CN117051049B - 一种d-手性肌醇的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物合成领域，具体公开了一种D‑手性肌醇的制备方法。本发明以淀粉和/或其衍生物为底物，利用多酶分子机器制备D‑手性肌醇。本发明方法具有原料便宜易得，生产成本低，污染低等优点，可以实现D‑手性肌醇的规模化生产。

Description

一种D-手性肌醇的制备方法
技术领域
本发明属于生物合成领域，具体涉及D-手性肌醇的生物合成，更具体涉及D-手性肌醇的制备方法。
背景技术
D-手性肌醇(D-chiro-inositol，简称DCI)是肌肉肌醇(myo-inositol，MI)的一种差向异构体，在自然界中主要存在于苦荞、角豆等植物中，是一种植物天然提取物。D-手性肌醇可从荞麦等植物中提取，然而D-手性肌醇在这些植物中的含量不高，导致资源的利用率较差，分离提取的成本较高。D-手性肌醇也可以通过有机合成法制备，但由于步骤繁琐，副产物难以分离，同时会有毒性物质的残留，影响产品的品质；另外需要用到大量的有机溶剂，环境友好性差。
Yoshida等(Yoshida K,etal.,Genetic modification of Bacillus subtilisfor production of D-chiro-inositol,an investigational drug candidate fortreatment of type 2diabetes and polycystic ovary syndrome.Appl EnvironMicrobiol 72:1310-1315,2006)尝试了生物转化合成D-手性肌醇，即利用基因改造的枯草芽孢杆菌通过发酵法从肌肉肌醇转化为D-手性肌醇，但产率仅为6％。在CN109706189B中公开了一种利用微生物全细胞和/或其裂解液催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇的方法。然而，这些生物转化的方法都是以肌肉肌醇为原料制备D-手性肌醇。随着肌肉肌醇的广泛应用和市场变动，其价格也越来越昂贵，导致以肌肉肌醇为原料制备D-手性肌醇的成本昂贵。因此，需要开发一种更高转化率的生产D-手性肌醇的方法，由此提出本发明。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用多酶分子机器由淀粉及其衍生物制备D-手性肌醇的方法，该方法具有D-手性肌醇转化率高、生产成本低、低污染等优点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明公开了一种D-手性肌醇的制备方法，其以淀粉和/或其衍生物为底物，加入α-葡聚糖磷酸化酶(α-Glucan phosphorylase，EC 2.4.1.1，简称αGP)，葡萄糖磷酸变位酶(Phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2，简称PGM)，肌醇-3-磷酸合成酶(Inositol-3-phophatesynthase，EC 5.5.1.4，简称IPS)和肌醇单磷酸酶(Inositol monophosphatase，EC3.1.3.25，简称IMP)，肌肉肌醇脱氢酶(myo-inositol 2-dehydrogenase，EC 1.1.1.18，简称IDH)和肌醇单酮异构酶(inosose isomerase，EC 5.3.99.11，简称KII)构建多酶分子机器或者，或者以表达所述多酶的一种细胞，或分别表达所述多酶中一种或几的多种细胞混合而构成全细胞催化剂，进行反应。
根据本发明，所述催化途径包括：由葡聚糖磷酸化酶将淀粉和/或其衍生物中的一个葡萄糖单元转化为葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸变位酶将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸；由肌醇-3-磷酸合成酶将葡萄糖-6-磷酸转化为肌醇-3-磷酸，由肌醇单磷酸酶将肌醇-3-磷酸转化为肌肉肌醇，由肌肉肌醇脱氢酶将肌肉肌醇氧化为2-酮基-肌肉肌醇，由肌醇单酮异构酶将2-酮基-肌肉肌醇异构化为1-酮基-D-手性肌醇，由肌肉肌醇脱氢酶将1-酮基-D-手性肌醇还原为产物D-手性肌醇，如图1所示。
在本发明中，所述多酶分子机器中的任何一种酶可以为任何一种具有同等功能的酶所替换。
在本发明的一些实施方案中，所述α-葡聚糖磷酸化酶的来源包括但不限于Hungateiclostridiumthermocellum、Thermus thermophilus、Pyrococcus sp.、Pyrococcushorikoshii、Pyrococcusfuriosus、Thermococcus barophilus、Thermococcus kodakarensis、Thermotoga maritima等。在本发明一些具体的实施方案中，所述α-葡聚糖磷酸化酶可来源于Hungateiclostridiumthermocellum，Uniprot数据库中的编号为A3DCB6。
