CN101875951B - 一种4-磷酸赤鲜糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种4-磷酸赤鲜糖的制备方法，在55-65℃下，固定化耐热的转酮醇酶，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛为原料通过酶促反应制备4-磷酸赤鲜糖。本发明利用分子生物学技术，制备耐高温、特异性转化4-磷酸赤鲜糖的转酮醇酶，通过固定化酶技术，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛为原料高效制备4-磷酸赤鲜糖，方法简单实用。

Description

一种4-磷酸赤鲜糖的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术应用领域，具体地说，涉及一种利用分子生物学技术制备4-磷酸赤鲜糖的方法。

背景技术

葡萄糖氧化分解的一种方式是磷酸戊糖(ppp)代谢途径。由于此途径是由6-磷酸葡萄糖(G-6-P)开始的，因此又被称为己糖磷酸旁路。此途径是在细胞的胞浆中进行的，整个代谢途径经过氧化阶段和非氧化阶段的一系列酶促反应，同时产生NADPH+H⁺，提供还原力。具体的说，第一阶段由G-6-P脱氢生成6-磷酸葡糖酸内酯开始，然后水解生成6-磷酸葡糖酸，再脱氢脱羧生成5-磷酸核酮糖；第二阶段是5-磷酸核酮糖经过一系列转酮反应及转醛反应，再经过磷酸丁糖、磷酸戊糖及磷酸庚糖等中间代谢物，最后生成3-磷酸甘油醛及6-磷酸果糖，后二者与糖酵解相衔接，还可重新进入糖酵解途径而进行代谢。

4-磷酸赤鲜糖是生物体内代谢的重要中间产物，赤鲜糖-4-磷酸(E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)可以合成莽草酸，是合成芳香族氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸)的前体物质，也可合成与植物生长、抗病性有关的生长素、木质素、绿原酸、咖啡酸等，植物在感病或受伤情况下，该途径明显加强；同时还是合成维生素B6等一些药物和活性中间体的前体物质。因此，4-磷酸赤鲜糖作为代谢的中间产物合成上述物质对生物体来讲具有重要的生理作用。

目前制备4-磷酸赤藓糖的方法主要有：1、过氧化氢氧化阿拉伯糖酸钙制备；2、四乙酸铅氧化D-葡萄糖制备；3、高碘盐酸氧化4，6-O-亚已基-D-葡萄糖制备。以上方法均需要在高温高压条件下进行，对反应设备要求高，产物成分复杂，并且得率低。

因此，有必要提出一种新的4-磷酸赤鲜糖的制备方法。

发明内容

本发明为了克服目前合成4-磷酸赤鲜糖方法的缺点，利用分子生物学技术，制备耐高温、特异性转化4-磷酸赤鲜糖的转酮醇酶，通过固定化酶技术，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛为原料高效制备4-磷酸赤鲜糖，方法简单实用。

一种4-磷酸赤鲜糖的制备方法，在55-65℃下，固定化耐热的转酮醇酶，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛为原料通过酶促反应制备4-磷酸赤鲜糖。

合成4-磷酸赤鲜糖的酶促反应如下：

本发明的方法，其中所述固定化转酮醇酶的方法优选采用重组工程菌表达C-端带有6个组氨酸标签的转酮醇酶(6×His-TK)，然后使用Ni-NTA蛋白纯化树脂层析柱特异性吸附6×His-TK，洗去杂蛋白，Ni-NTA蛋白纯化树脂层析柱保留TK，在有底物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛情况下，生成4-磷酸赤鲜糖。

本发明的方法，其中所述转酮醇酶能耐受55-65℃的温度。可以来源于皮炎组织胞浆菌(Ajellomyces dermatitidis)、紫球硫菌(Thiosphaerion violaceum)、红栖热菌(Thermus ruber)或白色嗜热单孢菌(Thermomonospora alba)。

