SK42594A3 - Method of production of fucosylated carbohydrates - Google Patents

Description

Spôsob výroby fukozylovaných uhľohydrátov

Oblasť techniky

Vynález ss týka zlepšených spôsobov enzymatickej výroby uhľohydrátov, predovšetkým fukozylovaných uhľohydrátov. Vynález predstavuje zlepšený spôsob syntézy glykozyl-1- alebo -2-fosfétov použitím ako chemických* tak enzymatických prostriedkov. Tieto fosforylované glykozidy sa potom používajú na výrobu cukor-nukleotidov a tie potom slúžia ako donorové cukry pre glykozyláciu akceptorových uhľohydrátov. Podľa vynálezu sa dáva najmä prednosť použitiu týchto spôsobov pri fukozylácii.

Doterajší stav techniky

Svojim obsahom sa predmetu vynálezu najviac blížia tieto patentové prihlášky USA: USSN 07/670701, dátum podania 18. marca 1991; USSN 07/707600, dátum podania 30. mája 1991; USSN 07/738211, dátum podania 30. júla 1991 s názvom Oligosaccharide Enzýme Substrates and Inhibitors:

' Mthods and Compositions; USSN 07/852409, dátum podania

16. marca 1992 a USSN 07/889652, dátum podania 26. mája • 1992.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob výroby fukozylovaných uhľohydrátov v jedinej reakčnej zmesi, ktorý sa vykonáva tak, že sa použije fukozyltransferáza kvôli vytvoreniu 0-glykozidickej väzby medzi nukleozid-5*-difosfofukózou a dostupnou hydroxylovou skupinou uhľohydrátovej akceptorovou molekulou, pričom vzniká fukozylovený uhľohydrát a nukleozid-5 '-difosfát; pričom sa recykluje in situ nukleozid-5'-difosfát s fukózou, za vzniku zodpovedajúcej nukleozid-5 ’-difosfofukózy.

Prednostné uskutočnenie tohto vynálezu zahrnujú použitie guanínu ako bázy pre nukleozid, použitie katalytických množstiev nuklezidov, použitie N-acetylglukozamínu, galaktózy, N-acetylgalaktozamínu alebo N-acetyllaktozamínu ako uhľohydrátovej akceptorovej molekuly a použitie sialylovanej uhľohydrétovej akceptorovej molekuly.

Predmetom vynálezu je tiež použitie vyššie uvede. ného spôsobu na výrobu fukozylovanej sialylovenej uhľohydrátovej molekuly enzymatickou tvorbou glykozidových » väzieb v jed. inej reakčnej zmesi, pri ktorej sa vytvorí prvá glykozidová väzba medzi čifosfonuleozidom aktivovaným glykozylovým donorom, ako je UĽP-Gal, a dostupnou hydroxylovou skupinou uhľohydrátovej akcéptorovej molekuly, ako je GlcNAc, použitím prvej glykozyltransferázy, ako je pL,4-gelaktozyltrensferáza pri výrobe Gaipi,4GlcNAc; čalej sa vytvorí druhá glykozidová väzba medzi monoí'osfonukleozidom aktivovaným sialylovým donorom, ako CMP-NeuAc a dostupnou hydroxylovou skupinou akceptorovej molekuly cukru, ako je hydroxylová skupina v polohe 3 Gal látky Galf?l,4GlcNAc, použitím sialyltransferázy, ako je <<2,3-sialvltransferáza; cielej sa vytvorí tretia glykozidová väzba medzi difosfonukleozidom aktivovaným fukozylovým donorom, ako je GĽP-Fuc a dostupnou hydroxylovou skupinou akceptorovej molekuly cukru, ako je hydroxylová skupina v polohe 3 GlcNAc látky Galp/l,4GlcNAc, použitím fukozyltransferázy, ako <<1,3/4-fukozyltransferázy, pričom aspoň jeden zo stupňov (a), (b) alebo (c) čalej zahrnuje in situ tvorbu fosfonukleotidom aktivovaného glykozylového donora použitím katalytického množstva zodpovedajúceho monofosfátového a difosfátového nukleozidu. Osobitná prednoť sa dáva tým spôsobom podľa vynálezu, pri ktorých sa ako produkt so sialýlovaným uhľohydrátovým zvyškom používa sialylovaný Lewisov ligand, ako je sialyl Le^x (SLe^x) alebo sialyl Le^a (SLe^a) pri ktorých sa fukóza prenáša z fukozylového donora na hydroxylovú skupinu

- 3 zvyšku N-ecetylglukozamínu alebo galaktózy uhľohydrátovej akceptorovej molekuly.

Do rozsahu tohto vynálezu tiež patria niekoľkonásobné reakcie katalyzované glykozyltransferázami, ktoré sa uskutočňujú v jedinej reakčnej zmesi, pričom prednosť sa dáva tým spôsobom, pri ktorých sa eko glykozyltransferáza používa sialyltransferáza zvolená zo súboru zahrnujúceho d2,3-sialyltransferázu, j;2,4-sialyltransf erázu, <2,6-sialyltransferázu a o<2,8-sialyltransf erázu. Vynález zahrnuje fukozyláciu oligosacharidu, pričom prednosť sa dáva fukozyltransferázam, zvoleným zo súboru zahrnujúceho Λ1,2-fukozyltrensferázu, <L,3/4-fukozyltr8nsferázu, jCl,3-fukozyltransferázu, tfjL,6-fukozyltransŕerézu a «<1,4-fukozyltransferázu₅ Z fukozyltransferáz sa osobitná pred nosť dáva (Sgalaktozidáza <zl,2-fukozyltransferáze, N-acetylglukozamín /1,3-fukozyltransferáze, N-acetylglukozamín οζί,4-fukozyltransferóze a N-acetylglukozamín <Al,6-fukozyltrsnsferáze·

Uhľohydrátové akceptorové molekuly nie sú v podstate obmedzené, keóže glykozyltransférázy nie sú selektívne za priľahlými polohami cukru. Môže teda ísť o akúkoľvek molekulu substituovanú uhľohydrátom, v ktorej je uhľohydrátom molekula Galp>l,4GlcNAc alebo jej analóg alebo molekula s koncovou skupinou Gal|>l,4GlcNAc-X, kde X predstavuje organickú molekulu. Ako óalšie uhľohydrátové akceptorové molekuly, ktoré predstavujú substráty pre fukozylázu, sa dajú uviesť enalógy Gal(?l,4GlcNAc a Gelp?l,4GlcNAc-X. Ako príklady takýchto molekúl sa dajú uviesť: laktóza, NeuAckl^Galfcl^GlcNAc, Osl^l,3GlcNAc, Galp> 1,4Glucal (laktal), NeuACA2,3Gal(Vl,4Glucal, 2-halogénsubst. i tuované reakčné produkty vyššie uvedených glukánov, Galf’l,4 (5-tio)Glc , Gal£l ,4GlcNAcp-O-alyl apod.

Je nutné si uvedomiť, že uhľohydrátové akceptorové molekuly iiiusi8 obsahovať dostupnú hydroxyskupinu v sacharide, ku ktorej sa viaže dinatovaný fukozyl alebo iná cukorná skupina 8 hydroxylová skupina, ktorá musí byť prítomná sa určí enzýmom glykozyltransferázou, ktorá sa používa pri tejto reakcii.

Nárokovaný spôsob zahrnuje čalej regeneráciu katalytického množstva nukleotidov použitých na vytvorenie nukleozid-cukorv. Prednostnými bázami pre nukleotidy sú bu<3 cytidín, guenín alebo uridín. Monosacharidovými donormi sú aktivované nukleotid-cukry, ako je cytidín-5*-monoiosfo-N-acetylneuramínová kyselina, guanidín-5*-difosfofukóza a uridín-5^z-difosfogalaktóza.

Okrem vyššie uvedených postupov tento vynález tiež zahrnuje reakčné systémy in vitro. Ako tieto systémy sú označované systémy zahrnujúce inertný alebo nereaktívny zásobník alebo oddiel zásobníka pre reakčné činidlá používané na uskutočňovanie popísaných reakcií. Tieto reakčné systémy konkrétnejšie zahrnujú prinajmenšom fukozyltransferázu a enzým vytvárajúcu nukleozid-difosfofukózu. Tieto reakčné systémy môžu ňalej obsahovať guanozín di• fosfofukóza pyrofosforylázu, ako enzým vytvárajúci GDP-fukózu, kinázu, ako pyruvát konázu alebo fruktóza-1,6 -difosfát kinázu, acetyl kinázu alebo fukóza kinázu. Iné reakčné zložky môžu zahrnovať NADPH regeneračný systém alebo guanozíndifosfát manózu a guanozín difosfomanóza pyrofosforylázu. Ak je prítomný NADPH regeneračný systém, môže zahrnovať katalytické množstvo NADP, izopropylalkohol v množstve od asi 10 do asi 100 g/1, prednostne asi 20 až asi 40 g/1, vztiahnuté na celý reakčný systém, a alkohol dehydrogenázu.

V tomto popise je tiež zverejnený veľký počet chemických metód pre syntézu oligosacharidov. Jeden z týchto spôsobov zahrnuje výrobu glykozyl-1- alebo -2-fosfátu reakciou blokovaného glykozylového kruhu obsahujúceho hydroxyskupinu v anomérnej polohe (polohe 1 alebo 2) s

- 5 trojmocným fosfitylačným reakčným činidlom, za vzniku blokovaného glykozl.v-1- alebo -2-fosfitom substituovaného kruhu. Blokovaný fosfit sa oxiduje na zodpovedajúci fosfát, ktorý sa používa pri enzymatickej reakcii. Glykos.ylový kruh môže zahrnovať galaktozylový, glukózylový, fukozylový, N-acetvlglukozylový a menozvlový kruh, rovnako tak ako kruhy iných sacharidov. Ako prednostne troj mocné fosfitylečné činidlo je možné uvisť dibenzyl-l\-N-dialkylfosforamidit, ako je dibenzyl-N-N-dietylfosforamidit. Bialkylovými skupinami sú v tejto súvislosti nižšie dialkylskupiny, v ktorých každý alkylový zvyšok obsa huje 1 ež 5 atómov uhlíka, pričom jednotlivé alkylové skupiny môžu byť rovnaké alebo rôzne. Τθηΐο spôsob takisto dalej využíva blokovacie reakčné činidlá na zavádza nie blokovacej acetylovej alebo benzylovej skupiny. Glykozylový kruh je poprípade zvolený zo súboru zahrnujúceho D- alebo L-alaózy obsehujúce. 4, ? alebo 6 atómov uhlíke alebo zo súboru zahrnujúceho E- alebo L-laktózy obsahujúce 4, 5 alebo 6 atómov uhlíka, ako aj sacharidy obsahujúce až do 9 atómov uhlíka v reťazci cukru.

Predmetom vynálezu sú dalej tiež nové medziproduk· ty na výrobu glykozyl-1- elebo -2-fosfátov. Prednostným mečziproduktom je blokovaný fosfitvlovaný monosacharid so všeobecným vzorcom I

F2 ^2 (I)

- 6 kde

R^ predstavuje ar.ylovú skupinu alebo nižšiu alkylovú skupinuj

X nezávisle v jednotlivých prípadoch predstavuje etóm kyslíka alebo dusíka;

R2 nezávisle v jednotlivých prípadoch predstavuje acylovú skupinu, benzylovú skupinu, silylovú skupinu alebo alkylovú blokovaciu skupinu;

R^ nezávisle v jednotlivých prípadoch predstavuje skupinu so vzorcom -CH^, -C^, -CH2OR2, -CHÍC^)-CH(0R₂) alebo CHĺC^-CHÍC^-CHtC^);

R^ predstavuje atóm vodíka, karboxyskupinu alebo esterovú skupinu karboxylovej kyseliny s alk.ylovým zvyškom s 1 sž 5 atómami uhlíka alebo benzylovým zvyškom; a n predstavuje číslo 1 alebo 2.

V prednostnej skupine zlúčenín so všeobecným vzor com I predstavuje symbol R^ atóm vodíka, takže všeobecný vzorec I prechádza na všeobecný vzorec II

kde R^, R2, Rj, X a n majú uvedený význam.

(II)

- 7 Jednu skupinu zlúčenín, ktorým se dáva osobitná prednosť tvoria tie zlúčeniny, v ktorých je monosacharid so šesťčlenným kruhom, R^ predstavuje atóm vodíka a obidva symboly X predstevujú atómy kyslíka, ako je manóza alebo fukóza. Prednosť sa dáva zlúčeninám, v ktorých R^ predstavuje benzylskupinu e R£ predstavuje benzylskupinu alebo acetylskupinu. Ako príklady prednostných medziproduktov sa dejú uviesť: dibenzylfosfityl-2,3,4,6-tetra-O-8ce tyl-D-manozid alebo dibenzylfosfityl-2,3,4-tri-0-acetyl-L-fukozid.

Ako óelšie skupine zlúčenín, ktorým sa dáve osobitná prednosť, se dejú uviesť zlúčeniny, v ktorých zahr nuje monosechsrid šesťčlenný kruh, R^ a R? meju vyššie uvedený význam, jedným zo symbolov X je dusík a druhým kyslík. Ako príklady zlúčenín z tejto skupinu sa dajú uviesť: GlcNAc, GalNAc a NeuAc. Ako ilustratívne zlúčeniny tohto typu sa dajú uviesť: dibenzylfosfityl-2-acetami do-2-deoxy-3,4,6-tri-O-acetyl-D-glukozid a -2-acet8mido-2-deox,y-3,4,6-tri-0-scetyl-D-galaktozid.

Tiež je popísaný monosacharidový analóg, ktorým je 2,3,4-tri-0-benzoyl-t<-L-fukopyranozylbromid.

Nasleduje vysvetlenie niektorých pojmov, ktoré sa používajú v tomto popise.

Pod označením dostupná hydŕoxylová skupina sa rozumie hydroxyskupina substituujúca atóm uhlíka, ktorý je súčasťou kruhovej časti uhľohydrátovej akceptorovej molekuly, ktorá môže vytvoriť glykozidovú väzbu pôsobením glykozyltransferázy, prenášajúcej mono- alebo difosfonukleozidom aktivoaný donor na dostupný atóm uhlíka. Pre fukozyláciu je dostupná hydŕoxylová skupina obvykle v polohe 3.

Pod označením blokovaný glykozylový kruh sa rozumie glykozylový kruh, v ktorom boli dostupné emínové alebo hydroxylové substituenty zreagované s reakčnými činidlami zavádzajúcimi acylové, benzylové, silylové alebo alkylové blokovacie skupiny. Takéto blokovacie skupiny sú všeobecne popísané v publikácii T. W., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc., 1981.

Pod označením uhľohydrát(y) sa rozumejú akékoľvek organické zvyšky obsahujúce kovalentne viazané k akým koľvek monomérnym sacharidom. Tie zahrnujú disacharidy, oligosacharidy, glykolipidy, glykoproteíny a neprirodzené spojenia, ako sú sacharidy viazané k organickým zlúčeninám, ku ktorým v prírode cukry pripojené nebývajú.

Pod označením uhľohydrátová ekceptorová molekula sa rozumie molekula nesúca prinajmenšom 1 monosacharid , pričom tento monosacharid obsahuje jednu alebo viac dostupných hydroxyskupín na vytváranie glykozidických väzieb s mono- alebo difosfonukleozidom aktivovanými glykozylovými donormi.

Pod označením katalytické množstvo sa rozumejú koncentrácie reakčných činidiel, ktoré sú prítomné v menšom množstve, v porovnaní s reakčnými činidlami používanými v stechiometrických množstvách, pričom koncentrácie činidiel prítomných v katalytických množstvách sa v priebehu reakčného postupu podstatne neznižujú. Reakčnými činidlami, ktoré sú prítomné v katalytických mnostvách, sú obvykle aktivačné činidlá, ktoré sú nakoniec regenerované a recyklované. do reakcie vedľajšími reakciami.

Pod označením mono- alebo difosfonukleozidom aktivovaný glykozylový donor alebo aktivovaná donorová molekula sa rozumie nukleotid-cukor, ako uridín-5 '-di- 9 fosfogalaktóza. Takáto zlúčeniny obsahujú väzby s vysokou energiou, ktoré uľahčujú vytvorenie glykozylovej väz by k uhľohydrátovej akceptorovej molekule. Nukleozid môže zahrnovať ktorúkoľvek z prírodných báz a cukrov, kto ré môžu byť mierne derivatizované, ako napríklad môžu zahrnovať metylové substitúcie alebo azo-substitúcie bázy, dehydroxylované deriváty cukorv alebo deriváty cukrov s blokovanými hydroxyskupinami a tiofosfátové analógy difosfátového zvyšku.

Pod označením glykozidová väzba sa rozumie väzba kyslík/uhlík, ktorá sa typicky vyskytuje medzi cukrami. Pokiaľ ide o konfigurácie, môže ísť o «ς- alebo p^gly kozidovú väzbu. Táto väzbs obvykle vzniká dehydratačnou syntetickou reakciou, pri ktorej sa difosfonukleozidom aktivovaný glykozylový donor presunie na dostupný uhlík uhľohydrátovej akceptorovej molekuly použitím glykozyltransf erázy .

Pod označením glykozylový kruh sa rozumie cukor alebo aminocukor obsahujúci 6 alebo 5 atómov uhlíka v kruhu. Do rozsahu tohto pojmu patria aldózy, deoxyaldózy a ketózy, bez ohľadu na orientáciu alebo konfiguráciu väzieb k asymetrickým atómom uhlíka. Ide o také cukry, ako je ribóza, arabinóza, xylóza, lyxóza, alóza, altróza, glukóza, idóza, galaktóza, telóza, ribulóza, xylóza, psikóza, N-acetylglukozamín, N-acetylgalaktozamín, N-ace tylmanozamín, N-acetylneuramínová kyselina, fruktóza, sorbóza, tagatóza, ramnóza a fukóza.

Pod označením glykozyltransferáza sa rozumie skupina enzýmov, ktoré sú schopné pripojiť mono- alebo difosfonukleozidom aktivovaný glykozylový donor k dostupnému atómu uhlíka uhľohydrátovej akceptorovej molekuly prostredníctvom glykozidovej väzby. Tieto enzýmy zahrnujú ako enzýmy purifikované z prírodných zdrojov, tak aj zo zdrojov, ktoré boli geneticky modifikované s cieľom expreeie takýchto enzýmov. Skupina glukozyltransfiéráz zahrnuje sialyltransferázy, N-acetylglukozaminyltransferázy, N-acetylgalaktozaminyltransferázy, fukozyltransferázy, manozyltransferázy, galaktozyltransferázy a KDO transferázy.

Pod označením NADPH regeneračný systém” sa rozumie komplement enzýmov, ktorý recykluje NADP, vytvorený in situ enzymatickou reakciou, spať na NADPH. Takýto sys tém býva obvykle založený na alkohol dehydrogenáze, ktorá konvertuje alkohol (izopropylalkohol) na ketón (acetón).

Pod označením sialylovaný Lewisov ligsnd, čo je funkčný termín, sa rozumie molekula schopná viazať sa bu3 k ELAM receptorovým alebo GMP-140 receptorovým proteínom. Čo sa týka chemickej definície, zahrnujú tieto ligančy prírodné tetrasacharínové ligandy SLe^x a SLe^s a ich deriváty. Takéto deriváty zahrnujú mierne substituované produkty, v ktorých sú hydroxyskupiny zamenené za . atómy vodíka, alkylskupiny, acyloxyskupiny, alkoxyskupiny, atómy halogénu, glykozylové skupiny a pod,, glykalo* vé molekuly, glykozylové cyklické zlúčeniny, v ktorých je kruhový atóm kyslíka nahradený atómom síry alebo iminoskupinou a príslušné alkylsubstituované, oxygénované alebo acylové deriváty, deriváty, v ktorých je k anomérnemu atómu uhlíka pripojený uhľohydrát alebo organická molekula, deriváty so zmenenou orientáciou alebo polohou glykozidových väzieb alebo deriváty so substituovanými enantiomérmi prírodných cukrov.

Pod označením stechiometrické množstvo sa rozumie množstvo prítomnej východiskovej látky, ktorá je pria mo úmerné množstvu reakčného produktu. Reakčné činidlo je prítomné v stechiometrickom množstve vzhľadom na koncové produkty, kečiže sa spotrebúva pri reakciách, pri ktorých konečný produkt vzniká a neregeneruje sa v prie11 behu tohto postupu. Stechiometrické množstvo východiskového produktu je obvykle ku konečnému produktu v pomere 1:1 alebo 2:1..

Pod označením trojmocné fsofitylačné činidlo S8 rozumie reakčné činidlo, ktoré reaguje s hydroxylovou skupinou organickej zlúčeniny za vzniku produktu obsahujúceho fosffit, ktorý sa dá po deprotekcii oxidovať na fosfát použitím oxidačného činidla.

Pokiaľ nie je uvedené inak, všetky citácie uvedené v tomto popise predstavujú náhradu za prenesenie ich celého obsahu do popisu tohto vynálezu.

V popise sa	používajú tieto skratky:
AĽP	adenozín-5'-difosfát,
ATP	adenozín-5'-trifosfát,
CMP	cytidín-5'-monofosfát,
CSP	cytidín-5 '-dif osfát,
CTP	cytidín-5'-trifosfát,
CMP-NeuAc	cytidín-5’-monofosŕát-N-acetyl-neuramínová kyselina,
Fuc	fukóza,
Fk	fukóza kináza,
Puc-l-P	fukóza-l-fosfát,
Fuc-T	fukoz.yltransferáza,
Gal	galaktóza,
GalNAc	N-acetylgalaktozamín,
GTP	guanozín-5'-trifosfát,
GLP-Fuc	guanozín-5'-difosfofukóza,
GDP	guanozín-5'-difosfát,
GDP-Man	guanozín-5'-difosfomanóza,
GDP-ManPP	GĽP-manóza pyrofosforyláza,
GDP-FUCPP	GDP-fukóza pyrofosforyláza,
Glc-l-P	glukóza-l-fosfát,

GlcNAc

ManNAc

ΝΑΕP (NAEPH)

NeuAc

NMK

MK

PPase

PK

PEP

Pyr

PPi

Pi

Rha

UEP

UTP

UEP-Glc

UEP-Gal

N-acetylglukozamín,

N-acetylmanozamín, nikotinamičadeníndinukleotid·’· fosfát,

N-acetylneursminová kyselina, nukleozidmonofosfát kináza, myokináza, anorganická pyrofosfatáza, pyruvát kináza, fosfo(enol)pyruvát, pyruvát, anorganický pyrofosfát (difosfát), anorganický fosfát, ramnóza, uridín-5'-difosfát, uridín-5'-trifosfát, uridín-5'-difosfoglukóza, uridín-5'-difosfogalaktóza.

Mnohé zo štruktúrnych vzorcov, ktoré sa tu používajú, obsahujú len 2 alebo 3 skupiny viazané ku kruhovým atómom uhlíka. Podľa zavedenej konvencie sú neznázornc-nými skupinami atómy vodíka, viazané k atómom uhlíka.

Tieto atómy vodíka sa neznázorňujú, pokiaľ nie je žiadúce ukázať stereochémiu. V ostatných vzorcoch sa klinovité vyčiernená čiary používajú na znázornenie väzieb vychádzajúcich z roviny paiera smerom hore, zatiaľ čo čiarkované klinôvité čiary sa používajú ha znázornenie väzieb, ktoré smerujú pod rovinu papiera, v ktorej je vzorec nakreslený. Vlnovky sa používajú na označenie obidvoch typov väzieb (ako «ξ-, tak p>- väzieb).

Prehľad obr. na výkresoch

Na obr. 1 je znázornený typický časový priebeh konverzie GEP-manózy na GEP-fukózu oxidáciou NAEPH, zistený na základe merania optickej denzity (Abs). Krivka A; kontrolná kyveta bez GEP-manózy; krivka B: rovnaká

- 13 kyveta ako v prípade krivky A, len s tým rozdielom, že je pridaný 1/umol GDP-manózy. Na ose y sú jednotky absor bancie pri 340 nm, zatiaľ čo os x uvádza čas v minútach.

Obr. 2 zahrnuje celkom tri okienka (obr. 2-A, 2-B a 2-C), na ktorých je znázornený priebeh elúcie pri HPLC v prípade konverzie GDP-manózy na GDP-fukózu v čase 0 (2-A), asi troch hodín (2-B) a asi 6 hodín (2-C) po zača tí reakcie. Na ose y sú uvedené jednotky realtívnej absorpcie pri 254 nm, zatiaľ čo os x uvádza čas v minútach

Na obr. 3 je uvedený graf ilustrujúci synergickú inhibíciu <<1,3-fukoz.yltransí'erázy guanozín-5 ^#-difosfátom (GDP) a zlúčeninou 50, za prítomnosti 0,2 mM ^^C-GDP-fukózy a 20 mM chloridu mangánateho pri pH 6,2. Použité symboly zodpovedajú týmto podmienkam: prázdne trojuholníčky = 0,05 mM GDP, prázdne štvorčeky = 34 mM zlúčeniny 50; prázdne krúžky = 0,05 mM GDP plus 34 mM zlúčeniny 50 Na osi y sú uvedené jednotky prevrátenej hodnoty začiatočnej rýchlosti tvorby produktu (1/v) zatiaľ čo na osi x sú uvedené jednotky prevrátenej hodnoty koncentrácie N-acetyllaktozamínu (LacNAc).

Nasleduje podrobnejší popis tohto vynálezu.

Ako už bolo uvedené vyššie, predmetom vynálezu je in situ multienzýmový reakčný postup, pri ktorom sa molekula uhľohydrátoveho akceptore fúkozyluje nukleozid-5'-difosfofukózou použitím fukozyltrensferázy, pričom nukleozid-5*-difosfofukóza sa prednostne vytvára enzymaticky z katalytických množstiev nukelotidov (pozri všeobecná schéma 1 a 2, uvedené óalej).

MiinNAc

Schéma 2

HO OH

N e uAís2.6Ga 121 .< G IcNAc

HO <X

UOr-Ga!

UCŕ-CtJ í í

UDP-Glc

PP1 WO

2PI \ ^0 >vvU ai2.í )li*lfl triníferízi

GalSMGloNÄc l£P

ΙΓΓΡ

cro,· Glc-1-Ρ

Konkrétne je možné uviesť, že tento vynález predstavuje zlepšený ostriedok na získavanie prekurzorových nukleotid-cukrov, ktoré pôsobia ako donorové substráty pre reakcie gl.ykozlytransferázy. Tieto metódy zahrnujú chemické a enzymatické prostriedky. Chemické zlepšenie sa vzťahuje na zlepšenie výťažku a stability blokovaných cukorných medziproduktov, ktoré sa používajú ne vytvorenie glykozyl-1- alebo -2-fosfátov, ktoré sa dalej oxidujú na fosfáty, ktoré sa kondenzujú s nukleozid-monofosfátmi, za vzniku nukleozid-5 '-difosfocukrov alebo nukleotid-cukrov.

Ďalším aspektom vynálezu je vyvinutie multienzýmového systému, ktorý zahrnuje viac než 1 reakciu s glykozyltransferázou, s cieľom syntézy uhľohydrátov. V tomto prípade sa jedno zlepšenie dosahuje týra, že sa používajú katalytické množstvánukleotidu. Nukleotidy sa regenerujú z mono- alebo difosfátovej formy na strifosfátovú formu použitím in situ enzymatickej reakcie, ktorá prebieha simultánne s reakciami použitím glykozyltransferázy. Katalytické množstvá nukleotidu sú užitočné, vzhľadom na inhibičný účinok, ktorý majú nukleotidy na glykozyltrensferázy.

A. Fukozylácia

Jeden aspekt tohto vynálezu sa zameriava na použitie vyššie popísané a odkazy doplnené technológiou fukozylácie uhľohydrátov. Fukozylácia je bežná terminálna modifikácie mnohých biologicky aktívnych uhľohydrátov, ako sú ako sialylové tak ak nesialylové Lewisové antigény.

(l) Fukozyltransferázy

Fukozylácia je vyvolaná pôsobením fukozyltransferáz. Fukozyltrans erázy sú dobre známe a ich prehľad je uvedený v Adv. Enzymol., 52: strana 44 až 56 (1981). Uhlík

- 17 akceptorováho uhľohydrátu je obvykle kruhovým členom glukózy, galaktózy alebo N-acetylglukozemínu alebo ich analógu. O-glykozidová väzbe má najčastejšie oriehtáciu <. Najobvyklejšími miestami sú 2-, 3- alebo 6-hydrox,yskupina galaktózy, 3-, 4- alebo 6-hydroxyskupina N-acetylglukozamínu alebo 3- alebo 4-bydroxyskupina glukózy. Sacharidy obsahujúce glukal a (5-tio)glukózu môžu byť tiež akceptoroAými sacharidovými jednotkami akceptorováho uhľohydrátu pre fukozyltransferázové enzýmy,,

Fukozyltransferázy sa dajú izolovať z prírodných zdrojov alebo z rekombinantných mikroorganizmov, ktoré boli geneticky modifikované tak, aby exprimovali fukozyltransferázy. Purifikované natívne fukozyltransferázy sú popísané v Foster, J. Biol. Chem. 266: 3526 až 3531 (1991); Muramatsu, Eur. J. Biochem. 157í 71 až 75 (1986); a Prieels et al., J. Biol. Chem., 256: 10456 až 10463 (1981). Boli už popísané gény fukozyltransferázy a ich kónovenie a expresia, pozri Campbell et al., J. Biol. Chem., 259:

11208 až 11214 (1984); Larsen et al., Proc. Natl. Acat.

Sci. USA, 87: 6674 až 6678 (1990); Kukowska-Latello et al., Genes. and Devel., 4: 1288 až 1303 (1990); Weston et al., J- Biol. Chem., 267: 4152 (1992).

Fukozyltransferázy sú obvykle viazané k membráne. Intaktné fukozyltransferázy sú teda obvykle nerozpustné vo vodnom roztoku. Na uľahčenie ich použitia pri spôsoboch a v reakčných systémoch podľa‘tohto vynálezu sa dáva prednosť používaniu rozpustných enzýmov, v ktorých bol nerozpustný cytoplazmový koniec reťazca vypustený alebo hydrofilizovaný selektívnou deléciou alebo zavádzaním polárnych aminokyselín. Natívne intaktné fukozyltransferázy sa však dajú pri tomto vynáleze použiť, ked sa pridajú menšie množsvá neiónových detergentov, ako je Triton X-100.

