CN109652473A

CN109652473A - 肌醇-1-磷酸的制备方法

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Publication number: CN109652473A
Application number: CN201710936975.9A
Authority: CN
Inventors: 张以恒; 李运杰
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-10-10
Filing date: 2017-10-10
Publication date: 2019-04-19

Abstract

本发明公开了一种肌醇‑1‑磷酸的制备方法，属于肌醇‑1‑磷酸的酶催化制备领域。本发明所公开的肌醇‑1‑磷酸的制备方法以淀粉及其衍生物和磷酸盐为底物，通过体外多酶分子机器催化将底物高效转化为肌醇‑1‑磷酸；本发明通过途径优化，添加能够促进淀粉及其衍生物水解的酶以及利用副产物葡萄糖的酶，显著提升肌醇‑1‑磷酸的产率。本发明方法肌醇‑1‑磷酸的产率高，生产设备简单，生产成本低，可实现肌醇‑1‑磷酸的规模化生产。

Description

肌醇-1-磷酸的制备方法

技术领域

本发明涉及肌醇-1-磷酸的制备方法，尤其涉及体外多酶分子机器催化将淀粉以及其衍生物转化为肌醇-1-磷酸的方法，属于肌醇-1-磷酸的酶催化生产领域。

背景技术

肌醇是水溶性维生素B族中的一种，是人、动物及植物生长的必需物质，广泛应用于医药、食品、饲料等行业。肌醇能够促进细胞新陈代谢，改善细胞营养，因而能够助长发育，增进食欲，恢复体力。并能阻止肝脏中脂肪堆积，加速去除心脏中过多的脂肪，与胆碱有协同的驱脂作用，因此用于治疗肝脂肪过多症、肝硬化症。此外，肌醇还能够防止动物毛发脱落。而肌醇-1-磷酸是合成肌醇的重要前体物质，故而开发一种肌醇-1-磷酸的制备方法具有重要意义。

生物法合成肌醇-1-磷酸普遍存在于真核生物中：在多数真核生物体内，葡萄糖-6-磷酸在肌醇-1-磷酸合成酶的作用下能够直接转变为肌醇-1-磷酸(Chen et al.2000；You et al.2017)。由于葡萄糖-6-磷酸的生产成本高，价格昂贵，故而以葡萄糖-6-磷酸生产肌醇-1-磷酸不具有工业化价值。本方法开发了一种以廉价淀粉或其衍生物以及磷酸盐为原料，通过多酶催化反应合成肌醇-1-磷酸的方法，具有非常重要的工业价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种肌醇-1-磷酸的多酶催化转化方法，是一种通过体外多酶催化淀粉及其衍生物生产肌醇-1-磷酸的方法，该方法具有产率和转化率高，生产成本低，低污染等优点。

本发明提供了一种合成肌醇-1-磷酸新途径，所采用的原料为廉价的淀粉或淀粉衍生物和磷酸盐。本发明的途径包括：由淀粉磷酸化酶催化淀粉或淀粉衍生物中的一个葡萄糖单元与游离的磷酸根离子结合而生成葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸变位酶将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸；由肌醇-1-磷酸合成酶将葡萄糖-6-磷酸转化为肌醇-1-磷酸。由于肌醇-1-磷酸合成酶催化的反应为不可逆反应，因此本发明所述途径对原料具有很高得率。

本发明使用的原料为淀粉或淀粉衍生物和磷酸盐。由于淀粉是一种由不同链长的直连淀粉和支链淀粉组成的混合物。为了提高产品肌醇-1-磷酸的得率，还可对上述途径扩展和补充。

众所周知，直连淀粉葡萄糖单元之间以α-1,4糖苷键相连，而支链淀粉通过α-1,6糖苷键与淀粉主链相连。而淀粉磷酸化酶只能作用于α-1,4糖苷键，并不能作用于α-1,6糖苷键。为了提高淀粉的利用率，可以在反应体系中加入能够分解淀粉中α-1,6糖苷键的去分支酶—异淀粉酶或普鲁兰酶。

其次，由于淀粉磷酸化酶水解淀粉的最终产物是麦芽糖，为了利用麦芽糖，本发明还在反应体系中加入麦芽糖磷酸化酶，将麦芽糖分解为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖。为了完全利用原料，还可在体系中加入聚磷酸和聚磷酸葡萄糖激酶，将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，最终转化为肌醇-1-磷酸。

