JP2008154495A - ラクト−n−ビオースi及びガラクト−n−ビオースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】N−アセチルグルコサミン又はN−アセチルガラクトサミン、リン酸、ラクト−N−ビオースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.211)及びUDP−グルコース−4−エピメラーゼ(EC 5.1.3.2)の存在下で、(i)糖質原料と、該糖質原料を加リン酸分解しα−グルコース−1−リン酸を生じる酵素との組合せ;並びに(ii)α−グルコース−1−リン酸をUDP−グルコースに変換する酵素及びUDPガラクトースをガラクトース−1−リン酸に変換する酵素とそれらの補因子との組合せ、及び/又はα−グルコース−1−リン酸及びUDP−ガラクトースをそれぞれUDP−グルコース及びα−ガラクトース−1−リン酸に変換する酵素(UDP−Gly生成酵素)とその補因子との組合せを作用させることを特徴とする、ラクト−N−ビオースI又はガラクト−N−ビオースの製造方法。
【選択図】図3
Description
(1)N−アセチルグルコサミン、リン酸、ラクト−N−ビオースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.211;1,3β−ガラクトシル−N−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ)及びUDP−グルコース−4−エピメラーゼ(EC 5.1.3.2)の存在下で、
(i)糖質原料と、該糖質原料を加リン酸分解しα−グルコース−1−リン酸を生じる酵素(G1P生成酵素)との組合せ;並びに
(ii)α−グルコース−1−リン酸をUDP−グルコースに変換する酵素及びUDP−ガラクトースをα−ガラクトース−1−リン酸に変換する酵素とそれらの補因子との組合せ、及び/又はα−グルコース−1−リン酸及びUDP−ガラクトースをそれぞれUDP−グルコース及びα−ガラクトース−1−リン酸に変換する酵素(UDP−Gly生成酵素)とその補因子との組合せを作用させることを特徴とする、ラクト−N−ビオースIの製造方法。
(i)糖質原料と、該糖質原料を加リン酸分解しα−グルコース−1−リン酸を生じる酵素(G1P生成酵素)との組合せ;並びに
(ii)α−グルコース−1−リン酸をUDP−グルコースに変換する酵素及びUDP−ガラクトースをα−ガラクトース−1−リン酸に変換する酵素とそれらの補因子との組合せ、及び/又はα−グルコース−1−リン酸及びUDP−ガラクトースをそれぞれUDP−グルコース及びα−ガラクトース−1−リン酸に変換する酵素(UDP−Gly生成酵素)とその補因子との組合せを作用させることを特徴とする、ガラクト−N−ビオースの製造方法。
(5)酵素が担体に固定化されている、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
以下に本発明の実施例を示す。
本発明者らはスクロースを糖質原料としたときのラクト−N−ビオースI合成について、ラクト−N−ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、UDP−グルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、及びグルコース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼとガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素を取得するため、Bifidobacterium longum JCM1217株ゲノムDNAより該酵素遺伝子の単離を行った。ラクト−N−ビオースホスホリラーゼ遺伝子は特開2005−341883に記載の方法で取得した。スクロースホスホリラーゼ(BL0536;配列番号1)、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ(BL1644;配列番号2)、UDP−グルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(BL1211;配列番号3)、及びグルコース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼとガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素(BL0739;配列番号4)の各遺伝子はBifidobacterium longum NCC2705株ゲノムデータベースに登録されている該酵素遺伝子の塩基配列を基にしてプライマーを作製した(配列番号5〜20;表1参照)。
スクロースを糖質原料としてラクト−N−ビオースIへの変換反応を行った。反応液量は1ミリリットルとし、終濃度0.24Mスクロース、0.24M N−アセチルグルコサミン、10mM 塩化マグネシウム、30mM リン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)、1mM UDP−グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクト−N−ビオースホスホリラーゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、UDP−グルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、スクロースホスホリラーゼを1ミリリットル当たり2U、20U、2.6U、2U加え、30℃で90時間反応を行った。反応を10分間煮沸停止後反応液のpHを4.5に調整しインベルターゼ処理を行うことにより残存スクロースを分解した。反応液をTLC(溶媒アセトニトリル−水75:25、担体シリカゲル60)で分析した結果、ラクト−N−ビオースI濃度は200mMであった。(図1、レーン2,3)
セロビオースを糖質原料としてラクト−N−ビオースIへの変換反応を行った。反応液量は1ミリリットルとし、終濃度0.24Mセロビオース、0.24M N−アセチルグルコサミン、10mM 塩化マグネシウム、30mM リン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)、1mM UDP−グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクト−N−ビオースホスホリラーゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、UDP−グルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、セロビオースホスホリラーゼを1ミリリットル当たり2U、20U、2.6U、10U加え、30℃で90時間反応を行った。反応を10分間煮沸停止後反応液のpHを5に調整しβグルコシダーゼ処理を行うことにより残存スクロースを分解した。反応液をTLC(溶媒アセトニトリル−水75:25、担体シリカゲル60)で分析した結果、ラクト−N−ビオースI濃度は80mMであった。(図1、レーン4,5)