Fukozyltransferázy predstavuje špecifický typ glykozyltransf eráz. Aktivovanou donorovou molekulou je obvykle nukleotid-5'“difosfofukóza. Pri reakcii sa vytvára nukleotid ako odstupujúca skupina a fukóza obsahujúca reaktívny karbioniový ión, ktorý vytvára glykozidovú väzbu s dostupnou hydroxyskupinou ekceptorovej molekuly.

(2) Reakčné podmienky a substráty vhodné pre fukozyláciu

Fukozyltransferázy sú typické glykozylázy a sú to enzýmy, ktér- sú pomerne robustné. Reakčné podmienky, ktoré sa hodia pre väčšinu glykozyltransferáz, sú tiež vhodné pre fukozyltransferázy. Tak napríklad, vhodné reakčné podmienky zahrnujú teplotné rozmedzie od asi 10 do asi 40 °C, pufre zahrnujú orgenické a anorganické pufre s hodnotou pi vo fyziologickom rozmedzí pH. Prijateľné rozmedzie pH leží v rozmedzí od asi 4 do asi 9. Koncentrácia soli je približne 0 až 200mM a používa sa približne 0,1 až 1,0 % neiónového detergentu (napríklad Triton X-100), pokiaľ sú enzýmy inak nerozpustné vo vodnom fukoz.ylačnom médiu. Často je potrebné pridať dvojmocné katióny, ako napríklad mangánaté ióny.

Rozsah uhľohydrátových ekceptórrych molekúl nie je v podstate obmedzený. Známe miesta väzby sú uvedené vyššie, zvyšok uhľohydrátovej akceptorovej molekuly však nie je rozhodujúci. Fukozyltransferázy sú celkom tolerantné voči substrátu a okrem akceptorového cukru, ku ktorému sa pripojuje fukóza a cukrov, ktoré bezprostredne susedia s akceptorovým cukrom, má zvyšná štruktúra substrátu len malú dôležitosť. Akceptorové uhlohydrátové molekuly môžu byť vytvorené výlučne z cukrných zvyškov zahrnujúcich monosacharidy, glykoproteíny, glykolipidy alebo neprirodzené zlúčeniny, v ktorých je cukor akceptujúci fukózu pripojený k zlúčeninám, ako sú aromatické uhl’ovo- 19 vodíky, heterocyklické zlúčeniny, cykloalkény a acyklické uhľovodíky.

Prednostná uhľohydrátová akceptorová molekula obsahuje terminálnu skupinu Gal^l,4GlcNAc-X,, kde X predstavuje organickú molekulu. Príklady skupiny X sú uvedené Šalej v texte. Ako príklady uhľohydrátových akceptorovýh molekúl sa dajú uviesť: Gal(?l,4GlcNAc, laktóza, NeuAcx2,6 Gaip l,4GlcNAc, Gal^l,3GlcNAc, Gal^l,4glukal (laktál), NeuAcí.2,3Gaip>l,4glukal, 2-halogénsubstituované reakčné produkty vyššie uvedených glukálov, Gaľl£> 1,,4(5-tio)Glc, Galŕl, 4GlcNAcp?-O-al.yl.

SLe^x alebo SL^a analóg môže ted8 obsahovať atóm halogénu namiesto jednej z kruhových hydroxyskupín. Bol nájdený nový spôsob výroby 2- alebo 3-halogénmono- a oligosacharidov zo zodpovedajúcich glykálov použitím chlórperoxidázy. Výsledné 2(3)-deoxy-2(3)-halogénsacharidy môžu byť potom využité pri syntéze, ktorá je prediskutovaná na inom mieste tohto popisu.

Podľa tejto metódy sa glykal zmieša s peroxidom vodíka, zvolenými halogenidovými iónmi (chloridmi, bromidmi alebo jodidmi) a katalytickým množstvom chlórperoxidázy (EC 1.11.10) vo vodnom pufri s hodnotou pH približne 2,5 až 3,5, za vzniku reakčnej zmesi. Výsledná reak čná zmes sa potom udržuje tak dlho, dokiaľ sa nevytvorí požadovaný produkt. Koncentrácie rôznych reakčných činidiel sa môžu meniť, ako je dobre známe v tomto obore. Príklady vhodných koncentrácií a syntetických postupov sú uvedené Šalej. T_ekto vzniknutý halogénhydrínový produkt sa prednostne izoluje.

Pri teplote okolia leží obvyklá reakčný čas v rozmedzí od 8si 15 minút do 2 až 4 dní. Jodid reaguje najrýchlejšie, zatiaľ čo chlorid najpomalšie.

Obvykle sa získajú termodynamicky výtvorené produkty, s výnimkou prípadu, pri ktorom 1,3-diaxíélna interakcia bráni tvorbe 2-axiálne substituovaného produktu Ked sú v reagujúcom glykále prítomné 1,3-diaxiálne interakcie, býva stereošpecificita halogénhydratovaného produktu taká, že halogénová skupina vykazuje X- alebo [5orientáciu, pričom tic-ž vzniknú obidva anoméry 1- alebo

2-hydroxylovej skupiny. Príklady syntézy 2- alebo 3-halogénuhľohydrátových akceptorových molekúl a ich prekurzorov sú ilustrované v schémach 3, 4 a 4A, uvedených dalej.

Brómhydratáciou sialyl Le^x molekuly s terminálnym glykalom (zlúčenina 36 v schéme 4A), ktorá má v roztoku podobnú konformáciu ako sialyl Le^x, sa získajú požadované produkty (zlúčeniny 37a a 37b). Tieto produkty majú spoločnú konformáciu so zlúčeninou 36 a sialyl Le v oblasti väzbovej domény, skladajúcej sa z NeuAc-Gal-Fuc (podľa štúdií NOE).

Brómovaná sacharidy sa dajú tiež vyrobiť použitím N-brómsukcínimiču (NBS) v zraesovom rozpúšťadle acetonitril-voda. Tento postup sa mcže používať na zistenie zmeneného pomeru získaných produktov, ako je to v prípade zlúčenín 32 a 33, ktoré sa získajú v rovnakom množstve pri enzymatickej reakcii a v pomere zlúčenina 32 zlúčenina 33 1:2,5, pokiaľ sa použije NBS. 3-halogénzlúčenina (35) s jej izomérny halogénhydra'tovaný produkt (zlúčenina 35a) vznikajú použitím reakcie s NBS v pomere 2:3 (zlúčenina 35:zlúčenina 35a) v porovnaní s jediným izomérom (zlúčenina 35), ktorý sa získa použitím enzymatickej reakcie.

- 21 Schéma 3

50%. β/α »= 0.4

COOH

COOH

Schéma 3 ilustruje brómhydratáciu D-glukálu, D-galektálu a D-fukélu a tvorbu zodpovedajúcich 2-deoxy-2-brómmonosachari ov (zlúčenín 20, 21, 22 a 23). Brómhydratácia sialálu (zlúčeniny 34) chlórperoxidázou (CPO), ktorá vedie k zodpovedajúcej 3-deoxy-3-brómsialylovej kyseline (zlúčenine 35) je tiež znázornená, v spodnej časti schémy 3.

Schéma 4 ilustruje chlór- a jódhydratáciu galaktélu, ktorá vedie k zlúčeninám 25, 26 a 27. V schéme 4 je tiež znázornená brómhydratácia Gall,3Glukálu (zlúčeniny 28) a Gali,4Glukélu (zlúčeniny 31), ktorá vedie k zodpovedajúcim a 0>-2-deoxy-2-bróm-zlúčeninám (zlúčeninám 29 a 30 a zlúčeninám 32 a 33).

Schéma 4

ChlorgeroxidázA H;O;, KCl,pH3 dny

15%rýtó.p/a = 3 produ<57% vfäfek

CPOJí₂O₂,

Kí, pH 3 min

Sitebo Aez. cWor/>eroxid2Íy

HO OH

(3:2/33=1)

Aktivovaný donor fukózy, nukleozid-5'-difosfofukóze, najčastejšie zahrnuje guanozín, existujú však aj alternatívne donory, ako sú nukleotidy zahrnujúce akýkoľ vek L-cukor, ako je L-rsmnóza a L-idóza.

Pri spájaní reakcie s fukozyltransferázou s druhou reakciou použitím glykozyltransferázy sa jednoducho, využíva skutočnosť, že optimálne reakčné podmienky sa použitím väčšiny glykozyltransferáz prekrývajú. Ľané rea kčné podmienky pre akúkoľvek glykozyltransferázu umožňujú teda pôsobenie známych fukozyltransferáz. Keá sa použijú reakčné podmienky pre fukozyltransferázy, ktoré sú uvedené vyššie, a vykonávajú sa rutinné titrsčné experimenty, môže sa dospieť k reakčným podmienakm, ktoré sú vhodné pre syntézu fukozylovaného oligosacharidu použitím len monosecheridov.

Všeobecne, pri voľbe reakčných podmienok pre niekoľkonásobné reakcie s glykozyltransferázami v jedinej reakčnej zmesi, je nutné zobrať do úvahy teplotu, pH, osmolaritu rozpúšťadla a iónové zloženie, ktoré boli uve dené vyššie. Keá je jednou z glykozyltransferáz fukozyltransferáza, zahrnujú vhodné reakčné podmienky prednostné rozmedzie pH približne 6,0 až 8,5, najmä polom 7,0 až 7,5. Užitočná je prítomnosť dvojmocných katiónov, ako napríklad mangánatých iónov, zatiaľ čo chelatačné činidlá pre dvojmocné ióny nie sú nutné.

Zloženie pufrov nie je kritické. Vhodné sú vodné pufre, ako je HEPES. Osmolarita pufra (vrátane pufra) je v rozmedzí od 100 do 300 mOsm.

Vyššie uvedené podmienky, pri ktorých enzýmy pôsobia, sa tu označujú ako biologické reakčné podmienky.

Reakčný čas kolíše v závislosti od použitých substrátov, enzýmov a teplôt. Typický reakčný čas leží v rozmedzí od 24 do 96 hodín.

Pri určitých podmienkach, ke3 sa použije galaktozyltransferáza a monosacharidový akceptor obsahuje aglykón jednej polohy glukózy v «^-orientácii, môžu reakčné podmienky zahrnovať laktalbumín, prednostne ^-laktalbumín.

T„k napríklad, reakcia so sialyltransferázou, ktorá je popísaná v Ichikawa et al., J. Amer,. Chem. Soc.,

113: 4698 - 4700 (1991), môže byť spojená s reakciou pri použití rekombinančnej humánnej Lewisovej rfjl,3/4)-fukozyltransferázy, popísanou v Kukowska-Latallo et al., Genes and Ľevel. 4: 1288 (1990). Jednoducho sa použije základná reakčná zmes vodného pufra (HEPES) s rozmedzím pH 7,0 až 7,5, pričom vhodná koncentrácia soli. je 50 až 200mM. Reakcia sa uskutočňuje pri teplote asi 37 C.

B. Specificita voči substrátu a inhibičná štúdia glykozyltransferáz »Q,3/4FucT je fukozyltransferáza, ktorá je schopná presunúť zvyšok Fuc z GBP-Fuc na 3- a 4-hydroxyskupinu GlcNAc, za vzniku Le^x alebo Le^s (Kukowéka-Latallo et al., Genes and Ľevelopment, 4: 1288 (1990); Ľumes et al., Bioorg. and Med. Chem. Lett., 1: 425 (1990)). Ako je ukázané v tabuľke 1, uvedenej čísle j, tento enzým katal.yzuje fukozyláciu Gal(7l,3GlcNAc rýchlejšie (V_re^580) než Galf?l,4GlcNAc (LacNAc) (údaje 1 e 4) pri lOmM koncentrácii uhľohydrátového akceptora. Sialylovaný LacNAc (údaj 7) je tiež substrátom pre tento enzým, ktorý umožňuje syntézu sialyl Le^x (Ľumas et al., Bioorg. and Med. Chem. Lett., 1: 425 (1991)).

Zaujímavé je, že Gaip>l,4(ť-tio)Glc (G8utheron-Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 8137 až 8245 (1991)) je za týchto podmienok lepšiu substrátom než zodpovedajúci disecharid, laktóza (údaje 2 a 3). Každý zo substrátov uvedených v tabuľke 1 predstavuje uhľohydrátový akceptor pre fukózu, ktorý prevezme fukozylový zvyšok z donora fukózy použitím tohto enzýmu. Galf?l,4deoxyno jirimycín (Gautheron-Le Narvor et al., J. Chem. Soc., 113: 8137 - 8245 (1991)) (údaj 11) je však inhibítorom (ΙΟ^θ 40mM). Váaka obmedzenej zásobe <<l,3/4Fuc nebol uskutočňovaný áalší výskum.

Schéma 4a

- 27 Tabuľka 1

Disacharidy a trisacharidy, ako substráty alebo inhibítory pre ,3/4fukozyltransferázu

Údaj	Substrát	V a rel
1.	Galf»l,4GlcNAc	100
2.	Gaip>l,4Glc	120
3.	Galf51,4(5-tioGlc)c	310
4.	Galp>l,3GlcNAc	580
5.	GlcNAcf>l,4GlcNAc	23
6.	Gal(Sl,4GalNAc	27
7.	NeuAc-c 2,3Galp? 1,4GlcNAcd	60
8.	Fuc^l,2Gelpl,4Glce	250
9.	GlcNAcpi,6Gal(5l,4Glce	13
	Inhibítor	IC50(mM)b
10.	Gaip>l, 4 (3-deoxy )GlcNAcp>Oalylc	>125
11.	Gaipi,4deoxynojirimycínc	40
12.	Galp>l,4GlucalC ’f	>125

⁸ Relatívna rýchlosť pri použití 0,20mM GĽP-Fuc,

20mM chloridu mangánateho a lOmM akceptore. Špecifická aktivita = 2 U/mg (1 U = 1/umol GĽP-Fuc, spotrebovaný za hodinu).

Koncentrácia inhibítora, ktorá je potrebná pre

50% inhibíciu pri použití 0,2mM GĽP-Fuc.

c

G8utheron-Le Narvor, C. et al., J. Chem. Soc. Chem.

Commun., 1130 (1991); Wong C. -H. et al., J. Am.

Chem. Soc., 113: 8137 (1991).

^d zakúpený od firmy Oxford GlycoS.ystems, Inc., Rosedale, New York, USA.

^e Zakúpený od firmy Sigma, St. Louis, MO, USA.

^f Haworth, W. N. et al., J. Chem. Soc. 1930, 2644.

e<l,3FucT z humánnej plazmy, je enzým , ktorý je zodpovedný za produkciu sialyl Le^x. Tento enzým bol nedávno klonovaný a exprimovaný (”overexpression”) (Weston at al., J. Biol. Chem., 267: 4152 (1992)) a použitý pri syntéze. Meranie špecificitv voči substrátu (pozri tabuľka 2, 3alej) podľa očakávania ukázalo, že enzým je špecifickejší pre LacNAc 2,9, údaj 1) než Gal()l,3GlcNAc (V/K_m 0,22, údaj 5). Podobne ako to. bolo v prípade £1,3/4FucT (údaj 3 v tabuľke 1), Gaip>l,4(5-tio)Glc je tiež substrátom, pre £FucT (údaj 3 v tabuľke 2). Na rozdiel od <1,3/4enzýmu, laktál (údaj 6) je substrátom pre <1,3 enzým.

Trisacharid NeuAc<<2,3Gal{5l,4GlcNAc (údaj 7), prekurzor sialyl Le , je najlepším substrátom s relatívne maximálnou rýchlosťou 620 % rýchlosti pre LacNAc £2,6-viazaný sialozid (údaj 10) je približne 50x menej aktív

- 29 ny, eko substrát, v porovnaní s j;2,3-izomér. Stojí zp to si všimnúť, že tento enzým meže tiež prenášať Fuc na sialylovaný trisacharid obsahujúci glukál (V , 330 %, údaj 9).

čo sa týka väzby, má tento enzým afinitu voči disacharidom (údaje 1, 3, 4 a 6) vyššiu než voči trisacharidom. Keó bol zvyšok GlcNAc látky LacNAc nahradený zvyškom 5-tioGlc, glukál (JTsworth et al., J. Chem. Soc., 2644 (1990)) alebo GlcNAcfOalyl, bolo pozorované zvýšenie afinity. Laktóza však má veľmi nízku afinitu,, napriek tomu že relatívna rýchlosť pri V_ffiax je pomerne vysoká (150 %). Každý zo substrátov, ktoré sú uvedené v tabuľke 2, predstavuje uhľohydrátový ekceptor pre fukózu, predávaný z fukozylového donora použitím tohto enzýmu.

- 30 Tabuľka 2

Lisacharidy a trisacharidy, ako substráty alebo inhibítory pre <£L, 3fukozyltransferázu

Údaj	Substrát	K (mM) m	V rel
1.	Galp»l,4GlcNAc	35	100
2.	Gal(Ll,4Glc	500	150
3.	Galpl,4(5-tioGlc)b	12	51
4.	Gal|Sl ,4GlcNAc[bOalylC	16	64
5.	Galpl,3GlcNAc	600	130
6.	Gal(bGlukálb,d	34	10
7.	NeuAck2,3G8ip>l ,4GlcNAce	100	620
8.	NeuAc/2,3Galf> 1,4GlcNAcfOalyl* 280	380
9.	NeuAc^' 2,3Gal(Sl, 4Glukálf	64	330
10.	ΝευΑοΛ 2,6Gal f>l, 4GlcNAc&	70	13
a	Relatívna maximálna rýchlosť pri	použití 0,	,lmM

GĽP-Fuc, lOmM chloridu mangánatého a lOmM Gal 1,4GlcNAc. 3pecifická aktivita = 2,6 U/mg (1 U = 1 /umol GDP-Fuc, spotrebovaný za hodinu).

Gautheron-Le Nervor, C. et al., J. Chem. Soc. Chem Commun., 1130 (1991); Wong C—H. et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 8137 (1991).

- 31 Haworth W. N. et al., J. Chem. 5oc<. 1930, 2644.

^e Zakúpený do firmy Oxford GlycoSystems, Inc., Rosedele, New York, USA.

f

Vyrobený enzymaticky použitím <r2,3sialyltransferázy od firmy Cytel Co. pri tejto štúdii.

® Ichikawe Y. et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113,

4698.

Pri našej štúdii inhibície <<l,3FucT (pozri tabuľka 3, nižšie) je pozorovanie, že 3'-deoxy-· LacNAc-pOalyl (Gautheron-Le Nervor, C. et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong C.-H. et al., J. Am. Chem. Soc., 113:

8137 - 8245 (1991)) je slabým inhibítorom (údaj 5) konzistentné s predchádzajúcou správou, týkajúcou sa deoxygenovaných oligosacharidov, vo vzťahu ku glykozlytransferázam (Hindsgeul et al., J. Biol. Chem.,, 266: 17858 (1991)). Zo skúšaných analógov akceptorovýcb uhľohydrátových substrátov je najsilnejším inhibítorom Gal(bl,4deoxynoirimycín (udaj 4, = 8mM).

Ľva azacukry (Kajimoto et al., J. Am. Chem. Soc.,

113: 6679 (1991)), ktoré sú známe ako silné inhibítory ρς-fukozidázy, boli skúšané ako analógy akceptora (údaj 8 a 9) a zistilo sa , že sú stredne silnými inhibítormi v porovnaní s LacNAc pre FucT (IC^q asi 34,v porovnaní s hodnotou 52mM). Ľeoxynojirimycín je však substrátom pre ,£l,4GalT (Wong C.-H. et al., J. Am. Chem. Soc., 113:

8137 - 8245 (1991)). Tiež GDP-Man je účinným inhibítorom ^l,3FucT (IC_5Q 2mM).

Pri štúdii inhibície tvorby produktu bola naša pozornosť zameraná na uvoľnený nukleozid-difosfát. GDP

- 32 je vedľajším produktom enzymatickej fukozylécie a je veľmi účin ným nekompetitívnym inhibítorom vzhľadom na LecNAc (K.. = 0,13mM, K. = 0,16mM, úd8j 10). Iný nukleozid-difosfát, UBP uvoľnený pri enzymatickej galaktozylácii, je takisto veľmi účinným inhibítorom GalT (K^ = 0,46mM). GĽP-Fuc je účinným inhibítorom <L,3FucT pri koncentráciách nad 0,2mM za prítomnosti lOmM LacNAc. Nie je však inhibítorom <<L,3/4FucT.

Okrem azacukrov (údeje 8 a 9, v tabuľke 3) vykazujú tiež iné azscukry, ako zlúčeniny 51, 52 a 53, charakterizované nižšie, inhibíciu aktivity ^-fukozidázy, ako to robí zlúčenina 50 (údaj 9 v tabuľke 3). Zlúčeniny 50 až 53 vykazujú hodnoty 1C s týmto enzýmom 4, 22, 8a 1,4/uM (pozri tiež Dumas

Lett., 2: 33 (1992)).

HO — et al., Bioorg. end Med. Chem,

H .N.

HO

V ry

I Un₃

£2

Teraz sa zistilo, že okrem zlúčeniny 50 je tiež zlúčenina 53 kompetitívnym inhibítorom λ-I,3-fukozyltrensferázy typu, ktorý sa nachádza v l’udskej plazme. Jej hodnota IC^q vzhľadom na LacNAc je 80mM. Okrem toho, GDP, ktorý sá vytvára v priebehu fukozylačnej reakcie z GDP-Fuc, e je nekompetitívnym inhibítorom, pokiaľ je prítomný pri = 0,05mM, vykazuje silnú synergickú inhibíciu za prítomnosti zlúčeniny 50 alebo 53. Dáta, ktoré boli namerané pri experimentálnej inhibičnej štúdii pri zlúčeniny 50, sú znázornené na obr. 3. Tento synergický účinok môže byť dôsledkom interakcie medzi GĽP a azacukrom na aktívnom mieste enzýmu, pri ktorej vzniká komplex, ktorý napodobňuje štruktúru prechodového stavu pri reakcii zahrnujúcej transfér fukozylu.

Vyššie uvedené výsledky umožňujú realizovať inhibíciu reakcie s glykoz.yltransf erázou, ako napríklad fukozyltransferázou. Pri tomto postupe sa vo vodnom médiu zmieša glykozlytransferéza, ako napríklad j;l,3-fukozyltransferáza typu nachádzajúceho sa v humánnej plazme, uhľohydrátová akceptorová molekula, ako je LacNAc, aktivovaná glykozylóonorová molekula, ako je GĽP-Fuc a inhibičné množstvo azacukru, ako je niektorá zo zlúčenín 50 alebo 53 a vzniknutá zmes sa udržuje za biologických reakčných podmienok v čase dostačujúcom pre inhibíciu reakcie s glykozyltransferázou.

S výhodou je tiež prítomné inhibičné množstvo nukleozid-difosfátového produktu glykozylačnej reakcie, ako UĽP alebo GĽP, kde GĽP-Fuc je glykozylačný donor. Aby bola konkrétna glvkozylačná reakcia inhibovaná je inhibičné množstvo azacukru a nukleozió-difosfátu, pokiaľ sú tieto látky prítomné, prednostne prinajmenšom asi 10 % ich indivinuálnej hodnoty IC^₀, s výhodou prinajmenšom 50 % tejto hodnoty, pri meraní in vitro spôsobom popísaným áalej. Koncentrácie, ktoré sú vyššie než hodnota IC^q sa dajú tiež použiť. Glykozylačné reakcie sú obvykle inhibované z prinajmenšom 25 % s s výhodou z prinajmenšom 50 %.

Inhibícia glykozylácie môže prebiehať in vitro alebo in vivo. Príklad inhibičnej štúdie in vitro je ilus trovený äalej. Pri použití in vivo je enzým, glykozylový donor a akceptorová molekula a GĽP prítomné v hostiteľskom cicavcovi, ktorým môže byť laboratórny cicavec, ako je myš potkan alebo králik alebo tiež človek. Azscukor sa hostiteľovi podáva obvykle používanou technikou podá- 34 vania liečiv, ktorá je dobre známe v tomto obore. Môžu sa tiež podávať pridávané množstvá GĽP, pokiaľ je to žiaduce. Biologické reakčné podmienky zaisťuje telo hostiteľského cicavca. Pridaný azacukor je v hostiteľskom cicavcovi udržovaný, dokiaľ sa nevylúči aleoo nekatabolizuje.

Tabuľka 3

Inhibícia t<l,3FucT

Údaj Inhibítor ΙΟ^θ⁸

1.	Galf’l ,4Glukálb	NIC
2.	Gaip 1,3 GlcNAc	NI
3.	Galf»l,3GalNAc	100
4.	Galp>l,4Beoxyno jirimyeínb	8
5.	Gaip>l, 4 (3-deoxy)GlcNAcPOalyl^	710
6.	GlcNAc l,4GlcNAc	NI
7.	GDP-Man	2
•·°Ίοη ,
8.		52
	HO
9.	OH i 44»	34
10.	GĽP HO	0,05(

- 35 Koncentrácia inhibítora potrebná na dosiahnutie

50% inhibície pri použití 0,lmM GDP-Fuc, lOmM mengánatých iónov a lOmM LacNAc pri pH 6,2 a 37 °C.

b Gautheron-Le Narvor, C. et al., J. Chem. Soc. Chem.

Commun., 1991, 1130.

^c Žiadna inhibícia nebola pozorovaná až do koncentrácie inhibítora 50mM.

d Kajimoto, T. et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113,

6679.

^e K. = 19 - 3mM, K.. = 0,13 - 0,05mM, K. = 0,16 X XX x s

0,06mM.

C. Chemické a enzymatické spôsoby výroby GDP-fukózy

Cyklická reakcia s fukoz.vltransf erázou môže byť poháňaná pridávaním stechiometrie kých množstiev príslušného cukor-nukleotidu, ako je GDP-fukóza alebo sa prednostne môže cukor-nukleotid vytvárať pôsobením katalytického množstva zodpovedajúceho nukleotidu a stechiometrických množstiev PEP a Man-l-P alebo Fuc-Í-P.

GDP-fukóza je prednostným aktivovaným cukorným donorom pre známe fukozyltrensferázy. Jej výroba je obti8Žna a nákladná a pri ostatných reakčných cykloch, ktoré sú tu popísané, sa dáva prednosť tomu, aby jej syntéza zahrnovala in situ regeneráciu ich nukleotidových prekurzorov. Všeobecná schéma je uvedená vo fukozylovom cykle v schéme 1.

(1) Chemická syntéza fukóza-l-fosfátu a GDP-fukózy

Chemická syntéza GDP-Fuc je založená na kondenzácii

- 36 fukóza-l-fosfátu a aktivovaného GMP, ako je GMP-morfolidát (pozri všeobecné publikácie a) Kochetkov et al., Adv Carbohydr. Chem. Biochem., 28: 307 (1973)jb) Moffat, Methods Enzymol., 8: 136 (1966) a c) Roseman et al., J. Am. Chem. Soc., 83: 659 (1961)). V dôsledku pomerne vysokej lability fukóza-l-fosfátu a GBP-Fuc sú oznáme výťažky chemickej syntézy Fuc-l-P a kondenzačnej reakcie Fuc-l-P a derivátu nízke. Bolo ohlásených niekoľko syntetických postupov vedúcich k fukóza-l-fosfátu. Vzhľadom na to, že cukor-nukleotidy má len Fuc-l-P termodynamicky nestály p-fosfátový zvyšok na anomérnom centre fukózy, je obtiažne regulovať stereochémiu 8nomérn . centr . V tomto popise sú uvedené dve účinné cesty vedúce k GBP-Fuc: jedna cesta je chemická a druhá enzymatická.

Prvá chemická syntéza GBP-Fuc bola uskutočnená Barkerovou skupinou (Nunez et al., Cen. J. Chem., 59: 2086 (1981)). Pre výrobu fukóza-l-fosfátu použila táto skupina 2,3,4-tri-O-acet.yl-f7-L-fukózu, pripravenú zo zod poved8júceho brómovaného derivátu a nasledujúcou frakčnou kryštalizáciou a fosforvláciou výsledného f?-Bnoméru. Hindsgaulove skupina (Gokhale, Can. J. Chem., 68: 1063 (199L)) použila glykozylačnú reakciu acetofukozylbromidu a tetrabutylamóniovej soli dibenzylfosfátu na výrobu pomerne nestáleho glykozylfosfátu (menej než 10 minút pri chormatografii na silikagéli). Schmidt et al., (Schmidt et al., Liebigs Ann. Chem., 191: 121 (1991)) použili fukozylimidát a získali produkt glykozidácie vo vysokom výťažku bez použitia Lev/isovej kyseliny, ako katalyzátora. van Boomova skupina (Westerduinn et al., Tetrahedron Lett., 27: 1211 (1986)) použila trojmocné f osf it.ylačné činidlo na 2,3,4-tri-O-benzylfukózu, ktorú, previedla na ^-fukozylfosfát.

V tomto popise sú uvedené dva zlepšené spôsoby chemickej syntézy GĽP-fukózy (pozri schéma 5 až 7, nižšie) Pri jednom z týchto postupov (schéma 5) sa používa glykozylačná reakcia benzoylovaného (Bz) fukozylbromidu (zlúčenina 3) a dibenzylfosfátu. Keó sa použiej benzoylskupina namiesto acetylskupiny, ako chrániacej skupiny, dosiahne sa zlepšená stálosť fukozylového derivátu a stereoselektivita glykozylačnej reakcie. Glykozylácia zlúčeniny 3 a dibenzylfosfátu (Linshorst et al., Carbohydr. Res., 2098: 119 (1991)) prebieha veľmi hladko a poskytuje kondenzačný produkt, ako jediný produkt v 95% výťažku. Ako bolo očakávané, zlúčenina 4 je dostatočne stála, aby sa dala prečistiť na stĺpci silikegélu (viac než 3 hodiny), avšak purifikovaná látka je nestála. Keč bola purifikovaná zlúčenina 4 ponechaná stáť cez noc pri teplote miestnosti, bol pozorovaný určitý stupeň jej rozkladu a anomerizácie. Je potrebné uviesť, že purifikovaná zlúčenina 4 bola ihneó po prečistení použitá v nasledujúcom stupni. Odstreňovanie benzylových (Bn) chrániacich skupín z fosfátového zvyšku a odstraňovanie benzylových skupín bolo vykonávané postupne, spôsobom popísaným vyššie (Gokhale et al., Can. J. Chem., 68: 1063 (1990)).

