CN106222211A

CN106222211A - 1,6‑二磷酸果糖的制备方法

Info

Publication number: CN106222211A
Application number: CN201610595066.9A
Authority: CN
Inventors: 李志敏; 王伟; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2016-07-21
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2016-12-14
Anticipated expiration: 2036-07-21
Also published as: CN106222211B

Abstract

本发明公开了一种1,6‑二磷酸果糖的制备方法，属于1,6‑二磷酸果糖的酶催化制备领域。本发明以淀粉或者蔗糖和焦磷酸为底物，在一个多酶催化反应体系中，通过体外多酶高效催化将底物转化为1,6‑二磷酸果糖。本发明通过对反应温度、pH和底物浓度等参数优化以及添加能够有效促进淀粉水解的酶，显著提升了1,6‑二磷酸果糖的得率和转化率。本发明制备方法步骤简捷、生产成本低、生产周期短、1,6‑二磷酸果糖的得率和转化率高，能够实现1,6‑二磷酸果糖的规模化生产。

Description

1,6-二磷酸果糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种1,6-二磷酸果糖的制备方法，尤其涉及一种体外多酶催化将淀粉或蔗糖转化为1,6-二磷酸果糖的方法，属于1,6-二磷酸果糖的酶催化制备领域。

背景技术

1,6-二磷酸果糖(fructose-1,6-diphosphate,FDP)，是果糖-6-磷酸经过磷酸化之后生成的分子，常以钠、钙等盐形式存在；作为糖代谢的调节物，具有增强细胞供能及钙拮抗作用，稳定生物膜等药理性能，广泛用于医药、保健食品和美容制品等行业。1,6-二磷酸果糖(FDP)是细胞内能量代谢的中间产物，直接参与能量代谢，并在其中起着非常重要的作用。国内外研究均确认，外源性的FDP既是人体能量调节剂，又是一种高能基质，是能在分子水平上作用到细胞内部代谢过程的少数几种活性物质之一。FDP能强化体内的能量代谢过程，具有突出的营养心肌、增强红细胞供氧能力，以及改善体内组织器官和大脑的缺氧，降低餐后血糖，保护肝脏的功效，尤其是在提高机体免疫力方面具有良好的效果，因而在临床上被广泛应用。

目前，1,6-二磷酸果糖主要通过微生物转化制备，以葡萄糖或蔗糖、无机磷酸盐为底物，经细胞内多酶催化转化反应获得，大部分积聚于细胞内。按选用的生物催化剂的不同，其制备工艺可分为：游离酵母细胞转化法，固定化酵母细胞转化法，嗜热脂肪芽孢杆菌转化法，固定化嗜热脂肪芽孢杆菌转化法，丝状真菌毛霉转化法。微生物转化法具有以下缺点：(1)1,6-二磷酸果糖是细胞内糖代谢的产物，分子大，带有较多的负电荷，很难通过细胞膜；(2)菌株中含有多种酶，会使一部分1,6-二磷酸果糖发生降解代谢；(3)发酵液是一个复杂的多相系，除1,6-二磷酸果糖外，还含有细胞、蛋白质、单磷酸果糖、单糖及其磷酸酯、无机磷酸盐等未作用的培养基杂质；(4)需额外添加昂贵的代谢调节因子。

鉴于微生物转化法制备1,6-二磷酸果糖具有上述缺点，因此，亟待开发一种工艺步骤简单、转化率高、生产周期短，生产成本低的无细胞多酶法合成1,6-二磷酸果糖的新方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种1,6-二磷酸果糖的制备方法，该方法通过体外多酶催化淀粉或蔗糖生产1,6-二磷酸果糖，具有工艺简单、步骤简捷、转化率高、生产成本低等优点。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种1,6-二磷酸果糖的制备方法，包括以下步骤：(1)以淀粉或淀粉衍生物和焦磷酸为底物，加入含有淀粉磷酸化酶(starch phosphorylase，EC2.4.1.1)、磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2)、磷酸葡萄糖异构酶(glucose-6-phosphate isomerase，EC 5.3.1.1)和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase，EC 2.7.1.90)的多酶催化物建立多酶反应体系进行酶催化反应；(2)将酶催化反应产物分离、纯化，即得。

