CN108085344A - 一种以蔗糖为原料的肌醇制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肌醇的制备方法，属于肌醇的酶催化制备领域。本发明所公开的肌醇的制备方法以蔗糖或它的衍生物为底物，在一个多酶反应体系中，通过体外多酶高效催化将底物转化为肌醇；本发明通过过程优化，添加能够利用中间产物果糖的酶，从而建立优化的多酶反应体系，可以显著提升原料的转化效率和肌醇的得率。本发明方法原料转化率高，肌醇得率高，步骤简捷，生产成本低，对环境影响小，可实现肌醇的规模化生产。

Description

一种以蔗糖为原料的肌醇制备方法
技术领域
本发明涉及肌醇的制备方法，尤其涉及体外多酶催化将蔗糖转化为肌醇的方法，属于肌醇的酶催化生产领域。
背景技术
肌醇又名环已六醇，是水溶性维生素B族类物质。肌醇是人、动物与微生物生长的必需物质，它被发现在许多植物和动物体内。经实验证明肌醇可用于治疗肝硬化、脂肪肝、血管硬化、胆固醇过高、肥胖症、糖尿病和四氯化碳中毒等多种疾病。此外，随着肌醇应用领域的不断拓展，特别是作为原料在营养保健品和化妆品方面的应用，以及饲料添加剂在水产养殖、畜牧业、家禽饲养业等领域的应用，也使得肌醇的消费量逐年上升。近年来，在美国、英国、日本等国家在婴幼儿食品及营养食品中添加肌醇，赋予其一定营养保健功能，尤其是以肌醇为主要成分的维生素功能饮料，具有很大的市场潜力。随着近年来世界各国经济状况的好转，肌醇消费量还有继续增加的趋势。目前全球的年需求量大概在10,000吨左右，由于目前肌醇的高售价，使得肌醇的市场前景还未得到充分的开发。中国是生产肌醇的主要国家之一，美国、西欧和日本是主要的消费市场，其中用于保健品、化妆品和医药方面占70%左右，饲料行业、食品行业占20%左右，其它领域10%。预计今后10年内，肌醇的供应将更为紧缺，市场行情继续看好。在这种情况下，目前中国国内，甚至全世界的产量都远远不能满足需求。
目前肌醇的生产主要还是传统的高温加压水解植酸（六磷酸肌醇）。该工艺设备材质要求严格，一次性投资大，操作压力只能控制在一定的范围内，限制了原材料利用率的提高，且粗产品精制工艺复杂，损失较多，生产成本较高，而且该工艺会产生大量的磷酸污染物，对水源，环境污染严重。近些年，为了减少能耗和污染开发了常压水解法，但是该工艺仍存在较多问题。目前研究肌醇生产的热点在微生物法、化学合成法、电渗析法、以及离子交换树脂法等，然而均不同程度的存在成本高、产率低等问题。
因此，亟待开发一种低成本，低污染，高产率的生产肌醇的新方法。针对上述问题，本专利提出了一种肌醇的酶催化转化方法，利用来源广泛的蔗糖作为底物，通过体外多酶催化的方法生产肌醇。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种肌醇的酶催化转化方法，通过体外多酶催化低成本的蔗糖生产肌醇的方法，该方法具有肌醇产率和原料转化率高，生产成本低，无污染等优点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种肌醇的制备方法，包括以下步骤：以蔗糖为底物，加入蔗糖磷酸化酶（Sucrose phosphorylase，EC 2.4.1.7），葡萄糖磷酸变位酶（Phosphoglucomutase，EC5.4.2.2），肌醇-1-磷酸合成酶（Inositol-1-phophate synthase，EC 5.5.1.4）和肌醇单磷酸酶（Inositol monophosphatase，EC 3.1.3.25）建立多酶反应体系，进行酶催化反应；
其中，蔗糖的浓度为10g/L；所述蔗糖磷酸化酶的用量为1U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为1U/mL，所述肌醇-1-磷酸合成酶的用量为5U/mL，所述肌醇单磷酸酶的用量为2U/mL；所述酶催化反应的条件是在20-90℃反应20-100小时；优选为在50℃反应70小时。
将所述多酶反应体系划分两温度阶段，能够有效提高肌醇的得率和原料的转化率；优选的，所述底物的浓度为10 g/L；所述蔗糖磷酸化酶的用量为1U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为1U/mL，所述肌醇-1-磷酸合成酶的用量为5U/mL，所述肌醇单磷酸酶的用量为2U/mL，所述催化反应首先在50℃反应12小时后在70℃再反应36小时。更优选的，为了进一步提高肌醇的得率，将冗余的果糖转化为肌醇，可以在所述反应体系中加入聚磷酸果糖激酶（Polyphosphate fructokinase）、磷酸葡萄糖异构酶（Phosphoglucose isomerase，EC5.3.1.9）以及聚磷酸盐，将副产物果糖转化为肌醇，提高肌醇的得率；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。 ，另一种将冗余的果糖转化为肌醇的方法是在所述多酶反应体系中加入葡萄糖异构酶（Glucose isomerase，EC 5.3.1.5）、聚磷酸葡萄糖激酶（Polyphosphateglucokinase，EC 2.7.1.63）和聚磷酸盐；优选的，所述葡萄糖异构酶的用量为3U/mL，聚磷酸葡萄糖激酶的用量为1U/mL，所述聚磷酸盐的用量为10 mM；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
