷三磷酸的终浓度为1.0～1.5mM；所述尿苷三磷酸的终浓度为1.0～1.5mM；所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为100mM；所述无机离子为镁离子；所述无机焦磷酸酶的终浓度为0.4～0.8mg/mL。
5.如权利要求4所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法，其特征在于，所述腺苷三磷酸的终浓度为1.2mM；所述尿苷三磷酸的终浓度为1.2mM；所述镁离子由氯化镁水解产生，镁离子的终浓度为10～20mM。
6.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法，其特征在于，所述生物合成的反应温度为27～47℃，转速为900～1100rpm/min，反应时间为50～70min；
进一步优选的，所述生物合成的反应温度为32℃，转速为1000rpm/min，反应时间为60min。
7.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法，其特征在于，所述N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的制备方法如下：
1)分别以N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1为目的基因，以pET-21a(+)为载体质粒，构建重组质粒，然后分别将重组质粒转化至大肠杆菌中，得到含有N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌；
所述N-乙酰己糖胺-1-激酶基因Zbasic2-NahK的GenBank登录号为69578838，所述UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因AGX1的GenBank登录号为6675；
2)选择转化成功的重组大肠杆菌扩大培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，收集菌液后进行破碎和离心，分别得到含有N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的上清液；
3)将含有N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的上清液一起加入到阳离子交换树脂中，在4℃，1000rpm/min下孵育2～3h，得到N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂。
8.如权利要求7所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法，其特征在于，步骤3)中，所述N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂中Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1的酶负载量比为(0.5～2.0)：1；所述阳离子交换树脂为purolite chromalite MS/C树脂；
进一步优选的，所述Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂中N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK的负载量为0.5～2.2mg/g，UDP-GalNAc焦磷酸化酶AGX1的负载量为0.2～0.8mg/g，单位：蛋白mg/树脂g；
最优选的，所述Zbasic2-NahK和Zbasic2-AGX1的酶负载量比为(1.0～1.5)：1。
9.一种扩大化生产尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的方法，其特征在于，步骤如下：
按照权利要求1所述的方法在组装的流动合成装置中连续合成，得到尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物；
所述N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的终浓度均为10～12mM；
所述腺苷三磷酸的终浓度为12～15mM；
所述尿苷三磷酸的终浓度为12～15mM；
所述缓冲液中Tris的终浓度为100mM；
所述无机离子为镁离子，终浓度为10～20mM；
所述无机焦磷酸酶的终浓度为0.4～0.8mg/mL；
所述N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的质量为2.0～3.0mg，总体积为0.8～1.2mL；
所述流动合成装置包括通过管道依次连接的底物槽，恒流泵和催化剂槽，底物位于底物槽内，催化剂槽内设置有N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，然后通过恒流泵将反应底物泵入催化剂槽内进行生物合成，合成后再将产物泵回至反应槽内；
所述流动合成装置的流速为1.0～1.8mL/min。
10.如权利要求9所述的扩大化生产尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的方法，其特征在于，所述N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的终浓度均为12mM；
所述腺苷三磷酸的终浓度为14mM；
所述尿苷三磷酸的终浓度为14mM；
所述N-乙酰己糖胺-1-激酶Zbasic2-NahK和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的质量为2.79mg，总体积为1.0mL；
所述流动合成装置的流速为1.2mL/min。
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