在本发明的一些实施方案中，所述葡萄糖磷酸变位酶的来源包括但不限于Hungateiclostridiumthermocellum、Thermus thermophilus、Pyrococcus sp.、Pyrococcushorikoshii、Pyrococcusfuriosus、Thermococcus barophilus、Thermococcus kodakarensis、Thermotoga maritima等。在本发明一些具体的实施方案中，所述葡萄糖磷酸变位酶可来源于Hungateiclostridiumthermocellum，Uniprot数据库中的编号为A3DEW8。
在本发明的一些实施方案中，所述肌醇-3-磷酸合成酶的来源包括但不限于Archaeoglobusfulgidus、Archaeoglobusprofundus、Thermotoga maritima、Thermococcus kodakarensis、Pyrococcusfuriosus等。在本发明一些具体的实施方案中，所述肌醇-3-磷酸合成酶可来源于Archaeoglobusfulgidus，Uniprot数据库编号为O28480。
在本发明的一些实施方案中，所述肌醇单磷酸酶的来源包括但不限于Thermotoga maritima、Methanocaldococcusjannaschii、Mycolicibacterium smegmatis等。在本发明一些具体的实施方案中，所述肌醇单磷酸酶可来源于Thermotoga maritima，Uniprot数据库编号为O33832。
在本发明的一些实施方案中，所述肌肉肌醇脱氢酶的来源包括但不限于Geobacilluskaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotogathermarum等。在本发明一些具体的实施方案中，所述肌肉肌醇脱氢酶可来源于Thermotoga maritima，Uniprot数据库编号为Q9WYP5。
在本发明的一些实施方案中，所述肌醇单酮异构酶的来源包括但不限于Geobacilluskaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotogathermarum等。在本发明一些具体的实施方案中，所述肌醇单酮异构酶可来源于Geobacilluskaustophilus，Uniprot数据库编号为Q5KYQ9。
在本发明中，所述淀粉和/或其衍生物可选自直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精和/或其组合物。所述淀粉和/或其衍生物可原样使用市售产品，也可使用经过α-淀粉酶处理后的混合物。其在反应体系中用量为5g/L至200g/L，具体为10g/L至50g/L。
在本发明的一些实施方案中，为了增加底物淀粉和/或其衍生物的利用，所述D-手性肌醇的制备方法还可包括利用淀粉分支酶如异淀粉酶（isoamylase，EC3.2.1.68，简称IA）将淀粉转化为麦芽糊精的步骤。所述异淀粉酶的来源包括但不限于Hungateiclostridiumthermocellum、Thermus thermophilus、Pyrococcus sp.、Pyrococcushorikoshii、Pyrococcusfuriosus、Thermococcus barophilus、Thermococcus kodakarensis、Thermotoga maritima、Sulfolobustokodaii等。在本发明一些具体实施方案中，所述异淀粉酶可来源于Sulfolobustokodaii，Uniprot数据库中的编号为Q973H3。在本发明的一些实施方案中，为了增加底物淀粉和/或其衍生物的利用，所述D-手性肌醇的制备方法还可包括利用淀粉分支酶如普鲁兰酶（PA）将淀粉转化为麦芽糊精的步骤。所述普鲁兰酶的来源包括但不限于Hungateiclostridiumthermocellum、Thermus thermophilus、Pyrococcus sp.、Pyrococcushorikoshii、Pyrococcusfuriosus、Thermococcus barophilus、Thermococcus kodakarensis、Thermotoga maritima、Sulfolobustokodaii等，也可原样使用市售产品。在本发明一些具体实施方案中，所述普鲁兰酶可来源于Thermotoga maritima，Uniprot数据库中的编号为O33840。