所述多酶反应体系还含有以下各成分：缓冲液、无机磷酸盐、二价镁离子和锌离子或锰离子；优选的，各成分的用量为：缓冲液100 mM，无机磷酸根50 mM，二价镁离子5 mM；其中，所述缓冲液优选为HEPES缓冲液，更优选的，HEPES缓冲液的pH值7.2。
本发明以蔗糖为底物，加入蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶，配制多酶反应体系，多酶催化途径包括：由蔗糖磷酸化酶将蔗糖中的一个葡萄糖单元转化为葡萄糖-1-磷酸并产生果糖；由葡萄糖磷酸变位酶将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸；由肌醇-1-磷酸合成酶将葡萄糖-6-磷酸转化为肌醇-1-磷酸，由肌醇单磷酸酶将肌醇-1-磷酸转化为肌醇。优选的，可以在所述多酶反应体系中加入葡萄糖异构酶，将果糖转化为葡萄糖再由聚磷酸葡萄糖激酶转化为葡萄糖-6-磷酸，最终由肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶转化为肌醇，可以将蔗糖中所有的糖单元转化为肌醇，从而提高肌醇的得率和转化率。由于由肌醇-1-磷酸合成酶将葡萄糖-6-磷酸转化为肌醇-1-磷酸和由肌醇单磷酸酶将肌醇-1-磷酸转化为肌醇的两个酶催化反应是不可逆反应，所以该酶催化体系能够得到很高的转化率。
由于所述酶催化体系中蔗糖磷酸化酶相较其他酶热稳定性差，该酶在高温反应过程（60-80℃）无法始终保持高活力，导致蔗糖转化率低。为了提高肌醇的转化率，本发明将多酶反应体系分两温度阶段进行，保证了原料蔗糖的充分降解从而提高肌醇的得率和转化率。
本发明多酶反应体系中的任何一种酶还可以为任何一种具有同等功能的酶所替换，优选为通过蛋白质工程改造所获得的具有同等功能的突变酶。
本发明体外多酶催化将蔗糖转化为肌醇试验中，在一个反应体系中，以蔗糖为原料，加入蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶，50℃进行催化反应70小时，最终蔗糖原子转化率为26.0%。在上述反应过程改为两阶段即50℃反应12小时后70℃反应36小时，最终蔗糖的原子转化率达到84.0%，原料利用率显著提高。另外，通过向上述反应体系添加聚磷酸、聚磷酸果糖激酶和磷酸葡萄糖异构酶，可以提高肌醇的转化率；更优选的，本发明在多酶反应体系中再加入葡萄糖异构酶、聚磷酸和聚磷酸葡萄糖激酶，将果糖转化为葡萄糖-6-磷酸，由肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶转化为肌醇，最终将蔗糖中所有的糖单元转化为肌醇，从而进一步提高肌醇的得率和转化率。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明在一个多酶反应体系中，以蔗糖以及其衍生物为原料，通过体外多酶催化转化为肌醇，并通过过程优化，改变反应进程，使原料转化效率显著提高，高得率和高转化率又大大降低肌醇的分离成本。本发明方法具有简便，原料利用率高、肌醇转化率高，生产成本低，污染低等优点，可以实现肌醇的规模化生产。
本发明所涉及到的术语及定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。
附图说明
图1为转化蔗糖生成肌醇的体外多酶催化途径的示意图；其中，SP，蔗糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸变位酶；IPS，肌醇-1-磷酸合成酶；IMP，肌醇单磷酸酶；
图2为SDS-PAGE检测4个关键酶；其中，第1列，蔗糖磷酸化酶；第2列，葡萄糖磷酸变位酶；第3列，肌醇-1-磷酸合成酶；第4列，肌醇单磷酸酶；
图3为利用HPLC分析肌醇；其中，图3a为用HPLC方式区分肌醇、果糖、葡萄糖-1-磷酸（G1P）和葡萄糖-6-磷酸（G6P）；图3b为用HPLC定量分析肌醇的浓度，通过肌醇峰的强度可以定量得到肌醇的浓度；