Schéma 5

H,C

OH z

OH

OH BiCS OH ~

3zO

O3z HBf-ÁcOH

OEz ~

CHjCI,

(SnO),P(O)OH

CKW

HjC·

BzO

z

OEz ⁰'⁷7ľx⁰-’^<0,(03’’

K,c

OH

OH

OH

O — P(O)(OH)2

1) H/Fd-C IN SUKCC,

E!OH

2) · NlOH vot/ny

3) Oow.r 1-X8 [HCO/j

- 38 Iná metóda používa trojmocné fosfitylačné reakčné činidlo, ako je dibenzyl-N,N-dietylfosforoamidit (ĽĽP), ktorý bol použitý na výrobu dibydroxyacetylfosfátu (ĽHAP) (pozri schéma 6, nižší) (Pederson et al., Tetrahedron,

47·’ 2643 (1991)). 2,3,4-tri-O-acetylfukóza, zlúčenina 7, pripravená bučí chemickou alebo enzymatickou deacetyláciou (Hennen et al., J. Org. Chem., 53: 4943 (1988)) bola fosfínovsná ĽDP za prítomnosti tetrazolu. Reakcia pokrečovala hladko a získala sa pri nej v 79% výťažku zlúčenina 8, zlúčenina so všeobecným vzorcom I a II, ktorá bola oxidovaná na zodpovedajúcu fosfátovú zlúčeninu 9. Ľeprotekcia zlúčeniny 9 bola vykonaná podobným spôsobom ako pri príprave zlúčeniny 5 zo zlúčeniny 4.

Schéma 6

H₃C

HO OH s OH Ac^O OH

NaOAc

H,C

AcO OAC

OAc SnNHj/TruOAc ~ or PPL

H,C

AcO ^0Ac 7

OH (5r.OhFN£<; _ _K,C OAc

/

AcO ^0Ac ^OP(O3n)j :0¾ ir-r n-r

H,C

AcO °^Ac

OAc

0,-0(03¾ ΗΌΗ.Ν S=HCO^

2) NaOH/H^O OH

OPO(ONa)j

- 39 Fosfitylačná reakcia pri použití (EDP), ilustrovaná v schéme 6, je dosť užitočná pre tvorbu rôznych fosfitov a zodpovedajúcich fosfátov vo vysokých výťažkoch. Ďalšie príkladné zlúčeniny a podrobnosti sú uvedené Čalej v sekcii H.

Fuc-l-P sa účinne aktivuje prevedením na trialkylamóniovú soľ reakciou s guanozín-5'-monofosfomorfolidátom (1:2) v rozpúšťadle, ako je pyrióín. Produkt, GĽP-Fuc, zlúčenina 12, sa prečistí obvyklou stĺpcovou chromatografiou. Tieto reakcie sú znázornené v schéme 7, nižšie.

Schéma 7

Pyr

O

HO OH

GDP-Fv,:

- 40 (2) Enzymatická tvorba GĽP-fukózy

Enzymetickej výrobe GĽP-Fuc z fukózy sa dáva pred nosť. Enzymatickú prípravu GĽP-fukózy oznámil Schacter et al., Methods of Enzymol, 28: 285 (1972) použitím fukóza inázy a GĽP-fukóza fosforylázy z pečene prasaťa.

Ako sa dá ľahko predvídať, táto multienzymová rea kcia sa dá ľahko uskutočniť použitím kombinácie rôznych enzýmov a vysoko energetického substrátu. Fukózový reakčný cyklus, znázornený v schéme 1 a 8, predstavuje príklad tohto multienzýmového systému. Fukóza sa do tohto systému pridáva v stechiometrickom množstve, spolu s PEP Spolu s AĽP a GĽP sa tiež pridávajú katalytické množstvá PK, FK a GĽP-FucPP. Reakčné podmienky sú podobné podmien kam popísaným vyššie pre transferázy.

Schéma 8

HO

CD?-Rjc

7~o-?-o-?-oOH i ‘

OH θ'

N.

NH,

- 41 (3) Menóza, ako východisková látka

GĽP-Fuc sa dá alternatívne účinne získať z GĽP-manózy nesledujúcou enzymatickou konverziou na GĽP-Fuc. Prekurzorom GĽP-Man je Man-l-P, zlúčenina 18. Man-l-P sa vyrába rovnakým spôsobom, aký je popísaný pri výrobe fukózs-l-P. Prednostne sa používajú acetylové blokovacie skupiny na výrobu msnóza per-O-acetátu, ako je to znézor nené v schéme 9, nižšie. Alternatívne sa môže Man-l-P vyrobiť enzymaticky podobným spôsobom, ako Glc-l-P.

Schéma 9

O OAc

1) Kj/Pd-C EiOH-N NaHCOj

AcO

AcO AcO

2) SoOK/HjO

020(03.-,),

1S

- 42 Enzymatická syntéza GĽP-fukózy z menóza-l-fosfátu s in situ tvorbou GĽP-manózy sa uskutočňuje použitím kombinácie dvoch enzymatických systémov: GĽP-manóza pyrofosfosryláza a GĽP-fukóza-syntetických enzýmov. Pre tvorbe GĽP-fukózy je nutné regenerovať NAĽPH. Táto regenerácia sa môže uskutočňovať použitím NAĽPH-závislej elkohol dehydrogenázy z Thermoanaerobacterium brokii za prítomnosti izopropanol alebo glukózafosfát dehydrogenázy v prítomnosti glukózy. GĽP-manóza pyrofosforyláza sa môže získať z kvasiniek óalej uvedeným spôsobom, ale boli popísané aj iné 2droje, ako napríklad Arthrobacter (Preiss et al., J. Biol. Chem., 239:3119 (1964)), Escherichia coli (Lieberman et al., J. Bact., 101: 965 (1970)). ako aj cicavčie zdroje (Smoot et al., Eur. J. Biochem. 148: 83 (1985)).

Konverzia GĽP-manózy na GĽP-fukózu bola prvýkrát oznámená Ginsburgom a Kirkmanom (Ginsburg et al., J. Am. Chem. Soc. 80: 3481 (1958)). Tento enzým bol čiastočne purifikovaný z A. aerogenes (ATCC 12658), ktorý ako mikroorganizmus bol v súčasnej dobe premenovaný na Klebsiella pneumoniae a použitý na demonštráciu konverzie GĽP-manózy na GĽP-fukózu (Ginsburg, J. Biol. Chem., 235: 2196 (1960)), Táto reakcia je závislá od NAĽPH. Yamamoto et al., tiež oznámili syntézu GĽP-fukózy z GĽP-manózy použitím enzýmu získaného z Agrobacterium radiobacter (Yamemoto et al., Agric. Biol. Chem., 48: 823 (1984)).

V tomto popise je popísaná konverzia manóza-l-fosfátu na GĽP-fukózu s in situ tvorbou GĽP-manózy. Manóza-1-fosfát sa prevedie na GĽP-fukózu použitím kombinácie dvoch enzymatických systémov, tj. GĽP-manóza pyrofosforylázy a GĽP-fukóza-syntetického enzýmu s regeneráciou NAĽPH. Napriek tomu že začiatočné výsledky zahrnovali nízke výťažky, očakáva sa, že až sa získajú vyššie aktivity enzýmu, výťažky bude možné podstatne zlepšiť. Tieto reakcie sú znázornené v schéme 10 a 11.

- 43 Schéma 10 h,c'7^ot'o-p-o-pΓΤ^-ΟΗ I · ¹ r>u O· O'

HO OH

CTDP-ruc

Schéma 11

K₂O

NADPH

Pri syntéze fukozylovaného oligosacharidu bol použitý regenerečný systém pre^aktor, v ktorom bol uvoľnený GĽP prevedený na GTP pomocou fosfoenolpyruvátu (PEP) a pyruvát kinázy (PK) a vytvorený NAĽP bol prevedený na NAĽPH pomocou 2-propanolu Ζ8 prítomnosti alkohol-dehydrogenázy. Použitím <L,3/4~fiukozyltrensferézy bol Gal{^l,3GlcNAc prevedený na Gal(!?l,3(EucZT,4)GlcNAc (Ľumas et al., Biomed. Chem. Lett., 1: 425 (1991)).

Ľ. Rec.yklovanie nukleotidov

Keóže sú glykozyltransferázy často inhibované nukleotidmi, prednostne sa koncentrácia nukleotidu udržuje na najnižšj možnej hodnote. Regenerácia nukleozid-trifosfátov z nukleotid-donorových cukrov umožňuje používať katalytické množstvá nukleotidov, čím sa účinne eliminuje nežiadúca inhibícia aktivity glykozyltransferázy. Regenerácia nukleotidov na zaistenie vysoko energetických väzieb nukleot.id-fukozyl-donorových molekúl vyžaduje, aby reakčné podmienky podporovali ako enzymatickú reakciu vyvolanú pyruvátkinázou, tak aj enzymatickú reakciu vyvolanú guanizín-5 '-difosŕofukóza pyrofosforylázou. Príklad recyklačného systému je znázornený na schéme 12, nižšie.

Schéma 12

HO

OH

Csipi JCIcNAc

NADP

NADPH

óthydJO£cr.2ja 'X tzoprcpsnol iceton

- 45 Tieto aktivované donorové monosacharidové regeneračné systémy podporujú reakcie s glykozyltransferázou. Regeneračné systémy zahrnujú aktivovaný donorový monosacharid a enzýmy pre regeneráciu aktivovaného nukleotid-cukorného donora zo zodpovedajúceho fosfátového donora, nukleotidu a cukorného donora. Enzýmy v tomto regeneračnom systéme zahrnujú kinázy, ako je pyruvát kináza, acetyl kináza e 1,6-difosfofruktokináza a nukelotid-cukor-pyrofosforylázy, 8ko je GDP-Fuc-PP. Fosfátové dohory zahrnujú PEP, acetylfosfát a D-fruktóze-l_Ť6-difosfát.

Niektoré fosfátové čonory môžu inhibovať aktivitu iných enzýmov v tomto systéme, a preto by donory mali byť vyberané starostlivo. Nukleotid, ktorý je fosforylovaný kinázou by mal byť tak, aby fungoval ako vhodný substrát pre nukleotid-cukor-pyrofosforylázu.

Vyššie popísaný regeneračný systém môže byť inhiobvaný mechanizmom spätnej väzby, v prípade, že koncentrácia anorganického pyrofosfátu (difosfátu) je nadmerná. Tento problém sa dá odstrániť použitím katalytických množstiev anorganických pyrofosfatáz.

E. Sialylové Lewisove ligandy

Prednostnými konečnými produktmi, ktoré sa získávajú spôsobmi uvedenými v tomto popise, sú farmaceutický účinné uhľohydráty. Tieto produkty 'zahrnujú sialylové Lewisove ligandy (pozri schémy 1 a 13). Skupinou R v sché me 13 môže byť atóm vodíka alebo anorganická skupina X, ako už bolo uvedené vyššie. Sialylové Lewisove ligandy sú definované ako akékoľvek zlúčeniny, ktoré sa viažu k selekčnému receptoru (pozri Polley et al., Proc. Natl. Acat. Sci. USA, 88: 6224 až 6228 (1991)). Pre tieto ligandy sú typické ich terminálne štruktúry obsahujúce sialovú kyselinu a fukózu, ktoré sa nachádzajú v glykorpo- 46 texnoch a glykolipidoch. Tieto ligandy zahrnujú v prírode sa vyskytujúce ligandy sialyl Le^x (SLe^x) a sialyl Le⁸ (SLe⁸). Tieto ligandy áalej zahrnujú tiež neprirodzené analógy, ktoré sa podobným spôsobom viažu k prírodným receptorom ligandov. Tak napríklad, analógy ligandov sa dajú vyrobiť s akceptorovými oligosacharidovými analógmi pre glykozyltransferázy. Niekoľko analógov akceptorov je dobre známych a zahrnujú nepriklad deoxygénované oligosacharidy, ktoré sú popísané v Hindsgaul et al., J. Biol. Chem., 266: 17858 až 17862 (1991).

NcuAca2JGaipi.4GlcNAcpOR

Analógy ligandov sa ľahko vyrábajú použitím vyššie popísaných reakčných metód a ľahko sa skúšajú použitím skúšky, ktorá je popísaná Óalej. Tak napríklad, receptory rozoznajú ligand, ktorý bol modifikovaný z prirodzeného stavu epimerizačnou reakciou (z GlcNAc na GalNAc) alebo zmenou orientácie jednej z glykozidových väzieb (konverzia väzby £2,6 na fb>2,6). Príklady vhodných postupov sú uvedené óalej.

Galektozylácia k

Boli vyvinutá dva multienzýmové systémy pre syntézu LacNAc s in situ regeneráciou kofaktora. Vychádza sa z Glc-l-P a používa sa UDP-Glc pyrofosforyláza (EC 2.7.7.9., UĽPGP) a UĽP-Gal 4-epimeráza (EC 5.1.3.2., UĽPGE) (Wong et al., J. Org. Chem., 47: 5416 (1982);

Auge et al., Carbohydr. Pes., 151: 147 (1986); Thiem et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30: 1163 (1991); Thiem et al., Synthesis, 141 (1992)), Tento postup je znázornený v schéme 14 a používa sa pri ňom NAcGlc(K)alyl (zlúčenina 40, X predstavuje 0-al.yl), ako ilustratívny akcep• tor pre GalT. UDP-galaktóza sa vytvára z UĽP-Glc pomocou UĽPGE. Táto rovnováha však favorizuje tvorbu UĽP-Glc a Glc-l-P musí byť vyrábaný separátne. Glc-l-P môže byť pripravený použitím fosfitylačnej reakcie uvedenej v tomto popise.

- 49 Schéma 14

Druhý systém používa Gal namiesto Glc-l-P, ako donorový prekurzor a UDPGP gelaktokinázu (GK; EC 2.7.1.6.) a Gal-l-P uridyltransferázu (Gel-l-P UT; EC 2.7.7.12.). Tento systém je znázornený v schéme 15 pri použití l-^^C-Gal, ktorý je v schéme ilustrovaný vyšrafovaným krúžkom v polohe 1. GK je špecifická pre gslaktózu a umožňuje priamo tvorbu Gal-l-P, ktorý sa prevádza na UDP-Gal s Gal-l-P UT a UEP-Glc. Bolo dokázané, že nsposledv uvedený systém je vhodný pre výrobu (Gal-l-^^C)-LacNAc.

ΓΓομ

Reakcia pri použití multienzýmového systému (schéma 15) vychádza z l-^^C-Gal (99 % etórn., výrobok firmy Isotec Inc., Miamisburg, OH, USA), GlcNAcpOalyl (zlúčenina 40) (Lee et al., Carbohydr. Res., 37:: 193 (1974)), fosfoenolpyruvátu (PEP) a katalytických množstiev Glc-1-P, ATP a UDP. UDP sa prevedie na UTP pomocou pyruvát kinázy (PK; EC 2.7.1.40) a PEP, a UTP zreaguje s Glc-l-P za katalýzy UDPGP, za vzniku UDP-Glc. Vedľajší produkt, anorganický difosfát (pyrofosfát) (PPi) sa rozloží anorganickou pyrofosfatázou (PPáza; EC 3.6.1.1.) použitím Gal-l-P UT, UDP-Glc zreaguje ¹^C-Gla-l-P, vzniknutým z ^c-Gal a ATP za prítomnosti GK a tým vznikne UDP-^^C-Gal a Glc-l-P. ^^C-Gal látky UĽP-^^C-Gal sa prenesie na akceptor (GlcNAcfbQalyl) pomocou GalT, za vzniku zlúčeniny LacNAcf^Oalyl obsahujúcej zvyšok (Gal-l-^^C) (zlúčenina 41). Vytvorený UEP sa opäť prevedie na UTP reakciou PK a PEP a ten zreaguje s uvoľneným Glc-l-P, za vzniku UDP-Glc. Použitím tohto multienzýmového systému sa v 54% výťažku získa (Gal-l-^c)-LacNAcf>Oalyl. Rovnaký postup sa tiež použije pri príprave nezančeného LacNAc a jeho analógov. V tejto schéme sú ilustrované príklady takýchto analógov (zlúčeniny 41a a 41c).

Sialylácia

Multienzýmový sjstém pre sialyláciu začína svoju činnosť s NeuAc, (Gal-l-^^C)-LacNAcpOal.yl, PEP a katalytickými množstvami ATP a CMP, ako je to zrejmé z nasledujúcej schémy 16. CMP sa prevedie na CDP, pomocou nukleozidmonofosfát kinázy (EC 2.7.4.4,NMK) za prítomnosti ATP, ktorý bol regenerovaný zo svojho vedľajšieho produktu AĽP za katalýzy PK v prítomnosti PEP, potom na CTP s PEP pomocou PK. CTP sa potom nechá reagovať s NeuAc použitím CMP-NeuAc syntetázy (EC 2.7.7.43), za vzniku CMP-NeuAc. Vedľajší produkt PPi sa hyórolyzuje na Pi pomocou PPázy.

- 52 Sial.ylácia LacNAcf^Oalyl sa uskutoční pomocou CMP-NeuAc a j;2,3sialyltransf erázy (cí2,3Si8t; EC 2.4..99.6). Uvoľnený CMP sa opäť prevedie na CLP, CTP a nakoniec CMP-NeuAc Použitím tohto systému sa pripraví (Gal-l-^^C)NeuAc<A2,3Gal^l,4GlcNAcflOalyl (zlúčenina 42), ako aj neznačený tri sacharid.

r»

O u

- 54 Zaujímavé je, že laktál (Galp»l,4Glukál) je tiež dobrým substrátom pre c<2,3SieT a umožňuje syntetizovať v 21½ výťažku KeuAc^2,3Gal|l·!,4Glukál (zlúčeninu 43, znázornenú v schéme 16). Laktál sa priprsví buď chemicky (Kaworth et al., J. Chem. Soc., 2644 (1930)) alebo enzymaticky použitím GalT a glukálu (Gautheron-Le Narvor,

C. et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); ’Vong C.-H. et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 8137 - 8245 (1991)). Oligosscharid obsahujúci gl.ykál, ako zlúčenina 43, sa mcže previesť na iné sialyl Le^x deriváty použitím chémie vyvinutej Danishefskym a ďalšími (Griffith et al. , J.

Am. Chem. Soc., 112: 5811 (1990); Halcomb et al., J. Am. Chem. Soc., 111: 661 (1989); Kessler, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 29: 425 (1990); Thiem et al., Synthesis, 696 (1978)). Zlúčenina 43 sa tiež môže halogénhydratovať, ako to bolo uvedené vyššie, za vzniku 2-halogén-2-deoxy-Glc-derivátov.

Pri použití podobného postupu, ako je postup znázornený v schéme 16 sa pomocou <ς2,ósialyltransferázy (EC 2.4.99.1) získa z východiskového akceptorového kerbohydrátu Gal^l,4GlcNAc v 22% výťažku NeuAc<2,6Gal(51,4GlcNAc, po dvojdennej reakcii pri teplote miestnosti,

Fukozylácia

Pre fukozyléciu použitím stechiometrického množstva GDP-Fuc (99 % atóm., výrobok firmy Isotec Inc., Miamisburg, OH, USA) sa použije klonovaný humánny enzým (pozri schéma 17, nižšie).

Schémy 17

Ι-Η

NIlAc

- 56 Fukozyláciou sialyl LacNAcfVOalyl (zlúčeniny 42) sa získa sialyl Le^x (zlúčenina 44) po purifikácii na silik8géli a BioGéli P-2. LacNAcfOalyl (zlúčenina 41) a sialyl-glykál (zlúčenina 43) sa tiež fukozylujú, za vzni ku Le trisacharidu (zlúčenina 45) s sialyl Le glykálu (zlúčeniny 46). Naposledy uvedené dve zlúčeniny sú znázornené v schéme 16. Zaujímavé je, že £l,3-FucT a <ς1,3/4FucT prijímajú Galp>l,4(5-tio)Glc, za vzniku (5-tio)GlcLe^xanalógu, Galf>l,4(FuoAl,3)-(5-tio)Glc, ako je to znázornené v schéme 18 dalej.

Schéma 18

Čo sa týka in situ regenerácie GĽP-Fuc, bola najprv vyskúšaná konverzia Ivían-l-P na GĽP-Fuc, cez GĽP-Man, na základe biosyntetickej dráhy GĽP-Fuc v mikroorganizmoch (pozri schéma 19). Pod označením Akceptor-OH'· sa v schémach 19 a 20 rozumie hydrox.ylová skupina uhľohydrátového akceptorového substrátu, aké sú napríklad zhrnuté v tabuľke 2 uvedenej vyššie.

nina 44 zo schémy 17. Alternatívne môže byť prítomný enzým FucT a prekurzor fukozylového donora, ako je fukóza, môže byť vynechaný. Podobne môže byť prítomná fukóza bez svojho fosforylačného enzýmu, fukóza kinázy.

F. Ľerivatizécia fukozylovaných produktov, za vzniku ligandov

Fukozylované produkty, ktoré boli popísané vyššie, sú haptány, ktoré najlepšie fungujú ako Ugandy, keá sú viazané k väčším zvyškom. Takéto zvyšky zahrnujú proteíny, glykiproteíny, glykolipidy a nebiologické anelógy takýchto molekúl. Obvykle je redukujúci koniec cukru pripojený k voľnej emínovej alebo merkaptánovej skupine prostredníctvom glykozidovej vazbv. Pre výrobu viacmocných makromolekúl sú užitočné lipozómy. Pre výrobu lipozómov existujú rôzne metódy, ktoré sú napríklad popísané v Szoka et al., Ann. Pev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980) a US patentoch č. 4 235 871; 4 501 728 a 4 837 028.

G. Skúšanie aktivity sialylovaných Lewisových ligandov

Jedno uskutočnenie tohto vynálezu sa týka výroby sialylovaných Lewisových antigénov, ako v prírodnej forme, tak vo forme simulovanej alebo vo forme analógov.

Tieto antigény majú svoju úlohu pri medzibunkovej adhézii a uplatňujú sa.pri zápaloch a iných chorobných stavoch človeka a ciesvcov. Na uľahčenie tvorby týchto antigénov použitím tohto vynálezu je užitočné skúšať výsledné produkty na ich schopnosť viazať sa k receptorom pre prírodné sialylvoé Lewisové antigény, ako sú receptory ELAM a GMP 140. Takéto skúšky boli podrobne popísané v Polley et al., Proc. Natl. Acat. Sci. USA, 88: 6224 až 6228 (1991) a Phillips et al., Science, 250: 1130 až 1132 (1990).

Aj kek je k dispozícii red rôznych skúšok, pri prednostnom stanovení sa meria schopnosť antigénu blokovať alebo inhibovať väzbu buniek nesúcich vhodné receptory adhézie a buniek exprimujúcich zodpovedajúci sialylový Lev.’isov antigén. Väzba sa sleduje vizuálne pod mikroskopom. Prednostnými bunakmi exprimujúcimi receptor sú aktivované krvné doštičky a endoteliálne bunky. Receptory tvoria súčasť skupiny označovanej nýzvom selektíny alebo LEC-CAM a zahrnujú LEC-CAM-1, ELAM-1, GMP-140 a CD-62. Ligandy sa nachádzajú na neutrofÍloch, monocytoch a nádorových bunkách.

Pri typickej skúške sa neutrofily izolujú tak, že sa heparinizovaná krv navrství na deliace médium Mono-Poly Resolving Médium (Ficoll-Hypaque-Flow Laboratories) a potom sa uskutoční 25 minútová centrifugácia pri frekvencii otáčania 2000 min”'¹' a kalej 25 minútová centrifugácia pri frekvencii otáčania 2500 min”^.

Doštičky sa dajú izolovať po vykonaní popísaného postupu. Krv sa odoberie normálnemu humánnemu darcovi injekčnou striekačkou obsahujúcou antikoagulant ACD (dextróza, 2,0 g; citran sodný, 2,49 g a kyselina citrónová, 1,25 g; pričom zmes je doplnená destilovanou vodou do 100 ml) v pomere šesť dielov krvi na jeden diel 8ntikoagulantu. Krv sa odstredí pri frekvencii otáčania 600 min^_l (približne 90 x g) počas 15 minút pri teplote miestnosti. Supernatant sa zachytí a odstrekuje pri frekvencii 1200 min“^ (približne 400 x g) počas 6 minút. Supernatant sa oddelí a opäť centirfúguje pri frekvencii otáčania 200 min ¹ (1200 x g) počas 10 minút, aby došlo k peletizácii doštičiek. Doštičková peleta sa 2x premyje pufrom Tyrode-HEPES s pH 6,5 (chlorid sodný, 8,0 g; chlorid draselný 0,02 gf monohydrát dihydrogenfosforečnanu monosodného, 0,057 g; hexahydrát chloridu horečnatého, 0,184 g; hydrogenuhličitan sodný, 0,1 g; dextróza, 1,0 g; a HEPES,

- 63 2,383 g; pričom vzniknutá zmes ss doplní ηε 1 1 destilovanou vodou a jej pH sa IN roztokom hydroxidu sodného upraví na 6,5) e potom sa raz premyje v PI3S. Doštičky sa suspendujú v PBS na koncentráciu 10 /ml a aktivizujú sa 20 minútovou inkubáciou pri teplote miestnosti s trombínom pri výslednej koncentrácii 0,25 U/ml.

Pri uskutočňovaní skúšky sa 20 /ul suspenzie došQ / tičiek (2 x 10 /ml) umiesti do Eppendorfovej centrifugačnej rúrky. Do rúrky sa pridá rovnaký objem oligosacheridových prípravkov s koncentráciami v rozmedzí od 200/Ug/ml do 0,3/Ug/ml alebo glykolipid-lipozómových prípravkov (pripravených vyššie popísaným spôsobom) pri koncentrácii v rozmedzí od 2 do 0,25/Ug/ml a rúrky sa nechajú stáť pri teplote miestnosti počas 20 minút. Potom sa do rúrok pridá 20/Ul neutrofÍlového prípravku (2 x 10^/ml) a rúrky sa nechejú stáť dalších 20 minút pri teplote miestnosti .

Adhézia aktivovaných doštičiek k neutrofilom sa stanovuje mikroskopicky. Obvykle sa na hodnotenie používa 100 neutrofilov. Adhézia je považovaná za pozitívnu, ak sú spojené dve alebo viac doštičiek a za negatívnu, ak sú viazané menej než 2 doštičky.

H. Zlepšený postup výroby glykozyl 1- alebo 2-P

Fosforylované cukry obsahujúce fosfátový zvyšok na anomérnom atóme uhlíka (l- alebo 2-poloha) sú cenné ako medziprodukty pri tu popísaných reakiách s niekoľko z nich je predmetom obchodného využitia. Tento vynález umožňuje tiež zlepšený spôsob selektívnej fosforylácie tohto uhlíkového atómu monosacharidu. Tento zlepšený spôsob zahrnuje použitie trojmocného fosfitvlačného činidla pre prenos fosfitylového zvyšku na požadovaný atóm uhlíka. Výsledný fosfit sa potom používa na výrobu zodpove- 64 dejúceho fosfátu, ktorý ss potom používs pri enzymatickej reakcii podľa vynálezu.

Blokovaný f osf it.^lmonosacharid má štruktúru, ktorá sa dá vyjadriť všeobecným vzorcom 1

	0 -°-R’ z \ _r0'P'
•	(R3-CH)„ χ o-r, \1γΒ<
>	1 í X X
kde	Ŕ2 Ŕ2

každý zo symbolov

Rl>	ktoré sú rovnaké alebo rôzne, predstavuje ar.ylskupinu, ako je fenylskupina, benzylskupina alebo nižšia alkylskupina s 1 až 5 atómami uhlíka;
x	nezávisle predstavuje kyslík alebo dusík;
«2 •	nezávisle predstavuje acylovú, benzylovú, silylovú alebo alkvlovú blokovaciu skupinu alebo
x-r2	chýba a je nahradený atómom vodíka,
R3	nezávisle predstavuje atóm vodíka, metylskupinu, skupinu so všeobecným vzorcom -OR2, -CH2OR2, -ch(or2)-ch(or2), -ch(or2)-ch(or2)~ch(or2), aminoskupinu alebo skupinu -NHR2;
R4	predstavuje atóm vodíka, karobxyskupinu, alkylskupinu s 1 až 5 atómami uhlíka alebo benzylskrboxylátovú skupinu; a
n	predstavuje číslo 1 alebo 2, prednostne 2.

- 65 Blokované fosfitylmonosacharidy teda zahrnujú deriváty sialovej kyseliny, KĽO, KĽN a podobné zlúčeniny, v ktorých R^ predstavuje karboxylovú alebo karboxyesterovú skupinu. V prednostnej skupine zlúčenín so všeobecným vzorcom I predstavuje R^ atóm vodíka. V tomto prípade prechádza všeobecný vzorec I na všeobecný vzorec II, kde R₁, R₂> ^R3»

I I

Rj R2

X a n majú

O-R,

O-R, vyššie uvedený význam.

(II)

Ako už bolo uvedené vyššie, jednotlivé skupiny R^ môžu byť rovnaké alebo rôzne. To vyplýva z toho, že sa fosfitvlsčné činidlo môže pripravovať reakciou chloridu fosforitého so sekundárnym emínom, ako je diizopropylamín a dvomi molmi alkoholu. Ked má teda alkoholická časť reakčnej zmesi povahu zmesi, môže sa pripraviť fosfitylačné činidlo a fosfit, ktoré obsahujú dve rôzne skupiny Rj| , ako napríklad benzylskupinu a etylskupinu. Prednostne sú obidve skupiny R^. rovnaké a najvýhodnejšie obid ve predstavujú benzylskupinv alebo fenylskúpiny, kedže tieto skupiny ss dajú odstraňovať hydrogenolýzou.

