CN101942489B - 一种7-磷酸景天庚酮糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种7-磷酸景天庚酮糖的制备方法，在70℃下，固定化耐热转酮酶，以5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖为原料通过酶促反应制备7-磷酸景天庚酮糖。本发明涉及的酶能够耐受70℃高温，在此条件下酶的反应体系不易染菌；并且在此条件下目标产物7-磷酸景天庚酮糖得率高。在此温度条件下，固定化酶层析柱中残留的大肠杆菌其它的酶失活，最大程度地减少其它酶的干扰，更容易得到并纯化目标产物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术应用领域，具体地说，涉及一种利用分子生物学技术制备7-磷酸景天庚酮糖的方法。
背景技术
磷酸戊糖途径是葡萄糖氧化分解的一种方式。由于此途径是由6-磷酸葡萄糖开始，故亦称为己糖磷酸旁路。此途径在胞浆中进行，可分为两个阶段。第一阶段由G-6-P脱氢生成6-磷酸葡糖酸内酯开始，然后水解生成6-磷酸葡糖酸，再氧化脱羧生成5-磷酸核酮糖。NADP+是所有上述氧化反应中的电子受体。第二阶段是5-磷酸核酮糖经过一系列转酮基及转醛基反应，经过磷酸丁糖、磷酸戊糖及磷酸庚糖等中间代谢物最后生成3-磷酸甘油醛及6-磷酸果糖，后二者还可重新进入糖酵解途径而进行代谢。
在生物体内磷酸戊糖途径除提供能量外，主要是为合成代谢提供多种原料。如为脂肪酸、胆固醇的生物合成提供NADPH；为核苷酸辅酶、核苷酸的合成提供5-磷酸核糖；为芳香族氨基酸合成提供4-磷酸赤藓糖。此途径生成的四碳、五碳、七碳化合物及转酮酶、转醛酶等，与光合作用也有关系。因此磷酸戊糖途径是一条重要的多功能代谢途径。
7-磷酸景天庚酮糖是磷酸戊糖代谢的中间产物，也是研究代谢途径中的重要转化酶-转酮酶和转醛酶的底物，还是合成一些药物和活性中间体的前体物质。
发明内容
本发明的目的是利用耐热转酮酶在70℃下具有最大酶活的特性，采用耐高温的固定化酶装置利用该酶催化合成7-磷酸景天庚酮糖。
一种7-磷酸景天庚酮糖的制备方法，在70℃下，固定化耐热转酮酶，以5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖为原料通过酶促反应制备7-磷酸景天庚酮糖。
本发明的方法，其中所述固定化耐热转酮酶的方法优选采用重组工程菌表达C-端带有6个组氨酸标签的耐热转酮酶(6×His-TK)，然后使用Ni-NTA蛋白纯化树脂层析柱特异性吸附6×His-TK，洗去杂蛋白，Ni-NTA蛋白纯化树脂层析柱保留TK，在有底物5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖情况下，生成7-磷酸景天庚酮糖。
本发明的方法，其中所述耐热转酮酶在70℃下有最大的酶活。可以来源于耐热解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella)或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
本发明的方法，其中所述耐热转酮酶优选来源于耐热解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。利用多聚酶链反应扩增耐热解纤维梭菌的转酮酶(TK)基因，然后把该基因片段插入到表达载体pET中，构建表达载体，转化大肠杆菌BL21，并表达TK。用于扩增TK基因的正向引物和反向引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。表达产物为C-端带有6个组氨酸标签的耐热解纤维梭菌转酮酶。
上述技术方案具有以下优点：
1、利用蛋白质亲和色谱技术，利用带有6个组氨酸标签的耐热转酮酶能与蛋白纯化树脂Ni-NTA层析柱特异性结合的原理，再用含有低浓度的咪唑洗去杂蛋白，保留在Ni-NTA层析柱上的6×His-TK，从而简化6×His-TK分离纯化步骤。
2、带有6个组氨酸标签的耐热转酮酶与蛋白纯化树脂Ni-NTA层析柱特异性结合，在洗去杂蛋白后，Ni-NTA层析柱保留特异性成分-耐热转酮酶(TK)，在有合适浓度的底物5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖情况下，高效合成7-磷酸景天庚酮糖。
3、本发明涉及的酶能够耐受70℃高温，在此条件下酶的反应体系不易染菌；并且在此条件下目标产物7-磷酸景天庚酮糖得率高。在此温度条件下，固定化酶层析柱中残留的大肠杆菌其它的酶失活，最大程度地减少其它酶的干扰，更容易得到并纯化目标产物。
附图说明
图1为耐热解纤维梭菌转酮酶基因的PCR产物电泳图；
图2为表达载体pET-28b(+)-tktA的EcoR I单酶切验证图；
图3为纯化的耐热解纤维梭菌转酮酶的SDS-PAGE电泳图；
图4为7-磷酸景天庚酮糖的液相色谱(HPLC)图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明涉及的转酮酶基因来源于耐热解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)，但也包括含有耐热转酮酶的其它微生物，如枯草杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等。
实施例1耐热解纤维梭菌转酮酶基因(tktA)的获得
以1μg耐热解纤维梭菌(C.cellulolyticum)基因组DNA为PCR反应模板，按转酮酶基因的序列(如SEQ ID NO.1所示)设计正向引物tktA-F为5′-TTTCCATGGGCATGAGCATGATAGACACAGC-3′，反向引物tktA-R为5′-TTTCTCGAGGTACTTAGCCAAAACAGCC-3′，其中斜体字母部分分别为酶切位点NcoI和XhoI，为保证读码框正确，我们额外地在正向引物5′端加了两个碱基，同时下游引物序列中的终止密码子变了一个碱基，被换为表达酪氨酸的密码子。PCR反应在50μL总体积中进行，反应条件为在94℃变性5min后开始循环，然后94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。取3μL PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证(图1)。取100μL PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。
