JP6171598B2

JP6171598B2 - β−マンノシドの製造方法

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Publication number: JP6171598B2
Application number: JP2013122333A
Authority: JP
Inventors: 博之中井; 高則仁平; 大坪　研一; 研一大坪; 北岡　本光; 本光北岡
Original assignee: Niigata University NUC; National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: Niigata University NUC; National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2013-06-11
Filing date: 2013-06-11
Publication date: 2017-08-02
Anticipated expiration: 2033-06-11
Also published as: WO2014199948A1; JP2014239651A

Description

本発明は、酵素法を用いてβ−マンノシドを製造する方法に関する。

糖鎖は、核酸、タンパク質に次ぐ第三の鎖といわれ、生体認識（細胞接着・抗原抗体反応・情報伝達・ウイルス感染など）の重要性について近年注目を集めており、急速にその機能解明が進められている。その中で、アスパラギン結合型糖鎖やリポ多糖のコア構造であるβ−マンノシドは、細胞分化、老化、免疫応答といった生命現象や、癌、ウイルス感染、炎症などの疾患に深く関与していることが知られており、分子レベルでの糖鎖機能の解明、さらには糖タンパク質製剤・免疫賦活剤・病原性ウイルス感染阻害剤などとしての糖鎖医療産業界への応用が期待されている。

生体内での発現量が微量なβ−マンノシドの調製は、現在煩雑な多段階反応を要する有機合成法に頼らざるを得ず（特許文献１）、効率的な大量調製が困難であるため、非常に高額であるという問題点から糖鎖工学研究分野や糖鎖医療産業の進展を妨げている。

β−マンノシドを可逆的に加リン酸分解する酵素の逆反応触媒活性を利用し、α−マンノース−１−リン酸を原料として、β−マンノシドを合成可能であることが示唆されているが（特許文献２及び３、非特許文献１）、α−マンノース−１−リン酸が高価であるため、コストの問題から実用性を欠いていた。

特許第４７７８３１５号明細書特願２０１２−１９０４７４号明細書特願２０１２−２０３８９１号明細書

ＫａｗａｈａｒａＲ．ら、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２８７（５０）：４２３８９−４２３９９（２０１２）

したがって、安価でかつ簡便にβ−マンノシドを製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を達成するため鋭意検討した結果、酵素法によりβ−マンノシドを安価に製造する方法を完成させた。

すなわち、本発明は以下を包含する。

（１）リン酸、α−ホスホグルコムターゼ（ＥＣ５．４．２．２）、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．８）、α−ホスホマンノムターゼ（ＥＣ５．４．２．８）及びそれらの補因子の存在下で、
（ｉ）糖質原料、及び該糖質原料を可逆的に加リン酸分解しα−グルコース−１−リン酸を生じる酵素の組合せ；並びに
（ｉｉ）β−マンノシドを可逆的に加リン酸分解してα−マンノース−１−リン酸を生じる酵素及びその逆反応において糖アクセプターとして作用する物質の組合せを作用させるβ−マンノシドの製造方法であって、
（ｉｉ）のβ−マンノシドを可逆的に加リン酸分解してα−マンノース−１−リン酸を生じる酵素及びその逆反応において糖アクセプターとして作用する物質の組合せが、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼとＮ−アセチルグルコサミン及び／若しくはＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースとの組合せ、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼとマンノース及び／若しくはフルクトースとの組合せ、よりなる群から選択される１つ以上の組合せであることを特徴とする、β−マンノシドの製造方法。

（２）（ｉ）の糖質原料、及び該糖質原料を可逆的に加リン酸分解しα−グルコース−１−リン酸を生じる酵素の組合せが、スクロースとスクロースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．７）との組合せ、デンプン若しくはデキストリンとホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．１）との組合せ、セロビオースとセロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２０）との組合せ、セロデキストリンとセロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．４９）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２０）との組合せ、ラミナリオリゴ糖とラミナリビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．３１）及び／若しくはβ−１，３オリゴグルカンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．３０）との組合せ、ソホロオリゴ糖とソホロースホスホリラーゼ及び／若しくはβ−１，２オリゴグルカンホスホリラーゼとの組合せ、並びにトレハロースとトレハロースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２３１）との組合せ、よりなる群から選択される１つ以上の組合せである、上記（１）に記載の方法。