在本发明中，所述多酶分子机器中所使用的酶自然存在于各种生物体中。虽然在实施例中使用具有所需活性的特定酶，但本发明不限于这些酶，因为其他酶可能具有类似的活性并且可以使用。
在本发明中，所述多酶分子机器中所使用的酶也可以是经过某些遗传修饰的酶，所述遗传修饰提高了酶的一些特性，例如反应活性，例如热稳定性等。通过基因工程技术衍生自野生型酶的具有所需特性的酶被称作“突变体”，“突变体衍生物”或“来自相应野生型酶的突变体”。本公开中，对于用于实施本公开的酶包括这些性能提高了的“突变体”。
在本发明中，所述多酶分子机器中酶的使用形式可以是多样的，包括但不限于纯化或部分纯化的酶、表达所述酶的微生物和/或微生物细胞、所述微生物的培养物、所述微生物的蛋白提取物、所述微生物的培养物的蛋白提取物或其组合。
在本发明中，所述多酶分子机器中的各种功能的酶可以独立地以各种形式单独使用，也可以共表达使用，例如表达在不同表达载体上，同时转入大肠杆菌中使用，例如以融合蛋白或酶复合体的形式使用。
在本发明中，所述多酶分子机器中的各种功能的酶可以纯酶的方式直接使用（即游离酶），或将纯酶固定化（即固定化酶）以保持稳定性和可回收再利用；或者，将含有所述各种功能的酶的全细胞微生物或全细胞微生物的培养物（即发酵产物）直接使用，或将所述全细胞固定化（即固定化细胞）以保持稳定性和可回收再利用。在本公开的一些具体实施方案中，为了获得快速反应速率，可以对全细胞进行通透性处理，示例性的，使用热处理的方式促进细胞膜通透性。
通常，在本发明制备D-手性肌醇的方法中使用的酶单位的比例等摩尔比。为了优化D-手性肌醇的产率，这些比例可以以任意数字的组合进行调整。为了提高D-手性肌醇的生产效率，特定的酶可以以约2×、3×、4×、5×等的量存在。
在本发明制备D-手性肌醇的方法中，在一定温度下，建立多酶催化反应体系，进行反应。合适的温度取决于如下因素，如多酶分子机器中的各种功能的酶的性质和量以及底物淀粉和/或其衍生物的量。
在本发明的一些实施方案中，所述制备D-手性肌醇的方法在25至90℃的温度下进行。在本发明的一些优选的实施方案中，所述制备D-手性肌醇的方法在45至75℃的温度下进行。在本发明的一些更优选的实施方案中，所述制备肌醇的方法在50至65℃的温度下进行。
在本发明制备D-手性肌醇的方法中，在一定pH下，建立多酶催化反应体系，进行反应。合适的pH取决于如下因素，如多酶分子机器中的各种功能的酶的性质和量以及底物淀粉和/或其衍生物的量。
在本发明的一些实施方案中，所述制备D-手性肌醇的方法在至少pH 5.0、至少pH5.5、至少pH 6.0、至少pH6.5、至少pH 7.0、至少pH 7.5、至少pH 8.0、至少pH 8.5、至少pH9.0下进行。在本发明的一些优选的实施方案中，所述制备肌醇的方法在pH 6.0至pH 8.0下进行。在本发明的一些更优选的实施方案中，所述制备肌醇的方法在pH 6.0至pH 8.0下进行。
在本发明制备D-手性肌醇的方法中，在一定缓冲液中，建立多酶催化反应体系，进行反应。合适的缓冲液及缓冲液浓度取决于如下因素，如反应的pH、多酶分子机器中的各种功能的酶的性质和量、底物淀粉和/或其衍生物的量以及镁离子和无机磷酸盐和/或多聚磷酸盐的量。
在本发明的一些实施方案中，所述制备D-手性肌醇的方法的缓冲液可以为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液。在本发明的一些实施方案中，所述制备D-手性肌醇的方法的缓冲液浓度可以为0-200 mM。其中，所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，更优选的，磷酸盐缓冲液的pH值6.5-7.5。
在本发明制备D-手性肌醇的方法中，建立多酶催化反应体系反应一段时间。合适的反应时间取决于如下因素，如多酶分子机器中的各种功能的酶的性质和量以及底物淀粉和/或其衍生物的量。
在本发明的一些实施方案中，所述制备D-手性肌醇的方法的反应时间为不超过96h、不超过72 h、不超过60 h、不超过48 h、不超过36 h、不超过24 h、不超过12 h、不超过10h、不超过8 h、不超过6 h。
优选地，温度、pH、缓冲液和/或反应时间的组合是有效的，以确保较高的D-手性肌醇的产率。
在本发明中，所述多酶反应体系还含有以下各成分：无机磷酸盐、镁离子的盐、NAD+或NADH；优选的，各成分的用量为：无机磷酸盐1-100mM；镁离子的盐1-10mM；NAD+或NADH0.5-10 mM。
在本发明的一些实施方案中，所述无机磷酸盐包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等，可以原样使用含有上述物质的市售产品。
在本发明的一些实施方案中，所述含镁离子的盐包括氯化镁、硫酸镁等，可以原样使用含有上述物质的市售产品。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明制备D-手性肌醇的方法，以廉价易得的淀粉和/或其衍生物为原料，通过多酶催化制备D-手性肌醇，所使用的酶稳定性更高，具有原料便宜易得，生产成本低，污染低等优点，可以实现D-手性肌醇的规模化生产。