本发明的方法，转酮醇酶优选来源于皮炎组织胞浆菌(Ajellomyces dermatitidis)，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。利用多聚酶链反应扩增皮炎组织胞浆菌的TK基因，然后把该基因片段插入到载体pET中，构建大肠杆菌表达载体，转化E.coli JM109后制备TK。用于扩增TK基因的正向引物和反向引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。表达产物为C-端带有6个组氨酸标签的皮炎组织胞浆菌转酮醇酶。

上述技术方案具有以下优点：

1、利用来源自皮炎组织胞浆菌等的转酮醇酶能够耐受高温，特异性生成4-磷酸赤鲜糖的特性，通过基因克隆，发酵表达，并结合Ni-NTA蛋白纯化树脂纯化带有6个组氨酸标签的转酮醇酶，同时制备耐高温的固定化酶装置，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛为原料高效制备4-磷酸赤鲜糖。

2、利用带有6个组氨酸标签的转酮醇酶能与Ni-NTA蛋白纯化树脂层析柱特异性结合的原理，再用含有低浓度的咪唑洗去杂蛋白，保留在Ni-NTA层析柱上的6×His-TK，从而简化6×His-TK分离纯化步骤。

3、反应不需在高温高压条件下进行，对反应设备要求不高，产物得率高。本发明提供的4-磷酸赤鲜糖制备方法，利用分子生物学技术，制备耐受55-65℃高温的转酮醇酶，在此温度条件下目标产物4-磷酸赤鲜糖得率高(4-磷酸赤鲜糖分子比占反应四种混合物的37％)；酶的反应体系不易染菌；同时固定化酶层析柱中残留的，干扰制目的产物的酶类失活，最大程度地减少其它杂酶的干扰，更大程度地得到目标产物4-磷酸赤鲜糖。

附图说明

图1为皮炎组织胞浆菌转酮醇酶基因的PCR产物电泳图；

图2为表达载体pET-22b(+)-tktA的BamHI和XhoI双酶切验证图；

图3为纯化的皮炎组织浆菌转酮醇酶的SDS-PAGE电泳图；

图4为4-磷酸赤鲜糖的液相色谱(HPLC)图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明涉及的转酮醇酶基因来源于皮炎组织胞浆菌，但也包括含有耐热转酮醇酶的其它微生物，如紫球硫菌(Thiosphaerionviolaceum)、红栖热菌(Thermus ruber)、白色嗜热单孢菌(Thermomonospora alba)等。

实施例1  皮炎组织胞浆菌(ATCC 18188)转酮醇酶基因(tktA)的克隆

以0.5μg皮炎组织胞浆菌基因组DNA为PCR反应模板，按转酮醇酶的序列(如SEQ ID NO.1所示)设计正向引物tktA-F为5′-TTCGGGATCCTACCCCTCGATGTGACTGCA-3′，反向引物tktA-R为5′-TTGCCTCGAGAATCTACTAAACGACCTTCCGC-3′，其中斜体字母部分分别为酶切位点BamHI和XhoI。3′引物的设计确保表达产物含有6个组氨酸标签。PCR反应在50μL总体积中进行，反应条件为在94℃变性5min后开始循环，然后94℃变性50s，56℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。取5μL PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证(图1)。取100μL PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。

实施例2  tktA表达载体的构建及在E.coli JM109中的表达

1.tktA基因的构建：凝胶回收实施例1中的PCR产物。纯化的PCR产物和pET-22b(+)载体分别用BamH I和XhoI双酶切，并通过凝胶回收试剂盒回收，然后进行连接(16℃，16h)，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后用BamHI和XhoI进行酶切验证分析(图2)，验证正确后进行DNA测序鉴定。构建pET-22b(+)-tktA表达载体。

2.tktA基因的表达：以测序验证的pET-22b(+)-tktA表达质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞；挑取阳性克隆，接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养OD₆₀₀至0.6～0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导3h。接种上述转化后的大肠杆菌JM109于1000mL LB培养基中，培养菌体生长的OD₆₀₀值为2.0时，诱导方法同上。通过诱导，使tktA基因在大肠杆菌JM109得到表达。