实施例2表达载体pET-28b(+)-tktA的构建
凝胶回收实施例1中的PCR产物和pET-28b(+)载体分别用NcoI和XhoI双酶切，并通过凝胶回收试剂盒回收，然后进行连接(16℃，16h)，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后用EcoR I进行单酶切验证分析(图2)，验证正确后进行DNA测序鉴定。构建的表达质粒被称为pET-28b(+)-tktA。
实施例3 tktA在E.coli BL21(DE3)中的表达及TK的纯化与鉴定
1.tktA基因的表达
以测序验证正确的pET-28b(+)-tktA表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞；挑取阳性克隆，接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至约为0.6-0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导3h。接种上述转化后的大肠杆菌BL21于1000ml LB培养基，待OD600值约达2.0时，诱导与上述相同。离心收集菌体，以50mmol/L、pH 8.0 Tris-HCl(含1mmol/L)缓冲液悬浮(湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体：5ml缓冲液)，在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后收集上清。
2.耐热解纤维梭菌转酮酶(TK)的纯化与鉴定
NTA介质填柱：用2倍柱体积的去离子水洗涤，接着加NiSO4溶液至NTA介质结合度达到饱和，用5倍柱体积的NAT-0缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl)洗柱。将上述收集破碎菌体离心后得到的上清加入到Ni2+-NTA树脂柱中，反复加入2～3次后，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液(NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑)洗涤介质以去除杂蛋白，最后用含有300mmol/L上述缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的耐热解纤维梭菌转酮酶，并做SDS-PAGE分析(图3)。
实施例4耐热解纤维梭菌转酮酶的酶活检测
耐热解纤维梭菌转酮酶的酶活分析液为：1ml反应体系中含有50mmol/L Tris(pH 7.4)，50mmol/L MgCl2，2mmol/L 5-磷酸核糖，2mmol/L 5-磷酸木酮糖，0.1mM焦磷酸硫胺素，2U磷酸丙糖异构酶(X型)和2U三磷酸甘油脱氢酶。酶反应时间从加入转酮酶液时开始，在340nm波长下用紫外分光光度计测定三磷酸甘油脱氢酶氧化NADH的速率。在标准反应混合物中，酶活力单位(U)定义为：在分析条件下每分钟氧化1μmol NADH所需要的酶量。
实施例5 Ni2+-NTA树脂柱合成7-磷酸景天庚酮糖及其分离
按实施例3的方法，上述收集破碎菌体离心后得到的上清上样到Ni2+-NTA树脂柱中，反复加入2～3次后，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液(NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑)洗涤介质以去除杂蛋白，在实施例3中已证明在洗去杂蛋白后，在Ni2+-NTA树脂柱中保留带有6个组氨酸标签的耐热解纤维梭菌转酮酶。
将含有5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖的体系(组份：50mmol/LTris(pH 7.4)，50mmol/L MgCl2，1％5-磷酸木酮糖，1％5-磷酸核糖)在37℃水浴锅中保温，以20mL/h的速度流经螯合有His-tag-TK的Ni2+-NTA树脂柱。得到含有5-磷酸木酮糖，5-磷酸核糖，和7-磷酸景天庚酮糖和3-磷酸甘油醛的反应体系，其中7-磷酸景天庚酮糖分子比占反应四种混合物的35％。利用高效液相色谱(离子交换柱)分离法，并结合7-磷酸景天庚酮糖标准品在上述高效液相色谱的分离方法和出峰时间得到有效分离。分离出的7-磷酸景天庚酮糖液体经浓缩，得到7-磷酸景天庚酮糖晶体产物。
实施例6 7-磷酸景天庚酮糖的检测
采用高效液相色谱法检测7-磷酸景天庚酮糖。检测用的色谱仪为Agilent 1200HPLC(Agilent 1200色谱工作站)，离子交换色谱柱为87H3，柱温60℃，检测器为示差折光检测器，流动相是5mmol/L的H2SO4，流速0.5ml/min，进样量为20μL。检测结果如图4。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种7-磷酸景天庚酮糖的制备方法，其特征在于，在70℃下，固定化耐热转酮酶，以5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖为原料通过酶促反应制备7-磷酸景天庚酮糖；所述耐热转酮酶来源于耐热解纤维梭菌（Clostridium cellulolyticum），其氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述固定化耐热转酮酶的方法是采用重组工程菌表达C-端带有6个组氨酸标签的耐热转酮酶（6×His-TK），然后使用Ni-NTA蛋白纯化树脂层析柱特异性吸附6×His-TK，洗去杂蛋白，Ni-NTA蛋白纯化树脂层析柱保留TK，在有底物5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖情况下，生成7-磷酸景天庚酮糖，其中，利用多聚酶链反应扩增耐热解纤维梭菌的转酮酶（TK）基因，然后把该基因片段插入到表达载体pET中，构建表达载体，转化大肠杆菌BL21，并表达TK，其中，用于扩增TK基因的正向引物和反向引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述耐热转酮酶在70℃下有最大的酶活，表达产物为C-端带有6个组氨酸标签的耐热解纤维梭菌转酮酶。
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