附图说明
图1为利用多酶分子机器由淀粉和/或其衍生物制备D-手性肌醇途径的示意图；其中，IA：异淀粉酶；PA：普鲁兰酶；αGP：葡聚糖磷酸化酶；PGM：葡萄糖磷酸变位酶；IPS：肌醇-3-磷酸合成酶；IMP：肌醇单磷酸酶；IDH：肌肉肌醇脱氢酶；KII：肌醇单酮异构酶；Pi：无机磷酸盐。
图2为D-手性肌醇的HPLC检测图。
图3为D-手性肌醇产量-反应时间曲线。
具体实施方式
定义：
为使本领域的技术人员可了解本发明的特点及功效，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域的技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本文使用“一”“一个”“一种”或类似的表达来描述本发明所述的组分和技术特征，此种描述仅仅是为了方便表达，并给予本发明的范围提供一般性的意义。因此，此种描述应理解为包括一个或至少一个，且单数也同时包括复数，除非明显是另指他义。
在本文中，“或其组合”即为“或其任一种组合”“任一”“任一种”“任一个”即为“任意一”“任意一种”“任意一个”。
本文所使用的术语“优选地”，“优选”并不能限制所要求保护的本发明的范围，或者暗示某些特征对于所要求保护的本发明的结构或功能是关键的，必要的，或者甚至是重要的。相反，这些术语仅仅是为了强调在本发明的特定实施例中能够或不能使用的替代或附加特征。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”“具有”“包括”“拥有”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
如本公开所使用的，术语“约”表示：一个数值包括测定该数值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。示例性的，前述标准偏差一般为原始数值相差20-30%的范围之内。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。本说明书中，术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。
如本公开所使用的，术语“合适的反应条件”是指在酶催化反应体系中的那些条件，例如酶加量、底物加量、温度、pH、缓冲液、辅因子等的范围，在所述条件下本公开的酶催化反应能够将葡萄糖转化为肌醇。一些示例性的“合适的反应条件”在本文中提供。
如本公开所使用的，术语“加量”，诸如在“酶加量”或“底物加量”中，是指在反应起始时组分在反应混合物中的浓度或量。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实验材料：
玉米淀粉，金玉米生物科技有限公司；麦芽糊精，使用α-淀粉酶自制。
大肠杆菌E. coli TOP10和DH5α（赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，马塞诸塞，美国）被用于DNA操作以及质粒扩增。大肠杆菌E. coli BL21（DE3）（英潍捷基生命技术有限公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚，美国）被用于重组蛋白的表达。
质粒及重组蛋白的制备和纯化：
本领域技术人员根据其实际需要可以使用本领域公知的技术手段制备重组工程菌，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)。本领域技术人员可培养经工程改造的微生物细胞生产所述酶。微生物细胞生产重组酶的指南和规程可在以下出版物中找到，如《发酵和生物化学工程手册：原理、过程设计和仪器》（2nd Edition, Henry C. Vogeland Celeste L. Todaro, Noyes Publications 1997）和《发酵技术原理》（2nd Edition,P. F. Stanbury et. al., Butterworth Heineman, 2003）。
实验中所采用的载体、质粒、宿主均为常规的细菌(例如大肠杆菌)表达采用的载体、质粒、宿主系列，如PET系列载体、质粒，BL21系列宿主菌；所采用的培养基为常规细菌(例如大肠杆菌)工程菌的培养基，如LB培养基；所采用的培养方法为常规细菌(例如大肠杆菌)工程菌培养方法。