ラミナリビオースを糖質原料としてラクト−N−ビオースIへの変換反応を行った。反応液量は1ミリリットルとし、終濃度0.24Mラミナリビオース、0.24M N−アセチルグルコサミン、10mM 塩化マグネシウム、30mM リン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)、1mM UDP−グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクト−N−ビオースホスホリラーゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、UDP−グルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼを1ミリリットル当たり2U、20U、2.6U、5U加え、30℃で90時間反応を行った。反応を10分間煮沸停止後反応液のpHを5に調整しβグルコシダーゼ処理を行うことにより残存スクロースを分解した。反応液をTLC(溶媒アセトニトリル−水75:25、担体シリカゲル60)で分析した結果、ラクト−N−ビオースI濃度は80mMであった。(図1、レーン6,7)
マルトヘプタオースを糖質原料としてラクト−N−ビオースIへの変換反応を行った。反応液量は1ミリリットルとし、終濃度0.24Mマルトヘプタオース、0.24M N−アセチルグルコサミン、10mM 塩化マグネシウム、30mM リン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)、1mM UDP−グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクト−N−ビオースホスホリラーゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、UDP−グルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼを1ミリリットル当たり2U、20U、2.6U、7U加え、30℃で90時間反応を行った。反応液をTLC(溶媒アセトニトリル−水75:25、担体シリカゲル60)で分析した結果、ラクト−N−ビオースI濃度は100mMであった。(図1、レーン8,9)
ラクト−N−ビオースIの合成は以下の通りに行った。反応液量は10ミリリットルとし、終濃度0.66M スクロース、0.60M N−アセチルグルコサミン、10mM 塩化マグネシウム、30mM リン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)、1mM UDP−グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクト−N−ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、UDP−グルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをそれぞれ1ミリリットル当たり0.25U、0.08U、2.50U、0.33U加え、30℃で500時間反応を行った。反応液中のラクト−N−ビオースI濃度はおよそ0.52Mであり、糖質原料の約80%がラクト−N−ビオースIに変換していた。反応液中の未反応のスクロースを分解するため、反応液のpHを塩酸で4.5に調整し、Sigma社より購入したインベルターゼ3mgを加え37℃で15時間処理した。処理後の反応液をTOYOPEARL HW40Fカラムに供し、ゲルろ過によりラクト−N−ビオースI画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりラクト−N−ビオースI標品0.95g(単離収率41%)を得た。
ガラクト−N−ビオースの合成は以下の通りに行った。反応液量は10ミリリットルとし、終濃度0.66M スクロース、0.60M N−アセチルガラクトサミン、10mM 塩化マグネシウム、30mM リン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)、1mM UDP−グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクト−N−ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、UDP−グルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをそれぞれ1ミリリットル当たり0.25U、0.08U、2.50U、0.33U加え、30℃で500時間反応を行った。反応液中のガラクト−N−ビオース濃度はおよそ0.40Mであり、糖質原料の約60%がガラクト−N−ビオースに変換していた。反応液中の未反応のスクロースを分解するため、反応液のpHを塩酸で4.5に調整し、Sigma社より購入したインベルターゼ3mgを加え37℃で15時間処理した。処理後の反応液をTOYOPEARL HW40Fカラムに供し、ゲルろ過によりガラクト−N−ビオース画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりガラクト−N−ビオース標品0.78g(単離収率34%)を得た。
ラクト−N−ビオースIの大量調製は以下の通りに行った。反応液量は1リットルとし、終濃度0.66M スクロース、0.60M N−アセチルグルコサミン、10mM 塩化マグネシウム、30mM リン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)、1mM UDP−グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクト−N−ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、UDP−グルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをそれぞれ1ミリリットル当たり2U、0.3U、20U、2.6U加え、30℃で135時間反応を行った。このときのスクロース濃度及びラクト−N−ビオースI濃度の経時変化を図2に示す。反応収率は87%であった。反応終了後の反応液に25mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したDEAE−TOYOPEARL 650M 160 mL加え、1時間撹拌することにより酵素を吸着させた後、ろ過により上清を分離した。この上清にドライイースト(日清カメリヤ)20グラムを加え、30℃で18時間攪拌し、酵母処理を行った。処理後、遠心分離及びセライトを用いたろ過により、酵母を取り除いた上清を得た。得られた上清をエバポレーターで濃縮した後、室温に静置しておくことで結晶が得られたため、この結晶をろ過により分離し、真空乾燥により標品を得た。また、結晶を分離した母液についても再度結晶化を行い回収率の向上を行った。これにより純度97%のラクト−N−ビオースI130グラム(収率55%)、純度85%のラクト−N−ビオースI65グラム(収率24%、合計収率79%)が得られた。
実施例8で調製した酵素の吸着されたDEAE−TOYOPEARL 650M 160mL分を径2.6cmのガラス製カラムにつめてバイオリアクターカラム(φ2.6cm×30cm)を調製した。該カラムにはラクト−N−ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、UDP−グルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼがそれぞれ約2000U、300U、200000U、2600U吸着されていた。本カラムに30℃、流速0.1ml毎分(滞留時間27時間)の条件で500mlの基質溶液(終濃度0.66M スクロース、0.60M N−アセチルグルコサミン、10mM 塩化マグネシウム、30mM リン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)、1mM UDP−グルコース)を供し、循環させた。1回カラム循環後の基質溶液中のラクト−N−ビオースI濃度はおよそ0.3M、2回カラム循環後では0.4M、3回カラム循環後のでは0.5Mであった。