再者，葡聚糖转移酶(4-a-glucanotransferase，EC.2.4.1.25)可以将短链的寡聚糖聚合成为长链的寡聚糖，而该长链的寡聚糖又可被淀粉磷酸化酶重新利用，因而在反应体系中加入葡聚糖转移酶也能够提高淀粉的利用率。

由于磷酸盐的价格相比淀粉更高，并考虑到环保要求，故而在实际生产中，可通过对工艺的调整，尽可能提高对磷酸盐的利用率。

本发明公开了一种肌醇-1-磷酸的制备方法，包括以下步骤：

以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入淀粉磷酸化酶(α-glucan(starch)phosphorylase，EC 2.4.1.1)，葡萄糖磷酸变位酶(Phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2)和肌醇-1-磷酸合成酶(Inositol-1-phophate synthase，EC 5.5.1.4)建立多酶反应体系，进行酶催化反应即得肌醇-1-磷酸。

本发明中所述淀粉优选为可溶性淀粉；所述淀粉衍生物包括：部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种。

本发明中所述底物淀粉的浓度为20-500g/L；所述淀粉磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1000U/mL，所述肌醇-1-磷酸合成酶的用量为0.1-1000U/mL；优选的，所述底物浓度为100-200g/L；所述淀粉磷酸化酶的用量为5-20U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为5-20U/mL，所述肌醇-1-磷酸合成酶的用量为5-20U/mL。所述酶催化反应的条件是在20-90℃反应2-100小时；优选的，所述酶催化反应在60-80℃反应24-72小时。

作为本发明的优选技术方案，所述多酶催化物中还包括(1)淀粉去分支酶、(2)麦芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8)和/或(3)葡聚糖转移酶(4-a-glucanotransferase，EC.2.4.1.25)中任何一种或多种。其中，所述淀粉去分支酶为异淀粉酶(isoamylase，EC 3.2.1.68)或普鲁兰酶(pullulanase，EC 3.2.1.41)中的任意一种或两种。优选的，在多酶反应体系中，所述淀粉去分支酶的用量为0.1-100U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶的用量为0.1-100U/mL；更优选的，所述淀粉去分支酶的用量为1-10U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶的用量为1-10U/mL。

为了进一步提高肌醇-1-磷酸的得率，将冗余的葡萄糖转化为肌醇-1-磷酸，所述多酶反应体系中还应还包含聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，EC2.7.1.63)和聚磷酸盐；所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1-500U/mL，所述聚磷酸盐的用量为1-500mM；优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为1-5U/mL，所述聚磷酸盐的用量为2-20mM；所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。

所述多酶反应体系还含有以下各成分：缓冲液、无机磷酸根、二价镁离子；优选的，缓冲液为磷酸钠缓冲液，浓度为2-2000mM；更优选的，磷酸钠缓冲液的pH值5.0-9.0；优选的，二价镁离子浓度为1-50mM；更为优选的，二价镁离子的浓度为5mM。

本发明多酶反应体系中的任何一种酶还可以为任何一种具有同等功能的酶所替换，优选为通过蛋白质工程改造所获得的具有同等功能的突变酶。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明在一个多酶反应体系中，以淀粉及其衍生物和磷酸盐为原料，通过体外多酶催化转化为肌醇-1-磷酸，并通过过程优化，添加能促进淀粉及其衍生物水解的酶以及利用副产物(葡萄糖)的酶，使转化效率显著提高，高得率又大大降低肌醇-1-磷酸的分离成本。本发明方法具有简便，原料利用率高、肌醇-1-磷酸产率高，生产成本低，污染低等优点，可以实现肌醇-1-磷酸的规模化生产。

本发明所涉及到的术语及定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。

术语“葡萄糖多聚物”意指葡萄糖分子聚合而成的淀粉。

术语“葡萄糖寡聚物”意指部分水解的淀粉、淀粉糊精、麦芽多糖、麦芽糖等。

附图说明

图1为淀粉转化生成肌醇-1-磷酸的体外多酶催化途径的示意图；其中，IA，异淀粉酶；PA，普鲁兰酶；αGP，淀粉磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸变位酶；IPS，肌醇-1-磷酸合成酶；4GT，葡聚糖转移酶；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶。