其中，步骤(1)所述淀粉或淀粉衍生物的浓度为5-200g/L；优选的，所述淀粉或淀粉衍生物的浓度为20-100g/L，最优选为50g/L；所述焦磷酸的浓度为10-1000mM，优选的，所述焦磷酸的浓度为50-300mM；最优选的，底物的比例为：淀粉或淀粉衍生物与焦磷酸的比例为(5g/L淀粉或淀粉衍生物)/(25mM焦磷酸)；其中所述焦磷酸为焦磷酸盐，优选为焦磷酸钠。所述淀粉磷酸化酶的用量为0.1-10g/L，所述磷酸葡萄糖变位酶的用量为0.01-5g/L，所述磷酸葡萄糖异构酶的用量为0.01-5g/L，所述焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的用量为0.01-10g/L；最优选的，每50g/L淀粉或淀粉衍生物，所述淀粉磷酸化酶的用量为0.5g/L，所述磷酸葡萄糖变位酶的用量为0.15g/L，所述磷酸葡萄糖异构酶的用量为0.1g/L，所述焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的用量为0.2g/L。所述酶催化反应的条件是20-90℃反应4-72h，优选为80℃反应6-8h。

本发明所述多酶催化反应体系中还包括：缓冲液、无机磷酸盐和二价镁离子；其中，所述缓冲液为pH值4.5-8.5的磷酸缓冲液，优选为pH值7.0-7.5的磷酸缓冲液，更优选为pH值7.0-7.2的磷酸缓冲液；优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液20-50mM(其中即含有无机磷酸盐20-50mM，因此不需要额外添加无机磷酸盐)、二价镁离子5-10mM；更优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液20mM(其中即含有无机磷酸盐20mM)、二价镁离子10mM。

本发明所述淀粉衍生物包括：部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种。

作为本发明的优选技术方案，本发明所述多酶催化反应体系中还可以包括：淀粉去分支酶和麦芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8)；或者，淀粉去分支酶和葡聚糖转移酶(4-a-glucanotransferase，EC.2.4.1.25)；所述淀粉去分支酶为异淀粉酶(isoamylase，EC 3.2.1.68)或普鲁兰酶(pullulanase，EC 3.2.1.41)中的任意一种或两种。优选的，在多酶催化反应体系中：每10g/L淀粉或淀粉衍生物，所述淀粉去分支酶的用量为0.01-1g/L，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为0.01-0.5g/L；或者，在多酶催化反应体系中：每10g/L淀粉或淀粉衍生物，所述淀粉去分支酶的用量为0.01-1g/L，所述葡聚糖转移酶的用量为0.01-0.5g/L；最优选的，每50g/L淀粉或淀粉衍生物，所述淀粉去分支酶的用量为0.1g/L，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为1U/mL；或者，每50g/L淀粉或淀粉衍生物，所述淀粉去分支酶的用量为0.1g/L，所述葡聚糖转移酶的用量为0.1g/L。

进一步优选的，为了进一步提高1,6-二磷酸果糖的得率，将冗余的葡萄糖转化为1,6-二磷酸果糖，在本发明所述多酶催化反应体系中加入聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，EC 2.7.1.63)和聚磷酸盐；其中，每10g/L淀粉或淀粉衍生物，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.01-10g/L，所述聚磷酸盐的用量为1-1000mM；优选的，每50g/L淀粉或淀粉衍生物，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1g/L，所述聚磷酸盐的用量为10mM；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸钠后的反应条件为：45℃反应2小时后，将温度提高到80℃反应2小时。反应结束后，残余的淀粉残渣将是纯的直链淀粉，此时可加入少量的α淀粉酶(EC 3.2.1.1)促进淀粉残渣的水解，进一步提高1,6-二磷酸果糖的产量。优选的，每10g/L淀粉或淀粉衍生物，α淀粉酶的用量为0.01g/L。其中，加入α淀粉酶后的反应条件为：37℃反应6小时，随后在80℃反应2小时。

本发明以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入淀粉磷酸化酶，磷酸葡萄糖变位酶，磷酸葡萄糖异构酶，焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶，配制多酶反应体系，多酶催化途径包括：由淀粉磷酸化酶将淀粉中的一个葡萄糖单元与无机磷酸根转化为葡萄糖-1-磷酸；由磷酸葡萄糖变位酶将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸；由磷酸葡萄糖异构酶将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸；由焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶将果糖-6-磷酸及焦磷酸转化为1,6-二磷酸果糖，同时生成的无机磷酸根进入第一步反应中，形成无机磷的循环。因此，该酶催化体系不需要额外添加ATP，大大降低生产成本。