示例性的，携带有相应蛋白编码基因的pET质粒制备方式如下所述：将相应基因被从它们相应的基因组中扩增或者基因合成获得。通过基于延长重叠延伸PCR（POE-PCR）的简单克隆技术（You, C., X.-Z. Zhang and Y.-H. P. Zhang (2012). "Simple Cloning:direct transformation of PCR product (DNA multimer) to Escherichia coli andBacillus subtilis." Appl. Environ. Microbiol. 78:1593-1595.），它们被插入到pET20b质粒，构建得到含有编码相应目的蛋白的核苷酸序列的质粒。
将含有编码相应目的蛋白的核苷酸序列的质粒转化至E. coli BL21（DE3）感受态细胞，挑取过夜培养的单菌落加入到含有相应抗性的5 mL LB试管中，37oC恒温摇床200rpm过夜培养。按照1% (v/v)的接种量接种到含有相应抗性和200 mL LB培养基的三角瓶中，37oC恒温摇床中200 rpm进行扩大培养。当OD600达到0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1 mM，16oC恒温摇床中200 rpm培养16-18 h，进行目的蛋白质的表达，得到细胞培养液。将细胞培养液通过离心在4oC收集细胞，并将收集得到的细胞用含有0.9% (w/v)氯化钠溶液洗涤一次。将细胞沉淀重新悬浮在50 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)缓冲溶液中并通过超声裂解。离心后，通过热处理的方式进行蛋白的纯化，使用SDS-PAGE检测蛋白的纯度。
在我们完成专利CN109706189B的研究过程中，我们发现在肌肉肌醇合成D-手性肌醇的过程中，肌肉肌醇脱氢酶催化的反应是整个途径中的限速步骤，其酶的稳定性影响着反应的顺利进行以及整个工艺的生产成本。因此，在此基础上，本发明进一步对肌肉肌醇脱氢酶进行了挖掘和表征，代表性地所表征的肌肉肌醇脱氢酶的性质如表1所示：
表1
ND：未检测到活性；-：未进行测定。
从表1可以看出，TmIDH相比于其他来源的IDH具有更高的稳定性。
因此，在完成本发明的过程中，为了使所使用的酶更加匹配本发明的反应体系，本发明所用酶选择如表2所示的酶，后续实施例采用表2中所用的酶：
表2 酶的来源
产物检测方法：
D-手性肌醇的浓度采用高效液相色谱法（HPLC）检测，HPLC检测条件为：色谱柱为ThermoHypersil APS-2；流动相为乙腈/水(v:v，80:20)；流速为1mL/min；柱温为40℃；检测器为示差折光检测器；进样量为10μL。
利用多酶分子机器由淀粉和/或其衍生物制备D-手性肌醇的催化途径包括：由葡聚糖磷酸化酶将淀粉和/或其衍生物中的一个葡萄糖单元转化为葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸变位酶将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸；由肌醇-3-磷酸合成酶将葡萄糖-6-磷酸转化为肌醇-3-磷酸，由肌醇单磷酸酶将肌醇-3-磷酸转化为肌肉肌醇，由肌肉肌醇脱氢酶将肌肉肌醇氧化为2-酮基-肌肉肌醇，由肌醇单酮异构酶将2-酮基-肌肉肌醇异构化为1-酮基-D-手性肌醇，由肌肉肌醇脱氢酶将1-酮基-D-手性肌醇还原为产物D-手性肌醇，如图1所示。
实验例1
在一个1 mL的反应体系中含有50 mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2)，5mM二价镁离子，2U/mL的葡聚糖磷酸化酶，5U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶、5U/mL的肌醇单磷酸酶、4U/mL肌肉肌醇脱氢酶、2U/mL肌醇单酮异构酶，10g/L麦芽糊精，1mMNAD+，在60℃进行催化反应，反应10 h。反应结束后，采用HPLC检测D-手性肌醇的浓度。HPLC检测显示D-手性肌醇的终浓度为0.71 g/L。由此可知，以麦芽糊精为底物生产D-手性肌醇，证明了本发明的反应路线的可行性。
实验例2
在一个1 mL的反应体系中含有30mM的磷酸盐缓冲液(pH7.0)，5mM二价镁离子，2U/mL的葡聚糖磷酸化酶，5U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶、5U/mL的肌醇单磷酸酶、4U/mL肌肉肌醇脱氢酶、2U/mL肌醇单酮异构酶，2U/mL异淀粉酶，10g/L的麦芽糊精，1mMNAD+，在60℃进行催化反应，反应12 h。反应结束后，采用HPLC检测D-手性肌醇的浓度。实验结果如图2所示，HPLC检测显示D-手性肌醇的终浓度为1.09g/L。
该实施例表明，通过进一步加入异淀粉酶后，D-手性肌醇产率得到提高（相对于实施例1来说提高了53.52%）。
实验例3