本発明によれば、安価でかつ簡便にβ−マンノシドを製造する方法が提供される。

図１は、スクロースからのマンノシル−β−１,４−Ｎ−アセチルグルコサミンの製造の概略図を示す。図２は、スクロースからのβ−１,２−マンノビオースの製造の概略図を示す。図３は、スクロースからのマンノシル−β−１，４−グルコースの製造の概略図を示す。図４は、セロビオースからのマンノシル−β−１,４−Ｎ−アセチルグルコサミンの製造の概略図を示す。図５は、セロビオースからのβ−１,２−マンノビオースの製造の概略図を示す。図６は、セロビオースからのマンノシル−β−１，４−グルコースの製造の概略図を示す。図７は、デンプンからのマンノシル−β−１,４−Ｎ−アセチルグルコサミンの製造の概略図を示す。図８は、デンプンからのβ−１,２−マンノビオースの製造の概略図を示す。図９は、デンプンからのマンノシル−β−１，４−グルコースの製造の概略図を示す。

本発明は、酵素法による、β−マンノシドの製造方法に関する。

本発明の酵素法は、主に以下の３つの酵素反応からなる：（１）糖質原料の加リン酸分解反応；（２）α−グルコース−１−リン酸のα−マンノース−１−リン酸への変換反応、（３）糖アクセプターからのβ−マンノシドの合成反応。

（１）の糖質原料の加リン酸分解反応は、上記要素（ｉ）に含まれる糖質原料と該糖質原料を加リン酸分解してα−グルコース−１−リン酸を生じる酵素（Ｇ１Ｐ生成酵素）との組合せが、リン酸の存在下で反応して、α−グルコース−１−リン酸及び還元末糖が生じる反応である。上記要素（ｉ）で用いられる糖質原料と係る酵素の組合せは、これに限定されるものではないが、スクロースとスクロースホスホリラーゼとの組合せ、デンプン若しくはデキストリンとホスホリラーゼとの組合せ、セロビオースとセロビオースホスホリラーゼとの組合せ、セロデキストリンとセロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼとの組合せ、ラミナリオリゴ糖とラミナリビオースホスホリラーゼ及び／若しくはβ−１，３オリゴグルカンホスホリラーゼとの組合せ、ソホロオリゴ糖とソホロースホスホリラーゼ及び／若しくはβ−１，２オリゴグルカンホスホリラーゼとの組合せ、トレハロースとトレハロースホスホリラーゼとの組合せのいずれか一つ、あるいは二つ以上の組合せを含む。より好ましい組合せは、スクロースとスクロースホスホリラーゼとの組合せ、セロビオースとセロビオースホスホリラーゼとの組合せ、セロデキストリンとセロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼとの組合せ、デンプン又はデキストリンとホスホリラーゼとの組合せのいずれか一つ、あるいは二つ以上の組合せであり、最も好ましい組合せは、スクロースとスクロースホスホリラーゼとの組合せである。

糖質原料の使用濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは約１〜約１０００ｇ／Ｌであり、より好ましくは約１０〜約１０００ｇ／Ｌである。

Ｇ１Ｐ生成酵素はいかなる起源の酵素を用いることも可能であり、その使用形態は特に限定されるものではなく、菌体抽出液、精製酵素、固定化酵素など種々のものを利用することができ、その使用量も特に限定されないが、例えば糖質原料１ｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇで使用し得る。

またこの反応に関わるリン酸はいかなる起源のものであっても良い。反応系に加えるリン酸濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜約１００ｍＭ程度である。

上記（２）のα−グルコース−１−リン酸のα−マンノース−１−リン酸への変換反応は、α−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、α−ホスホマンノムターゼ及びそれらの補因子の組合せによって、上記（１）の糖質原料の加リン酸分解反応で生じたα−グルコース−１−リン酸をグルコース６−リン酸に、グルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に、フルクトース−６−リン酸をマンノース−６−リン酸に、マンノース−６−リン酸をα−マンノース−１−リン酸へ変換する反応である。

これらの酵素は特に限定されるものではなくいかなる起源の酵素を用いることも可能である。この酵素の使用形態は特に限定されるものではなく、菌体抽出液、精製酵素、固定化酵素など種々のものを利用することができ、その酵素の使用量（活性で表す）も特に限定されないが、例えば糖質原料１ｇあたり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇで使用し得る。補因子の使用濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭ、より好ましくは約０．０２ｍＭ〜約５０ｍＭである。