由于天然玉米淀粉是直链淀粉(20-30％)和支链淀粉(70-80％)的混合物。支链淀粉中的支链是以α-1,6糖苷键与主链相连的，而淀粉磷酸化酶并不能分解α-1,6糖苷键。为了提高1,6-二磷酸果糖的转化率，本发明在多酶反应体系中加入了能够分解淀粉中α-1,6糖苷键的去分支酶—异淀粉酶或普鲁兰酶。由于淀粉磷酸化酶水解淀粉的最终产物是麦芽糖，为了利用麦芽糖，本发明还在反应体系中加入麦芽糖磷酸化酶，将麦芽糖分解为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖；更优选的，本发明在多酶反应体系中再加入聚磷酸和聚磷酸葡萄糖激酶，将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，由磷酸葡萄糖异构酶和磷酸果糖激酶转化为1,6-二磷酸果糖，最终将淀粉及其衍生物中绝大多数的葡萄糖单元转化为1,6-二磷酸果糖，从而提高1,6-二磷酸果糖的得率和转化率。在这里，麦芽糖磷酸化酶可被葡聚糖转移酶替换，该酶可以将短链的寡聚糖聚合成为长链的寡聚糖，而该长链的寡聚糖又可被淀粉磷酸化酶重新利用，从而能够提高淀粉的利用率。

本发明对以淀粉为底物，含有淀粉磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的多酶催化反应体系制备1,6-二磷酸果糖的酶催化反应温度优化结果表明，在80℃进行催化反应，1,6-二磷酸果糖的转化率显著高于其他温度；对反应pH优化结果表明，缓冲液pH为7.0时，1,6-二磷酸果糖的转化率显著高于其他pH；对淀粉浓度优化的结果表明，在控制淀粉与焦磷酸盐比例，以及淀粉与酶浓度比例一定的条件下，最佳淀粉浓度为50g/L，所制备的1,6-二磷酸果糖的终浓度达到45g/L。

本发明通过添加促进淀粉水解的酶，在淀粉磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的基础上，添加了异淀粉酶、麦芽糖磷酸化酶和聚磷酸葡萄糖激酶后，从50g/L淀粉生产1,6-二磷酸果糖的终浓度是61g/L；转化率明显高于不添加异淀粉酶、麦芽糖磷酸化酶和聚磷酸葡萄糖激酶生产1,6-二磷酸果糖的终浓度45g/L。同样，在淀粉磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的多酶反应体系中，添加异淀粉酶、葡聚糖转移酶和聚磷酸葡萄糖激酶，从50g/L淀粉生产1,6-二磷酸果糖的终浓度为63g/L，明显高于不添加异淀粉酶，葡聚糖转移酶和聚磷酸葡萄糖激酶的反应体系；而随后在反应体系中加入少量的α淀粉酶，最终1,6-二磷酸果糖的终浓度达到68g/L。

本发明还公开了一种体外多酶催化将蔗糖转化为1,6-二磷酸果糖的方法，包括以下步骤：(1)以蔗糖和焦磷酸为底物，加入含有蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase，EC2.4.1.7)、磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2)、磷酸葡萄糖异构酶(glucose-6-phosphate isomerase，EC 5.3.1.1)和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase，EC 2.7.1.90)的多酶催化物建立多酶催化反应体系，进行酶催化反应；(2)将酶催化反应产物分离、纯化，即得。

其中，所述的多酶催化体系中，蔗糖的浓度为10-300g/L，焦磷酸的浓度为50-1000mM，蔗糖磷酸化酶的用量为0.01-1g/L每10g/L蔗糖，磷酸葡萄糖变位酶的用量为0.005-0.5g/L每10g/L蔗糖，磷酸葡萄糖异构酶的用量为0.005-0.5g/L每10g/L蔗糖，焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的用量为0.005-1g/L每10g/L蔗糖；优选的，步骤(1)所述底物的浓度分别为蔗糖20g/L，60mM焦磷酸；所述蔗糖磷酸化酶的用量为0.2g/L，所述磷酸葡萄糖变位酶的用量为0.15g/L，所述磷酸葡萄糖异构酶的用量为0.1g/L，所述焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的用量为0.2g/L。其中，所述焦磷酸为焦磷酸盐，优选为焦磷酸钠。所述酶催化反应的条件包括：40-90℃反应4-72h；优选为，在55℃条件下反应24h。