ラクト−N−ビオースIの合成は以下の通りに行った。反応液量は1ミリリットルとし、終濃度0.66M スクロース、0.60M N−アセチルグルコサミン、10mM 塩化マグネシウム、30mM リン酸緩衝液(pH7.0)、1mM UTPからなる基質溶液を調製し、そこにラクト−N−ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、グルコース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.9)とガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.10)の両活性を持つ酵素をそれぞれ1ミリリットル当たり0.25U、0.08U、2.5U、5.0U加え、30℃で60時間反応を行った。60時間後の反応液中のラクト−N−ビオースI濃度は50mMであった。
ラクト−N−ビオースIの合成は以下の通りに行った。反応液量は1ミリリットルとし、終濃度0.66M スクロース、0.60M N−アセチルグルコサミン、10mM 塩化マグネシウム、30mM リン酸緩衝液(pH7.0)、1mM UDP−グルコース、1mM ピロリン酸ナトリウムからなる基質溶液を調製し、そこにラクト−N−ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、グルコース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.9)とガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.10)の両活性を持つ酵素をそれぞれ1ミリリットル当たり0.25U、0.08U、2.5U、5.0U加え、30℃で60時間反応を行った。60時間後の反応液中のラクト−N−ビオースI濃度はいずれも50mMであった。
Claims (5)
- N−アセチルグルコサミン、リン酸、ラクト−N−ビオースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.211)及びUDP−グルコース−4−エピメラーゼ(EC 5.1.3.2)の存在下で、
(i)糖質原料と、該糖質原料を加リン酸分解しα−グルコース−1−リン酸を生じる酵素との組合せ;並びに
(ii)α−グルコース−1−リン酸をUDP−グルコースに変換する酵素及びUDP−ガラクトースをα−ガラクトース−1−リン酸に変換する酵素とそれらの補因子との組合せ、及び/又はα−グルコース−1−リン酸及びUDP−ガラクトースをそれぞれUDP−グルコース及びα−ガラクトース−1−リン酸に変換する酵素とその補因子との組合せを作用させることを特徴とする、ラクト−N−ビオースIの製造方法。 - N−アセチルガラクトサミン、リン酸、ラクト−N−ビオースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.211)及びUDP−グルコース−4−エピメラーゼ(EC 5.1.3.2)の存在下で、
(i)糖質原料と、該糖質原料を加リン酸分解しα−グルコース−1−リン酸を生じる酵素との組合せ;並びに
(ii)α−グルコース−1−リン酸をUDP−グルコースに変換する酵素及びUDP−ガラクトースをα−ガラクトース−1−リン酸に変換する酵素とそれらの補因子との組合せ、及び/又はα−グルコース−1−リン酸及びUDP−ガラクトースをそれぞれUDP−グルコース及びα−ガラクトース−1−リン酸に変換する酵素とその補因子との組合せを作用させることを特徴とする、ガラクト−N−ビオースの製造方法。 - (i)の組合せが、スクロースとスクロースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.7)との組合せ、デンプン又はデキストリンとホスホリラーゼ(EC 2.4.1.1)との組合せ、セロビオースとセロビオースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.20)との組合せ、セロデキストリンとセロデキストリンホスホリラーゼ(EC 2.4.1.49)及びセロビオースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.20)との組合せ、ラミナリオリゴ糖とラミナリビオースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.31)及び/又はβ−1,3オリゴグルカンホスホリラーゼ(EC 2.4.1.30)との組合せ、並びにトレハロースとトレハロースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.231)との組み合わせ、よりなる群から選択される1つ以上の組合せである、請求項1又は2に記載の方法。
- (ii)の組合せが、UDP−グルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.12)と、UDP−グルコース、UDP−ガラクトース又はその混合物との組合せ;グルコース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.9)及びガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.10)と、UTPとの組合せ;グルコース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.9)及びガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.10)と、UDP−グルコース及び/又はUDP−ガラクトース及びピロリン酸との組合せ;グルコース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.9)及びガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.10)と、UTP及びUDP−グルコース及び/又はUDP−ガラクトース及びピロリン酸との組合せ;グルコース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼとガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、UTPとの組合せ;グルコース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼとガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、UDP−グルコース及び/又はUDP−ガラクトース及びピロリン酸との組合せ;並びにグルコース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼとガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、UTP及びUDP−グルコース及び/又はUDP−ガラクトース及びピロリン酸との組合せ、よりなる群から選択される1以上の組合せである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 酵素が担体に固定化されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
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