图4为利用HPLC检测以蔗糖为底物，经过酶促反应后的产物，箭头所指表示肌醇的特征峰；
图5为过程优化的转化蔗糖生成肌醇体外多酶催化途径的示意图；其中，SP，蔗糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸变位酶；GI，葡萄糖异构酶；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；IPS，肌醇-1-磷酸合成酶；IMP，肌醇单磷酸酶；
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实验材料
蔗糖（Sucrose），Sigma公司产品，产品编号：424490020；
pET20b载体，Novagen，Madison，WI；
大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；
本发明中的大部分酶（除了肌醇单磷酸酶）能在Sigma公司购买得到；但是都可以按照基因工程方法通过原核表达获得；
实验例1体外多酶催化将蔗糖转化为肌醇
通过一个体外多酶催化体系将蔗糖转化为肌醇（图1）。这些关键酶包括：（1）蔗糖磷酸化酶（SP，EC 2.4.1.7），催化蔗糖分解成为葡萄糖-1-磷酸和果糖；（2）葡萄糖磷酸变位酶（PGM，EC 5.4.2.2），催化葡萄糖-1-磷酸到葡萄糖-6-磷酸；（3）肌醇-1-磷酸合成酶（IPS，EC5.5.1.4），其催化葡萄糖-6-磷酸为肌醇-1-磷酸；（4）肌醇单磷酸酶(IMP，EC 3.1.3.25)，其将肌醇-1-磷酸脱磷成为肌醇。由于最后两个酶反应是不可逆反应，所以该酶催化体系能够得到很高的转化率。
在本发明中，蔗糖磷酸化酶来源于Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum，基因在KEGG上的编号为Tthe1921，葡萄糖磷酸变位酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM0769，肌醇-1-磷酸合成酶来源于Archaeoglobus fulgidus，基因在KEGG上的编号为AF1794，肌醇单磷酸酶也来源于T. maritima，基因在KEGG上的编号为TM1415，这些基因组DNA都可从ATCC的官方网站（www.atcc.org）上获得。这四个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过Simple Cloning（You, C., et al. (2012). "Simple Cloning via DirectTransformation of PCR Product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis." Appl. Environ. Microbiol. 78(5): 1593-1595.）的方法克隆至pET20b载体(Novagen,Madison, WI)中，获得相应的表达载体pET20b-TtSP，pET20b-AfIPS，pET20b-TmPGM和pET20b-TmIMP。这四个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3) (Invitrogen,Carlsbad, CA)中，并进行蛋白质表达与纯化，蛋白质纯化的结果如图2所示。
在一个1.0毫升的反应体系中含有100mM的HEPES缓冲液（pH 7.2），50mM的无机磷酸根，5mM的二价镁离子， 1U/mL的蔗糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，5U/mL肌醇-1-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇单磷酸酶，10g/L的蔗糖，在50℃进行催化反应，反应70个小时。
根据保持时间的不同，HPLC可以用来区分反应液中的肌醇、果糖、葡萄糖-1-磷酸或葡萄糖-6-磷酸(图3a)；并且可以对肌醇进行定量，如图3b所示，肌醇的浓度与HPLC中肌醇特征峰的强度是成正比的；HPLC的流动相为5 mM的稀硫酸。
反应结束后，肌醇的终浓度是1.3g/L，蔗糖原子转化率为26.0%。
实验例2体外多酶催化将蔗糖转化为肌醇
蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶的制备同实验例1。
在一个1.0毫升的反应体系中含有100 mM的HEPES缓冲液（pH 7.2），50 mM的无机磷酸根，5 mM的二价镁离子，1 U/mL的蔗糖磷酸化酶，1 U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，5 U/mL肌醇-1-磷酸合成酶和2 U/mL的肌醇单磷酸酶，10 g/L的蔗糖，在70℃进行催化反应，反应40个小时。