进一步优选的，所述多酶催化反应体系中还可以包括：葡萄糖异构酶(Glucoseisomerase,EC 5.3.1.5，将果糖转化为葡萄糖)、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。其中，每20g/L蔗糖，葡萄糖异构酶的用量为0.1g/L，聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1g/L，聚磷酸钠的用量为10mM。

本发明所述多酶催化反应体系中还包括：缓冲液、无机磷酸盐和二价镁离子；其中，所述缓冲液为pH值5.0-9.0的磷酸缓冲液，优选为pH值7.0-7.5的磷酸缓冲液；更优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液20mM、二价镁离子10mM。

本发明以蔗糖和焦磷酸为底物，加入蔗糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶，从20g/L蔗糖制备1,6-二磷酸果糖的终浓度为9.7g/L；通过进一步添加葡萄糖异构酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸钠后，1,6-二磷酸果糖的终浓度达到了15.9g/L，转化效率明显提高。

本发明1,6-二磷酸果糖的制备方法，所述多酶催化反应体系中的任何一种酶还可以为任何一种具有同等功能的酶或通过蛋白质工程改造所获得的具有同等功能的突变酶所替换。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明采用无细胞多酶法合成1,6-二磷酸果糖，在一个反应体系中，通过体外多酶催化将底物淀粉或蔗糖和焦磷酸转化为1,6-二磷酸果糖，该方法克服了通过微生物转化制备1,6-二磷酸果糖的一系列缺陷，而且具有1,6-二磷酸果糖的转化率高，易于分离纯化，工艺简单，步骤简捷，生产成本低等特点。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

本发明所涉及到的术语及定义

术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。

附图说明

图1为利用淀粉生成1,6-二磷酸果糖的体外多酶催化途径的示意图；其中，αGP，淀粉磷酸化酶；PGM，磷酸葡萄糖变位酶；PGI，磷酸葡萄糖异构酶；PP-PFK，焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶；(Pi)₂，焦磷酸盐；Pi，无机磷酸根；

图2为SDS-PAGE检测4个关键酶；其中，αGP，淀粉磷酸化酶；PGM，磷酸葡萄糖变位酶；PGI，磷酸葡萄糖异构酶；PP-PFK，焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶；第1列，淀粉磷酸化酶细胞破碎上清液；第2列，淀粉磷酸化酶细胞破碎液热处理上清液；第3列，磷酸葡萄糖变位酶细胞破碎上清液；第4列，磷酸葡萄糖变位酶细胞破碎液热处理上清液；第5列，磷酸葡萄糖异构酶细胞破碎上清液；第6列，磷酸葡萄糖异构酶细胞破碎液热处理上清液；第7列，焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶细胞破碎上清液；第8列，焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶细胞破碎液热处理上清液；

图3为酶法检测1,6-二磷酸果糖的标准曲线；其中，FDP为1,6-二磷酸果糖，NADH为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

图4为优化利用淀粉生产1,6-二磷酸果糖的最佳反应温度；

图5为优化利用淀粉生产1,6-二磷酸果糖的最佳pH；其中，FDP为1,6-二磷酸果糖；

图6为淀粉浓度对1,6-二磷酸果糖的生产的影响；

图7为利用蔗糖生成1,6-二磷酸果糖的体外多酶催化途径的示意图；其中，SP，蔗糖磷酸化酶；PGM，磷酸葡萄糖变位酶；PGI，磷酸葡萄糖异构酶；PP-PFK，焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶；(Pi)₂，焦磷酸盐；Pi，无机磷酸根；fructose，果糖；