上記（３）の糖アクセプターからのβ−マンノシドの合成反応は、β−マンノシドを可逆的に加リン酸分解してα−マンノース−１−リン酸を生じる酵素（β−マンノシドホスホリラーゼ）の存在下で、糖アクセプターを出発原料として、上記（２）のα−グルコース−１−リン酸のα−マンノース−１−リン酸への変換反応によって生じたα−マンノース−１−リン酸からβ−マンノシドを合成する反応である。出発原料として用いる糖アクセプターの濃度は特に限定されないが、好ましくは約１０ｍＭ〜約２Ｍ、より好ましくは約１００ｍＭ〜約１Ｍである。β−マンノシドホスホリラーゼは特に限定されるものではなく、またいかなる起源の酵素を用いることも可能である。好ましくはマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼ、マンノシル−β−１，４−グルコースホスホリラーゼ、β−１，４−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼを用いる。β−マンノシドホスホリラーゼの使用形態は特に限定されるものではなく、菌体抽出液、精製酵素、固定化酵素など種々のものを利用することができる。β−マンノシドホスホリラーゼの使用量も特に限定されないが、例えば糖質原料１ｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇで使用し得る。

上述した本発明の酵素は、任意の起源のものでよく、例えば細菌等の原核生物、酵母、菌類、動物等の真核生物由来のいずれの酵素であってもよく、また組換え酵素であってもよい。そのような酵素は市販のものを使用し得るか、または当業者に周知の方法、例えば天然から精製してもよいし、あるいは遺伝子組換え法によって取得し得る。例えば、遺伝子組換えによる方法では、本発明の酵素は、文献に記載されている若しくは公知の核酸又はタンパク質配列データベースに登録されている該酵素遺伝子の塩基配列を基に作製したプライマーを用いたＰＣＲによって適当なライブラリー中の該酵素遺伝子に対応するｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡを増幅した後に、該ｃＤＮＡを市販の遺伝子発現ベクターに組込み、該発現ベクターで大腸菌等の菌体を形質転換することによって、菌体中で生成される。生成された酵素は、硫安分画等の粗分画又は各種のカラムクロマトグラフィーなど、当業者に周知のタンパク質精製法によって精製できる。また、酵素をＧＳＴやＨｉｓ−ｔａｇとの融合タンパク質として発現させることにより、その後の精製を容易にすることができる。

本発明の酵素はまた、上記の原核生物細胞又は真核生物細胞から直接精製してもよい。細胞破壊液を調製し、遠心分離、硫安分画、透析、各種クロマトグラフィー（例えばゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなど）、電気泳動、限外ろ過、結晶化などの酵素精製のための一般的な技術を適宜組合せて、目的の酵素を精製することができる。本発明に使用可能な酵素の形態は、精製酵素の他に、粗製酵素（例えば菌体抽出液、凍結乾燥体など）でもよい。粗製酵素を使用する場合には、本発明の上記反応を妨害する因子を含むべきではない。

反応形態は特に限定されるものではないが、通常は水溶液又は緩衝液中で行われる。反応液のｐＨは好ましくは５〜９である。反応温度は特に限定されるものではないが、好ましくは５℃〜８０℃、より好ましくは２０℃〜６０℃である。また反応時間は特に限定されるものではないが、０．１〜３０００時間であることが好ましい。

本発明の一つの利点は、上記全ての酵素反応を、一容器中で又はバイオリアクターを用いて簡便かつ容易に実施できる点にある。

本発明により得られるβ−マンノシドは任意の方法で精製することができる。例えば、本発明により得られるβ−マンノシドは、カラムクロマトグラフィーや結晶化により単離することが可能である。カラムクロマトグラフィーとして、これに限定されるものではないが、サイズ排除クロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過膜分離、逆浸透膜分離が含まれる。結晶化方法としては、これに限定されるものではないが、濃縮、温度低下、溶媒添加（エタノール、メタノール、アセトンなど）が含まれる。

なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の思想を逸脱しない範囲で種々の変形実施が可能である。

次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

スクロースを糖質原料としてマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンへの変換反応を行った。反応液量は１ｍＬとし、終濃度０．２５Ｍスクロース、０．２５ＭＮ−アセチルグルコサミン、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５９μＭグルコース−１，６−ビスリン酸からなる基質溶液を調製し、そこにスクロースホスホリラーゼ、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ、α−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、α−ホスホマンノムターゼを１ミリリットル当たり０．０３３ｍｇ、０．０８３ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．２３ｍｇ、２．４ｍｇ加え、３０℃で１２０時間反応を行った。反応を０．１３ｍＬの６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止し、反応液のｐＨを４．５に調整後、インベルターゼ処理を行うことにより残存スクロースを分解した。反応液をＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０Ｓカラムに供し、ゲル濾過によりマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン標品２０ｍｇを得た。