在一个1 mL的反应体系中含有50 mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2)，5mM二价镁离子，2U/mL的葡聚糖磷酸化酶，5 U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，5 U/mL肌醇-3-磷酸合成酶、5 U/mL的肌醇单磷酸酶、4 U/mL肌肉肌醇脱氢酶、2 U/mL肌醇单酮异构酶，5 U/mL普鲁兰酶，10g/L可溶性淀粉，1mMNAD+，在55℃进行催化反应，随着反应时间进行取样，采用HPLC检测D-手性肌醇的浓度。D-手性肌醇的产量-时间曲线如图3所示，HPLC检测显示反应12 h后D-手性肌醇的终浓度为1.05g/L。
该实施例表明，将底物改变为可溶性淀粉，同时进一步加入普鲁兰酶，D-手性肌醇产率得到增加（相对于实施例1来说提高了47.89%）。
实验例4
在一个1 mL的反应体系中含有100 mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2)，10 mM二价镁离子，8 U/mL的葡聚糖磷酸化酶，10 U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，10 U/mL肌醇-3-磷酸合成酶、10 U/mL的肌醇单磷酸酶、8 U/mL肌肉肌醇脱氢酶、10 U/mL肌醇单酮异构酶，5 U/mL异淀粉酶，100 g/L麦芽糊精，5mMNAD+，在55℃进行催化反应，反应48 h。反应结束后，采用HPLC检测D-手性肌醇的浓度。HPLC检测显示D-手性肌醇的终浓度为13.3g/L。
该实施例表明，在高底物浓度下（高至100g/L）下，本发明反应路线仍然是可行的。相比于实施例1产率提高了87.32%。

Claims (8)

1.一种D-手性肌醇的制备方法，其特征在于，以淀粉和/或其衍生物为底物，加入α-葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-3-磷酸合成酶，肌醇单磷酸酶，肌肉肌醇脱氢酶、肌醇单酮异构酶，以及普鲁兰酶或异淀粉酶构建多酶反应体系，或者以表达所述多酶的一种细胞，或分别表达所述多酶中一种或几种的多种细胞混合而构成全细胞催化剂，进行反应得到D-手性肌醇；
反应是在50-65℃的温度下进行；
所述肌肉肌醇脱氢酶来源于Thermotoga maritima，其Uniprot编号为Q9WYP5；
所述α-葡聚糖磷酸化酶来源于Hungateiclostridium thermocellum，其Uniprot编号为A3DCB6；所述葡萄糖磷酸变位酶来源于Hungateiclostridium thermocellum，其Uniprot编号为A3DEW8；所述肌醇-3-磷酸合成酶来源于Archaeoglobus fulgidus，其Uniprot编号为O28480；所述肌醇单磷酸酶来源于Thermotoga maritima，其Uniprot编号为O33832；所述肌醇单酮异构酶来源于Geobacillus kaustophilus，其Uniprot编号为Q5KYQ9；所述异淀粉酶来源于Sulfolobus tokodaii，其Uniprot编号为Q973H3；所述普鲁兰酶来源于Thermotoga maritima，其Uniprot编号为O33840。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述淀粉和/或其衍生物选自直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精和/或其组合。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述淀粉和/或其衍生物是经过α-淀粉酶处理淀粉和/或其衍生物后的混合物，在反应体系中用量为5g/L至200g/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述多酶反应体系还含有以下各成分：无机磷酸盐、镁离子的盐、NAD+或NADH。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述多酶反应体系还含有以下各成分：无机磷酸盐1-100 mM；镁离子的盐1-10mM；NAD+或NADH 0.5-10 mM。
6.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反应是在pH 5.0-pH9.0下进行。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述反应是在pH 6.0至pH 8.0下进行。
8.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反应是在缓冲液中进行；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液。
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