图8为利用蔗糖生产1,6-二磷酸果糖。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、实验材料

可溶性淀粉，soluble starch，国药集团化学试剂有限公司产品，产品编号：10021318；

十水合焦磷酸钠，sodium pyrophosphate decahydrate，Sigma-Aldrich产品，产品编号：221368；

麦芽糊精，ALDRICH公司产品，产品编号419672；

大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；

本发明中所用到的酶均能通过商业途径购买得到(Sigma公司)；也可以按照基因工程的常规方法(通过原核表达)获得；

pET20b载体，Novagen，Madison，WI；

麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284；

麦芽多糖从Sigma公司购买；

α淀粉酶从Sigma公司购买，产品编号为10065；

本发明中用于1,6-二磷酸果糖检测的酶均购自Sigma公司。

实验例1体外多酶催化将淀粉转化为1,6-二磷酸果糖

通过一个体外多酶催化体系将淀粉转化为1,6-二磷酸果糖(图1)。这些关键酶包括：(1)淀粉磷酸化酶(αGP，EC 2.4.1.1)，从淀粉上释放出葡萄糖-1-磷酸；(2)磷酸葡萄糖变位酶(PGM，EC 5.4.2.2)，催化葡萄糖-1-磷酸到葡萄糖-6-磷酸；(3)磷酸葡萄糖异构酶(PGI，EC 5.3.1.1)，催化葡萄糖-6-磷酸到果糖-6-磷酸；焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶(PFK，EC 2.7.1.90)，催化果糖-6-磷酸和焦磷酸到1,6-二磷酸果糖，释放出磷酸。

在本发明中，淀粉磷酸化酶来源于海栖热孢菌(Thermotoga maritima)，其基因序列在KEGG上的编号为TM1168，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化(Zhou W,You C,Ma H,Ma Y,Zhang Y-HP.2016.One-pot biosynthesis of high-concentrationα-glucose1-phosphate from starch by sequential addition of three hyperthermophilicenzymes.J.Agr.Food Chem.64:1777-1783.)；磷酸葡萄糖变位酶来源于极端嗜热古生菌(Thermococcus kodakarensis)，其基因序列在KEGG上编号为TK1108(Rashid N,Kanai T,Atomi H,Imanaka T.2004.Among Multiple Phosphomannomutase Gene Orthologues,Only One Gene Encodes a Protein with Phosphoglucomutase andPhosphomannomutase Activities in Thermococcus kodakaraensis.J.Bacteriol.186(18):6070-6076.)，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化；磷酸葡萄糖异构酶是来源于Thermus thermophilus HB8，其基因序列在KEGG上编号为TTHA0277(Ninh PH,HondaK,Sakai T,Okano K,Ohtake H.2015.Assembly and Multiple Gene Expression ofThermophilic Enzymes in Escherichia coli for In Vitro MetabolicEngineering.Biotechnol.Bioeng.112:189-196.)，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化；焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶来源于海栖热孢菌(Thermotogamaritima)，其基因序列在KEGG上编号为TM0289，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化。通过分子克隆获得相应的表达载体pET20b-TmαGP，pET20b-TkPGM，pET28a-TtcPGI和pET-28a-TmPP-PFK。这四个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达和纯化，蛋白质纯化的结果如图2所示。

在一个1毫升的反应体系中，含有20mM的磷酸缓冲液(pH 7.5)，10mM的二价镁离子，0.5g/L淀粉磷酸化酶，0.15g/L磷酸葡萄糖变位酶，0.1g/L磷酸葡萄糖异构酶，0.2g/L焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶，5g/L可溶性淀粉，25mM焦磷酸盐，在60℃进行催化反应，反应6个小时。

可以利用酶法进行1，6-二磷酸果糖的测定，取0.1mL含有不同浓度的1，6-二磷酸果糖至3mL三乙醇胺缓冲液(pH 7.6)中，添加0.1mM NADH，0.4U甘油-3-磷酸脱氢酶(GDH，EC1.1.1.8)，2.5U磷酸丙糖异构酶(TIM，EC 5.3.1.1)，0.135U醛缩酶(ALD，EC 4.1.2.13)，340nm处检测NADH的减少，结果如图3所示，1,6-二磷酸果糖的浓度与NADH的变化(即△A)成正比。

酶促反应结束后，利用该方法对体系中的1，6-二磷酸果糖进行测定，1,6-二磷酸果糖的终浓度是2.25g/L。

实验例2利用淀粉生产1,6-二磷酸果糖的反应温度优化

淀粉磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的制备同实验例1。

在一个1毫升的反应体系中，含有20mM的磷酸缓冲液(pH 7.5)，10mM的二价镁离子，0.5g/L淀粉磷酸化酶，0.15g/L磷酸葡萄糖变位酶，0.1g/L磷酸葡萄糖异构酶，0.2g/L焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶，5g/L可溶性淀粉，25mM焦磷酸盐，分别在60、70、80和90℃进行催化反应，反应6个小时。