反应结束后，肌醇的终浓度是0.8 g/L，蔗糖原子转化率为16%。
实验例3通过条件优化，利用体外多酶催化将蔗糖转化为肌醇
由于本专利中构建的酶催化体系中蔗糖磷酸化酶相较其他酶热稳定性差，该酶在高温反应过程（60-80℃）无法始终保持高活力，导致蔗糖转化率低。为了提高肌醇的转化率，本发明改进多酶反应体系为两温度阶段进行，保证了原料蔗糖充分降解从而提高肌醇的得率和转化率。
在一个1.0毫升的反应体系中含有100mM的HEPES缓冲液（pH 7.2），50mM的无机磷酸根，5mM的二价镁离子，1 U/mL的蔗糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，5U/mL肌醇-1-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇单磷酸酶，10 g/L的蔗糖；该体系首先在50℃进行，反应12个小时，随后提高反应温度至70℃再反应36小时；反应结束后，肌醇的终浓度为4.2 g/L，蔗糖原子转化率达到了84%，如图4所示。
实验例4通过过程优化，利用体外多酶催化将蔗糖转化为肌醇
通过过程优化的体外多酶催化体系将蔗糖转化为肌醇的示意图见图5。
其中，蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶的制备同实验例1。葡萄糖异构酶（Glucose isomerase，EC 5.3.1.5）从Sigma公司购买，产品编号为G4166。聚磷酸葡萄糖激酶来源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的编号为Tfu1811，该菌株的基因组DNA是美国康奈尔大学的David Wilson教授友情提供；该基因通过PCR获取，并通过Simple Cloning（You, C., et al. (2012). "Simple Cloning viaDirect Transformation of PCR Product (DNA Multimer) to Escherichia coli andBacillus subtilis." Appl. Environ. Microbiol. 78(5): 1593-1595.）的方法克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-TfuPPGK并转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，进行蛋白质表达与纯化。
在一个1.0毫升的反应体系中含有100mM的HEPES缓冲液（pH 7.2），50mM的无机磷酸根，5mM的二价镁离子，10 mM聚磷酸钠，1U/mL的蔗糖磷酸化酶，3U/mL的葡萄糖异构酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，5U/mL肌醇-1-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇单磷酸酶，10 g/L的蔗糖；该体系首先在50℃进行，反应12个小时，随后提高反应温度至70℃再反应36小时；反应结束后，肌醇的终浓度为7.8 g/L，肌醇产率达到了78%。

Claims (4)

1.一种肌醇的制备方法，其特征在于，
以蔗糖为底物，加入蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇单磷酸酶和无机磷酸根，建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
2.一种肌醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以蔗糖为底物，加入蔗糖磷酸化酶、葡萄糖异构酶，聚磷酸葡萄糖激酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇单磷酸酶和无机磷酸根，建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系中还含有聚磷酸盐；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
4.按照权利要求1和2所述的制备方法，其特征在于，所述多酶反应体系还含有以下成分：磷酸盐缓冲液、二价镁离子。
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