Ako už bolo takisto uvedené vyššie/ každý zo ^symbolov X môže predstavovať atóm kyslíka alebo atóm duskíka a do rozsahu zlúčenín so všeobecným vzorcom I spadajú predovšetkým zlúčeniny obsahujúce obidve tieto skupiny, ako je blokovaný sialyldibenzylfosfát, zlúčenina 97. Blokovacími skupinami R^ ^môžu byť acylskupiny, ako napríklad acylskupina s 1 až 5 atómami uhlíka, ako je formyl, acetyl, pivaloyl a pentano.yl, benzoylskupiny a ftaloylskupiny, alkylové blokovacie skupiny a silylové skupiny. Ako prík66 ledy alkylskupín sa dajú uviesť alkylskupiny s 1 až 5 atómami uhlíka, 8ko je metyl, etyl, izopropyl, terc.butyl. cyklopentyl e pentyl. Acetály a ketá'Ly, vytvorené z dialkylketónov s 1 až 5 atómami uhlíka v alkylovom zvyšku alebo aldehydov, ako napríklad prednostne z acetónu a formaldehydu, môžu takisto vytvárať alkylové blokovacie skupiny. Vhodná blokovacia skupina acetalového typu môže byť tiež vytvorená z benzaldehydu. Ketalové a acetalové skupiny sú dobre známe blokovacie skupiny v chémii sacharidov. Ako príklady vhodných silylových blokovacích skupín sa dajú uviesť trialkylsilylskupiny s 1 až 5 atómymi uhlíka v alkylovom zvyšku, ako je trimetylsilyl, terc.butyldimetylsilyl a pod., alkyldifenylsilylové blokovacie skupiny s 1 až 5 atómami uhlíka v alkylovom zvyšku, ako je difenylmetvlsilyl, dielkylfenylsilylové blokovacie skupiny s 1 až 5 atómami uhlíka v alkylovom zvyšku, ako je fenyldimetylsilylová e trifenylsilylová blokovacia skupina.

Obvykle sa dáva prednosť tomu, aby všetky blokovacie skupiny boli rovnaké alebo, pokiaľ sú rôzne, aby sa dali selektívne odštepovať za rôznych podmienok. Tak napríklad, benzylskupiny sa dajú odštepovať za prítomnosti acetylskupín hydrogenolýzou, zatiaľ čo acetylskupina sa dá odštiepiť za prítomnosti benzylskupiny pôsobením primárneho amínu, ako je benzylamín. Acetylskupina je osobitne vhodnou blokovacou skupinou, keÓže O-acetvlskupina v anomérnej polohe (1- alebo 2-polohe) sa môže ľahko odštiepiť za prítomnosti iných O-acetylskupín v iných polohách kruhu, pôsobením primárneho amínu.

Tiež je potrebné si všimnúť, že zoskupenie X-I^ môže chýbať a môže byť nahradené atómom vodíka. Pokiaľ to tak je, je blokovaným monosacharidom deoxymonosacha- 67 rid a príkladmi takýchto látok sú zlúčeniny 97 a 101 až 113.

Tiež je potrebné chápať, že pokiaľ vo všeobecnom vzorci I n predstavuje číslo 2, ako sa tomu dáva prednosť u cukrov so šesťčlenným kruhom, obidve skupiny Rj-CH nemusia byť rovnaké a obvykle sú odlišné. Tak napríklad, v blokovanom fukozylfosfite, zlúčenine 8, o ktorej bola reč vyššie v súvislosti so schémou 6, jedna skupina R^ predstavuje metylskupinu, zatiaľ čo druhá predstavuje O-acetylskupinu (OAc). Podobne, v prípade blokovaného monozylfosfátu, zlúčeniny 16, o ktorej bola reč v súvislosti so schémou 9, jedna skupina R^ predstavuje skupinu CH^OAc, zatiaľ čo druhá predstavuje skupinu OAc.

Všeobecný vzorec I sa dá alternatívne vyjadriť ako všeobecný vzorec IA

R,

Πχ

P-R,

O-Rr (IA)

X..

m n₂ (CH),

X

Ŕ₂ kde každý zo symbolov

R-p ktoré sú rovnaká alebo rôzne, predstavuje arylskupinu, ako fenylskupinu, alebo benzylskupinu alebo nižšiu alkylskupinu s 1 až 5 atómami uhlíka;

X nezávisle predstavuje atóm kyslíka alebo atóm dusíka;

R₂ nezávisle predstavuje scylovú, benzylovú, silylovú, alebo alkylovu blokovaciu skupinu alebo

X-R₂ cbýba a je nahradený atómom vodíka;

R^ nezávisle predstavuje atóm vodíka, metylskupinu, skupinu so všeobecným vzorcom -C^, -CH2OR2, -CH(OR₂)-CH(OR₂) alebo -CH(OR₂)-CH(OR₂)-CH(OR₂);

R4 predstavuje atóm vodíka, karboxyskupinu, alkylskupinu s 1 až 5 atómami uhlíka alebo benz.ylkarboxylátovú skupinu; a m predstavuje číslo O alebo 1, takže kecí m predstavuje číslo 0, skupina (CH-X-R₂) chýba a vzniká päťčlenný kruh a keó m predstavuje číslo 1, je skupina (CH-X-R2) prítomná a monosacharid má šesťčlenný kruh, čomu sa dáva prednosť.

Zo zlúčenín so všeobecným vzorcom IA sa, ako už bolo uvedené, dáva prednosť blokovaným monosacheridovým fosfitom, v ktorých má monosacharid šesťčlenný kruh. Tieto zlúčeniny sa dajú vyjadriť všeobecným vzorcom IB

Ŕ₂ (IB)

- 69 kde Rp R2, Rp R4 2 X majú význam uvedený vo všeobecnom vzorci IA.

Ako už bolo uvedené, dáva sa prednosť takým zlúčeninám so všeobecným vzorcom I, v ktorých R^ predstavuje atóm vodíka, tj. zlúčeninám so všeobecným vzorcom II, ktoré sa dajú tiež vyjedriť všeobecným vzorcom IIA, uvedeným cíalej. Z nich potom sa dáva prednosť zlúčeninám obsahujúcim blokované monosscharidy so šesťčlenným kruhom (m = 1) a v tomto prípade prechádza vzorec IIA na vzorec IIB.

O '⁰“^Rl _D

O-R,

(CH ' 1 X

Ŕ, (IIA) kde Rp R£, Rp m a X majú význam uvedený vo všeobecnom vzorci IA.

S výnimkou rozdielov uvedených v definíciách skupiny R vo vzorcoch I, II, ΙΑ, IB a IIA, je totožnosť sku pín X, acylskupín, silylskupín, alkylskupín 8 podobných skupín v týchto vzorcoch rovnaká.

Trojmocné fosfitylačné činidlá reakčné už boli definované vyššie. Dostupné trojmocné fosfitylačné činid lá zahrnujú dibenzyl-N,N-dietylfosforoamidit, 2-kyanoetyl-N,N,N',N‘’-tetrsizopropylfosforoamidit alebo 2-kyanoetyl-N,N-diizopropylchlórfosforoamidit.

Spôsob výroby blokovancýh monosacharidových fosfitov z nesubstituovaného (neblokovaného) monosacharidu predstavuje viacstupňový postup, ktorý vychádza z akéhokoľvek monosacharidu (8ldóz,y alebo ketózy, bez obmedzenia na určitú konformáciu alebo orientáciu). Monosacharid sa najprv blokuje na všetkých hydroxylových (alebo emínových) skupinách použitím štandartných reakčných činidiel na zavádzanie blokovacích skupín, ako sú ecylové, benzylové, silylové alebo alkylové skupiny, uvedené vyššie. Potom sa blokovacia skupina, obvykle acylskupina s 1 až 5 atómami uhlíka, 8lebo benzylskupina v 1- alebo

2-polohe selektívne odštiepi použitím buá lipázy z podžalúdkovej žľazy prasaťa alebo elkyl- alebo benzylemínu V névodnom polárnom rozpúšťadle, ako je tetrahydrofurán alebo dichlórmetán. Potom sa uskutoční fosfitylácia trojmocným fosfitylačným činidlom v 1- alebo 2-polohe za anaeróbnych podmienok, použitím aromatického sekundárneho alebo terciárneho amínu, ako kondenzačného Činidla, napríklad 1,2,4-triazolu, imidazolu, tetrazolu alebo pyridínium-p-toluénsulfonátu. Z kondenzačných činidiel sa v súčasnej dobe dáva prednosť triazolu alebo tetrazolu. Vzniknutý produkt sa potom oxiduje takým oxidačným činidlom, ako je peroxid vodíka alebo terc.butylhydroperooxid. Výsledná fosfor.ylová skupina sa zbaví chrániacej skupiny, za vzniku soli kyseliny fosforečnej (napríklad sodnej soli) použitím redukcie pomocou vodíka za prítomnosti paládia, pokiaľ sa spracúva benzylderivát, alebo alkalic8lkalického spracovania, pokiaľ sa spracúva 2-kysnoetylderivát.

Použitím vyššie uvedenej reakcie sa dá teda pripraviť rad monoglykozylfosfitov a zodpovedajúcich fosfátov. Fosfátové zlúčeniny, uvedené ako príklady, boli pripravené z 2-acetamido-2-deoxy-B-galsktózy (GalNAc, zlúčenina 85), 2-acetamido-2-deoxy-B-glukózy (GlcNAc, zlúčenina 90), B-galsktózy (Gal, zlúčenina 91), D-glukózy (Glc, zlúčenina 92), B-manózy (Man, zlúčeniny 18 a 93), L-remnóz.y (RHA, zlúčenina 94), L-fukózy (Fuc, zlúčenina 5) o N-ecetylneuramínovej kyseliny (NeuAc, zlúče71 nina 99) tieto reakcie sú znázornené v schémach 21 až 23. Spôsobom ilustrovaným v schéme 23 bol tiež vyrobený fosfit 2-ft8limidoyl-2-deoxy-Ľ-glukóza-3,4,6-triecetátu (zlú čenina 100), približne vo výťažku 90 %.

Schéma 21

Schéma 23

OH	(BnOkPNEi,	AcO OAc	OPíOSaíj	t-BuOnH
AcO^7 0 Y* COOMe AcO	7KF	AcHH — AcO	'T'COOMe.	Tnr
96		97

V tabuľke 4, ktorá nasleduje, je uvedená totožnosť rôznych skupín R (R , R , R a R ), ktoré figurujú vo vyššie uvedených schémach. V tabuľke 5 sú uvedené výťažky a pomery anomérov pre rôzne zlúčeniny uvedené v schémach 21 až 23 a tabuľke 4.

Zistilo sa, že rozpúšťadlá ovplyvňujú pomer anomérov vo fosfitvlovaných produktoch. Tak napríklad, pokiaľ bola zlúčenina 70 získaná fosfityléciou tetrahydrofuránu, zistené pomer izomérov *;:(*> bol 1:6, zatiaľ čo použitím chloroformu sa tento pomer zmenil na 1:2.

Tabuľka 4 Pre schémy 21 a 22

Zl. *	R1	R2	R3	R4	Zl .*	Rl	R2	R3	R4
61	H	NHA	OA	H	79	OA	H	H	OA
					80	H	OA	OA	H
62	H	NHA	14	OA
					8 1	Oáz	H	H	OA
63	H	OA	OA	n
					8 2	H	NHA	Oáz	H
64	H	OA		OrZ
65	OA	K	u	Oáz	83	H	NHA	H	OA
					8 4	H	OA	OA	H
66	H	Oáz	ΟΛζ
					» c	H	OA	H	OA
67	Oáz	H	E	Or<z
					8 6	OA	H	H	OA
68	H	NHA	Oáz
69	H	NHA	H	Oáz	87	H	OA	Oáz	H
70	H	OA	OA	u	88	OA	H	H	OA
					8 9	H	NHA	OH	H
7 1	H	Oáz	E	Oa
72	Oáz	jj	M	OAc	90	u	NHA	H	OH
					9 1	E	OH	OH	U
73	K	Oáz	O.-c	n
74	Oáz	K	H	OA	92	H	OH	H	OH
75	H	NHA	OA	H	93	OH	H	H	OH
76	H	NHA	«V	OA	94	v	OH	OH	H
77	H	OA	OA	H	95	OH	H	H	OH
78	H	Oáz	H	OA

Zl zlúčenina

Tabuľka 5

Pomery snomérov a výťažky chemických reakcií v jednotlivých stupňoch v schémach 21 až 23

Zl*	<£;p>	Výťažok (%}	Zl*		Výťažok
68	len λ	71	86	3:1		98
69	len <	83	87	6:1		98
70	2:1	81	99	len		64
71	3:1	85	90	len	di	39
72	len	87	91	1:2		42
73	18:1	88	92	1:4		59
75	7,4:1	47	93	3:1		72
76	len j.	93	94	6:1		76
77	1:2	88	97	len	t	68
78	1:4	97
79	3:1	80	98	len	f-	95
80	6:1	97	99	len		99
82	len <<	93
83	Len <	97
84	1:2	94
85	1:4	98

*Z1. - zlúčenina

- 76 Je potrebné si všimnúť, že zlúčeniny vo vyššie uvedených schémach a tabuľkách zahrnujú deriváty manóz.y s fukózy, ktorým boli v predchádzajúcej diskusii pridelené rôzne čísla. Kvôli zjednodušeniu prezentácie dát boli tieto zlúčeniny prečíslované. V príkladoch, ktoré sú uvedené áelej, sú uvedené obidve pridelené čísla.

Reakciami, ktoré sú znázornené v schéme 23 je tie možné syntetizovať niekoľko čalších špecifických monosachar idkarbox.ylátov so všeobecným vzorcom I. Tieto zlúčeniny sú príbuzné D-sialovej kyseline (zlúčenina 101). Da L-KĽN a Ľ- a L-KDO. Štruktúry metylesterových (Me) čie nov súboru týchto zlúčenín, kde R₂ predstavuje acetylsku pinu a R^ predstavuje benzylskupinu, sú uvedené čalej (zlúčeniny 101 až 113). Substrátové monosacharidkarboxyláty sa dajú vyrobiť reakciami katalyzovanými kyselina sialová-aldolázou, ako je to uvedené v Gautheron-Le Narvor et al., J. Am. Chem.. Soc., 113: 7816 (1991) a Sugai et al., J. Am. Chem. Soc. - v tlači.

AcO

OAc

113

OPíOBn),

Vo vyššie uvedenom texte je uvedený prehľad vynálezu a vodítko na spájanie reakcií prebiehajúcich použitím fukozlytransferázy s reakciami, pri ktorých ss vyvíja energia a ktoré prebiehajú za prítomnosti katalytického množstva nenákladných nukleotidov a s reakciami prebiehajúcimi použitím iných transferáz. Nasledujúce príklady slúžia na objasnenie podrobností tohto vynálezu. Tieto príklady mejú výlučne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú. Odborníkom v tomto obore je zrejmé, že mnohé parametre nie sú kritické 8 dajú sa meniť.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Chemická syntéza fukóza-l-fosfátu (schéma 5 e 6) (a) 1,2,3,4-tetrs.O-benzoyl-L-fukóza (Zlúčenina 2)

Benzoylchlorid (21,4 g, 152,3 mmol, 17,7 ml) sa prikvapká k ochladenému roztoku L-fukózy (5,0 g, 30,5 mmol) v pyridíne (100 ml) pri teplote 0 až 5 °C a zmes sa Čalej mieša 3 hodiny pri teplote mistnosti. Potom sa zmes naleje do ľadovej vody a extrahuje etylacetátom ( EtOAc). Extrakty sa postupne premyjú, ľadovou chaldnou zriedenou kyselinou chlorovodíkovou, vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného nasýteným roztokom chloridu sodného, vysušia sa bezvodým síranom horečnatým a skoncentrujú sa. Produkt sa bez čistenia použije v äslšom stupni.

(b) Eibenzylfosforyl-2,3,4-tri-O-benzoyl-fy-L-fukozid (zlúčenina 4)

- 79 K ochladenému roztoku zlúčeniny 2 (2,0 g, 3,44 mmol) v dichlórmetáne (20 ml) a acetsnhydride (2 ml) sa prikvapká 30% kyselina brómovodíková v kyseline octovej (V priebehu 8 minút) pri 0 až 5 °C a zmes sa 2 hodiny mieša pri teplote miestnosti. Potom sa zmes naleje do ľadovej vody a extrahuje sa etylacetátom. Extrakty sa postupne premyjú vodou, vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, nasýteným roztokom chloridu sodného, vysušia sa bezvoóým síranom horečnatým e skoncentrujú sa. Získa sa zlúčenina so všeobecným vzorcom III, ktorá sa bez čistenia použije v äalšom stupni.

¹H NMR (CDCl-j) 5: 1,36 (3 H, d, J 6,51 Ήζ, 6-CH₃), 4,69 (1H, br q, J 6,56 Hz, H-5), 5,62 (1H, dd, J 3,91, 10,5 Hz, H-2), 5,84 (1H, dd, J 0,97, 3,33 Hz, H-4), 6,01 (1H, dd, J 3,36, 10,50 Hz, H-3), 6,94 (1H, D, <J 3,92 Hz, H-l); ¹³C NMR (CĽCíp S : 15,8, 68,6, 69,2, 70,4, 69,4, 165,4, 165,6, 165,7.

Uhličitan strieborný (1,90 g, 6,89 mmol) sa pridá k ochladenému (0 až 5 °C) roztoku zlúčeniny 3, dibenzylfosfátu (2,88 g, 10,3 mmol) a molekulárnemu situ 3 (6 g) v zmesi dichlórmetánu, dietyléteru a acetonitrilu (20 ml každého z týchto rozpúšťadiel) v banke s guľatým dnom, zabalenej do hliníkovej fólie, aby sa zatienilo svetlo. Zmes se mieša 10 minút pri teplote miestnosti, potom sa prefiltruje cez celitovú filtračnú podložku a filtrát sa Skoncentruje. Zvyšok sa chromatográfuje na silikagéli použitím zmesi toluénu a etylacetátu (2,5:1), za vzniku zlúčeniny 4 (2,4 g, 95 %) vo forme jediného rpoduktu.

¹H NMR (CĽC1₃) £.:1,35 (1 H, d, J 6,35 Hz, 6,CH₃), 4,225 (1H, br dt, J 5,71, 6,70 Hz, H-5), 4,77 (1H, dd, J 7,07 11,65 Hz, benzyl), 4,86 (lH, dd, J 6,50, 1,63 Hz, benzyl)

5,11 (1H, dd, J 7,51, 11,71 Hz, benzyl), 5,14 (1H, dd,

J 7,27, 11,70 Hz, benzyl), 5,58 (1H, dd, J 3,48, 10,44

Hz, H-3), 5,69 (1H, dd, J 7,37, 7,89 Hz, H-l), 5,76 (1H, dd, J 8,03, 3,44 Hz, H-4), 5,90 (1H, dd, J 8,03, 10,45 Hz, H-2); ^Í3C NMR (CĽCl-j) fc: 16,12, 69,31, 69,35, 69,54, 69,58, 69,63, 69,70, 70,57, 70,83, 71,70, 69,97, 97,00, 127,28, 127,40, 127,89, 128,06, 126,13, 128,26, 128,31,

128,43, 128,56, 128,66, 128,83, 129,06, 129,67, 129,72,

129,77, 129,93, 133,27, 133,41, 133,51, 165,24, 165,45,

165,79, HRMS vypoč. pre C^H-j^PCs (M+Cs⁺) 869,1128, zist. 869,1138.

(c) β-L-fukóza-l-fosŕát (zlúčenina 5)

Zlúčenina 4 (2,32 g, 3,15 mmol) sa hydrogenizuje na 5% paládiu na uhlíku (400 mg) v etanole (60 ml) a za prítomnosti IN roztoku hydrogenuhličitanu sodného (15 ml) počas 10 hodín. Katalyzátor sa odfiltruje cez celitovú filtračnú podložku a k ochladenému roztoku zvyšku vo vode (20 ml) sa pri teplote 0 až 5 °C prikvapká IN roztok hydroxidu sodného (20 ml). Zmes sa mieša 3 hodiny pri teplote miestnosti, potom sa opatrne neutralizuje prídavkom chladnej IN kyseliny octovej na pH 7,5 s nerozpustná látka sa odfiltruje cez celitovú filtračnú podložku. Filtrát sa zriedi na 250 ml a nanesie sa na stĺpec živice Ľowex 1-X8 (v cykle HCO₂) (2 x 15 cm) a elúuje sa stupňovitým gradientom NH^OAc₂, voda (200 ml), O,1M NH₄OAc₂ (200 ml), O,1M NH₄0Ac₂ (200 ml) a 0,3M NH₄OAc₂ (200 ml). Fukóza sa elúuje vodou a požadovaná zlúčenina 5 sa elúuje medzi 0,2 až 0,3M NH₄0Ac₂· Po odstránení soli sa získa zlúčenina 5 (700 mg, 82 %). NMR a. ^³C NMR dáta sú v dobrom súhlase s dátami, ktoré oznámila Bakerova skupina (Nunez et al., Can. J. Chem., 59: 2086 (1981)).

(d) 1,2,3,4-tetra-O-acetyl-L-fukóza (zlúčenina 6)

Zmes L-fukózy (3,0 g, 18,2 mmol) a bezvodého octenu sodného (50 mg, 0,61 mmol) v acetanhydride (20 ml) sa mieša 2 hodiny pri teplote miestnosti a potom sa 2 hodiny zahrieva na 100 °C. Po ochladení sa zmes naleje do ľadovej vody^ mieša sa 2 hodiny a extrahuje sa chloroformom. Extrakty sa postupne premyjú vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vysušia sa bezvodým síranom horečnatým a skoncentrujú sa. Sirupovitá látks, ktorá sa získa ako zvyšok, sa chromatografuje na silikagéli použitím zmesi toluénu a et.ylacetátu (10:1). Získa sa zlú čenina 6 (5,92 g, 98 %) vo forme zmesi a f>izoméru (v pomere 1:7, podľa spektra H NMR).

(e) 2,3,4-tri-O-acetyl-L-fukóza (zlúčenina 7 alebo 74)

i) Chemická metóda

Roztok zlúčeniny 6 alebo 67 (3,0 g, 9,0 mmol) a benzylamínu (1,45 g, 13,5 mmol, 1,47 ml) v tetrahydrofuráne (35 ml) sa mieša 1 deň pri teplote miestnosti. Zmes sa zriedi chloroformom a postupne premyje ľadovo chladnou zriedenou kyselinou chlorovodíkovou, vodným roztokom hydrogenuhličitsnu sodného a vodou, vysuší sa bezvodým síranom horečnatým a skoncentruje sa. Zvyšná sirupovitý látka sa chromatografuje na silikagéli použitím zmesi toluénu a etylacetátu (1:1), ako elučného činidla.

NMR spektrum je v dobrom súhlase so spektrom oznámeným (Hennen et al al., J. Org. Chem., 5'3: 4743 (1988)).

ii) Enzymatická metóda

Suspenzia zlúčeniny 6 alebo 67 (2,5 g, 7,5 mmol) a pankreatickej lipázy z prasaťa (5,6 g) v 13% (obj.) dimetylformemidu vo fosfátovom pufri (50mM, pH 7) sa mie ša počas 5 dní pri teplote miestnosti a v priebehu tejto doby sa hodnota pH upravuje IN roztokom hydroxidu sodné82 ho. Zmes se prefiltruje e filtrát sa extrahuje etylacetátom. Extrakt sa premyje a vysuší bezvodým síranom horečnatým. Čistenie produktu sa uskutočňuje vyššie popísaným spôsobom a získa sa zlúčenina 7 alebo 74 (1,1 g,

48,5 %) vo forme zmesi ä- s [yizoméru (1:1).

(f) Dibenzylfosforyl-2,3,4-tri-O-acetyl-L-fukozid (zlúčenina 9 alebo 88)

Dibenzyl-N,N-dietylfosforoamidát (Pederson et al., Tetrahedron, 47: 2643 (1991)) (2,7 g, 8,5 mmol) sa prikvapká k roztoku zlúčeniny 7 alebo 74 (1,0 g, 3,4 mmol) a tetrazolu (1,0 g, 14,5 mmol) v tetrahydrofuráne (50 ml) pod atmosférou dusíka pri teplote miestnosti a zmes sa 1 hodinu mieša pri teplote miestnosti. K zmesi sa pridá éter (50 ml) a organická fáza sa premyje chladnou zrie denou kyselinou chlorovodíkovou, vodným roztokom hydrogenuhličitsnu sodného a vodou, vysuší sa bezvodým síranom horečnatým a skoncentruje se. Zvyšná sirupovitá látka sa chromatografuje na silikagéli použitím zmesi hexánu a etylacetátu ( v pomere 4:1), za vzniku zlúčeniny 8 alebo 81 (1,43 g, 79 %) vo forme zmesi a β-izoméru

Ί ' (1:10), β-izomér má toto spektrum H NMR:

¹H NMR (CĽC1₃) δ: 1,22 (3 H, D, J, 6,50 Hz, ô-CH-j), 1,91, 1,99, 2,19 (3 H každý, s, 3 x OAc), 3,85 (l H, dg, J 1,00

6,50 Hz, H-5), 4,82 - 4,96 (4 H, m, benzylové protóny), 5,02 - 5,08 (2 H, m, H-2, 3), 5,25 '(1 H, dó, J 0,50, 3,50 Hz, H-4), 5,32 (1 H, dd, J 8,00, 10,50 Hz, H-l).

K ochladenému roztoku zlúčeniny 8 alebo 81 (500 mg, 0,9 mmol) tetrahydrofuránu (50 ml) sa naraz pridá 30% peroxid vodíka (7 ml) a zmes sa nechá ohriať na teplotu miestnosti a 90 minút sa mieša. Potom sa zmes zriedi éterom a premyje sa ľadovo chladným vodným roztokom tio- 83 síranu sodného, vodným roztokom hydrogenuhličitenu sodného a vodou, vysuší ss sírenom horečnetým a skoncetruje sa. Získa sa zlúčenina 9 alebo 88 (420 mg, 81 %). Táto látka sa použije bez čistenia v čalšom stupni. ^H NMR spektrum je v dobrom súhlase so spektrom oznámeným (Schmidt et al., Liebigs Ann. Chem. 191: 121 (1991)).

¹H NMR (CDCl-j) 6: 1,22 (3 H, 3, J 10,0 Hz, 6-CH₃), 1,91, 1,99, 2,19 (3 H každý), s, 3 x OAc, 3,90 (1 H, dg, J 6,50,

7.50 Hz, H-5), 5,00 - 5,03 (m, H-3, benzylové protóny),

5,03 - 5,12 (m, benzylové protóny), 5,26 (1 H, dd, J 1,00,

3.50 Hz, H-4), 5,27 - 5,33 (2 h, m, H-1,2).

HRMS, vypočítané pre ^26^31θ11^^δ (M+Cs)+ 683,0658, zistené 683,0658.

(g) L-fukóza-l-fosfát (zlúčenina 5 alebo 95)

Zlúčenina 9 alebo 88 (5,0 g, 9,1 mmol) sa hydrogenizuje na 5%. peládiu na uhlíku (400 mg) v etanole (70 ml) a IN hydrogen uhličitane sodnom (30 ml) pod atmosférou vodíka 3 hodiny pri teplote miestnosti. Potom sa katalyzátor odfiltruje a k chladnému filtrátu sa pri 0 8Ž 5 °C pridáva IN roztok hydroxidu sodného tak dlho, dokiaľ nie je roztok silne alkalický (pH nad 13). Zmes sa 4 hodiny mieŠ8 pri teplote miestnosti a potom sa neutralizuje prídavkom chladnej'Ayseliny octovej do pH 7,5. Zmes sa prefiltruje, zriedi na 500 ml, nanesie na stĺpec živice Ľowex 1-X8 (v cykle HCOO~) a élúuje lineárnym gradientom hydrogenuhličitenu amónneho (0, až 0,5M). Vhodné frakcie sa spoja a lyofilizujú sa. Nadbytok hydrogenuhličitanu amónneho sa odstráni prídavkom živice Ľowex 50 X8 (vo vodíkovom cykle) k roztoku lyofilizovaného prášku vo vode. Živica sa odfiltruje a filtrát sa l.yofilizuje. Roztok produktu sa nechá prejsť stĺpcom živice Ľo wex 50 W-X8 (v sodíkovom cykle) použitím vody a produkt sa lyofilizuje. Získa sa zlúčenina 5 alebo 95 (2,61 g,

%) vo forme zmesi </;- a fs-izoméru (1:10, podľa NMR).

Ί J O '

H NMR a ^JC NMR dáta sú v dobrom súhlase s oznámenými dátami (Nunez et al., Can. J. Chem., 59: 2086 (1991)).

Príklad 2

Chemická syntéza GĽP-fukózy (zlúčenina 12, schéma 7)

Zlúčenina 5 sa najprv prevedie na svoju trietylamóniovú soľ prechodom stĺpca živice Ľowex 50 W-X8 (vo forme Et-^NH⁺) použitím vody, ako mobilnej fázy. Produkt sa lyofilizuje. Lyofilizovaná trietylamóniová soľ L-fukóza-l-fosfátu (zlúčenina 10) (300 mg, 0,83 mmol) a guanozín-5 '-monofosfátmorfolidát (zlúčenina 11, 600 mg, 0,83 mmol) sa oddelene vysuší dvojnásobným odparením spolu s pyridínom. Potom sa zmiešajú so suchým pyridínom (20 ml) a zmes sa 5 dní mieša pri teplote miestnosti a potom S8 skoncentruje. Produkt sa prečistí na stĺpci Sephadex 025 (superfine) (3 x 65 cm) použitím vody (2 x). Vhodné frakcie sa spoja 8 nechajú ss prejsť stĺpcom Ľowex 50 W-Xg (v sodíkovom cykle) použítm vody. Frakcie sa spoje a lyofilizujú, za vzniku zlúčeniny 12 (asi 300 mg), ktorá je sprevádzaná malým množstvom GMP (podľa NMR).

NMR spektrum je v dobrom súhlase s oznámenými hodnotami (Gokgale et al., Can. J. Chem. 68: 1063 (1990)).