1,6-二磷酸果糖的检测同实验例1。结果如图4，确定最佳反应温度为80℃。

实验例3利用淀粉生产1,6-二磷酸果糖的最佳pH优化

在一个1毫升的反应体系中含有20mM柠檬酸缓冲液(pH 4.5-6.5，加入20mM无机磷)或20mM磷酸缓冲液(pH 6.5-8.5)，10mM的二价镁离子，0.5g/L淀粉磷酸化酶，0.15g/L磷酸葡萄糖变位酶，0.1g/L磷酸葡萄糖异构酶，0.2g/L焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶，5g/L可溶性淀粉，25mM焦磷酸盐，在80℃进行催化反应，反应6个小时。

1,6-二磷酸果糖的检测同实验例1。结果如图5，pH为7.0的条件下生成1,6-二磷酸果糖的浓度最高，因此确定最佳反应pH是7.0。

实验例4淀粉浓度对1,6-二磷酸果糖的生产的影响

在一个1毫升的反应体系中含有20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，10mM的二价镁离子，0.5g/L淀粉磷酸化酶，0.15g/L磷酸葡萄糖变位酶，0.1g/L磷酸葡萄糖异构酶，0.2g/L焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶，控制淀粉与焦磷酸盐比例为(5g/L淀粉)/(25mM焦磷酸盐)，淀粉浓度由5g/L提高至100g/L。在80℃进行催化反应，反应8个小时。

1,6-二磷酸果糖的检测同实验例1。结果如图6，确定最佳淀粉与酶的浓度比例是50g/L/(0.5g/L淀粉磷酸化酶，0.15g/L磷酸葡萄糖变位酶，0.1g/L磷酸葡萄糖异构酶，0.2g/L焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶)，1,6-二磷酸果糖的终浓度是45g/L。

实验例5通过过程优化和添加促进淀粉水解的酶，利用体外多酶催化将淀粉转化为1,6-二磷酸果糖

由于淀粉是有分支链，单纯采用淀粉磷酸化酶并不能完全将淀粉水解，因为淀粉磷酸化酶只会作用于α-1，4糖苷键，而分支链是以α-1，6糖苷键与主链连接的。这需要加入异淀粉酶(isoamylase，EC 3.2.1.68)水解α-1，6糖苷键。最后，淀粉被这两种酶水解的最终产物是麦芽糖和葡萄糖，为了将这些最终产物转化为1,6-二磷酸果糖，还需要加入麦芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8)和聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphateglucokinase，EC 2.7.1.63)。

在本发明中，异淀粉酶来源于Sulfolobus tokodaii，基因在KEGG上的编号为ST0928，该菌株的基因组DNA是德国Albert-Ludwigs-Freiburg的Georg Fuchs教授友情提供。聚磷酸葡萄糖激酶来源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的编号为Tfu1811，该菌株的基因组DNA是美国康奈尔大学的David Wilson教授友情提供。这两个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过Simple Cloning(You,C.,et al.(2012)."Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product(DNAMultimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-StIA和pET20b-TfuPPGK，这两个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达与纯化。

淀粉磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的制备同实验例1。麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284。

在一个1毫升的反应体系中，含有50g/L可溶性淀粉，20mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，10mM的二价镁离子，0.5g/L淀粉磷酸化酶，0.15g/L磷酸葡萄糖变位酶，0.1g/L磷酸葡萄糖异构酶，0.2g/L焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶，0.1g/L的异淀粉酶，250mM焦磷酸盐，在80℃进行催化反应，反应8个小时，随后再加入1U/mL的麦芽糖磷酸化酶，0.1g/L的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸钠，45℃处理2小时后，将温度再次提高到80℃反应2小时。

1,6-二磷酸果糖的检测同实验例1。

结果表明，如果不添加异淀粉酶，麦芽糖磷酸化酶和聚磷酸葡萄糖激酶，从50g/L的淀粉生产1,6-二磷酸果糖的终浓度是45g/L；而添加了异淀粉酶，麦芽糖磷酸化酶和聚磷酸葡萄糖激酶后，1,6-二磷酸果糖的终浓度是61g/L。

实验例6通过过程优化和添加促进淀粉水解的酶，利用体外多酶催化将淀粉转化为1,6-二磷酸果糖

葡聚糖转移酶可以将麦芽糖转化为更长链的麦芽多糖，该长链的麦芽多糖可以被淀粉磷酸化酶利用生产葡萄糖1磷酸，以生产1,6-二磷酸果糖。葡聚糖转移酶来源于Thermococcus litoralis，基因在KEGG上的编号为OCC_10078，该菌株的基因组DNA可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。将该基因克隆至pET20b载体上，形成pET20b-Tl4GT，随后转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达与纯化。