スクロースを糖質原料としてβ−１，２−マンノビオースへの変換反応を行った。反応液量は１ｍＬとし、終濃度０．２５Ｍスクロース、０．２５Ｍマンノース、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５９μＭグルコース−１，６−ビスリン酸からなる基質溶液を調製し、そこにスクロースホスホリラーゼ、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼ、α−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、α−ホスホマンノムターゼを１ミリリットル当たり０．０３３ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．２３ｍｇ、２．４ｍｇ加え、３０℃で１２０時間反応を行った。反応を０．１３ｍＬの６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止し、反応液のｐＨを４．５に調整後、インベルターゼ処理を行うことにより残存スクロースを分解した。反応液をＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０Ｓカラムに供し、ゲル濾過によりβ−１，２−マンノビオース画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりβ−１，２−マンノビオース標品３９ｍｇを得た。

スクロースを糖質原料としてマンノシル−β−１，４−グルコースへの変換反応を行った。反応液量は１ｍＬとし、終濃度０．２５Ｍスクロース、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５９μＭグルコース−１，６−ビスリン酸からなる基質溶液を調製し、そこにスクロースホスホリラーゼ、マンノシル−β−１，４−グルコースホスホリラーゼ、α−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、α−ホスホマンノムターゼ、キシロースイソメラーゼを１ミリリットル当たり０．０．３３ｍｇ、０．７６ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．２３ｍｇ、２．４ｍｇ、０．３３ｍｇ加え、３０℃で１２０時間反応を行った。反応を０．１３ｍＬの６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止し、反応液のｐＨを４．５に調整後、インベルターゼ処理を行うことにより残存スクロースを分解した。反応液をＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０Ｓカラムに供し、ゲル濾過によりマンノシル−β−１，４−グルコース画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりマンノシル−β−１，４−グルコース標品２８ｍｇを得た。

セロビオースを糖質原料としてマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンへの変換反応を行った。反応液量は１ｍＬとし、終濃度０．２５Ｍセロビオース、０．２５ＭＮ−アセチルグルコサミン、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５９μＭグルコース−１，６−ビスリン酸からなる基質溶液を調製し、そこにセロビオースホスホリラーゼ、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ、α−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、α−ホスホマンノムターゼを１ミリリットル当たり２．３ｍｇ、０．０８３ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．２３ｍｇ、２．４ｍｇ加え、３０℃で１２０時間反応を行った。反応を０．１３ｍＬの６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止し、反応液のｐＨを５に調整後、β−グルコシダーゼ処理を行うことにより残存セロビオースを分解した。反応液をＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０Ｓカラムに供し、ゲル濾過によりマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン標品１２ｍｇを得た。

セロビオースを糖質原料としてβ−１，２−マンノビオースへの変換反応を行った。反応液量は１ｍＬとし、終濃度０．２５Ｍセロビオース、０．２５Ｍマンノース、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５９μＭグルコース−１，６−ビスリン酸からなる基質溶液を調製し、そこにセロビオースホスホリラーゼ、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼ、α−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、α−ホスホマンノムターゼを１ミリリットル当たり２．３ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．２３ｍｇ、２．４ｍｇ加え、３０℃で１２０時間反応を行った。反応を０．１３ｍＬの６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止し、反応液のｐＨを５に調整後、β−グルコシダーゼ処理を行うことにより残存セロビオースを分解した。反応液をＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０Ｓカラムに供し、ゲル濾過によりβ−１，２−マンノビオース画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりβ−１，２−マンノビオース標品１５ｍｇを得た。

セロビオースを糖質原料としてマンノシル−β−１，４−グルコースへの変換反応を行った。反応液量は１ｍＬとし、終濃度０．２５Ｍセロビオース、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５９μＭグルコース−１，６−ビスリン酸からなる基質溶液を調製し、そこにセロビオースホスホリラーゼ、マンノシル−β−１，４−グルコースホスホリラーゼ、α−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、α−ホスホマンノムターゼを１ミリリットル当たり０．０８３ｍｇ、０．０３３ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．２３ｍｇ、２．４ｍｇ加え、３０℃で１２０時間反応を行った。反応を０．１３ｍＬの６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止し、反応液のｐＨを５に調整後、β−グルコシダーゼ処理を行うことにより残存セロビオースを分解した。反応液をＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０Ｓカラムに供し、ゲル濾過によりマンノシル−β−１，４−グルコース画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりマンノシル−β−１，４−グルコース標品４６ｍｇを得た。

デンプンを糖質原料としてマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンへの変換反応を行った。反応液量は１ｍＬとし、終濃度５０ｍｇ／ｍＬデンプン、０．２５ＭＮ−アセチルグルコサミン、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５９μＭグルコース−１，６−ビスリン酸からなる基質溶液を調製し、そこにホスホリラーゼ、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ、α−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、α−ホスホマンノムターゼ、イソアミラーゼを１ミリリットル当たり０．９６ｍｇ、０．０８３ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．２３ｍｇ、２．４ｍｇ、０．３μｇ加え、３０℃で１２０時間反応を行った。反応を０．１３ｍＬの６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止し、反応液のｐＨを４．５に調整後、グルコアミラーゼ処理を行うことにより残存デンプンを分解した。反応液をＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０Ｓカラムに供し、ゲル濾過によりマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン標品６ｍｇを得た。

デンプンを糖質原料としてβ−１，２−マンノビオースへの変換反応を行った。反応液量は１ｍＬとし、終濃度５０ｍｇ／ｍＬデンプン、０．２５Ｍマンノース、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５９μＭグルコース−１，６−ビスリン酸からなる基質溶液を調製し、そこにホスホリラーゼ、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼ、α−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、α−ホスホマンノムターゼ、イソアミラーゼを１ミリリットル当たり０．９６ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．２３ｍｇ、２．４ｍｇ加え、３０℃で１２０時間反応を行った。反応を０．１３ｍＬの６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止し、反応液のｐＨを４．５に調整後、グルコアミラーゼ処理を行うことにより残存デンプンを分解した。反応液をＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０Ｓカラムに供し、ゲル濾過によりβ−１，２−マンノビオース画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりβ−１，２−マンノビオース標品１１ｍｇを得た。

デンプンを糖質原料としてマンノシル−β−１，４−グルコースへの変換反応を行った。反応液量は１ｍＬとし、終濃度５０ｍｇ／ｍＬデンプン、０．２５Ｍグルコース、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５９μＭグルコース−１，６−ビスリン酸からなる基質溶液を調製し、そこにホスホリラーゼ、ンノシル−β−１，４−グルコースホスホリラーゼ、α−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、α−ホスホマンノムターゼ、イソアミラーゼを１ミリリットル当たり０．９６ｍｇ、０．７６ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．２３ｍｇ、２．４ｍｇ、０．３３μｇ加え、３０℃で１２０時間反応を行った。反応を０．１３ｍＬの６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止し、反応液のｐＨを４．５に調整後、グルコアミラーゼ処理を行うことにより残存デンプンを分解した。反応液をＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０Ｓカラムに供し、ゲル濾過によりマンノシル−β−１，４−グルコース画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりマンノシル−β−１，４−グルコース標品１１ｍｇを得た。

以上のように本発明は、医薬品・食品・研究試薬産業で利用できる。

Claims

リン酸、α−ホスホグルコムターゼ（ＥＣ５．４．２．２）、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．８）、α−ホスホマンノムターゼ（ＥＣ５．４．２．８）及びそれらの補因子の存在下で、
（ｉ）糖質原料、及び該糖質原料を可逆的に加リン酸分解しα−グルコース−１−リン酸を生じる酵素の組合せ；並びに
（ｉｉ）β−マンノシドを可逆的に加リン酸分解してα−マンノース−１−リン酸を生じる酵素及びその逆反応において糖アクセプターとして作用する物質の組合せを作用させるβ−マンノシドの製造方法であって、
（ｉｉ）のβ−マンノシドを可逆的に加リン酸分解してα−マンノース−１−リン酸を生じる酵素及びその逆反応において糖アクセプターとして作用する物質の組合せが、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼとＮ−アセチルグルコサミン及び／若しくはＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースとの組合せ、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼとマンノース及び／若しくはフルクトースとの組合せ、よりなる群から選択される１つ以上の組合せであることを特徴とする、β−マンノシドの製造方法。
（ｉ）の糖質原料、及び該糖質原料を可逆的に加リン酸分解しα−グルコース−１−リン酸を生じる酵素の組合せが、スクロースとスクロースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．７）との組合せ、デンプン若しくはデキストリンとホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．１）との組合せ、セロビオースとセロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２０）との組合せ、セロデキストリンとセロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．４９）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２０）との組合せ、ラミナリオリゴ糖とラミナリビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．３１）及び／若しくはβ−１，３オリゴグルカンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．３０）との組合せ、ソホロオリゴ糖とソホロースホスホリラーゼ及び／若しくはβ−１，２オリゴグルカンホスホリラーゼとの組合せ、並びにトレハロースとトレハロースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２３１）との組合せ、よりなる群から選択される１つ以上の組合せである、請求項１に記載の方法。