Príklad 3

Enzymatické postupy a stanovenie konverzie manóza-1 P na GĽP-fukózu (schéme 9 až 11) (a) Výroba GĽP-manóza pyrofosforylázy pre konverziu Μεη-1-Ρ na GĽP-manózu

- 85 Enzýmom pre tvorbu GĽP-manózy je GĽP-manóza pyrofosforyláza (GĽP-MsnPP), ktorá sa dá získať z kvasiniek. Väčšina GĽP-ManPP z kvasiniek sa izoluje zrážaním síranom amónnym (asi 80 %, v porovnaní so surovým extraktom bez buniek), pričom špeicifieká aktivita je približne 0,1 U/ml roztoku enzýmu.

Kvasinka Saccharomyces cerevisiee sa pestuje na ./ tomto médiu: (koncentrácie sú uvádzané v g/1) kvasinkový extrakt 5; peptón 10;úpH 6,0. Kultúra sa pestuje cez • noc za pretrepávania pri 30 °C. Bunky sa zozbierajú centrifugáciou a premyjú 50mM tris pufrom (pH 7,5) s obsahom 2mM chloridu horečnatého a^;0,5mM ĽTT. Potom sa bunky (asi 10 g) rozbijú sklenenými perlami v perlovom rozbíjačom zariadení Bead-beater (Bioseptic Products, OK, USA) päťnásobným pulzným spracovaním s jednominútovými intervalmi. Roztok sa odstredí pri 4 °C a 23000 x g (1 hodina). Supernatant (extrakt neobsahujúci bunky) sa oddelí a použije sa pre.purifikáciu enzýmu. Pre čiastočnú purifikáciu enzýmu, ktorá sa uskutočňuje pri 0 C sa použije zrážanie síranom amónnym v rozmedzí od 40 do 80 %. Postupuje sa tak, že sa práškový síran amónny pomaly pridáva k extraktu neobsahujúcemu bunky až do koncentrácie • 40 %, potom sa roztok 30 minút odstrekuje pri 4 °C a 15000 x g, a k supernatantu sa opäť pridáva síran amónny až do 80% nasýtenia. Po centrifugácii sa zrazenina oddelí a opäť rozpustí v 20 ml 50mM tris pufru. (pH 7,5), ktorý obsahuje chlrid horečnatý v 2m^ koncentrácii a ĽTT v 0,5mM koncentrácii a vzniknutý roztok sa dialýzuje v 4 1 rovnakého pufru cez noc (asi 18 hodín) pri 4 °C. Aktivita tohto prípravku je podľa odhadu, na základe stanovenia HPLC približne 0,1 U/ml.

(b) Príprava GDP-fukóza syntetických enzýmov pre konverziu GĽP-manózy na GĽP-fukózu

- 86 Úvodný pokus použiť sčasti purifikovaný GBP-fukózs syntetický enzým (získaný po zrážaní síranom amónnym) pre konverziu GBP-manóza na GBP-fukóza nebol úspešný, v dôsledku silnej vnútornej oxidácie NABPH. Ďalšia purifikácia enzýmu priechodom cez stĺpec BEAB-Sephsrose CL-6B viedla k zvýšeniu aktivity enzýmu a tiež k poklesu oxidačnej aktivity NABPH. Aktivita roztoku enzýmu v tomto štádiu bola približne 0,05 U/ml, na základe NABPH-oxidačného stanovenia.

Použitím stanovenia HPLC bolo pozorované zvýšenie tvorby GBP-fukózy. Po 6 hodinách reakcie bol výťažok GEP-fukózy odhadnutý na asi 9 %, vztiahnuté na pridaný manóza-l-fosfát. Očakáva sa, že by bolo možné dosiahnuť vyšší výťažok, keba bolo možné vyrobiť roztoky enzýmu s vyššou aktivitou. V priebehu reakcie bola pozorovaná degradácia GBP-manózy. Tejto degradácii sa dá zabrániť prídavkom fluoridu draselného. K tomuto javu dochádza v dôsledku kontaminácie enzýmov ého prípravku inými enzýmami. Použitím čistého enzýmu by prídavok fluoridovej soli pravdepodobne nebol nutný.

Baktéria, Klebsiella pneumoniae ATCC 12658, sa pestuje na 2 1 média obsahujúceho 10 g kazamino-kyseliny (Bifco), 5 g kvasinkového extraktu, 3 g hydrogenfosforečnanu didraselného, 1 g dihydrogenfosforečnanu draselného a 5 g B-glukózy v jednom litri (pH = 7,0). Po inkubácii pri 37 °C (18 hodín) sa bunky zozbiérajú centrifugáciou (10000 x g, 50 minút, 4 °C) a resuspendujú v 50mM tris pufru s obsahom 0,5mM BTT (pH 7,5). Bunky sa rozbijú vo francúzskom lise pri tlaku 110 MPa. Bunkové zvyšky sa odstránia centrifugáciou pri 23000 x g (60 minút) a supernatant (extrakt neobsahujúci bunky) sa použije na purifikáciu enzýmu. Extrakt neobsahujúci bunky (50 ml) z dvojlitrovej kultúry sa zmieša s 60 mg sulfátu protamínu a vzniknutá zrazenina sa oddelí centri- 87 fugáciou. Potom sa pridáva síran emónny (pomaly a za mie šenia), až do dosiahnutia 70% nesýtenia (0,436 g/ml pri 0 °C). Po centrifugácii sa zrazenina oddelí a resuspenduje v 20 ml pufru (50mM tris pufer obsahujúci 0,5mM DTT pH = 7j5) 8 dialýzuje cez noc (asi 18 hodín) pri 4 C v 4 1 rovnakého pufru. Výsledný roztok (20 ml) sa nechá prejsť stĺpcom DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) (3 x 30 cm), ktorý bol dopredu ekvilibrovený s ronakým pufrom. Enzým sa elúuje použitím lineárneho gradientu od 0 do lmM chloridu sodlného v rovnakom pufri (celkom 400 ml). Aktívne frakcie sa spoja a dialýzujú v 2 1 50mM tris puf ru obsahujúceho 0,5mM ĽTT (pH 7,5). Tento enzýmový prípravok sa priamo použije pre syntézu. Odhadnutá aktivita je asi 0,5 U/ml, podľa HPLC a NADPH oxdisčného stanovenia.

(c) Stanovenie aktivity enzýmu

Na stanovenie tvorby GDP-Man a GDP-fukóza sa použije systém HPLC. Použije sa stĺpec Partisil 5 SAX (What man Co.), 4,6 x 12,5 cm s veľkosťou častíc 5/um. Ako mobilná fáza sa použije O,1M fosfátový pufer /pH 3,5/ s prietokom 0,5 ml/min (pri tlaku 4,1 MPa). Zlúčeniny sa deteguju pomocou UV detektora pri 254 nm. Retenčná doba pre GDP-manózu je asi 8,9 minúty a pre GDP-fukózu asi 13 minút. Aktivita GDP-manóza pyrofosforylázy sa stanovuje na základe sledovania tvorby GDP-manózy z ,ζ-msnóza-l-fos fátu a GTP pomocou analýzy HPLC. Reakčná zmes obsahuje 10/umol tris-HCl, 1/Umol βζ-manóza-l-f osf átu, l/umol GTP a sčasti purifikovsný enzým v celkovom objeme 0,5 ml. Zmes sa inkubuje pri 30 °C v čase, ktorý je závislý od aktivity enzýmu. Potom sa reakčná zmes (100/Ul) odoberie a cetrifúguje vo filtračnej jednotke Ultrafree (vylučovacia hranica molekulovej hmotnosti 10000 Dalton, Millipore). Piltrát (5/Ul) sa nastriekne na stĺpec HPLC, s cieľom merania tvorby GDP-manózy. Kvantifikácia GDP-manózy ss odhadne použitím štandartného roztoku GDP-manózy, pripraveného z purifikovanej GDP-manózy (Sigma). Jedna jednotka zodpovedá ζβ podmienok tohto stanovenia 1 /Umol GDP-manózy, vytvorenej za minútu.

Meranie aktivity, s cieľom zistenia konverzie GDP-D-manózy na GDP-L-fukózu, sa dá vykonávať buď spektrofotometrickým stanovením oxidácie NADPH alebo priamym meraním tvorby GDP-L-fukózy metódou HPLC. Vzhľadom na to, že enzýmové prípravky obsahujú NADPH oxidázovú aktivitu, je potrebné simultánne stanoviť rýchlosť oxidácie NADPH za neprítomnosti substrátu. Použijú sa dve kyvety obsahujúce 1 ml 50mM tris pufru /pH 7,5) s obsahom 0,2 /Umol NADPH a roztoku enzýmu. Do druhej kyvety sa pidá 0,1yumol GDP-manózy. Stanovuje sa rýchlosť poklesu optickej aktivity v obidvoch kyvetéch pri 340 nm. Rozdiel rýchlosti oxidácie NADPH je meradlom konverzného postupu.

Na obr. 1 je znázornený typický priebeh tohto stanovenia, pričom krivka absorbancie A zodpovedá kontrolnej kyvete bez GDP-manózy, zatiľ čo krivka 8 zodpovedá kyvete, ktorá obsahuje rovnaký ro: tok ako kyveta A, ale navyše 1/Umol GDP-manózy. Jedna jednotka zodpovedá oxidácii 1yumol NADPH /min za použitých podmienok stanovenia.

Pri stanovení HPLC sa použije reakčné médium obsahujúce 1 ml tris pufru (pH 7,5) s obsahom 1/Umol GDP-D-manózy, 0,2/umol NADPH, 2/umol fluoridu draselného,

U T. brokii alkohol dehydrogenázy, lO^ul izopropanolu a vhodný roztok enzýmu. Po určitej dobe inkubácie (1 hodina) sa 100/Ul reakčnej zmesi odoberie a odstredí cez filtračnú jednotku Ultrafree (vylučovacia hranica molekulovej hmotnosti 10000 Dalton, Millipore). Filtrát (5 /Ul) sa nastriekne na stĺpec HPLC, s cieľom merania tvorby GDP-fukózy. Kvantifikácia GDP-fukózy sa odhadne pou- 89 žitím štendartného roztoku GDP-fukózy, pripraveného z purifikovanej GDP-fukózy (Sigma). Jedna jednotka zodpovedá za podmienok tohto stanovenia 1 /Umol GDP-fukóz.y, vytvorenej za minútu. Na obr. 2 sú na ilustráciu znázornené tri grafy HPLC, zodpovedajúce času 0 (A), asi 3 h (B) a asi 6 h (C) po začatí reakcie. Ako už bolo uvedené vyššie, GDP-manóza sa elúuje za asi 8,9 minúty, zatiaľ čo GDP-fukóza sa elúuje za asi 13 minút.

Príklad 4

Enzymatická syntéza GDP-fukózy z manóza-l-fosfátu

K 5 ml reakčného roztoku sa pridá 5/umol Man-l-fosátu, 1/umol NADPH, 5/Umol GTP, 5/Umol PEP, 100 U pyruvát kinázy, 50/Ul izopropylalkoholu, 5 U T. brokii alkohol dehydrogenázy, l/umol chloridu horečnatého, 100 U anorganickej fosfatáz.y, 5/Umol fluoridu draselného, 0,1 U roztoku GDP-manóza pyrofosfatázy a 0,05 U GDP-fukóza syntetických enzýmov a zmes se inkubuje 6 hodín pri 30 °C. Pomocou HPLC sa stanoví tvorba GDP-fukózy.

Príklad 5

Príprava Galf>l,3(Fua£l,4)GlcNAc použitím in situ tvorby GDP-Fuc

Zmes GTP Na soli (6,0 mg, lOyumol), Μεη-1-Ρ K soli (3,5 mg, 10/Umol), Gal^l,3GlcNAc (3,8 mg, lO^umol),

NaF (0,42 mg, 10/Umol), NAĽPH (9,4 mg, lOyUmol), PEP K soli (4,1 mg, 20/umol)., MgCl₂-6H₂O (2,6 mg, 10/Umol),

2-propanolu (50/Ul), ADH (12 U), PK (200 U), PPázy (100 U), surového anzýmového prípravku GDP-manóza pyrofosforylázy (l,0 ml), a surového enzýmového prípravku obsahujúceho enzým produkujúci GDP-Fuc (1,0 ml) v lOOmM tris pufri (pH 7,5) sa zriedi na 3 ml. K zmesi sa pridá ^1,3/4

-fukozyltrensferáza (0,01 U) a výsledná zmes sa 3 dni mieša pri teplote miestnosti pod atmosférou argónu. Potom sa zmes prefiltruje a filtrát sa spracuje na stĺpci živice Ľowex 1-X8 (v hvdroxylovanom cykle) a potom na stĺpci Ľowex 50V/-X8 (vo vodíkovom cykle) použitím vody. Frakcie sa zhromaždia a lyofilizuju. Zvyšok sa purifikuje použitím vody na stĺpci Sephadex G-25 (superfine). Vhodné frakcie sa spoja a lyofilizujú. Získa sa Gelf>l,3(Fuc^l,4)GlcWAc. NMR spektrum tejto látky je v dobrom súhlase so spektrom oznámeným (Ľumas et. al., Biomed. Chem. Lett., 1: 425 (1991)).

Príklad 6

Chemická syntéza manóza-l-fosfátu (zlúčenina 18 alebo 93, schéma 9) (a) 1,2,3,4,6-penta-O-acetyl-Ľ-msnóza (zlúčenina alebo 65)

Ľ-manóza (zlúčenina 13, 5,0 g, 27,8 mmol) sa rozpustí v bezvodom pyridíne (30 ml) a roztok sa v ľadovom kúpeli ochladí na 0 až 5 °C. K vzniknutému roztoku sa pomaly pridáva acetanhydrid (20 ml) a zmes sa 8 h mieša pri teplote miestnosti. Potom sa zmes naleje do ľadovej vody a extrahuje sa etylacetátom. Extrakty sa postupne premyjú chladnou kyselinou chlorovodíkovou, vodou, chladným nasýteným roztokom hydrogenuhli'čitanu sodného, vodou, nasýteným roztokom chloridu sodného, a vodou a vysušia sa bezvodým síranom sodným. Organická vrstva sa skoncentruje pri zníženom tlaku a použije sa bez čistenia v nasledujúcom stupni. Zlúčenina 14 alebo 65, ktorá predstavuje čistý ^-izomér, sa získa v množstve 10,6 g (výťežok. 98½).

(b) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-Ľ-menóza (zlúčenina alebo 72)

Pentaacetát (zlúčenina 14 alebo 65, 10,0 g , 25,6 mmol) sa rozpustí v tetrahydrofuráne a k vzniknutému roztoku sa pridá 1,5 ekvivalentu benzylamínu (4,6 ml). Zmes sa 1 deň mieša pri teplote miestnosti a potom sa extrahuje etylacetátom 8 postupne premyje chladnou kyselinou chlorovodíkovou, vodou, chladným nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vodou, nasýteným roztokom chloridu sodného a vodou a vysuší sa bezvodým síranom sodným. Organická vrstva sa skoncentruje pri zníženom tlaku a zvyšná sirupovitá látka ss chromatografu je; na silikagéli použitím zmesi etylacetátu a hexánu (objemovo 2:3), za vzniku zlúčeniny 15 alebo 72 (7,8 g, výťažok 87 %, čistý ^-izomér).

¹H NMR (CDC1₃) ý: 2,00, 2,05, 2,11, 2,17 (3 H, s, 4 x CH₃C0), 4,01 - 4,15 (1 H, m, 5-H), 4,21 - 4,29 (2 H, m, 6-H), 5,24 (1 H, d, 1-H), 5,26 - 5,27 (1 H, m, 2-H),

5,30 - 5,34 (1 H, d, J = 12,03 Hz, 4-H), 5,41 - 5,45 (1 H, dd, J = 3,36, 9,99 Hz, 3-H).

(c) Dibenzylfosfit-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-manozid (zlúčenina 16 alebo 79)

Tetraacetát manózy (zlúčenina 15 alebo 72) (l,5 g, 4,31 mmol) sa rozpustí v bezvodom tetrahydrofuráne (31 ml) a pri teplote miestnosti mieša pod atmosférou dusíka. K vzniknutému roztoku sa pridá 1,2,4-triazol (1,5 g, 21,7 mmol) a zmes sa mieša, dokiaľ sa t.riazol nerozpustí. K vzniknutému roztoku sa pridá dibenzyl-N,Ndietylfosforoamidit (10,0 g, 31 mmol) a zmes sa 1 hodinu mieša. K roztoku sa pridá 50 ml éteru a reakčná zmes sa extrahuje chladným nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vodou, chladným nasýteným roztokom chloridu sodného a vodou a vysuší sa bezvodým síranom sodným. Organický extrakt sa skoncentruje pri zníženom tlaku a zvýš ná sirupovitá látka sa prečistí na stĺpci silikegélu použitím zmesi etylacetátu a hexánu (objemovo 1:4), ako rozpúšťadlového systému. Získa sa čistý ^-izomér, tj, zlúčenina 16 alebo. 79).

¹H HO (CĽCl-j) $z 2,0 - 2,3 (12H, 4s, 4 x CH-jCO), 3,92-3,98 (1H, dd, 6-Ha), 4,05-4,1 (1H, m, 5-H), 4,18-4,24 (1H, dd, 6-Hb), 4,85-5,12 (4h m, CH<,Ph), 5,22-5,24 (11H, m, 2-H), 5,28-5,32 (1H, t, 4-H), 5,38-5,42 (1H, dd, 3-H), 5,48-5,52 (1H, dd, 1-H).

(d) Dibenzylfosforyl-2,3,4-6-tetra-O-acetyl-D-manozid (zlúčenina 17 alebo 86)

Zlúčenina 16 alebo 79 sa rozpustí v bezvodom tetrahydrofuráne a ochladí sa v kúpeli zo suchého ľadu a acetónu na teplotu -76 °C. Potom sa k roztoku naraz pridá 30& peroxid vodíka (7 ml). Vzniknutý roztok sa nechá ohriať na teplotu miestnosti a 90 min sa mieša. Nadbytok peroxidu vodíka sa rozloží prídavkom ľadového chladného tiosírenu sodného. Potom sa k zmesi pridá 100 ml éteru a uskutoční sa extrakcia postupom popísaným vyššie, za vzniku zlúčeniny 17 alebo 86, ktorá sa bez čistenia použije v nasledujúcom stupni.

(e) D-manóza-l-fosfát (zlúčenina 18 alebo 93)

Zlúčenina 17 alebo 86 sa hydrogenizuje na 5% paládiu na uhlík (400 mg) v etanole (30 ml) a hvdrogenuhličitane sodnom (10 ml) pod atmosférou vodíka počas 2 h. Katalyzátor sa odfiltruje a filtrát sa skoncentruje. K zvyšku sa prikvapká roztok hydroxidu sodného pri 0 až 5 °C tak dlho, dokiaľ pH reakčnej zmesi nestúpne nad 12.

-.93 Zmes sa 3 h mieša pri 4 °C a potom ss neutralizuje prídavkom chladnej kyseliny octovej do pH 7,2. Zmes sa prefiltruje, zriedi sa na 400 ml, nanesie na stĺpec Dowex

1-X8 (v HCOO^- forme) (2 x 28 cm) a elúuje sa lineárnym gradientom hydrogenuhličitanu emónneho (0 až 0,6M). Frak cie obsahujúce D-manóza-l-fosfát sa spoja a lyofilizujú. Nadbytok hydrogenuhličitanu amónneho sa odstráni premytím roztoku lyofilizovaného prášku na živici Eowex 50W-X8 (vo vodíkovej forme). Získa S8 zlúčenina 18 alebo 93 vo forme dvojsodnej soli.

Príklad 7

Enzymatická halogénhydratácia (A) Všeobecný postup halogénhydratácie katalyzova nej chlórperoxidázou (schéma 3,4 a 4a).

K reakčnej zmesi obsahujúcej 20 ml fosfátového pufru s kyselinou citrónovou (pH 3), 1 mmol glykálu, 5 mmol halogenidu draselného a 1170 U enzýmu sa pridá 600 yul peroxidu vodíka (30%). Reakcia sa nechá prebiehať počas 30 minút v prípade jódhydratácie, 3 hodiny v prípade brómhydratácie alebo 3 dni v prípade chlórhydratácie, vždy pri teplote miestnosti. Rozpúšťadlo sa odstráni pri zníženom tlaku a k zvyšku sa pridá metanol. Nerozpustná látka sa odfiltruje a rozpúšťadlo sa odstráni pri zníženom tlaku. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na stĺpci silikegélu s reverznou fázou Cg, za vzniku 2-deoxy-2-halogén-cukru. Produkt sa prevedie na peracet.át štendartným postupom použitím pyridínu, katalytického množstva 4-dimetylaminopyridínu a 8cetanhydridu (1 deň) a prečistí sa na stĺpci silikagélu, s'cieľom charakterizácie.

(1) Peracetát zlúčeniny 20

NMR (CECl^) ó: οζ-izomér: 2,04 (3H, s), 2,08 (3Η, s), 2,10 (3H, s), 2,21 (3H, s), 4,05 (1H, dd, J =

2,5, 12,5 Hz, H-6), 4,05 (1H, dd, J=3,5, 11 Hz, H-2),

4,28 (1H, ddd, J=2, 4, 10 Hz, H-5), 4,31 (1H, dd, J=4,

12.5 Hz, H-6), 5,09 (1K, dd, J=9, 10 Hz, H-3), 5,52 (1H, dd, J=9, 11 Hz, H-4), 6,36 (1H, d, J=3,5 Hz, H-l) ppm.

p-izomér: 2,03 (3K, s), 2,09 (3H, s), 2,11 (3H,

s), 2,18 (3H, s) , 3,88 (1H, ddd, J=2,4, 4,5, 10,5 Hz,

H-5), 3,90 (1H, dd, J=9, 10,5 Hz, H-2), 4,11 (1H, dd,

J=2,5, 12,5 Hz, H-6), 4,32 (1H, dd, J=4,5, 12,5 Hz, H-6), 5,03 (1H, dd, J=9, 10 Hz, H-3), 5,34 (1H, dd, J=9, 10,5 Hz), 5,81 (1H, d, J=9 Hz, H-l) ppm. ^l3C-NMR (CDCl-j) d: 20,52-20,67 (4 x C), 47,50, 62,10, 68,46, 72,85, 74,36, 93,11, 167,91-170,10 (4 x C) ppm. HRMS (M+Na⁺): vypočít. 433,0110/435, zisten. 433,0112/435.

(2) Peracetát zlúčeniny 21 ¹H NMR (CĽC1₃) ó: j;-izomér: 2,07 (3H, s), 2,10 (3H, s), 2,11 (3H, s), 2,17 (3H, s), 4,19 (1H, ddd,

J=2,5, 4,5, 10,5 Hz, H-5), 4,17 (1H, dd, J=2,5, 10,5 Hz, H-6), 4,23 (1H, dd, J=4,5,12,5 Hz, H-6), 4,43 (1H, dd,

J=2, 4 Hz, H-2), 5,21 (1H, dd, J=4, 9,5 Hz, H-4), 5,45 (1H, t, J=10 Hz, H-4), 6,32 (1H, d, J=2 Hz, H-l) ppm. ¹³C-NMR (CBC1₃) S: 20,60, 20,66, 20,75, 20,86, 47,77,

61,82, 65,54, 68,75, 71,25, 93,11, 167,20-171,90 (4 x C) ppm.

frizomér: 2,07 (3H, s), 2,10 (3H, s), 2,12 (3H, s), 2,18 (3H, s), 3,82 (1H, ddd, J=2,5, 5, 9,5 Hz, H-5), 4,13 (1H, dd, J=2,5, 12,5 Hz, H-6), 4,27 (1H, dd, J=5,

10.5 Hz, H-6), 4,60 (1H, dd, J=3,5,' 1,5 Hz, H-2), 5,00 (1H, dd, J-4, 9,5 Hz, H-3), 5,43 (1H, t, J-9,5 H_z, H-4), 5,74 (1H, d, J=l,5 Hz, H-l) ppm. ¹³C-NMR (CBCl-j) í: 20,60 -20,85 (č x c), 51,05, 61,82, 65,27, 71,01, 73,04, 90,01, 167,20-171,90 (4 x C) ppm. HRMS (M+Na⁺): vypočít. 433,0110/ 435, zistené 433,0115/435.

(3) Peracetét zlúčeniny 22 ’H-NHR (CDCIj) í: č-isomer: 2_f 04 (3H, s), 2,07 (3H, S), 2,16 (3H, s), 2,19 (3H, s), 4,08 (1H, dd, J«9,

11,5 Hz, H-2), 4,10-4,15 (3H, a, 2 X H-6 & H-5), 5,15 (1H, dd, J=3, 11,5 Hz, H-3), 5,35 (1H, d, J=3 Hz, H-4),

5.84 (1H, d, J*=9 Hz, H-l) ppa. ^UC-NHR (CDCIj) í: 20,42 20,52, 20,61, 20,66, 46,35, 60,89, 67,03, 71,94, 72,.78, 93,43, 168,31-170,90 (4 X C) ppa. α-isoner: ¹³C-NHR (CDC1₃) í: 20,42-20,66 (4 X C), 44,39, 67,04, 67,69, 68,64, 69,39, 91,05, 167,01-17 0,8 6 (4 X C) ppa. ERJíS (H-ŕNa*) ívypoč- 433,0110/435 , zist. 4 3 3,0119/4 35.

(4) .Zlúčenina 23 ¹H-NHR (CDC1,), č-iscner: 1,12 (3H, d, J=6,5, CHj) , 3,45 (1H, dd, J=l, 3 Hz, H-4), 3,52 (1H, dd, J=3,

10,5 Hz, H-3), 3,58 (1H, cd, J=l, 6,5 Hz, H-5), 3,69 (1H, dd, J=8,5, 10,5 Hz, H-2), 4,45 (1H, d, J=8,5 Hz,

). ¹³C-N?S (CDCIj), ŕ-isozer: 16,71, 53,04, 72,13,

73,56, 76,03, 98,73 ppa. £-Ísoaer: 16,71, 54,71, 67,25, 71, 13, 74,55, 94,20 ppa. HRHS (Η-ί-Na*) : τvypočítané 248,9738/251,zist- . 24 8,9730/251.

(5) Peracetét zlúčeniny 25 'H-NHR (CDCIj) c: --iscaer: 2,05 (3H, s), 2,.08 (3H, s), 2,16 (3H, s), 2,13 (3H, s), 4,06 (1H, dd, J=9 , H-2), 4,07-415 (3H, a, 2 X H-6 & H-5), 5.09 J=3, 11,5 Hz), 5,39 (1H, d, J=3 Hz, H-4), 5,75 (1H, (1H, d, J=9 Hz, H-l) ppa. '³C-NHR (CDCIj) , 5-isoaer: 20,21-22,55 (4 X C), 55,30, 60,87, 66,84, 71,86, 72,74, 93,53, 168,20-180,21 (4 x C) ppa. c-isoaer: 20,1-22,55 (4 X C), 53,46, 61,04, 67,44, 63,67, 69,51, 90,94, 168,20-180,21 (4 x C) ppa. HRHS (H-ŕNa’) : vypočítané 389,0615/391, zist .389,0610/391.

(6) Peracetét zlúčeniny 27 ’H-NHR (CDCIj) í: £-isoaer: 2,04 (3H, s), 2,07 (3H, s), 2,12 (3H, s), 2,17 (3H, s), 4,06-4,17 (4H, a,

Η-2, 2 x Η-6 * Η-?), 5,13 (1Η, dd, J=3,5, 10 Hz, H-3), 5,25 (1H, d, J=3,5 Hz, H-4), 5,91 (1H, d, J=9,5 Hz, H-l) ppm. ¹³C-NMR (0Γ01₃), β-izomér: 20,5-22,50 (4 x C), 24,96, 60,94, 67,10, 72,16, 74,10, 94,15, 168,20-179,36 (4 x

C) ppm; ος-izomér: 20,5-22,50 (4 x C), 29,87,

60,63, 67,68, 68,31, 69,42, 92,16, 168,20-179,36 (4 x C) ppm. HRMS (M+Na⁺): vypoč.480,9972, zistené 480,9999.

(B) Halogénhydratácia disacharid-glykálov a sialálu, katalyzovaná chlórperoxidázou (1) Helogénhydratácia zlúčeniny 28 (schéma 4)

40/Ul 30% peroxidu vodíka sa.pridá k zmesi zlúčeniny 28 (20 mg, 0,065 mmol), bromidu draselného (38,6 mg, 0,32 mmol) a chlórperoxidázy (76 U) v citrátovom pufri (1,4 ml, pH = 3) ε reakčná zmes sa 3 hodiny jemne mieša pri teplote miestnosti. Rozpúšťadlo sa odstráni pri zníženom tlaku a k zvyšku sa pridá metanol. Nerozpustná látka sa odfiltruje a filtrát sa skoncentruje pri zníženom tlaku. Zvyšok sa prečistí chromatograficky na stĺpci silikagélu s reverznou fázou Οθ. Získa sa zmes D-galakt o pyr a z ony 1-(5(1,3 )-2-bróm-2-deoxy-Ľ-glukopyrsnózy, zlúčeniny 29 (10 mg) a Ľ-galaktopyranozyl-p/l,3)-2-bróm-2-deox.y-D-menopyranózy, zlúčeniny 30 (10 mg) vo výťažku 76 %. Produkty sa acetylujú acetanhydrióom a pyridínom za prítomnosti katalytického množstva ĽMAP, s cieľom charakterizácie.

(2) Halogénhydratácia 2,3-dehydro-N-acetyl-neuramínovej kyseliny (zlúčenina 35, schéma 3) katalýzovaná chlórperoxidázou

100/Ul 30% peroxidu vodíka sa pridá k zmesi zlúčeniny 34 (Meindl, Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem.,

- 97 1350: 1088 (1969); 50 mg, 0,17 mmol), bromidu draselného (102 mg, 0,857 mmol) a chlórperoxidázy (200 U) v citrátovom pufri (3,5 ml, pH = 3) a reakčná zmes sa 30 minút jemne mieša pri teplote miestnosti. Rozpúšťadlo sa odstráni pri zníženom tlaku a k zvyšku sa príčá metanol. Nerozpustná látka sa odfiltruje a filtrát sa skoncentruje pri zníženom tlaku. Zvyšok sa prečistí chromatograficky na stĺpci BioGel P-2 a potom na stĺpci silikagélu s reverznou fázou Cg, použitím zmesi acetonitrilu a vody (5:1). Získa sa 2-bróm-2-deoxy—^-acetylneuramínová kyselina (zlúčenina 35, 43 mg, 65 %). Produkt sa peracetyluje acetenhydridom a pyridínom za prítomnosti katalytického množstva ĽMAP, a potom sa uskutoční metylácia pomocou metyljodidu a uhličitanu cézneho, s'ciel’om charakterizác ie.