淀粉磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的制备同实验例1，异淀粉酶和聚磷酸葡萄糖激酶的制备同实验例5。α淀粉酶从Sigma公司购买，产品编号为A3403。

在一个1毫升的反应体系中，含有50g/L可溶性淀粉，20mM的磷酸缓冲液(pH 7.2)，10mM的二价镁离子，0.5g/L淀粉磷酸化酶，0.15g/L磷酸葡萄糖变位酶，0.1g/L磷酸葡萄糖异构酶，0.2g/L焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶，0.1g/L的异淀粉酶，0.1g/L的葡聚糖转移酶，250mM焦磷酸盐，在80℃进行催化反应，反应8个小时，随后加入0.1g/L的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸钠，45℃处理2小时后，将温度再次提高到80℃反应2小时。

1,6-二磷酸果糖的检测同实验例1。最终1,6-二磷酸果糖的终浓度是63/L，高于不添加异淀粉酶，葡聚糖转移酶和聚磷酸葡萄糖激酶的反应体系。随后在反应体系中加入少量的α淀粉酶促进残渣淀粉的水解，提高1,6-二磷酸果糖的产量，α淀粉酶的用量为0.05g/L，反应先在37℃反应6小时，随后继续在80℃反应2小时，最终1,6-二磷酸果糖的终浓度为68g/L。

实验例7体外多酶催化将麦芽糊精转化为1,6-二磷酸果糖

淀粉磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的制备同实验例1，异淀粉酶，葡聚糖转移酶和聚磷酸葡萄糖激酶的制备同实验例5和6。

在一个1毫升的反应体系中，含有50g/L麦芽糊精(ALDRICH公司产品，产品编号419672)，20mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，10mM的二价镁离子，0.5g/L淀粉磷酸化酶，0.15g/L磷酸葡萄糖变位酶，0.1g/L磷酸葡萄糖异构酶，0.2g/L焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶，0.1g/L的异淀粉酶，0.1g/L的葡聚糖转移酶，250mM焦磷酸盐，在80℃进行催化反应，反应8个小时，随后加入0.1g/L的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸钠，45℃处理2小时后，将温度再次提高到80℃反应2小时。1,6-二磷酸果糖的检测同实验例1，最终1,6-二磷酸果糖的终浓度是64g/L。

实验例8体外多酶催化将蔗糖转化为1,6-二磷酸果糖

本发明用蔗糖作为底物来生产1,6-二磷酸果糖，如图7所示。

蔗糖磷酸化酶来源于Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum JW/SL-YS485(Qi P,You C,Zhang YHP.2014.One-Pot Enzymatic Conversion of Sucrose toSynthetic Amylose by using Enzyme Cascades.ACS Catal.4:1311-1317.)，该基因在KEGG的编号是Tthe_1921。通过分子克隆获得相应的表达载体pET20b-SP。这个质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达和纯化。

磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的制备同实验例1。

在一个1毫升的反应体系中，含有20mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，10mM的二价镁离子，0.2g/L蔗糖磷酸化酶，0.15g/L磷酸葡萄糖变位酶，0.1g/L磷酸葡萄糖异构酶，0.2g/L焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶，20g/L蔗糖，60mM焦磷酸盐，在55℃进行催化反应，反应24个小时。

1,6-二磷酸果糖的检测同实验例1，最终1,6-二磷酸果糖的终浓度是9.7g/L，如图8所示。

同样可以通过添加聚磷酸葡萄糖激酶来增加1,6-二磷酸果糖的最终浓度，在添加了0.1g/L葡萄糖异构酶(Glucose isomerase,EC 5.3.1.5，将果糖转化为葡萄糖)，0.1g/L的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸钠后，在45℃继续反应12小时，1,6-二磷酸果糖的终浓度达到了15.9g/L。

Claims

1.一种1,6-二磷酸果糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以淀粉或淀粉衍生物和焦磷酸为底物，加入含有淀粉磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的多酶催化物建立多酶催化反应体系，进行酶催化反应；(2)将酶催化反应产物分离、纯化，即得。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述淀粉衍生物包括：部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种；所述焦磷酸为焦磷酸盐，优选为焦磷酸钠。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的多酶催化反应体系中：所述淀粉或淀粉衍生物的浓度为5-200g/L；优选的，所述淀粉或淀粉衍生物的浓度为20-100g/L，更优选为50g/L；所述焦磷酸的浓度为10-1000mM，优选的，所述焦磷酸的浓度为50-300mM；最优选的，淀粉或淀粉衍生物与焦磷酸的比例为5g/L淀粉或淀粉衍生物/25mM焦磷酸；