实施例3  TK的分离纯化及酶活检测

1.皮炎组织胞浆菌转酮醇酶的纯化：将实施例2中发酵液经离心收集菌体，以50mmol/L、pH 8.0Tris-HCl(含1mmol/L)缓冲液悬浮(湿菌体与缓冲液的比例为1g∶5mL)，在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后收集上清。NTA介质填柱，用2倍柱体积的去离子水洗涤，加NiSO₄溶液至NTA介质使结合度达到饱和，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl)洗柱。将上述得到的上清加入到Ni²⁺-NTA树脂柱中，反复加入3～5次后，用5倍柱体积的NAT-2缓冲液(NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑)洗涤介质以去除杂蛋白，最后用含有300mmol/L的上述缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的转酮醇酶，并做SDS-PAGE分析(图3)。

2.转酮醇酶的酶活分析为：取一定量的纯化酶加入反应体系中检测酶的活性。酶反应时间从加入转酮醇酶液时开始，在340nm波长下用紫外分光光度计测定三磷酸甘油脱氢酶氧化NADH的速率。每个反应测三次。在标准反应混合物中，酶活力单位(U)定义：在分析条件下每分钟氧化1μmol NADH所需要的酶量。1mL酶促反应体系中含有50mmol/L Tris(pH 7.4)，50mmol/L MgCl₂，2mmol/L 6-磷酸果糖，2mmol/L 3-磷酸甘油醛，0.1mM焦磷酸硫胺素，2U磷酸丙糖异构酶(X型)和2U三磷酸甘油脱氢酶。

实施例4  Ni²⁺-NTA树脂柱制备4-磷酸赤鲜糖及检测

1.制备：按实施例3的方法，使带有6个组氨酸标签的转酮醇酶保留在Ni²⁺-NTA树脂柱中。将含有6-磷酸果糖、3-磷酸甘油醛的体系(组份：50mmol/L Tris(pH 7.4)，50mmol/L MgCl₂，1％6-磷酸果糖，1％3-磷酸甘油醛)在37℃水浴锅中保温，以20mL/h的速度流经螯合有His-tag-TK的Ni²⁺-NTA树脂柱。得到含有6-磷酸果糖、3-磷酸甘油醛、4-磷酸赤鲜糖和5-磷酸木酮糖的反应体系。利用高效液相色谱分离法，并结合4-磷酸赤鲜糖标准品在高效液相色谱上出峰的时间得到有效分离为标准，分离出目的产物4-磷酸赤鲜糖。

2.检测：采用高效液相色谱法检测4-磷酸赤鲜糖。检测用的色谱仪为Agilent 1200 HPLC(Agilent 1200色谱工作站)，离子交换色谱柱为87H3，色谱柱温为60℃，检测器为示差折光检测器，流动相是4mmol/L的H₂SO₄，流速0.6mL/min，进样量为25μL。结果如图4。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种4-磷酸赤鲜糖的制备方法，其特征在于，采用重组工程菌表达C-端带有6个组氨酸标签的转酮醇酶（6×His-TK），然后使用Ni²⁺-NTA蛋白纯化树脂层析柱特异性吸附6×His-TK，洗去杂蛋白，Ni²⁺-NTA蛋白纯化树脂层析柱保留6×His-TK；将pH为7.4的50mmol/LTris、50mmol/L MgCl₂、1% 6-磷酸果糖、1% 3-磷酸甘油醛在37℃水浴锅中保温，以20mL/h的速度流经Ni²⁺-NTA树脂柱，得到含有6-磷酸果糖、3-磷酸甘油醛、4-磷酸赤鲜糖和5-磷酸木酮糖的反应体系，利用高效液相色谱分离法，并结合4-磷酸赤鲜糖标准品在高效液相色谱上出峰的时间得到有效分离为标准，分离出目的产物4-磷酸赤鲜糖； 

所述转酮醇酶来源于皮炎组织胞浆菌（Ajellomyces dermatitidis），氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用多聚酶链反应扩增皮炎组织胞浆菌的6×His-TK基因，然后把该基因片段插入到载体pET中，构建大肠杆菌表达载体，转化E.coli JM109后制备6×His-TK。 

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，用于扩增6×His-TK基因的正向引物和反向引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 

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