¹H-NMR (CDCip ó: 1,95, 2,04, 2,05, 2,10, 2,19,

2,20, (3H, s, každý, OAc a NHAc), 3,83 (3H, s, C00CH₃),

4,11 (1H, ddd, J=8,7, 10,6, 10,7 Hz, H-5), 4,22 (1H, dd, J=6,4, 12,5 Hz, H-9), 4,32 91H, dd, J-1,8, 10,6 Hz, H-6), 4,57 (1H, dd, J=5,15 (1H, ddd, J=2,4, 5,5, 6,4 Hz, H-8), 5,31 (1H, dd, J=l,8, 5,5 Hz, H-7), 5,43 (1H, d, J=8,7 Hz, NH), 5,67 (1H, dd, J=3,8, 10,7 Hz, H-4). HRMS: vypočít. pre ^c22^H3O^NO14^BrCs 743,9904/746, zistená 743,9900/746.

(3) 1,3,6,2^#, 3,^z 4,^z 6 ^z-hepteacet,yl-D-g8laktopyr8nožyl-β>(1,4 )-2-bróm-2-deoxyglukopyránóza (zlúčenina 32) a -2-deoxyrnanopyranóza (zlúčenina 33)

Vyššie uvedeným všeobecným postupom sa získa zmes

1:1 zlúčeniny 32 a zlúčeniny 33 (155 mg, 71 %) z Gaip>(l,4) -glukálu (zlúčenina 31) (96,5 mg). Pomer zlúčeniny 32 k zlúčenine 33 sa stanoví z integrálneho pomeru anomerických protónov zlúčenín 32 a 33. Zlúčeniny 32 a 33 sa zís98 forme anoaérnych zmesí α:β: zlúčenina 32 (α:β - 1:3), zlúčenina 33 (α:β = 2:1).

HRMS zlúčeniny 32 a. zlúčeniny 33 ; vypočít. pre ^C2Ä°17^SrCs (^K+Cs*) 831, 0112/833, zist. 831,0112/833.

¹H-NMR zmesi zlúčenín 32 a 33:

¹H-NKR (CDC1₃) S 1,96, 1,97, 1,98, 1,981, 2,03, 2,04,

5 05, 2,06, 2,070, 2,074, 2,075, 2,08, 2,12, 2,13,

2,132, 2,15, 2,16, 2,166 (—OCHj) , 3,84 (dd, J=l,6, 9,0 Hz, H-2 Glu. β anoaértc .zlúčeniny^: 32), 3,73-4,22 (n)-, 4,4 0 (dd, J=2,2, 3,8 Hz, K-2 a anoaéru zlúčeniny 33) , 4,43-4,47 (a), 4,46 (dd, J«l,0, 7_r6 Hz), 4,55 (d, J=8,0 Hz), 4,57 (dd, J=l,6, 4,0 Hz, H-2 a anoneru .zlúčeniny 33), 4,59 (d, J*=8,0Hz), 4,93 (dd, J»3,5, 5,1 Hz), 4,96 (dd, J=3,5, 4,96 Hz), 4,99 (dd, J-3_f5, 10,5 Hz, K-3^Z β ancaeru zlúčeniny 32, 5,03 (dd, J=3,8, 8,8 Hz), 4,07-5,.12 (a), 5,16 (dd, J=8,0,

10,5 Hz), 5,20-5,26 (a), 5,35-5,38 (a), 5,70 (d, J=l,6,

K-l β anoaéru zlúčeniny 33), 5,76 (d, u=9,0 Hz, H-l ' β anoaéru .zl účeniny 32), 6,26 (d, J=2,2 Hz, H-l . a ancaeru zlúčeniny 32), 6,30 (d, J=3,4 Hz, H-l a anoaéru zlúčeniny 32). ^|3C-KHR (CDClj) 20, 52, 20,61,

20,65,

48.13, 62,04,

69.14, 70,91, 74,13, 100,84,

169.14, 170,16,

20,75,	20,30,	20,84,	20,83,	20,93,	46,27,	47,95
51,26,	60,77,	60,51,	61,08,	61,49,	61,67,	51^75
66,55,	66Ť62,	66,71,	66,75,	68,97,	69,03,	69,09
69,30,	7 0, 68,	70,72,	70,75,	7 0,78,	70,82,	70,86
70,54,	70,98,	71,16,	71,73,	7.3,44,	73,63,	73,80
74,29,	76,32,	76,61,	83,77,	90,34,	92,98,	53,13,
101,19	, 101,4	5, 163,	42, 158	,45, 168,53, 168,92,
165,22	, 169,3	6, 159,	59, 159	,65, 170,08, 1	70,13,
170, 29	, 170,35, 170,	4 6.

(4) 1,3,6,2,'3,'4 ,'6-hepteacetyl-D-galaktopyranozyl-p(l,3)-2-bróm-2-deoxyglukopyranóza (zlúčenina 29) a -2-deoxymanopvranóza (zlúčenina 30)

Vyššie uvedeným všeobecným postupom ss získa zmes

1:1 zlúčeniny 29 e zlúčeniny 30 (66 mg, 76 z Gaip>(l,3) glukálu (zlúčenina 28) (38,6 mg). Zlúčeniny 29 a 30 sa izolujú chromatografiou na stĺpci silikagé’lu (použitím . zmesi etylacetátu a n-hexánu v pomere 5:2), vo forme anomérnych zmesí zlúčenina 29 (^:^= 1:10). zlúčenina (<:p = 12:ť).

P anomér zlúčeniny 29: ^H-NMR (CĽCl^) í: 1,98, 2,04, 2,07, 2,08, 2,09, 2,15, 2,17 (3H, každý, s, OAc x 7), 3,78 (1H, ddd, J=l,8, 4,6, 9,7 Hz, H-5 Glu), 3,85 (1H, t, J=9,5 Hz, H-2 Glu), 3,89 (1K, t, J-~7 Hz, H-5 Gal), 3,96 (1H, t, J=10,0 Hz, H-3 Glu), 4,07 (1H, m,

H-6 Gal), 4,09 (1H, dd, J=l,8, 12,4 Hz, H-6 Glu), 4,13 (1H, dd, J=7,0, 11,1 Hz, H-6 Gal), 4,25 (1H, dd, J=4,6,

12,4 Hz, H-6 Glu), 4,89 (1H, d, J=7,7 Hz, H-l Gal), 4,97 (1H, t, J=9,6Hz, H-4 Glu), 5,03 (1H, dd, J=3,4, 10,0 < Hz, H-3 Gal), 5,13 (lH, dd, J=7,7, 10,0 Hz, H-2 Gal),

5,36 (1H, d, J=3,4 Hz, H-4 Gal), 5,75 (1H, d, J=9,0, Hz, ‘ H-l Glu).

HRMS: vypočít. pre C2gH-j^0^yBrCs (M+Cs⁺) 831,0112/833, zistené 831,0112/833.

¹³C-NMR (CĽCI-j) ó: 20,55, 20',64, 20,68, 20,71, 20,75, 20,96, 50,11, 60,93, 61,62, 66,73, 68,53, 68,96, 70,62, 70,82, 72,87, 77,21, 81,30, 92,86, 101,61, 168,77, 169,03, 169,35, 170,13, 170,20, 170,36, 170,67,

100 £ anomér zlúčeniny 30: ^H-NMR (CDClj) &:

4,24 (1H, bd, J=3,0 Hz, H-2 Man), 4,55 (1H, d, J=8,0 Hz, H-l Gal), 5,01 (lH, dd, J=3,4, 10,5 Hz, H-3 Gal),

5,18 (1H, dd, J=7,8, 10,5 Hz, H-2 Gal), 5,32 (1H, t,

J=8,7 Hz, H-4 Man), 5,39 (lH, dd, J=1,O, 3,4 Hz, H-4 Gal), 6,30 (1H, d, J=3,0 Hz, H-l Man).

β anomér zlúčeniny 30: ³H-NMR (CECl-j) 5: 4,45 (1H, dd, J=2,0, 3,5 Hz, H-2 Man), 4,55 (lH, d, J=8,0 Hz, H-l Gal), 5,01 (lH, dd, J=3,4, 10,5 Hz, H-3 Gal), 5,20 (1H, dd, J=7,8, 10,5 Hz, H-2 Gal), 5,30 (lH, t, J=7,4 Hz, H-4 Man), 5,39 (lH, dd, J=1,O, 3,4 Hz, H-4 Gal), 5,80 (1H, d, J=2,0 Hz, H-l Man).

HRMS: vvpočít. pre C2^H^^0^y3rCs (M+Cs⁺) 831,0112/833, zist. 831,0110/833.

¹³C-NMR 20,57, 20,65, 20,67, 20,87, 20,95, 21,01, 21,04, 48,21, 60,98, 61,19, 62,01, 62,61, 66,75, 66,82, 68,43, 68,52,.70,71, 70,88, 71,05, 72,03, 73,36, 74,74, 75,93, 77,23, 90,08, 92,80, 100,10, 100,,24, 168,23, 169,13, 169,22, 169,73, 170,18, 170,40.

(5) Sialyl-x;(l,3)Galp>(l ,4) (Fucá(1,3) )-2-bróm-2-deoxyglukopyranóza (zlúčenina 37a) a -2-bróm-2-čeoxymanopyranóza (zlúčenina 37b)

Vyššie uvedeným všeobecným postupom sa vyrobí zmes zlúčenín 37a a 37b v pomere L.L '(3,5 mg, 56 %) z NeuAc(2,3)Gal()(l,4) (Fuc* (1,3) )glukálu (zlúčeniny 36) (5,5 mg). Pomer množstva zlúčenín 37a a 37b sa stanoví z integrovaného pomeru met.ylových protónov fukózy.

³H-NMR Zmesi zlúčenín 37a a 37b:

101 ¹H-NMR (Ľ₂0) 1,17 (d, J=6,0 Hz, CH3 Fuc), 1,18 (d,

J=6,0 Hz, CH3 Fuc), 1,80 (t, J=12,7 Hz, K-3ex NeuAc),

2,02 (s, NHAc), 2,75 (dd, J=5,0, 12,7 Hz, H-3 eq NeuAc), 3,45-4,13 (m), 4,48 (d, J=S,0 Hz, H-l Gal), 5,0-5,04 (m), 5,18-5,22 (m), 5,36-4,42 (m).

Príklad 8

Všeobecný postup brómhydratácie pomocou NBS

K roztoku 1 mmol glukálu v zmesi 3,6 ml acetonitrilu a 1,5 ml vody ss pridá 1 mmol N-brómsukcínimidu ( NBS) pri teplote miestnosti. Reakcia sa nechá prebiehať 3 hodiny pri tejto teplote. Rozpúšťadlo sa odstráni pri zníženom tlaku a zvyšok sa chromatografuje na stĺpci silikagálu. Produkty sa prevedú na perscetáty v pyridíne a acetanhydride za prítomnosti katalytického množstva 4-dimetylaminopyridínu a prečistia ss stĺpcovou chromatografiou na silikagéli s cieľom charakterizácie.

(a) 1,3,6,2 '3 ,^z4 ,^z6 '-heptaacetyl-D-galaktopyranozyl-f?(l,4)-2-bróm-2-deoxyglukopyranóza (zlúčenina 32) a -2-deoxymanopyranóza (zlúčenina 33)

Vyššie uvedeným všeobecným postupom sa získa zmes 1:2,5 zlúčeniny 32 a zlúčeniny 33 (30 mg, 78 %) z Gal|3(l,4)glukálu (zlúčenina 31) (17 mg). Pomer zlúčenín 32 a 33 sa stanoví z integrovaného pomeru anomérnych protónov. Zlúčeniny 32 a 33 sa získajú vo forme [5 anomérnych zmesí. Zlúčenina 32: ,<:p> = 3:5; zlúčenina 33: = 5:2.

(b) Metyl-5-acetamido-2,4,7,8, 9-penta-O-acetyl-3-bróm-3,5-dideox,y-[5-I)-ery tro-L-mano-2-nonulopyranozonát (metylperacetyl-zlúčenina 35,

102 zlúčenina 35©) a metyl-b-acetamido-2,4,7,8,9-penta-O-acetyl-3,5-dideoxy-^-D-erytro-L-gluko-2-nonulopyranozonát (zlúčenina 35b)

Chemická brómhydratácia sa uskutočňuje vyššie uve deným všeobecným postupom a produkty sa prevedú na peracetáty a potom esterifikujú metyljodidom za prítomnosi ekvimolárneho množstva uhličitanu cézneho, za vzniku zme si zlúčenín 35© a 35b (155 mg, 74 %). Pomer množstva vyrobených zlúčenín 35© a 35b sa stanoví z integrálneho pomeru metylesterových protónov. NMR spektrá zlúčenín 35© © 35b sú v dobrom súhlase s predchádzajúcou správou.

Zlúčenina 35b: ¹H-NMR (CĽCl-j) ó: 1,90, 2,03, 2,08 2,10, 2,12, 2,15 (3H, s, každý, OAc a NHAc), 3,78 (3H, s, COOCH₃), 4,04 (1H, dd, J=6,0, 12,4 Hz, H-9),‘ 4,09 (1H, d, J=10,0 Hz, H-3ax), 4,33 (1H, ddd, J=10,0, 10,6,

10,7 Hz, H-5), 4,36 (1H, dd, J=2,4. 12,4 Hz, H-9), 5,10 (1H, ddd, J=2,4, 6,0, 6,1 Hz, H-8), 5,25 (1H, dd, J=2,5,

10,7 Hz, H-6), 5,30 (1H, dd, J=10,0, 10,6 Hz, H-4), 5,38 (1H, dd. J=2,5, 6,1 Hz, H-7), 5,90 (1H, d, J=10,0 Hz, nH).

Príklad 9

Expresia Galpl,3/4GlcNAcx:2,3sialyltransferázy

Vysoký výťažok expresie rozpustnej Galftl,3/4GlcNAc^2,3sialyltransferázy sa dosiahne v expresnom systéme na báze baculovírusu použitím cBNA, kódujúcej fúzovaný proteín medzi pre-inzulínovým signálnym peptidom a katalytickou doménou sialyltrsnsferázy. cBNA, kódujúca fúzovaný proteín, sa skoncentruje spôsobom popísaným Wenom a kalšími v plazmidovom vektore pGIR199 (Huseh et al.,

J. Biol. Chem., 261: 4940 (1986)). Na izoláciu DNA fragmentu obsahujúceho celú kódovaciu sekvenciu sa jediné

- 103 Eco RI miesto na 3' konci chimerického génu najprv rozštiepi, previs sa zakončí tupým koncom a ligujú sa syntetické linkery obsahujúce miesto Nhe 1. Výsledný plezmid sa štiepi Nhe 1, aby sa uvoľnila cĽNA fúzovaného proteínu a tento fragment sa klonuje v jedinom mieste Nhe 1 do pBlueBac a baculovírusového expresného systému s prenosovým vektorom, pod kontrolou baculovírusového polyhedrínového promotora (Invitrogen; San Diego, CA, USA). Všetky manipulácie s rekombinantnou DNA sa uskutočňujú za podmienok doporučených v štandartných. protokoloch, priložených ako inštrukcie výrobcom enzýmu (Sambrook et al., Molecula - Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, USA (1989)).

Rekombinantný bsculovírus sa vytvorí použitím expresného systému MaxBac (invitrogen), presne podľa protokolov doporučených výrobcom. V krátkosti sa dá tento postup popísať takto: plazmid a DNA divokého typu vírusu sa zmiešajú a nechajú transfektovať Sf-9 bunkami použitím metódy s fosforečnanom vápenatým. Pomocou prenesených buniek sa vyrobí rekombinantný vírus, ktorý sa prenesie do kultivačného média a opakovane sa prečistí cez plaky použitím obmedzujúceho zriedenia. Niekoľko klonovených plakov, ktoré sa izolujú, sa analyzuje na schopnosť spôsobovať sekréciu <2,3 NeuT do infikovaného bunkového média, skúšaním alikvitu média priamo na aktivitu <2,3 NeuT sialyltransferázovou skúškou. Izolát s ktorým sa dosahuje najvyššia úroveň sekrécie <2,3 NeuT je označený šifrou rBv2,3ST a rozšíri sa na 500 ml infekciou čerstvých buniek Sf-9. Aktivita ^2,3 NeuT sa stanoví použitím modifikácie publikovaného stanovenia s koncentráciou 0,9mM. Tieto manipulácie sú schématicky ilustrované v schéme 24.

- 104 -

Schéma 24

Ξ) PLS: proinzulinov'a vedúca sekvenefe

SrS PLS α·2.3 NeuT

I tupý konic-c a tigrej J -s Nhe I liňkerom

Nhe

Nhe

SF5 PLS c-2^NeuT

Nhe I p3lueSčc vekior

H'^penf Nhe 1

Nhe I Nhe J

Ľ : ------ -----U

PLS a-2,3NeuT

Ugácj&

105

Príklad 10

GaH>l,3GlcNAc|M,3Gsipi,4Glc, ako akceptor

Na produkciu veľkých množstiev <2,3KeuT sa použije rBv2,3ST pre infekciu buniek Sf-9 v monovrstvovej kultúre. Obvykle sa dosiahne výťažok 2 až 3 U <2,3NeuT,(sekg retovanej 10 infikovaných buniek), pri pestovaní na médiu Excell-400 (JRP Biosciences, Lenexa, KS, USA). Jednotky aktivity (mmol/min) sú definované ako násobok výsledkov skúšania číslom 1,6, s cieľom získania aktivity pri V_max· Médiá z buniek infikovaných rBv2,3ST sa zhromaždia 72 hodín po infekcii a rekombinsntná <2,3NeuT sa čiastočne purifíkuje v jednom chromatogrefickom stupni.

litre média obsahujúceho <2,3 NeuT sa prefiltrujú a skoncentrujú na približne 250 ml v systéme Amicon ČH2PRS, so špirálovitou patrónou S1Y10. Jednotka sa potom nechá pracovať diafiltračným spôsobom, s cieľom odsolenia koncentrovaného supernatantu použitím 3 objemov lOmM kakodylovej kyseliny, 25mM chloridu sodného, 25% glycerolu s pH 5,3 (pufer A). Vzorky sa potom spracúvajú na stĺpci (2,5 x 17 cm) S-Sepharose Fest Flow (Pharmacia), ktorý je ekvilibrovaný pufrom A. Použije sa prietoková rýchlosť 2 ml/min. Po nanesení celej vzorky sa stĺpec premýva pufrom A tak dlho, dokiaľ sa optická hustota OI^gQ prúdu vytekajúceho zo stĺpca nevráti na základnú hustotu (1,6 objemu stĺpca).

Potom sa <2,3 NeuT elúuje zo stĺpca pomocou 50mM kakodylovej kyseliny, IM chloridu sodného, 25% glycerolu (pH 6,5). Frakcie obsahujúce <2,3NeuT sa spoja a dialýzuju cez noc (asi 18 hodín) proti 1 1 50mM kakodylovej kyseliny 0,5M chloridu sodnému, 50% glycerolu (pH 6,0). Vzroky sa skladajú pri -20 °C.

- 106 Príklad 11

Galaktozylácia (a) LacNAcpOalyl zo zlúčeniny 4L (schéma 14)

Zmes zlúčeniny 40 (Lee et al., Carbohydr. Res.. 32:193 (1974)) (2,0 g, 7,65 mmol), Glc-l-P (ľ,74 g, 7,65 mmol), PEP (K soli), 1,6 g, 7,65/Umol), NAD⁺ (193 mg, 0,25 mmol), MnCl2.4H20 (79,2 mg, 0,4 mmol), MgCl2.6H2 (162,6 mg, 0,8 mmol), DTT (306 mg, 2 mmol), KC1 (1,04 g, 15 mmol), NaN^ (20 mg, 0,31 mmol) a UDP (90 mg, 0,19 mmol) v HEPES pufri (100 mM, pH 7,5; 200 ml)-sa nastaví pomocou 10N a IN NaOH na pH 7,5 s enzýmy UDPGE (10 U), UDPGP (20 U), PK (100 U), GalT (5 U) a PPáza (100 U) sa pridajú k vzniknutému roztoku. Zmes sa mierne mieša pod atmosférou argónu pri teplote miestnosti pri 25 °C počas 5 dní. Potom sa zmes skoncentruje a chromaíografuje na silikagéli použitím zmesi trichlórmetánu, etylacetátu a metanolu (v pomere 5:2:2 až 5:2:3). Získa sa diaacharid, ktorý sa ďalej purifikuje na stĺpci Sephadex G-25, za vzniku LacNAcftOalyl (zlúčeniny 41) (1,7 g, výťažku 50 %) ^TH NMR (D20) $: 2,00 (3 H, s, NHAc),

3,49 (1H, dd, J 7,84, 9,97 Hz, H-2 Gal), 3,52-3,57 (1H, m,.H-5 GlcNAc), 3,63 (1H, dd, J 3,31, 10,04 Hz, H-3 Gal), 3,65-3,75 (8 H,m), 3,79 (1H, dd, J 5,10, 12.27 Hz, H-6a GlcNAc), 3,88 (1H, br d, J 3,32 Hz, H-4 Gal), 3,95 (1H, dd, J 2,14, 12,27 Hz, H-6b GlcNAc), 4,43 (1H, d, J

7,81 Hz, H-l gal), 4,55 (1H, D, J 8,28 Hz, H-l GlcNAc), 5,21-529 (2H, M, alyl 5,83-5,90 (1H, m, alyl ¹³C NMR (D₂0) S: 22,6, 55,5, 60,5, 61,5, 69,0, 70,9, 71,4, 72,9, 75,8, 78,8, 100,4, 103,3, 118,6, 133,7.

- 107 (b) Zlúčenine l-³³c-41 zo schémy 15

Roztok zlúčeniny 40 (1,15 g, 4,4 mmol), l-¹³C-Gal (99 Atóm. percent, zakúpené od Izotec Inc., Miamisburg,

OH; 800 mg, 4,4 mmol), PEP Ksoli (1,82 g, 8,8 mmol; 95 percent), UDP (90 mg, 0,19 mmol), ATP (100 mg, 0,18 mmol), cysteín (116 mg, 0,96 mmol), DTT (183 mg, 1,2 mmol), MgCl₂.6H₂0 (244 mg, 1,2 mmol), MnCl₂.4H₂O (118 mg, 0,6 mmol), KC1 (179 mg, 2,4 mmol) a Glc-l-P (77 mg, 0,22 mmol) v HEPES pufri (100 mM, pH 7,5; 120 ml) sa nastaví pomocou 10 N a IN NaOH ne pH 7,5, a enzýmy GK (10 U), PK (

200-U), PPáza (10 U), Gal-l-P UT (10 U), UDPGP (10 U) a GalT (10 U) sa pridajú k vzniknutému roztoku. Zmes sa mierne mieša pod atmosférou argónu pri.teplote miestnosti pri asi 25 °C počas 3 dní. Potom sa zmes skoncentruje pri zníženom tlaku a zvyšok sa chromatografuje na silikagéli použitím zmesi etylacetátu a metanolu (v pomere 2:1). Získa sa disacharid, ktorý sa čísle j purifikuje na stĺpci Sephadex G-25, pomocou vody, za vzniku zlúčeniny

1-¹³C-41 (106 g, 57 %). ¹H NMR (D₂0) ó: 2,00 (3H, s,

NHAc), 3,48-3,52 (1H, m, H-2 Gal), 4,43 (1H, dd,

H-2 8,32’ ^JH-1,13C-1 ¹⁶²>^{33 Hz}> ^{H_1 Gsl}b 4,54 (1H, dj J 8,32 Hz, H-l’GícNAc). HRMS vypočítané pre ¹²0χ6 ¹³CH29NO_xlNa (M+Na⁺) 447,1672, zistené 447,1681.

(c) 2-deoxy-D-galaktopyranozyl-b(l,4)-2-acetamido-2-deoxyglykopyranóza (zlúčenina 41b) (36 %): ako ³H NMR spektrum heptaacetátu tejto zlúčeniny, tak aj ³³C NMR spektrum zlúčeniny 41a sú v dobrom súhlase s oznámenými hodnotami (thiem et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30: 1163 (1991)).

108 (d) 2-amino-2-deoxy-D-galaktopyranozyl-b(1,4)-2-acetamido-2-deoxyglukopyranóza (zlúčenina

41b) (12 percent): ¹H NMR HC1 soli (ϋ_£0) £: 2,022,. 2,024 (s, NKAc a panomér GlcNAc), 3,17-3,23 (1H, m, H-2 GalN), 4,67 (d, J 7,53 Hz, H-lb GlcNAc), 5,13 (d,

J 1,54 Hz, H-la GlvNAc). HRMS vypočít pre ^]_4^26^1’θ1Ο^^δ z (M+Na⁺) 405,1485, zistené 405,1489.

• NMR spektrum ecetátovej formy tejto látky je v dobrom súhlase s oznámenými hodnotami (Palcic et al., Glycobiology, 1: 205 (1991)).

(e) Etyl-D-galaktopyranozyl—b(1,4)-2-azido-2-deoxy-D-glukopyranozid (zlúčenina 41c)

V tomto prípade sa DTT vypustí, kečže 2-azidoskupina sa pomocou DTT redukuje na zodpovedajúcu aminoskupinu. (15 percent): NMR (5anomér (D₂0) £: 1,22 (1H, t, J 7,80 Hz, OCH₂CH₃), 3,27 (1H, J 8,33, 9,64 Hz, H-2 z GlcNj), 4,40 (1H, d, J 7,81 Hz, H-l Gal), 4,55 (1H, H

8,24 Hz, H-l GlcN^). HRMS vypočít. pre C^^H₂^N^O^gNa (M+Na⁺) 418,1438, zistené 418,1438.

Akceptor, etyl-2-azido-2-deoxy-D-glukopyran‘ozid, sa vyrobí týmto spôsobom: triacetyl-D-glukál sa azidonit ruje (Lemieux et al., Can. J. Chem., 57: 1244 (1979)) použitím azidu sodného a komplexného dusičnanu ceritoamónneho Ce(NH^)₂(NO^)g v acetonitrile a acetolýzuje sa pôsobením octanu sodného v kyseline octovej. Získa sa

2-azido-l,3,4,6-tetra-0-acetvl-2-deoxy-D-glukopyranóza, na ktorú sa pôsobí bromidom titaničitým v zmesi dichlórmetánu a etylecetátu. Získaný glvkozylbromid sa potom glykozyluje použitím etanolu v prítomnosti trifluórmetán

109 sulfonátu strieborného (AgOTf) a molekulového sita 4 v dichlórmetáne. Po O-deecetylácií pomocou metoxidu sodného v metunole ss získa etyl-2-azido-2-deoxy-Ľ-glukopyranozid (celkový výťažok 22 %) vo forme zmesi snomérov φ (1:1,5).

¹H NMR (Ľ₂0) $: 1,21 (t, J 7,80 Hz, OCH^H^ (S anomér), 1,22 (t, J 7,80 Hz, 0CH₂CH₃), 2,99 (dd, J 7,43,

9,83 Hz, H-2 panomér), 5,11 (d, J 3,58 Hz, H-l anomér). HRMS vypočítané pre C g H^N^O^Cs (M+Cs⁺) 366,0066, zistené 366,0066.

Príklad 12

Sislylácia (schéma 16) (a) Zlúčenina 42

Roztok zlúčenina l-^^C-41 (210 mg, 0,50/umol), NeuAc (160 mg, 0,52/umol), PEP Na^ soli (120 mg, 0,51 mmol), MgCl₂.6H₂O (20 mg, 0,10 mmol), MnCl₂.4H₂O (4,9 mg, 0,025 mmol), KC1 (7,5 mg, 0,10 mmol), CMP (16 mg,

0,05 mmol), ATP (2,7 ,g. 0,005/Umol) a merkaptoet8nolu (0,34 ml) v HEPES pufri (200 mM, pH 7,5; 3,5 ml) sa nastaví pomocou IN NaOH na pH·7,5 a k výslednému roztoku, sa pridajú enzýmy NMK (5 U), PK (100 U), PPáza (10 U), CMP-NeuAc syntéza (0,4 U) a j;2,3SiaT (0,1 U). Zmes sa mierne mieša pod argónovou atmosférou pri teplote miestnosti (25 ^UC) počas 3 dní. Potom sa zmes skoncentruje a zvyšok ša chromatografuje na silikagéli použitím zmesi etylacetátu, izopropylalkoholu a vody (v pomere 2:2:1), za vzniku trisacharidu, ktorý sa áalej purifikuje na BioGel P-2 použitím vody, čím sa získa zlúčenina 42 (88 mg, 24 %).

110 ¹H NMR (Ľ₂0) d 1,81 (1H, br t, J 12,02 Hz, H-3ax NeuAc), 2,04 (6h, s, NHAc GlcNAc a NeuAc), 2,76 (1H, dd,

J 4,57, 12,33 Hz, H-3eq NeuAc), 3,96 (1H, br d, J 3,10 Hz, H-4 Gal), 4,13 (1H, dd, J 3,09, 9,94 Hz, H-3 Sal),

4,56 (1H, dd, J_R__{1 H}_₂ 7,83, J_{H-1 13C} 162^78 Hz, H-l Gal), 4,58 (1H, d, J 8,32 Hz, H-l GlcNAc). HRMS vypočítané pre ^C27^H44^N2°19^Cs2 <M-H⁺+2Cs) 980,0759, zistené 980,0720.

(b) NeuAcď2,3'Laktál zlúčenina 43 (82 mg) ^ΧΗ NMR (D₂0, 320 °K) $: 1,84 (1H, br t, J 12,18 Hz, H-3eq NeuAc), 2,08 (3Η, s, NHAc NeuAc), 2,82 (1H, dd, J 4,46, 12,32 Hz, H-3eq NeuAc), 4,01 (1H, br d, J

2,50 Hz, H-4 Gal), 4,16 (lH, dd, J 2,50, 9,50 Kz, H-3 Gal), 4,43 (1H, dt, J 1,18, 6,46 Hz, H-3 Glukál), 4,65 (1H, d, J 7,86 Kz, H-l Gal), 4,88 (1H, dd, J 2,63, 6,07 Hz, H-2 Glukál) a 6,51 (1H, dd, J 1,45, 6,08 Hz, H-l Glukál). HRMS vypočítané pre C₂₃H₃-NO^yNaCs₂ (M-H⁺+2Cs) 864,0092, zistené 864,0066.