所述淀粉磷酸化酶的用量为0.1-10g/L，所述磷酸葡萄糖变位酶的用量为0.01-5g/L，所述磷酸葡萄糖异构酶的用量为0.01-5g/L，所述焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的用量为0.01-10g/L；优选的，每50g/L淀粉或淀粉衍生物，所述淀粉磷酸化酶的用量为0.5g/L，所述磷酸葡萄糖变位酶的用量为0.15g/L，所述磷酸葡萄糖异构酶的用量为0.1g/L，所述焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的用量为0.2g/L。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶催化反应的条件是：20-90℃反应4-72小时，优选为80℃反应6-8小时。

5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多酶催化物中还包括(1)-(2)中的任何一种：

(1)淀粉去分支酶和麦芽糖磷酸化酶；优选的，在多酶催化反应体系中：每10g/L淀粉或淀粉衍生物，所述淀粉去分支酶的用量为0.01-1g/L，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为0.01-0.5g/L；优选的，每50g/L淀粉或淀粉衍生物，所述淀粉去分支酶的用量为0.1g/L，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为1U/mL；或者，

(2)淀粉去分支酶和葡聚糖转移酶；优选的，在多酶催化反应体系中：每10g/L淀粉或淀粉衍生物，所述淀粉去分支酶的用量为0.01-1g/L，所述葡聚糖转移酶的用量为0.01-0.5g/L；优选的，每50g/L淀粉或淀粉衍生物，所述淀粉去分支酶的用量为0.1g/L，所述葡聚糖转移酶的用量为0.1g/L；

其中，所述淀粉去分支酶为异淀粉酶或普鲁兰酶中的任意一种或两种。

6.按照权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系中还包括：聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；

优选的，在多酶催化反应体系中，每10g/L淀粉或淀粉衍生物，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.01-10g/L，所述聚磷酸盐的用量为1-1000mM；更优选的，在多酶催化反应体系中，每50g/L淀粉或淀粉衍生物，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1g/L，所述聚磷酸盐的用量为10mM；

加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐后的反应条件为：45℃反应2h后，将温度提高到80℃反应2h。

7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系中还包括：缓冲液、无机磷酸盐和二价镁离子；其中，所述缓冲液为pH值4.5-8.5的磷酸缓冲液，优选为pH值7.0-7.5的磷酸缓冲液，更优选为pH值7.0-7.2的磷酸缓冲液；

优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液20-50mM、二价镁离子5-10mM。

8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：在酶催化反应结束后向反应产物中加入α淀粉酶；优选的，每10g/L淀粉或淀粉衍生物，α淀粉酶的用量为0.01g/L。

9.一种1,6-二磷酸果糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以蔗糖和焦磷酸为底物，加入含有蔗糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的多酶催化物建立多酶催化反应体系进行酶催化反应；(2)将酶催化反应产物分离、纯化，即得。

10.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述的多酶催化体系中，蔗糖的浓度为10-300g/L，焦磷酸的浓度为50-1000mM，蔗糖磷酸化酶的用量为0.01-1g/L每10g/L蔗糖，磷酸葡萄糖变位酶的用量为0.005-0.5g/L每10g/L蔗糖，磷酸葡萄糖异构酶的用量为0.005-0.5g/L每10g/L蔗糖，焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的用量为0.005-1g/L每10g/L蔗糖；

优选的，所述的多酶催化体系中，蔗糖的浓度为20g/L，焦磷酸的浓度为60mM；所述蔗糖磷酸化酶的用量为0.2g/L，所述磷酸葡萄糖变位酶的用量为0.15g/L，所述磷酸葡萄糖异构酶的用量为0.1g/L，所述焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶的用量为0.2g/L。

11.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述酶催化反应的条件是：40-90℃反应4-72h；优选为，55℃反应24h。

12.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系中还包括：缓冲液、无机磷酸盐和二价镁离子；其中，所述缓冲液为pH值5.0-9.0的磷酸缓冲液，优选为pH值7.0-7.5的磷酸缓冲液；更优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液20mM、二价镁离子10mM。

13.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系中还包括：葡萄糖异构酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；

优选的，每20g/L蔗糖，葡萄糖异构酶的用量为0.1g/L，聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1g/L，聚磷酸盐的用量为10mM；

其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。