图2为SDS-PAGE检测3个关键酶；T，大肠杆菌细胞裂解液；S，裂解液上清；H，经热处理的裂解液上清；Ni，经镍柱纯化的酶。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实验材料

可溶性淀粉，soluble starch，ACROS公司产品，产品编号：424490020；

麦芽糊精，ALDRICH公司产品，产品编号419672；

pET20b载体，Novagen，Madison，WI；

大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；

本发明中的所有酶(除聚磷酸葡萄糖激酶、葡聚糖转移酶、肌醇-1-磷酸合成酶)均能在Sigma公司购买得到，所有酶都可以按照基因工程方法通过原核表达获得；

麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284；

实验例1体外多酶催化将淀粉转化为肌醇-1-磷酸

通过体外多酶催化体系将淀粉转化为肌醇-1-磷酸(图1)。这些关键酶包括：(1)淀粉磷酸化酶(αGP，EC 2.4.1.1)，从淀粉上释放出葡萄糖-1-磷酸；(2)葡萄糖磷酸变位酶(PGM，EC 5.4.2.2)，催化葡萄糖-1-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸；(3)肌醇-1-磷酸合成酶(IPS，EC 5.5.1.4)，催化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇-1-磷酸。由于最后一个酶反应是不可逆反应，所以该酶催化体系转化率很高。

在本发明中，淀粉磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号分别为TM1168和TM0769，肌醇-1-磷酸合成酶来源于Archaeoglobusfulgidus，基因在KEGG上的编号为AF1794，这些基因组DNA都可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这三个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过Simple Cloning(You et al.2012)的方法克隆至pET20b载体(Novagen,Madison,WI)中，获得相应的表达载体pET20b-TmαGP，pET20b-TmPGM和pET20b-AfIPS。这三个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并进行蛋白质表达与纯化，蛋白质纯化的结果如图2所示。

在一个1.0mL的反应体系中含有200mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.2)，5mM的二价镁离子，0.5U/mL的淀粉磷酸化酶，0.1U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，和0.5U/mL肌醇-1-磷酸合成酶，20g/L的可溶性淀粉，在70℃进行催化反应，反应时间为72个小时。

肌醇-1-磷酸的检测采用酶法进行检测。取反应样品65μL，加入35μL 1.88mol/L的高氯酸进行处理，然后加入5mol/L的KOH调节pH至中性。离心取上清，加入过量的肌醇单磷酸酶，使肌醇-1-磷酸完全转化为肌醇，采用HPLC检测肌醇的浓度，进而换算出肌醇-1-磷酸的浓度。

肌醇-1-磷酸的检测可采用减差法进行测定。采用硫酸苯酚法测定反应开始和结束体系中的总糖，总糖减少量即为肌醇-1-磷酸的产生量。硫酸苯酚法作为一种简单、快速测定碳水化合物的方法被广泛应用。几乎所有种类的糖都能采用硫酸苯酚法进行定量，包括糖类衍生物、寡聚糖和多聚糖。硫酸苯酚法的精度可达±0.5％。氨基酸，乳酸和柠檬酸均不会干扰检测。

中间产物葡萄糖-6-磷酸的浓度可用酶法测定。通过与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联，测定NADH的增加量即可确定葡萄糖-6-磷酸的含量。

中间产物葡萄糖-1-磷酸的浓度可用酶法测定。通过与葡萄糖磷酸变位酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联，测定NADH的增加量即可确定葡萄糖-1-磷酸的含量。

反应结束后，最终肌醇-1-磷酸的终浓度是6.0g/L，对淀粉转化率为30％。

实验例2体外多酶催化将淀粉转化为肌醇-1-磷酸(不同温度反应)

淀粉磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶和肌醇-1-磷酸合成酶的制备同实验例1。

在一个1.0mL的反应体系中含有200mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.2)，5mM的二价镁离子，0.5U/mL的淀粉磷酸化酶，0.1U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，和0.5U/mL肌醇-1-磷酸合成酶，20g/L的可溶性淀粉，在80℃进行催化反应，反应时间为72个小时。

反应结束后，肌醇-1-磷酸的终浓度是6.4g/L，对淀粉转化率为32％。

实验例3通过过程优化和添加促进淀粉水解的酶，提高肌醇-1-磷酸的得率

由于淀粉磷酸化酶不能完全水解淀粉，限制肌醇-1-磷酸的得率。故而我们在反应体系中增加能够帮助淀粉水解的异淀粉酶(isoamylase，EC 3.2.1.68)。在淀粉磷酸化酶和异淀粉酶的双重作用下，淀粉水解的终产物为麦芽糖和葡萄糖。为了将这些产物转化为肌醇-1-磷酸，还需要加入麦芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase，EC2.4.1.8)和聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，EC 2.7.1.63)。

在本发明中，异淀粉酶来源于Sulfolobus tokodaii，基因在KEGG上的编号为ST0928，该菌株的基因组DNA是德国Albert-Ludwigs-Freiburg的Georg Fuchs教授友情提供。聚磷酸葡萄糖激酶来源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的编号为Tfu1811，该菌株的基因组DNA是美国康奈尔大学的David Wilson教授友情提供。葡聚糖转移酶来源于Thermococcus litoralis，基因在KEGG上的编号为OCC_10078，该菌株的基因组DNA可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这三个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过Simple Cloning.的方法克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-StIA，pET20b-TfuPPGK和pET20b-Tl4GT，这三个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达与纯化。

淀粉磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-1-磷酸合成酶的制备同实验例1；麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284。

在一个1.0mL的反应体系中含有200mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.2)，40mM的二价镁离子，20mM聚磷酸钠，5U/mL的淀粉磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，和5U/mL肌醇-1-磷酸合成酶，1U/mL的异淀粉酶，1U/mL的麦芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/mL的葡聚糖转移酶，100g/L的可溶性淀粉，在70℃进行催化反应，反应时间为72个小时。反应24小时后，补加100mM的磷酸根离子。

反应结束后，肌醇-1-磷酸的终浓度是75g/L，对淀粉转化率为75％。

Claims

1.一种肌醇-1-磷酸的制备方法，其特征在于：以淀粉或淀粉衍生物和无机磷酸根离子为底物，加入淀粉磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-1-磷酸合成酶，以及缓冲溶液进行多酶催化反应，生产肌醇-1-磷酸。

2.权利1所述多酶反应体系中，所述淀粉或淀粉衍生物的底物浓度为20-500g/L，所述无机磷酸的根底物浓度为2-2000mM，所述α-淀粉磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1000U/mL，所述肌醇-1-磷酸合成酶的用量为0.1-1000U/mL；

优选的，所述淀粉或淀粉衍生物底物浓度为100-200g/L，所述无机磷酸根的浓度为50-500mM，所述α-淀粉磷酸化酶的用量为5-20U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为5-20U/mL，所述肌醇-1-磷酸合成酶的用量为5-20U/mL。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述酶催化反应的条件为：20-90℃反应2-100小时；优选为，60-80℃反应24-72小时。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述淀粉衍生物包括部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种按照任意比例组成的混合物。

5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多酶催化物中还包括(1)淀粉去分支酶、(2)麦芽糖磷酸化酶和/或(3)葡聚糖转移酶中任何一种或多种。其中，所述淀粉去分支酶为异淀粉酶或普鲁兰酶中的任意一种或两种。

优选的，在多酶反应体系中，所述淀粉去分支酶的用量为0.1-100U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为0.1-100U/mL，所述葡聚糖转移酶的用量为0.1-100U/mL；

更优选的，所述淀粉去分支酶的用量为1-10U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为1-10U/mL，所述葡聚糖转移酶的用量为1-10U/mL。

6.按照权利要求1和5所述的肌醇-1-磷酸制备方法，其特征在于：所述多酶催化物中还包括：聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；

优选的，在多酶反应体系中，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1-500U/mL，所述聚磷酸盐的用量为1-500mM；更优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为1-5U/mL，所述聚磷酸盐的用量为2-20mM；

其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。

7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系中还包括：缓冲液和二价镁离子；

所述缓冲液优选为磷酸缓冲液，pH为5.0-9.0；

优选的，各成分的用量为：缓冲液2-2000mM，二价镁离子1-50mM；

更优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液200mM，二价镁离子5mM。

8.按照权利要求1所述的制备方法，肌醇-1-磷酸可以从反应液中分离。