Príklad 13 fukozylácia (schéma 17) (a) Zlúčeniny 44, 45 a 46

Roz+ok FucT (0,02 U, 2 ml) sa pridá k roztoku zlúčeniny 42 (23 mg, 0,031 mmol) a GĽP-Fuc (Ichikawa et al., J. Org. Chem., v tlači) (24 mg, 0,036 mmol) v pufri HEPES (3 ml, 200mM, pH 7,5) s obsahom 5mM ATP a 20mM msngánatých iónov. Zmes sa mierne mieša pod argónovou atmosférou počas 5 dní pri tejlote miestnosti (25 °C). Podobné výsledky sa dosiahnu použitím roztoku obsahujúceho zlúčeninu 42 (23 mg, 0,031 mmol) a GĽP-Fuc (70 mg, 0,105 mmol) v HEPES pufri (1 ml, 200mM, pH 7,4) s obsahom man111 gánatých iónov (20mM) a roztoku <l,3FucT (0,01 U) použitím podobnej manipulácie. Zmes sa skoncentruje a chromatografuje na silikagéli použitím zmesi etylacetátu, izopropylalkoholu a vody (v pomere 2:2:1), za vzniku tetrasacharidu, ktorý sa óalej prečistí na BioGel P-2 použitím vody. Eluát sa nechá prejsť stĺpcom živice Bowex 50W-X8 (vo vodíkovom cykle), stĺpec·sa elúuje vodou, e^y sa odstránili mangánaté katióny a eluát sa neutralizuje IN hydroxidom sodným a lyofilizuje sa. Získa sa zlúčenina 44 (18 mg). Podobným spôsobom sa tiež pripraví zlúčenina 45 (42 mg) a 46 (51 mg).

Zlúčenina <4: 1H NHR (D.O) Si 1,11 (3H, d, J 6,61 HZ, 6-CHj Fuc), 1,73 (1K, br t, J 12,04 Hz,

H-3ax . NeuAc), 1,96 (2H, S, NHAC GlcNAc) , 1,97 (3H, s, NHAc NeuAc), 2,69 (1H, dd, J 4,52 , 12,33 Hz, H-3eq

NeuAc), 3,46 (1H, d“, J 7,00, 9,68 Hz, H-2 Gal), 3,71 (1H br C, J 3,00 HZ, H-4 Fuc) , 4,02 (1H, dd, J

2,94, 9,73 Hz, H-3 Gal), 4,46 (IH, dd, J,₂ 7,90,

162,13 Hz, H-l Gal), 4,52 (1H, d, J 8,41 Hz, H-l GlcNAc), 5,04 (1H, □, J 3,93 Hz, H-l ' Fuc).

Zlúčenina < 5: 1H NHR (b.O) í: 1,17 (3H, d, J 6,61 Hz,.6-CHj Fuc), 2,03 (3H, s, NHAc GlcNAc),

3,50 (1H, ddd, J 6,47, 7,86, 9,56 Hz, H-2 Gal), 3,80

Fuc), 4,46 (1H, dd, J₁₂ Gal) , 4,59 (IH, d, J 8,44 (1H, br d, J 2,83 Hz, H-4 7,79, J,_KX 161,45 Hz, H-l Hz, K-l GlcNAc), 4,84 (1H, br q, J 7,50 Hz, H-5 ' Fuc), 5,11 (1H, d, J 3,90 Hz, H-l.· Fuc),.

Zlúčenina46: Ή NKR (DjO 320°K) 6: 1,11 (3H, d, J 6,61 HZ, 6-CKj ' Fuc), 1,84 (1H, br t, J 12,00 Hz, H-3ax NeuAc), 2,08 (3H, s, NHAc . NeuAc) , 2,80 (1H, dd, J 4,52, 12,38 Hz, H-3eq NeuAc), 4,49 (1H, br q, J

7,50 HZ, H-5 Fuc), 4,64 (1H, d, J 8,0 Hz, H-l

Gal), 5,02 (1H, dd, J 2,5, 6,0 Hz, H-2 Glukál), 5,09 (1H, d, J 3,93 Hz, H-l Fuc), 6,51 (1H, Hz, K-l ' Glu al).

dd, J 1,5, 6,0

112 (b) Gaipi,4(Fuc£l,3)-(5-tio)Glc

Roztok Gal^l,4(5-tio)Glc (30 mg, 84 mmol), GĽP-Fuc (60 mg, 84 mmol) a t<l,3/4FucT (0,5 ϋ) v pufri sa sodnej soli kyseliny kekodylovej (5,4 ml, 50mM, pH 6,2 ) s obsahom 6mM ATP s 20mM chloridu mangánatého sa 2 dni mieša pri teplote miestnoti. Hodnoty R^ východiskovej látky a produktu sú 0,39 a 0,31 pri chromatografii na tenkej vrstve oxidu kremičitého použitím zmesi etylacetátu, kyseliny octovej a vody (v pomere 3:2:1). Reakčná zmes sa priamo nanesie ne stĺpec Sephades G-25 Superfine (1,5 x 30 cm) a elúuje ss vodou. Frackie obsahujúce produkt sa spoja a nechajú sa postupne prejsť stĺpcom QAE-Sephadex a Ľowex 50-X8 (vo vodíkovom cykle) použitím vody ako elučného činidla. Vytekajúci prúd sa spojí a lyôfilizuje sa (výťažok 21 mg). NMR (ĽpO, 20 °C)

1,13 (3H, d, J=6,7 Hz, 6-CH₃ Fuc), 3,40 (lH, dd, J=6,4 s 11,7 Hz), 3,60 (1H, dd, J=3,6 a 11,7 Hz), 4,52 (1H, d, J=7,9 Hz), 4,95 (lH, J=2,6 Hz, 5,34 (1H, d, J=3,8 Hz)

Príklad 14

Kinetická štúdia enzýmov (a) FucT

Použije sa v podstate rovnaký skúšobný postup, aký bol popísaný vyššie (Fukowska-Latallo et al., Gene S- Ľevelopment, 4: 1288 (1990)) s určitými modifikáciami.

Čerstvo sa pripraví zásobná zmes obsahujúca 0,25mM GDP-l^C-Fuc (5000 cpm/ml), 6,25mM chloridu mangánatého a 62,5mM kakodylátu sodného (pufer s pH 6,2) a táto zmes sa udržuje na ľade. Bezprostredne pred použitím sa k to- 113 muto roztoku pridá FucT e reakcie se začne zmiešaním 16/Ul te^jto zmesi so 4/Ul lOOmM akceptora (celkový objem inkubačného roztoku je 20/Ul). Inkubácia sa uskutočňuje pri 37 °C počas 30 až 240 minút, v závislosti od toho, aký ekceptor sa študuje. Vykonávajú sa tiež zvláštne stanovenia za neprítomnosti akceptora, aby bolo možné skutočné pokusy opraviť na hydrolytické pozadie hydrolýzy GĽP-Fuc. Po skončení inkubácie sa pridá 400/Ul 25% (objemovo) suspenzie QAE-Sephadex. Tieto suspenzie sa jemne miešajú pri teplote miestnosti počas 10 minút a potom sa 1 minútu odstrečujú pri frekvencii otáčania 13000 min^-1.

Zo supernatantu sa odoberie 200/Ul a zmieša s 10 ml Scintilačného koktejlu. Rádioaktivita se spočíta v scintilačnom počítači. Dbá sa na to, aby v priebehu inkubačnej doby prebehla enzymatická reakcia menej než z 10 %. Toto stanovenie sa môže uskutočňovať za neprítomnosti ATP.

(b) GalT

Začiatočná rýchlosť enzymatickej reakcie sa stenoví meraním rýchlosti tvorby LacNAc použitím malej modifikácie Pierceho stanovania (Pierce et al., Anál. Biochem., 102: 441 (1980)). Všetky reakcie sa uskutočňujú v lOOmM kakodylovom pufri (pH 7,5) s pevnou koncentráciou mangénatých iónov (9,3mM) a UDP-Gsl (0,lmM, 58,5. cpm/pmol UDP-^^C-Gal) v 100 ml roztoku. Reakcia sa začne prídavkom GalT (0,05 U, 120 mg proteínu, výrobok firmy Sigma) a reakčná zmes sa nechá 30 minút stáť pri 20 °C. Nešpecifická hydrolýza UĽP-Gal sa meria pomocou kontrolnej reakcie uskutočňovanej za neprítomnosti GalT. Reakcia sa zastaví priechodom cez stĺpec QAE-Sephadex (700 ml), pričom elúcia sa uskutočňuje za'mierneho tlaku vzduchu, aby sa odstránil nezreagovaný UDP-Gal. Reakčná nádoba sa 2x premyje vždy 400 ml vody a výplach sa prejsť stĺpcom živice. Filtréty sa spoja a priamo prevedú do scintilačnej nádoby. Do nádoby sa pridá scintilačná tekutina a potom

114 sa zmeria rádioaktivita v kvapalinovom scintilačnom počítači. Dáta sa analyzujú pomocou dvojnásobného recipročného grafu, aby sa získala hodnota K_m (l,5mM pre GlcNAc) (Palcic et al., oznámili hodnotu 1,3 - lmM, Palcic et al., Carbohydr. Pes., 159: 315 (1987)) s íC (0,46 i 0,6mM) pre UDP.

Príklad 15

Enzým poskytujúci GDP-Puc, použitý v schéme 19 (a) Príprava enzýmu (GDP-FucS)

Baktéria Klebsiella pneumoniae, ATCC 12658, sa pestuje na 2 1 média obsahujúceho 10 g kazamino-kyseliny (Ľifco), 5 g kvasinkového oxtraktu, 3 g hydrogenfosforečnanu didraselného, 1 g dihydrogenfosforečnanu draselného a 5 g D-glukózy v jednom litri (pH = 7,0). Po inkubácii pri 37 °C (18 hodín) sa bunky zozbierajú centrifugáciou (10000 x g, 50 minút, 4 °C) a resuspendujú v 50mM tris pufru s obsahom 0,5mM DTT. Bunky sa rozbijú vo francúzskom lise pri tlaku 110 MPa. Bunkové zvyšky sa odstránia centrifugáciou pri 23000 x g (60 minút) a supernatant (extrakt neobsahujúci bunky) sa použije na purifikáciu enzýmu. Extrakt neobsahujúci bunky (50 ml) z dvojlitrovej kultúry sa zmieša s 60 mg sulfátu protemínu a vzniknutá zrazenina sa oddelí centrifugáciou. Potom sa pridáva síran amónny (pomaly a za miešania), až do dosiahnutia 70% nasýtenia (0,436 g/ml pri 0 °C). Po centrifugácii sa zrazenina oddelí a resuspenduje v 20 ml pufru (50mM tris pufer obsahujúci 0,5mM DTT, pH ~ 7,5) a dialýzuje sa cez noc (asi 18 hodín) pri 4 °C v 4 1 rovnakého pufru.

115 Výsledný roztok (20 ml) ss nechá prejsť stĺpcom ĽEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) (3 x 30 cm), ktorý bol dopredu ekvilibrovaný s rovnakým pufrom, Enzým sa elúuje použitím lineárneho gradientu od 0 do lmM chloridu sodného v rovnakom pufri (celkovo 400 ml). Aktívne frakcie sa spoja a dielýzujú v 2 1 50mM tris pufru obsahujúceho 0,5eiM ĽTT (pH 7,5). Tento enzýmový prípravok GĽP-FucS sa priamo použije pri príprave GPP-Fuc. Odhadnutá aktivita je asi 0,05 U/ml, podľa HPLC a NADPH oxidačného stanovenia.

(b) Enzymaticá príprava a regenerácia GĽP-Fuc z Man-l-P, schéma 19

Roztok imidazolu (lOmM), Man-l-P (lOmM), GDP (lOmM), PEP (lOmM), KF (5mM), Mg²⁺ (lOmM), (20mM), NAĽP (2mM),

EDTA (6mM), iPrOH (2 %), PK (80 U), TBĽH (32 U)., kvasinkových buniek (S. cerevisiee, 52 mg lyofilizovaných buniek z 50mM tris pufru (pH 7,5), enzýmu poskytujúceho GĽP-FucT (400 ml) v HEPES pufri (pH 7,5) (celkový objem roztoku je 2 ml) sa inkubuje 18 hodín pod aŕgónovou atmosférou pri 37 °C.

Použije sa HPLC stĺpca Partisil 5 SAX (Whatmen Co.), 0,46 x 12,5 cm s veľkosťou častíc 5/um. Ako mobilné fáza sa použije O,1M fosfátového pufru /pH 3,5) s prietokom 0,5 ml/min (za tlaku 4,1 MPa). Zlúčeniny sa detegujú pomocou UV detektora pri 254 ňm. Retenčná doba pre GDP-Men je 9,92 minúty a pre GĽP-Fuc 13,4 minút. Na základe enalýzy HPLC sa zistí, že vznikne 5 % GĽP-Fuc a 30 % GĽP-Men.

Pridá sa roztok zlúčeniny 41 alebo 42 (lOmM) v 2 ml HEPES pufru s pH 7,5, s obsahom 5mM ATP a 20mM chloridu mangánatého a zmes sa 5 dní mieša. Pri chromatografii na tentkej vrstve silikagélu sa zisti hodnota R^ =

- 116 = 0,28, pre zlúčeninu 45ε0,50 pre zlúčeninu 41, použitím zmesi etylacetát :kyselina octová:voda v objemovom pomere 4:2:1 a hodnota 0,56 pre zlúčeninu 44 a 0,63 pre zlúčeninu 42, použitím zmesi IM amoniaku a izopropylalkoholu v objemovom pomere 1:2,4. Zlúčeniny 4^ a 44 (8 mg a 4 mg) sa izolujú a purifikujú vyššie popísanými spôsobmi.

Príklad 16

Purifikácia GDP-fukóza pyrofosforylázy na použitie pre reakcie znázornené v schéme 20 (a) Výroba enzýmu

Prasačia pečeň (4 kg) sa homogenizuje v ľadovom chladnom lOmM MOPS s pH 7,5 s obsahom 1 mg/ml každej z nasledujúcich látok, antipainu, sprotinínu, chymostatínu, leupeptínu a pepstatínu v miešači Waring (5 pätnásťsekundových cyklov pri nastavení na najvyššiu rýchlosť). Zvyšky buniek sa odstránia 2ominútovým odstreďovaním pri zrýchlení 8000 x g a teplote 4 °C. K jednotlivej frakcii supernatantu sa pridá 2% roztok sulfátu protamínu. Zmes sa mieša 5 minút a zrazenina sa oddelí spôsobom popísaným vyššie. Potom sa k frakcii supernatantu pomaly pridáva síran amónny až do 50% nasýtenia (0,291 g/ml) pri teplote 0 °C. Po odstredení (za vyššie popísaných podmienok) sa zrazenina zhromaždí a resuspenduje v 1600 ml 1,2M síranu amónneho.

Vzorka sa zmieša so suspenziou živice fenyl-Sepharose (250 ml), ktorá bola ekvilibrovsná v 1,2M síranu amón neho. Živica s viazaným enzýmom sa potom premyje 1,2M roztokom síranu amónneho (1,5 1) s sktivita enzýmu sa elúuje 0,4M síranom amónnym (750 ml). Tento postup sa opakuje, pričom živicou sa nechá pretekať elučné činidlo

117 tak dlho, dokiaľ sa väčšina aktivity enzýmu zo vzorky neodstráni.

časť eluátu (200 ml) zo živice fenyl-Sepharose sa dialýzuje proti lOmM MOPS s pH 7,5 a potom sa nechá prejsť stĺpcom ĽEAE 5PW (15 x 2,15 cm), ktorý bol ekvilibrovaný. v rovnakom pufri. Aktivita enzýmu sa v prúde odtekajúcom zo stĺpca skoncetruje pomocou ultrafiltračného zariadenia Amicon.

Potom ss vzorka podrobí gelovej filtrácii na stĺpci TSK Gel 3000 SW9 (30 x 2,15 cm), ktorý bol ekvilibro vaný v 50mM MOPS s pH 7,5 so 150mM chloridu draselného. Rovnaké zloženie roztoku sa použije tiež ako mobilná fáza. Aktivne frakciessa zhromaždia a uložia vo forme suspenzie zrazenej 50% síranom amónnym. V priebehu purifikácie sa GĽP-Fuc pyrofosforyláza stanovuje spôsobom popísaným Ishiharou a Healthom (Isbihars et al., J. Bio.

Chem., 243: 1110 (1968)). Jedna jednotka aktivity je de32 finovaná ako zavedenie 1 mmol anorganického P-pyrofosfátu do GTP za minútu.

(b) Regenerácia GĽP-fukózy použitím GĽP-fukóza pyrofosforylázy, schéma 20, syntéza Sialyl Lewis-x

Roztok MOPS, pH 7,5 (50 mM), Fuc 1-P (10 mM), GĽP (1 mM), PEP (10 mM), KF (5 mM), Mg²⁺ (10 mM), Mn²⁺ (10 mM), PK (5 U), sialyl-t3H)-LacNAcft-0-(CH₂)₆C0₂Me (10 mM) <<l,3FucT (0,1 U),a anorganická pyrofosfatáza (5 U), a GĽP-Fuc pyrofosforyláza (0,1 U) sa zmiešajú v objeme 100 ml. Reakčná zmes sa inkubuje v zariadení na prevracanie skúmaviek pri teplote miestnosti počas 60 hodín. Produkty sa zhromaždia na stĺpci Sep-Pac C18 a elúcia sa uskutočňuje 50% metanolom. Vzorka sa vysuší odparením pri zhíženom tlaku, resuspenduje sa vo vode a snalýzuje sa

118 chromatografiou na tenkej vrstve na silikagélových doskách , použitím zmesi izopropylalkoholu a IM octanu amónneho (6:1), ako rozpúšťadla. Vznikne sialyl Lewis-x vo výťažku približne 30 %, podľa stanovenia v scintilačnom počítač i.

Príklad 17 (2R)-metyl-(5S )-hydroxymetyl-(3R,4R)-dihydrox.ypyrolidín (zlúčenina 50)

A) Cis-2,3-epoxy-l,4-butándiol

Cis-2,3-epoxy-l,4-butándiol sa pripraví z 1,4-dihydroxy-2-buténu spôsbom popísaným v Nelson. et al., J.

Med. Chem., 19: 153 (1976), len s tým rozdielom, že sa reakcia uskutočňuje pri teplote miestnosti počas 36 hodín.

B) 2-azido-2-deoxytreitol

Roztok s obsahom cis-2,3-epoxy-l,4--butándiol (1,82 g, 17,5 mmol), azidu sodného (NaNp 5,68 g, 5 ekvivalentov) chloridu amónneho (NH^Cl, 4,68 g, 5 ekvivalentov) v 100 ml metanolu a 12 ml vody sa 24 hodín varí pod spätným chladičom. Rozpúšťadlo sa odstráni pri zníženom tlaku, potom sa pridá etanol a zrazenina sa odfiltruje. Zrážací postup sa niekoľkokrát opakuje, aby sa odstránil nadbytok azidu sodného a chloridu amónneho. Získa sa 2-azido-2-deoxytreitol vo forme žltej kvapaliny (90% výťažok). Rf = 0,28 (100% etylacetát), IČ (v hmote) 2109 cm^-1 (-N₃);

¹H NMR (CĽ₃COCĽ₃) δ: 3,49 (1H, m) 3,59 (3H, m),

3,79 (5H, m), 4,03 (1H, t, J=5,5 Hz), 4,19 (1H, d, J=5,5),

4,30 (1H, T, J=5,5 Hz) ppm. HRMS (M+H⁺) vypočítané pre 148,0722, zistené 148,072.

119 C) 5-azido-5-deoxy-L-x.ylohexulóza-l-fosfát

Roztok obsahujúci 2-azido-2-deoxytreitol, pripravený vyššie popísaným spôsbom (476 mg, 3,24 mmol) v 10 ml vody sa ochladí na 0 °C a pridá sa k nemu jodistan sodný (NalO^, 762 mg, 1,1 ekvivalentu). Po 10 minútach východisková lt.áka úplne zmizne a v chromatograme, získanom chromatografiou na tenkej vrstve sa objaví nová škvrna (R^ - 0,5, et.ylacetát). Potom sa k roztoku pridá chlorid bárnatý (BsC^ - 2 1^0, 870 mg, 1,lekvivalentu) a vzniknutá zrazenina sa odfiltruje. Roztok sa okylsí na pH 1 pomocou živice Bowex 50 vo vodíkovom cykle. Racemic ký 2-azido-3-hydrox.ypropiónladehyd, ktorý sa takto získa sa neizoluje.

Po filtrácii sa roztok obsahujúci racemát salkalizuje 10N hydroxidom sodným na pH 7. Potom sa pridá dihydroxyacetónfosfát (1,5 mmol) a hodnota pH roztoku sa opäť upraví 10N roztokom hydroxidu sodného na pH 7. K vzniknutému roztoku sa pridá FDP aldoláza z králičieho svalu (500 jednotiek) a roztok sa pomaly mieša počas 2 dní. Enzymatickým stanovením sa zistí, že sa všetok BHAP spotreboval.

Titulná zlúčenina sa najprv izoluje vo forme bárnatej soli tak, že sa pridajú 2 ekvivalenty dihvdrátu chloridu bárnatého k reakčnej zmesi. Roztok sa udržuje cez noc (18 hodín) pri teplote -20‘°C. Zrazenina sa oddelí a spracuje pomocou živice Dowex 50 (vo vodíkovom cykle, uloženej v destilovanej vode, aby sa odstránili bárnaté katióny. Po filtrácii sa pH získaného roztoku opäť nastaví na 7 a roztok sa lyofilizuje. Získa sa prečistené zlúčenina menovaná v nadpise (vo výťažku 75 %). ¹H NMR (Ľ₂0)

120 & 3,13 (1Η, d, J-9,5 Hz, H-3), 3,14 (1H, ddd, J=9,5, 5,

Hz, H-5), 3,20 (1H, t, J=ll Hz, H-6a), 3,31 (1H, t, J-9,5 Hz, H-4), 3,37 (1H, dd, J=6, 11 Hz, H-6e), 3,40-3,44 (2H, m, 2 x H-l) ppm. ¹³C-NMR (ĽgO) ó 61,78, 63,36, 67,35, 70,95, 97,67 (d, J=9,5 Hz), ppm. HRMS (M-4H⁺ + 5Na⁺) vypočítané pre 395,9540, zistené 395,9538.

D) Zlúčenina 50

Roztok 5-8zido-5-deoxy-L-xylokexulóza-l-fo sfátu (100 mg, 0,35 mmol) v 5 ml vody ss hydrogenizuje za prítomnosti 20 mg 10% pšLádia na uhlíku pod tlakom vodíka 275 kPa počas jedného dňa. Katalyzátor sa odfiltruje a filtrát sa skoncentruje pri zníženom tlaku. Zvyšok sa chromatografuje na stĺpci siliksgélu (použitím zmesi metanol:chlóroform:voda v pomere 6:4:2, ako elučného činidla). Získa sa zlúčenina 50 (40 mg, výťažok 78 %, v pomere 2R:2S približne 6:1).

³Η NMR (Ľ20) á 1,31 (3H, d, J=7 Hz, 2R-CH3), 1,27 (3H, d, J=6,5 Hz, 2S-CH3), 3,36 (1H, m, H-2), 3,66 (1H, m, H-5), 3,74-3,81 (2H, m, 2 x H-5), 3,85 (1H, m, H-3), 4,08 (1H, dd, J=2,5, 4,5 Hz, H-4) ppm; ¹³C-NMR (D20) S 16,58 (C-2'), 57,90 (C-5'), 61,50, 63,44, 75,62,’ 87,09 ppm. HRMS (M+H⁺) vypočítané pre 148,0974, zistené 148,0974

Príklad 1. 8

Výroba FucT inhibítorov, zlúčenín 51 až53

Inhibítorové zlúčeniny 51 az53 sa vyrobia všeobecne spôsobom, ktorý je znázornený v schéme 25.

121

Schéma 25

OH O

CHO

Si OH

OH O (R)-«

OH

Pri syntéze zlúčenín 51 až 53 sa ako akceptory pre aldolázou katalvzované reakcie s dihydroxyacetónfosfátom (stupeň a, fukulóza-l-fosfát aldoláza; stupeň b, fruktóza-1,6-difosfát aldoláza z králičieho svalu) použije azidoaldehvd (S)-54 a (R)-54, za vzniku intermediár nych fosfátov, na ktoré sa najprv pôsobí kyslou fosfatózou a potom sa redukčné aminujú (stupeň c,; vodík za prítomnnšti paláóis na uhlíku pri tlaku 344 kPa), za vzniku výsledných produktov, ktoré obsahujú dve prídavné chirál ne centrá v. polohe 3 ε 4.

Zlúčeniny (S)-54 s (R)-54 sa· pripravia z 2-butín-1-olu reakciou s Lindlsrovým katalyzátorom, po ktorej sa uskutoční epoxidacis a otvorenie azidom, za vzniku zodpovedajúcich enantiomérov 2- a 3-3zidiolov v pomere 6:1. Štiepenie 2-azidodiolov sa uskutoční použitím lipázy s Pseudomonss sp. a vinylacetátu, ako acylačného činidla (Wang et al., J, Org. Chem., 53: 3127 (1988); Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 7200 (1980)), za vzniku (2R,3S)-2-azióo-3-hvdroxy-4-acetátu a (2S,3R)-2-azido-3,4-diacetátu, vo vysokej optickej čistote, podľa sta122 novenia NMR za prítomnosti Euíhfc)^. Prečistený azidohydroxyacetát a azidodiecetét sa oddelene hydrolyzuje, za vzniku zodpovedajúcich diolov, ktoré sa potom oxidačné štiepia pomocou jodistanu sodného, čím sa získajú zlú čeniny (S)-54 a (R)-54.

Zlúčeniny 51 až 53 majú tieto fyzikálne dáta;

Zlučenina53 : [ c]_b ^2í-ť21j S° (c=l,0, CHjOK); Rí=0,20 (CHCl₃/CK₃OH/H₂O/NH,OH=5/4/l/0_;08) ; ’H NMR (500 MHz, CDjOD/TMS): 5 1,140 (3H, d, J=6 Hz, CH₃) , 2,34-2,45 (1H, n, CKN), 2,47-2,55 (1H, m, CRN), 3,656 (ÍR, dd, J=4 Kz a 11 Kz, CH_aO) , 3,744 (1H, dd, J=5 Rz a 11 Kz,

CHj.0) , 3,876 (ÍR, dd, J=5 Hz a 5 Kz, CHC) , 4,263 (ÍR, dd, J=5 Hz a . S Rz, CHO). ¹³C NMR (125 MRz, CDjOD) : i 12, 58, 60, 56, 65,24 , 70, 55, 72,14, 73,SS. HRMS (M-R*) vypočít. 148,0574, zistené ¹⁴⁸/⁰⁸⁸³ , učenina 52 : [ c )_p ^í5+22, 7° (c=l,2, CHjOH) ; Rf=0,19 (CHC1₃/CRjOH/K₂O/NH,OH=5/4/1/0, 08) ; ’h NMR (500 MHz, CDjOD/TMS): 6 1,162 (3H, d, J=6,5 Hz, CK₃) , 2,915 (ÍR, dt, J*=4 a . 4,5 Rz CRN), 3,213 (1H, dq, J=4 a 6,5 Hz, CRN), 3,650 (1H, dd, J=5 Hz a.·.. 11 Hz, CH/)) , 3,685 (1H, dd, J=5 Hz a., 11 Hz, CH_bO) , 3,741 (1H, dd, J=l,5 Hz a 4 Hz, CHO), 3,835 (ÍR, dd, J=l,5 Hz a 4 Hz, CHO)'. ¹³C NMR (125 MHZ, CDjOD) : S 12,12, 57,85, 63, 07, 68,60,

80,60, 81,54. HRMS (M+ίΓ) vypočít.^{14 8}1 0974 , zistené 148,0964.

Zlúčenina 51: [α)_β ²⁵+39,1° (c=0,8, CHjOH) ; Rf==0,19 (CKCl3/CH3OH/H2O/NHiOK«^Í5/4/l/0/08) ; ’H NMR (500rMHz, CDjOD/TMS): S 1,193 (3R, d, J=6,5 HŽ, CHj) , 2,920 (1H, dt, J=6,5 a 7,5 Hz, CKN), 2,582 (ÍR, ddd, J=4,5, 6,5 a. 6,5 Rz, CKN), 3,500 (1H, dd, J=6,5 Hz a. 7,5 Hz,

CHO), 3,572 (1H, dd, J=6 Hz a 11 Hz, ΟΗ,Ο) , 3, 644 (1H, dd, J=4,5 Hz a 11 Hz, CH_&O) , 3,751 (1H, dd, J=6,5 Hz a 6,5 Hz, CHO). ^,3C NMR (125 MRz, CDjOD): S 18,83,

58,07 , 63,61, 64,36, 79,88 , 84,88. HRMS (M-ťH*) vypočít. 148,0974. Zistenél43,0971.

- 123 Príklad 19

Spôsoby syntézy zlúčenín uvedených v schémach 21 až 23 a fyzikálne dáta týchto zlúčenín

Zlúčeniny 61 až 99 a spôsoby ich syntézy boli prediskutované v súvislosti so schémami 21 až 23. Vybrané dáta NMR a HRMS zlúčenín z týchto schém sú uvedené v tabuľkách 6 až 8, ktoré nasledujú. Špecifické podrobnosti syntézy príkladných zlúčenín, okrem tých, ktoré už boli diskutované, sú uvedené čalej.

Calej popísané postupy boli tiež aplikované na iné glykozyl-l-fosfátové zlúčeniny 89 ε 95. Jediná modifikácia sa vyskytuje v purifikaenom stupni zlúčenín 68,

69, 75 a 76. Ako elučné činidlo pre zlúčeniny 68 a 69 sa používa etylacetát, pre zlúčeninu 75 zmes etylecetátu a hexánu v pomere 2:3 a pre zlúčeninu 76 zmes trichlórmetánu, etylacetátu a metanolu v pomere 15:0,5:0,2.

(A) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-Ľ-glukóza (zlúčenina 71)

Roztok pentaacetátu zlúčeniny 64 (5,0 g, 12,8 mmol) a BnNH2 (19,2 mmol) v tetrahydrofuráne (30 ml) ss udržuje cez noc pri teplote miestnosti (približen 18 hodín). Zmes sa zriedi chladnou vodou a extrahuje trichlórmetánom (3 x 50 ml). Spojená organická vrstva sa postupne premyje ľadovo chladnou zriedenou kyselinou chlorovodíkovou, nasýteným roztkom hvdrogenuhličitanu sodného, nasýteným roztokom chloridu sodného a vodou a potom sa vysuší bezvodým síranom sodným a skoncentruje pri zníženom tlaku. Sirup, získaný ako zvyšok, sa prečistí chromatografiou na silikagéli za použitia zmesi etylacetátu a hexánu (2:3)

124

Získa sa zlúčenina 71 (3,80 g, 85 %) vo forme zmesi anomérov j;:p= 3:1, podľa analýzy NMR (CDCl^).

(B) Bibenzylfosfinyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-B-glukózafosfit (zlúčenina 78)

Bibenzyl-N,N-dietylfosforoamidit (0,86 g, 7,3 mmol) sa pridá k roztoku zlúčeniny 71 (1,0 g, 2,9 mmol) a 1,2,4-triazolu (0,8 g, 11,5 mmol) v bezvodom dichlórmetáne pod atmosférou dusíka a pri teplote miestnosti. Zmes sa 1 až 2 hodiny mieša pri teplote miestnofti a potom sa zriedi éterom. Ďalej sa zmes postupne premyje ľadovo chladným nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, nasýteným roztokom chloridu sodného a vodou, vysuší sa bezvodým siričitsnom sodným a skoncentruje sa pri zníženom tlaku. Výsledný sirup sa chromatografuje na silikagéli použitím zmesi etylacetátu a hexánu v pomere 1:4. Získa sa zlúčenina 78 (1,73 g, 97 %) vo forme zmesi snomérov = 1:4 podľa analýzy NMR (CDCl^).

(C) Ľibenzylfosforyl-2,3,4, 6-tetra-O-acetyl-B-glukóza (zlúčenina 25)

K roztoku zlúčeniny 78 (1,2 g, 2,2 mmol) v tetrahydrofuráne (50 ml), ochladenému v kúpeli zo suchého ľadu a acetónu na -78 °C, sa prikvapká 30% peroxid vodíka (10 ml) a zmes sa nechá ohriať na teplotu miestnosti, a potom sa 1,5 hodiny mieša pri teplote miestnosti. Potom sa zmes zriedi éterom a postupne premyje ľadovo chladným nasýteným roztokom tiosíranu sodného, nasýteným roztokom hydrogenu ličitanu sodného, nasýteným roztokom chloridu sodného a vodou. Organická fáza sa vysuší bezvodým síranom sodným a skoncentruje sa. Získa sa zmes anomérov íjjbv pomere 1:4 zlúčeniny 85 (1,36 g, 98 %) (podľa analýzy ¹H NMR (CĽC1₃).

- 125 Tento produkt sa bez čistenia použije v nasledujúcom stup ni.

(D) Glukóza-l-fosfát (zlúčenina 92)

Zlúčenina 85 (1,0 g, 1,8 mmol) sa hydrogenizuje za tlaku 101 kPa, použitím 5% paládia na uhlíku (200 mg) v etanole (30 ml) a 10% hvdrogenuhličitane sodnom (20 ml) počas 10 hodín pri teplote miestnosti. Zmes sa prefiltruje a filtrát sa skoncentruje. Na zvyšok sa pôsobí IN roztokom hydroxidu sodného (10 ml) pri teplote miestnosti počas 10 hodín. Zmes sa neutralizuje ľadovouchladnou IN kyselinou octovou na pH 7,5 a nerozpustná látka sa odfiltruje. Alternatívne sa namiesto roztoku hydroxidu sodného použije roztok zmesi metanolu a vody (1:1, objemovo) v 10% trietylamíne, aby bolo možné eliminovať nasledujúci neutralizačný stupeň. Filtrát sa skoncentruje, zriedi sa vodou a nechá sa prejsť stĺpcom živice Ľowex 50W-X8 V sodíkovom cykle) (1 x 15 cm) použitím vody ako elučného činidla. Vhodné frakcie sa spoja a lyofilizujú, za vzniku zlúčeniny 92.

Niekedy je pozorované malé množstvo defosforylovaného produktu. Tento produkt sa odstráni tým, že sa zriedený filtrát nechá prejsť stĺpcom živice Ľowex 1W-X8 (v HCO₂ forme) (1 x 30 cm). Stĺpec sa najprv elúuje vodou, abv sa odstránil neutrálny produkt a potom sa aplikuje lineárny gradient hydrogenuhličitanu amónneho (O,1M až O,3M), aby sa elúoval požadovaný produkt. Vhodné frakcie sa spoja a lyofilizujú. Lyofilizovaný prášok sa rozpustí vo vode (10 ml), ochladí na 0 °C a neutralizuje sa na pH 7,0 pomocou živice Ľowex 50W-X6. 6ivi.ca sa odfiltruje a filtrát sa opäť lyofilizuje. Tak sa získa zlúčenina 92 (0,30 g, 59 %) vo forme zmesi anomérov = 1:4, podľa analýzy ^H NMR (Ľ₂0).

- 126 (E) Met,yl-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-0-acetyl-3,5-dideoxy-(5-Ľ-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozonát (zlúčenina 96)

Táto zlúčenina sa vyrobí spôsobom popísaným v Marra et al., Carbohydr. Res., 190: 317 (1989). Alternatívne sa môže postupovať tak, že sa zmes metyl-2-chlór-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-0-acetyl-3,5-dideoxy-(M)-gl,ycero-Ľ-galakto-2-nonulopyranozonátu (Kuhn et al„, Chem. Ber.,

99: 611 (1966)) (0,67 g, 1,3 mmol) a uhličitanu strieborného (0,363 g, 1,3 mmol) v acetóne (5 ml) s vode (0,5 ml) 10 hodín mieša pri teplote miestnosti. Suspenzia sa prefiltruje cez lôžko celitu 545 a filtrát sa odparí dosucha. Zvyšok sa zriedi chloroformom, premyje sa vodou a roztokom chloridu sodného a vysuší sa síranom sodným. Roztok sa odparí pri zníženom tlaku, tak sa získa surová látka, ktorá sa chromatografuje na stĺpci silikagélu (použitím zmesi chloroformu a metanolu v pomere 25:1). Získa sa zlúčenina 96 (0,568 g, 88 %) vo forme bielych ihličiek.

^H-NMR (CĽCl-j) í: 1,90, 2,02, 2,03, 2,10, 2,14 (2H každý, s, 4x0Ac a NAc), 2,17 (1H, dd, J 5,04, 12,72 Hz, H-3eq), 2,29 (1H, dd, J 11,52, 12,72 Hz, H-3ax),

3,87 (3H, s, COOMe), 4,02 (1H, dd, J 7,04, 12,4 Hz, H-9),

4,12 (1H, dd, J 2,1, 7,8 Hz, H-6), 4,13 (1H, d, J 7,8 Hz, NH), 4,17 (1H, ddd, 7,8, 9,8, 10,28, Hz, H-5), 4,42 (1H, dd, J 1,92, 12,4 Hz, H-9), 5,20-5,26 (2H, m, H-4 a H-8), 5,32 (1H, dd, J 2,1, 6,50 Hz,' H-7), 5,37. (1H, bs, OH).

(F) Metyl-5-8cetamido-4,7,8,9-tetra-0-acet.yl-2-(dibenzylf osf ityl )-3,5-dideoxy-Pz-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyrenozonát (zlúčenina 97)

Ľibenzyl-N,N-dietylfosfoamidát (0,25 g, 0,78 mmol) sa prikvapká k roztoku zlúčeniny 96 (0,166 g, 0,34 mmol)

- 127 a ΙΗ-tetrazolu (0,10 g, 1,43 mmol) v tetrahydrofuráne (5 ml) pod atmosférou dusíka a výsledná zmes sa 4 hodiny udržuje pri teplote miestnosti. Potom sa k zmesi pridá dichlórmetán (10 ml) a organická fáza sa premyje ľadovo chladnou zriedenou kyselinou chlorovodíkovou, vodným hydrogenuhličitanom sodným a ľadovou vodou a vysuší sa bezvodým síranom sodným. Roztok ss odparí pri zníženom tlaku a tak sa získa surová látka, ktorá sa chromatografuje nastĺpci silikagélu použitím zmesi etylacetát:hexán v pomere 5:1, za vzniku zlúčeniny 97 (0,17 g, 68 %) vo forme bezfarebného sirupu.

170,4, 170,8, 171,0. HRMS: vypočítané pre C₃₄H₄₂NO₁₅PCs (M+Cs⁺) 868,1346, zistené 868,1346.

(G) Metyl-5-ecetamido-4,7,8, 9-tetra-O-acet.yl-2- (d ibenzylf osf oryl )-3,5-d ideoxy-f’-Ľ-glycero-Ľ-galakto-2-nonulopyranozonát (zlúčenina 98)

K ochladenému roztoku zlúčeniny 97 (0,13 g, 0,17 mmol) v tetrahydrofuráne (2 ml) sa pridá t-BuO₂H (0,4 ml) pri teplote -10 °C, zmes sa nechá ohriať ne teplotu miestnosti a počas 1 hodiny sa mieša pri rovnakej teplote. Potom sa zmes zriedi dichlórmetánom, premyje sa ľadovo chladným roztokom hydrogenuhličitaňu sodného a vodou a vysuší sa bezvodým síranom sodným. Organciká fáza sa odparí pri zníženom tlaku a tak sa získa surová látka, ktorá sa chromatografuje na silikagéli použitím zmesi trichlórmetánu a metanolu v pomere 25:1. Získa sa zlúčenina 98 (0,126 g, 95 '%) vo forme bezfarebného sirupu.

HRMS: vypočítané pre C^H^NO^PCs (M+Cs⁺) 884,1396, zistené 884,1305.

128 (H) Metvl-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-^-Ľ-glycero-Ľ-galakto-2-nonulopyrenozonát-2-fosforečná kyselina (zlúčenina 99, vodíková forma)

Zlúčenina 98 (0,22 g, 0,25 mmol) sa hydrogenizuje pri tlaku vodíka 101 kPa za prítomnosti 5% paládia na uhlíku (10 mg) pod atmosférou vodíka 7 hodín pri teplote miestnosti. Katalyzátor sa odfiltruje ne lôžku z celitu 545 a filtrát sa skoncentruje pri zníženom tlaku. Surová látka se chromatografuje na stĺpci silikagélu s reverznou fázou, použitím zmesi acetonitril:voda (5:1) za vzniku zlúčeniny 99 vo vodíkovej forme (0,164 g, 99 %) v podobe bezfarebného sirupu.

HRMS: vypočítané pre (Z^qH^qNO^PCs (M+Cs⁺) 704,0356, zistené 704,0356.

129

to rc
> q? CO	q
+-'	ty
c: .
co	-P
-P	id
>:0	o
q	G
O	w
M 'CO	GJ •r-M
C!	q
>o	ro
M	>
CO	'>3
q	q
o	id
-t-	ω
q	q
•r-t	G
ro	q
e	id TO
G	ω
G	H
>	w <o
q q	Ό >
m
o	XD
G	q
'>5	ω >
_Si	<->
O	q
Ή	CO
£	-P
ω	CO
Ä	ω
O	q
..
d	X)

- 130 'Ί g

ΡΊ ' C ! pT i

S S

ΓΜ ~

Ž £ cT-*

ΓΡ —· C O ρΓγΤ

O O c* cT S S cí* r*

-° 5Í *5·

A ▼ —· ? i_ e < —«

-M X ý

-. 2

í.

•5 o

ŠEII « _ •3? λ r*. ^c c—. í

Č ΑΛ s ¹¹ í

^s- -Ξn — «s _O8 8.S.

j C rľ Í « Ä w-t V» Ό <? (ζ. 'r' *-T s-* Λ

B >

C? ,Λ

I rs

J. I

Π r<

«π —*

C

Θ9

Y“>

<A

n. r-r tO ·“* „g

T *n

-r

O T. (-1 w*i —*

- n n c^c <M -»ÍO

- r« » ri C*\

8¾

Θ < -Q C <6 *o • wT *1

ΓΊ

S

Tabuľka 6 (pokračovanie) o

ΪΏ-?á-~

So rs e-„ «Ί. pfpc r? t-“ če p cΊ. -“ _ O -5 X r-> n. cr o

(P c- e š s

E >~ľ *->

ee <

*<

T <n O ΓΊ ec.

r>* t— 5ŕ n t. «0

O *» r*ľ «©” X r. c. “S. o m n ao {? *m **

O cm — r·» n k •Ό

C o 55

3ľl·!žCs-í?

š

T** r* g

s ry i

« u

z s

I £

•o d: HRMS ítM^CjiIIj^POj, ΝΝ» (MiN»’) 6H,I767, zist 6M.I7VÍ.

e: lIRMS^/wŕť/rpC^lljjPO^Ci (MlC»+) 725,07M, 2/^,725,0704^77.725,0760 ^7(1.725,0766 prel).

- 131 Tabuľka 6 (pokračovanie)

-S

X vi C

ΓΊ —

C ^-*X <x w>

S* ° Ώ í <| J

-K ΓΊ — 2* Cm tn cTcT

Τ' »M *M o c r ^3.

, ΓΊ Ό

X Žš

-Λ c* r-T o £>

ς *·

X í* n, o

n.

Sm

-5 5 * í •x 5

á. á r·» *1 *r «-^ Ό

CM w>

x- x c c Ώ. c’

J r X r·.

o X £

n.

X

n.

o o k O *▼ ^ew -5 V , - ’ ? X Ό ξ 2- Ď- %. ľO «Α C'

-x X X _es.g £

-» c r? c< o ~ — n Ό ’C *5. X X

CM V

CO *Ί

X wt _cc S S =_-r ΓΜ . Λ S-®⁴ · = ο « s n. * m < r? ^ ·**-»*° S 2^ ľ? ~ T 5L3-ľ?

ľ? <» «L X »n ⁰ 2 S 20 o o <=·« T. S - * — n e<1 -'-

•r“í	•rM
g	s
'>5	'>>
£3	£3
O	ω
S	e
K3	xc
c	G
CQ	N
O	O
CO	10
0) .	ω
to	w
CO	CO
(—1	1—1
43 ·	43
'B	'L
to	CO
S	S
0	O
	L
43	43
O	O
Ό	T3
>..	>
'b	'3
CO	CO
CC	CO
P	-P
'CO	'CO
O	T3
«	P3
53
2;	S
33	W- t-M
rH	rH
.,	..
<H ·	QjO

132 ζ

ο ο

C-I ΰ

ar

Γ*.

η „íl

Š x Ž S.*, i

Sf^

O X5 *· w-j

Š!.

f i ž “ΐ. »-Γ «η c*

-» c? <

rľ

C m

γΓ

X *.

= x s-’-i.-. -» r<

5- « ·“

R «5 «.

«·_ w-> «S c

P?

Jl —

Γ* * ΓΊ r) ·>

m •Í rí * c-T —* *t LZ* *“ λ o < < P* Ä J «I r-Γ e c*>

O «n

Šľ£ θ'

C* < _c «c c:

•“t,* — r/* n

G ⁿ * ·· ·-» * γί -« -* *<

r>

ω

Ή

Č ω

>

ο >ο ω

b

2d

Ο

Ρ.

ο (0

Fd rH

-Ο α3

Η _ cc C

3í c^wn.

? ň.

-* «S C*

O

Wi o

n.

r t r\ £ **1 % M rt *\ n n ľS

Λ m —* γί —>

O WS ° *?

O — H. *1

- ' (-1 p>

í rí rX c< 6.

ľ'-- í (S fi.

r-t N c* ee *-> O O 'β -5 n“ p** < f, fc e o cr *>

-5 — «-.SS, rT r* » n fiT. - w> <» „ *o r* ~~ vš~ pí ľ- r- 133 Vybrané dáta NMR pre zlúčeniny⁸ zo schémy 22

• r-|

S '>5 c:

φ ε

'05

Č

N

O w

H NMR dáta sú v dobrom súhlase i—I no

134

ΓΟ

CXJ

>«	a
		XU Λ O ω
	CO	o N CO
	CO	>; G • r—1 G
	λ:	ω XJ
	H	'G r—1
	£>	N ω G
	CO EH	a K
		a rH G
		A xo Ό XU
		G G G J0 >5 >

c o

u

M*

U

C <M

*-S í? c

II

Ol

CV ·»» *·

O\ «n eo “í rí* r· Ό r*

X <T «_ C-ef í ²-S Š £ * V - · «Π ws Os C9 ·*

E zú

Vi š_

S s n rs ? g c-τ 5 c·'»’ iw ’ < — «

-í * n 3 r <-> A t n £ ΓΓ £ í í čr£ r*. e-\ A *< r> n \j v*

N »n *-s (S *r <S *^ ·>

.0 rr<

chemický posun v ppm a interakčná konštanta (J) v Hz chemický posun CH,CON pre 97 = l,79(s); 9S = l,87(s); 99 = l,S9(s)

CO X5

- 135 Vyššie uvedený popis, vrátene príkladov uskutočnenia, má len ilustretívny charakter a v žiadnom ohľade neobmedzuje rozsah vynálezu. Do tohto rozsahu spadajú, aj rezne čalšie modifikácie, ktoré sú urobené v duchu vynálezu a sú kryté nasledujúcimi nárokmi, ktoré sú pre rozsah vynálezu určujúce.

Claims (51)

1. PATENTOVÍ NÁROKY

   1. Spôsob výroby fukozylovaných uhľohydrátov v jedinej reakčnej zmesi, vyznačujúci satým, že sa (a) použije fukozyltransferáza na vytvorenie 0-glykozidovej väzby medzi nukleozid-5*-difosfofukózou a dostupnou hydroxylovou skupinou uhľohydrátovej akceptorovej molekuly, za vzniku fukozylovaného uhľohydrátu a nukleozid-5'-difosfstu; a (b) recykluje in situ nukleozid-5 ’-difosfát s fukózou, zs vzniku zodpovedajúcej nukleozid-5'-difosfofukózy.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m, že bázou nukleozidu je guanín.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m, že nukleozid-5'-difosfát je prítomný v katalytickom množstve.
4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci s s t ý m, že hydroxylová skupina uhľohydrátovej akceptorovej molekuly je časťou N-ecetylglukozamínu, galaktózy alebo N-acetylgalaktozamínu.
5. 5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m, že uhľohydrátová akceptorová molekula je sialylovaná.

   - 137
6. 6. Spôsob podľa nároku 1, na výrobu fukozylovanej sialylovenej uhľohydrátovej molekuly, pri ktorom sa enzymaticky vytvoria glykozidová väzby v jedinej reakčnej zmesi, v y z na čujúci sa tým, že sa (a) vytvorí prvá glykozidová väzba medzi difosfonukleozidom aktivovaným glykozylovým donorom, s dostupnou hydroxylovou skupinou uhľohydrátovej akceptorovej molekuly, použitím prvej glykozlytransferázy;

   (b) vytvorí ss druhá glykozilová väzby medzi monofosfonukleozidom aktivovaným sialylvovým donorom a dos tupnou hydroxylovou skupinou uhľohydrátovej akceptorovej molekuly použitím sialyltransferázy; a (c) vytvorí sa tretia glykozidová väzba medzi difosfonukleozidom aktivovaným fukozylovým donorom a dostupnou hydroxylovou skupinou uhľohydrátovej akceptorovej molekuly spôsobom podľa nároku 1, pričom glykozidová väzby v stupňoch (a), (b) a (c) sa vytvárajú v jedinej reakčnej zmesi.
7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že fúkozyloveným sialýlovaným uhľohydrátovým zvyškom je sialylovaný Lewisov ligand.
8. 8. Spôsob podľa nároku 7, v-yznačujúci y

   sa t ý m, ze sialýlovaným Lewisovým ligandom je SLe alebo SLe⁸.
9. 9. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci s a t ý m, že^sefukóza prenáša z fukozylového donoru na hydroxyskupinu N-acetvlglukozaminového zvyšku uhľohydrátovej akceptorovej molekuly.

   138
10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m, že fukozylový donor prenáša fukózu na hydroxy skupinu na atóme uhlíka v polohe 3 N-acetylglukozemínu.
11. 11. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že fukozylový donor prenáša fukózu na hydroxyskupinu zvyšku galek+ózy uhľohydrátovej akceptorovej molekuly.
12. 12. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že sialyltransferáza je zvolená zo súboru zahrnujúceho <f,2,3-sivlyltrsnsf erázu, ^2,4-sialyltransferázu, £2,6-sislyltrensferázu a £2,8-sialyltransferázu.
13. 13. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že fukozyltransferáza je zvolená zo súboru zahrnujúceho £l,2-fukozyltransferázu, <£l,3-fukozyltransferázu, ^1,6-fukozyltransferázu a ,ςΐ,4-fukozyltransferázu a £1,3/4-fukozyltransferázu.
14. 14. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že fukozyltransferáza je zvolená zo súboru zahrnujúceho {S-gslaktozidáza jrl, 2-fukozyltransf eráz - , N-acetylglukozamín £l,3-fukozyltransferázu,

    N-ace ty Iglu kozami n kl,4-fukozyltransferázu,

    N-acetylglukozamín -íl, 6-fukozyltransf erázu, a

    N-acetylglukozamín ^1,3/4-fukozyltransferázu.
15. 15. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že uhľohydrátovou akceptorovou molekulou je uhľohydrátom substituovaná molekula, v ktorej uhľohydrát je zakončený zoskupením Gal^l^GlcNAc-X, kde X predstavuje organickú molekulu.

    - 139
16. 16. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že bázou aspoň jedného nukleozidu je buč cytidín alebo uridín.
17. 17. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že monofosfonukleozidom aktivovaným sialylovým donorom je cytidín-5'-monofosfor-N-acetvlneuramínová kyselina.
18. 18. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že monofosfonukleozidom aktivovaným sialylovým donorom je guanozín-5 '-difosfofukóza.
19. 19. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m,že glykozylovým donorom zo stupňa (a) je dif osf onukleozidom aktivovaný galakoz.ylový donor, ktorým je uridín-5'-dofosfogalaktóza.
20. 20. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že sa stupne (a) a (b) v podstate ukončia pred začatím stupňa (c).
21. 21. Reakčný systém in vitro, vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje fukozyltransferázu s enzým vytvárajúci nukleozid-difosfofukózu.
22. 22. Reakčný systém podľa nároku 21, v y z n a č u júci sa tým, že enzýmom vytvárajúcim nukleozid-di.f osf ofukózu je guanozín-difosfofukóza pyrofosforyláza.
23. 23. Reakčný systém podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že áalej obsahuje kinázu.

    140
24. 24. Reakčný systém podľa nároku 23,, vyznačujúci sa tým, že äalej obsahuje pyruvát kinázu.
25. 25. Reakčný systém podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že kinázou je fukóza kináza.
26. 26. Reakčný systém podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že äalej zahrnuje regeneračný systém NADPH.
27. 27. Reakčný svstém podľa nároku 26, vyznačujúci ss tým, že systém vytvárajúci nukleozid-difosfofukózu zahrnuje guanozín-difosfomanózu.
28. 28. Reakčný systém podľa nároku 27, vyznačujúci.sa tým, že guanozíndifosfát-msnóza sa vytvára in situ z gusnozíntrifosfátu a menóza-l-fosfátu.
29. 29. Reakčný systém podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že dalej zahrnuje pyruvát kinázu a guanozín-difosfomanóza pyrofosforylázu.
30. 30. Spôsob výroby glykozyl-1- alebo -2-fosfitu, vyznačujúci sa tým, že sa nechá reagovať blokovaný glykozylový kruh s hydroxylovou skupinou v anomérnej polohe s trojmocným fosfitylačným činidlom, za vzniku blokovaného kruhu substituovaného glykozyl-1- alebo -2-fosfitom.
31. 31. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa t ý m, že glykozylový kruh je zvolený zo súboru zahrnujúceho gelaktozyl, glukozyl, fukozyl, N-acet.ylglukozaminyl, manozyl a kruhy cukrov s 8 alebo 9 atómami uhlíka,

    141 obsahujúcimi v polohe 1 karboxyskupinu alebo alk.ylskupinu s 1 až 5 atómami uhlíka alebo skupinu benzylesteru karboxylovej kyseliny.
32. 32. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa t ý m, že glykozvlovým kruhom je fukozyl.
33. 33. Spôsob podľa nároku 31, vyz nečujúc i sa t ý m, že trojmocným fosfitylačným činidlom je dibenzyl-N, N-d i alkylf osf or oemid i t .
34. 34. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa t ý m, že N,N-dialkylfosforoamiditom je dibenzyl-N,N-dietylfosforoamidit.
35. 35. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa t ý m, že glykozylový kruh je blokovaný acetylovými alebo benzylovými blokovacími skupinami.
36. 36. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúc i sa t ý m, že glykozylový kruh je zvolený zo súboru zahr nujúceho L- a Γ-aldózy obsahujúce 4, 5 alebo 6 atómov uhlíka.
37. 37. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa t ý m, že glykozylový kruh je zvolený zo súboru zahr nujúceho L- a Ľ-ketózy obsahujúce 4, 5 alebo 6 atómov uhlíka.
38. 38. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa t ý m, že glykozylový kruh je zvolený zo súboru zahr nujúceho C- a L-aldózy a ketózy obsahujúce 4 až 9 atómov uhlíka.

    142
39. 39. Blokovaný fosfitylovaný monosacharid so všeobecným vzorcom IA

    R(IA)

    R, kde

    R, každý zo symbolov

    R,, ktorá su rovnaké alebo rôzne, predstavuje arylsku pinu alebo nižšiu alkylskupinu s 1 až 5 atómami uhlíka;

    X nezávisle predstavuje atóm kyslíka alebo atóm dusíka;

    ?2 nezávisle predstavuje acylovú, benzylová, silylovu, alebo alkylovú blokovaciu skupinu alebo

    X-?2 chýba a je nahradený atómom vodíka;

    nezávisle predstavuje atóm vodíka, metylskupinu, skupinu so všeobecným vzorcom -OR2, -CH(OR₂)-CH(OR₂.) alebo -CH(OR₂ )-CH(OR₂)-Cíí(OR₂) ;

    R4 predstavuje atóm vodíka, karboxyskupinu, elkylsku pinu s 1 až 5 atómami uhlíka alebo benzylkarboxylátovú skupinu; a m

    predstavuje číslo 0 alebo 1

    143
40. 40. Zlúčenina podľa nároku 39, v ktorej m predstavuje číslo 1 a každý zo symbolov X predstavuje atóm kyslíka.
41. 41. Zlúčenina podľa nároku 39, v ktorej je monosacharid zvolený zo súboru zahrnujúceho manózu, fukózu, gslaktózu, glukózu a ramnózu.
42. 42. Zlúčenina podľa nároku 39, v ktorej m predstavuje číslo 1 a jeden zo symbolov X predstavuje atóm dusíka, pričom zvyšné symboly X predstavujú atómy kyslíka .
43. 43. Zlúčenina podľa nároku 42, v ktorej je monosacharid zvolený zo súboru zahrnujúceho 2-acetamido-2-deoxygalaktózu, 2-scetamido-2-deoxyglukózu, N-acet.ylneur amínovú kyselinu a 2-ftalimidoyl-2-deoxyglukózu.
44. 44. Zlúčenina podľa nároku 39, v ktorej R^ predstavuje benzylskupinu.
45. 45. Zlúčenina podľa nároku 39, v ktorej R£ predstavuje benzylskupinu alebo acetylskupinu.
46. 46. Zlúčenina podľa nároku 39, zvolená zo súboru zahrnujúceho dibenzylfosfinyl-2,3,4,6-teťra-O-ecetyl-^-D-manozid, dibenzylfosf inyl-2,3,4-t.ri-O-acetyl-^-L-fukozič, dibenzylfosfinyl-2-acetamido-2-deoxy-3,4,6-tri-0-acetvl-D-galaktozid, dibenzylf osfinyl-2-acetamido-2-deoxy-3,4,6-tri-0-acetyl-D-glukózu, dibenzylfosfinyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-galaktozid,

    144 dibenzylfosf inyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-Ľ-glukozid, dibenzylfosf inyl-2,3, 4-tri-O-a.cetyl-L-ramozid, dibenzylfosfiny1-2-ftalimidoyl-2-deoxy-3,4,6-tri-O-acetyl-Ľ-glukozid a metyl-5-acetemido-4, 7,8,9-tetra-0-acet,yl-2- (diben zylf osŕityl )-3,5-dideoxy-(5-E-glycero-r-galakto-2-nonulopyranozonát.
47. 47. Zlúčenine, ktorou je 2,3,4-tri-0-benzoyl-<£-L-fukopyranozylbromid.
48. 48. Spôsob halogénhydratácie, vyznačujúci sa t ý m, že sa (a) glykál zmieša s peroxidom vodíka, halogenidovými iónmi, zvolenými zo súboru zahrnujúceho chloridy, bromidy a jodidy a katalytickým množstvom enzýmu chlórperoxidázy vo vodnom pufri s hodnotami pH približne 2,5 až 3,5, ζε vzniku reakčnej zmesi; a.

    (b) výsledná reakčná zmes sa potom udržuje v čase postačujúcom pre halogénhydratáciu a vznik halogenhydrinového produktu.
49. 49. Spôso'b podľa nároku 48, vyznačajúci sa t ý m, že zahrnuje äalší stupeň spočívajúci v izolá cii halogénhydrínového produktu.
50. 50. Produkt pripraviteľný spôsobom podľa nároku

    48.

    145
51. 51. Glykozylhelogénhydrín, ktorého štruktúre zodpovedá vzorcu zvolenému z tohto súboru vzorcov: