KR970010134B1

KR970010134B1 - 뉴클레오시드의 제조법

Info

Publication number: KR970010134B1
Application number: KR1019900702343A
Authority: KR
Inventors: 히로시 야마우찌; 히데끼 우쯔기; 유이찌로오 미도리가와
Original assignee: 야마사 쇼오유 가부시끼가이샤; 하마구찌 미찌오
Priority date: 1989-02-28
Filing date: 1990-02-27
Publication date: 1997-06-21
Also published as: EP0411158A4; CA2028119C; EP0411158A1; CA2028119A1; AU5108090A; AU631607B2; EP0411158B1; KR920700290A; DE69027154T2; US5258301A; US5506122A; DK0411158T3; US5384251A; DE69027154D1; ES2089010T3; WO1990010080A1; ATE138689T1; JP2795748B2

Abstract

내용없음.

Description

[발명의 명칭]

뉴클레오시드의 제조법

[도면의 간단한 설명]

제1도는 본 발명의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 가장 적당한 pH 및 안정한 pH 범위를 나타낸 것이다.

제2도는 본 발명의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 가장 적당한 온도 및 안정한 온도범위를 나타낸 것이다.

제3도는 본 발명의 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 최적 pH 및 안정한 pH 범위를 나타낸 것이다.

제4도는 본 발명의 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 최적 온도 및 안정온도 범위를 나타낸 것이다.

제5도는 바실루스·스테아로더모필러스 TH6-2와 브레비 박테리움·아세틸리캄 AT 6-7을 효소원으로서 사용하여 1-β-D-리보플라노실-1,2,4-트리아졸-3-카르복스아미드(리바비린)를 제조할때의 반응시간에 있어서 리바비린의 생성률을 비교한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 바실루스속에 속하는 호열균 유래의 뉴클레오시드 포스포릴라아제가 함유된 효소제조물을 사용하는 뉴클레오시드의 제조법에 관한 것이다.

[배경기술]

뉴클레오시드, 리보오스-1-인산등의 당 잔기 공여체와 염기 공여체를 효소적으로 반응시켜 뉴클레오시드를 제조하는 방법으로서는 예를들면, 각종 퓨린 뉴클레오시드의 제조법(특공소 43-24475호, 특공소 43-28954호, 특공소 43-28955호, 특공소 43-28956호, 특공소 45-11116호, 특공소 48-14957호, 특개소 55-71495호, 특개소-56-18599호, 특개소 56-142293호, 특개소 56-164793호, 특개소 56-166199호, 특개소 58-63393호, 특개소 58-94396호, 특개소 58-170493호 등), 각종 피리미딘 뉴클레오시드의 제조법(특공소 35-16478호, 특개소 56-102794호, 특개소 59-213397호, 특개소 60-239495호 등), 기타 각종의 뉴클레오시드의 제조법(특개소 50-29720호, 특개소 57-146593호, 특개소 58-190396호, 특개소 58-216696호, 특개소 59-143599호, 특개소 59-179094호, 특개소 59-213397호, 특개소 60-120981호, 특개소 60-133896호, 특개소 63-31093호, 특개소 63-177797호 등) 등이 보고되어 있다.

그러나, 이러한 뉴클레오시드의 효소적 제조법은 효소반응 특유의 기질 특이성, 입체 선택성의 점에 있어서 화학적 합성법에 비해 우수한 것이지만, 효소의 능력이 충분하지 않고 수율 및 수득량의 점에서 결코 만족할 수 있는 것은 아니었다. 또한, 상온에서 반응을 행하면, 잡균에 의한 오염이 원인으로 생각되는 수율저하가 관찰되고, 오염을 회피하기 위하여 고온(예를들면 45℃ 이상)에서 반응을 행하면 효소가 점차로 활성을 상실하게 되어 결과적으로 수율이 현저히 저하되는 문제점도 있었다.

일반적으로 화합물의 합성은 생성반응과 분해반응의 평형이 생성반응쪽으로 기울어짐으로써 이루어지는 것이다.

이때문에 화합물의 수율 및 수량을 높이기 위해서는 생성 반응을 촉진하고 분해반응을 억제하는 것이 중요하고, 이 원칙은 화합물의 효소적 제조법에서도 예외가 아니다.

또, 반응온도를 높게 하면 반응속도가 빨라지고, 단시간중에 반응이 종료되고 기질의 용해성도 높아지게 되어 목적화합물을 양호한 수율로 제조할 수 있는 가능성이 있다.

뉴클레오시드 포스포릴라아제를 사용하여 뉴클레오시드를 제조하는 경우, 뉴클레오시드의 생성반응을 촉진하기 위해서는 촉매로서 사용하는 효소 자체의 능력 및 반응조건의 2가지 점을 고려하지 않으면 안된다.

반응조건의 선정은 사용하는 효소의 능력을 인출하기 위한 보조적인 수단에 지나지 않고, 생성반응을 촉진하고 목적화합물의 수율을 높이기 위한 근본적인 방법은 우수한 능력을 갖는 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 사용하는 것이다.

뉴클레오시드의 제조에 사용되고 있는 종래의 뉴클레오시드 포스포릴라아제는, 제조가 용이한 미생물로부터 제조되는 것이 대부분이다.

그러나, 반응의 효율, 비활성, 내열성, 목적화합물의 수율등에 있어서, 효소의 능력을 검토한 결과, 종래 사용하고 있는 것이 반드시 만족할 수 있는 것은 아니었다.

한편, 제조된 뉴클레오시드의 분해반응에 관여한다고 생각되는 효소, 예를들면 뉴클레오시드에 관하여 광경화수지를 사용하는 고정화법에 의한 뉴클레오시다제의 억제법이 보고되어 있다(특개소 62-253393호).

그 방법은 우수한 방법이지만, 효소제조물로서 미생물 균체를 사용하는 경우에는 미생물에 따라 고정화하기 어려운 것이 있고, 범용성이 부족한 방법이 있었다.

본 발명자 등은 뉴클레오시드의 효소적 제조에 사용할 수 있는 능력이 우수한 효소를 발견하기 위하여 여러가지 미생물을 스크리닝한 결과, 바실루스속에 속하는 효열균중에서 극히 비활(比活)성이 높고, 내열성이 있는 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 다량으로 함유하고, 균체 단위 중량당의 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성이 높은 미생물군을 발견하였다.

종래 바실루스속에 속하는 호열균인 바실루스·스테아로더모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터 뉴클레오시드 포스포릴라아제가 단리정제되어, 그 효소적 성질이 검토 보고되고 있다(J. Biol, Chem., 244, 3691∼3697(1969), Agric, Biol. Chem., 53, 2205∼2210(1989년 8월 23일), Agric, Biol. Chem., 53, 3219∼3224(1989년 12월 23일) 참조).

또 바실루스·스테아로더모필러스의 미생물 균체를 효소원으로 사용한 5-메틸우리딘 또는 티미딘의 제조법도 보고되어 있다(특개평 1-320995호 공보(1989년 12월 27일 공개), Agric, Biol. Chem., 53, 197∼202(1989년 1월 23일) 참조). 그러나 상기 보고의 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 내열성을 가지는 이점이 있지만, 비활성이 낮고 균체 단위 중량당의 효소활성도 낮기 때문에 뉴클레오시드를 양호한 수율로 제조할 수 없는 종래의 문제점을 해결하기까지에는 이르지 못하였다. 즉, 특개평 1-320995호 공보에 기재되어 있는 뉴클레오시드의 수율을 사용된 염기 공여체에 대한 비율로서 나타내면, 기껏해야 30% 전후(이상적으로 반응하였다 하더라도 효소 반응의 평형상수에서 구해지는 목적물의 수율은 53∼56%이다)이다.

[발명의 개시]

발명자등은 본 발명자등이 발견한 상기의 비활성이 높고 내열성이 있는 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 다량으로 함유하고 균체 단위 중량당의 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성이 높은 미생물군에 관하여 더욱 연구를 거듭한 결과, ① 이들의 미생물군은 비활성이 높고, 내열성이 있는 퓨린 뉴클레오시드 포스폴릴라아제와피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 함께 가지면서 뉴클레오시다제를 함유하고 있지 않거나, 함유하고 있더라도 뉴클레오시드를 제조할때의 반응온도(35∼80℃)에서는 극히 미약한 활성밖에 나타내지 않는다는 것, 및 ② 이 미생물군의 1종 또는 2종 이상의 미생물 균체에서 유래된 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 함유하는 효소제조물을 뉴클레오시드의 효소적 제조에 사용하면, 소량의 효소로 단시간에 양호한 수율로 뉴클레오시드를 제조할 수 있는 것을 알게 되어 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 뉴클레오시드 포스포릴라아제 제조물을 사용하여 염기공여체, 당 잔기 공여체 및 인산공여체를 반응시킴으로써, 염기공여체의 염기부분과 당 잔기 공여체의 당 부분 사이에 N-글루코시드 결합을 형성시켜 뉴클레오시드를 제조하는 방법에 있어서, 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 함유하는 효소제조물로서, 바실루스에 속하는 효열균중 균체 단위 중량당 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성이 높은 미생물군의 1종 또는 2종 이상의 미생물의 균체에서 유래하는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드의 제조법에 관한 것이다.

또한, 본 명세서에서 「뉴클레오시드」란, 우리딘, 티미딘, 시티딘, 아데노신, 구아노신 등의 천연에 존재하는 뉴클레오시드와 각종의 뉴클레오시드 유사체까지 포함하는 범위를 지칭하는 것이다.

또, 본 발명은 상기 효소 제조물 자체, 그 효소제조물을 제조하기 위하여 사용하는 신규 미생물, 그 미생물에서 제조되고 뉴클레오시드의 제조에도 사용할 수 있는 신규 뉴클레오시드 포스포릴라아제에 관한 것이다.

[발명을 실시하기 위한 바람직한 형태]

Ⅰ. 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 함유하는 효소제조물

본 발명의 : 「뉴클레오시드 포스포릴라아제를 함유하는 효소제조물」(이하, 「효소제조물」이하 칭한다)이란, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 적어도 한가지 바람직하게는 두가지 모두의 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 함유하는 것을 지칭한다.

또한, 「효소의 정제 정도」란, 총 단백질에 차지하는 효소 단백질량의 비율을 의미한다.

본 발명의 효소제조물은 바실루스속에 속하는 효열균, 구체적으로 바실루스·애씨도칼다리우스(Bacillus acidocaldarius), 바실루스·슐레겔리(Bacillus schlegeli), 바실루스·스테아로더모필러스(Bacillus stearothermophilus) 등의 중간 정도의 호열균에 속하는 미생물중, 균체 단위 중량당 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성이 높은 미생물군의 미생물(이하, 본 발명의 미생물이라 함)로부터 제조할 수 있다.

미생물을 선정하기 위한 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성은 예를들면, 이하의 값이 대체로 바람직하다.

· 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제

10U/g 습균체 이상, 바람직하게는 12U/g 습균체 이상

· 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제

10U/g 습균체 이상, 바람직하게는 15U/g 습균체 이상

이들 2가지 조건중 한쪽을 만족하는 것은 본 발명 방법에 사용하는 효소제조물의 제조원으로서 사용될 수 있고, 상기의 두가지 조건을 동시에 만족하는 것은 효소제조물의 제조원으로서 적당하다.

이와같은 조건을 만족하는 적당한 미생물을 구체적으로 예시하면, 바실루스·스테아로더모필러스 TH 6-2, P-21, P-23 등(어느것이든 야마사 쇼오유(주) 부지내의 토양에서 분리한 토양 분리균주)을 예시할 수가 있다.

이 균주균 가운데 가장 대표적인 균주인 TH 6-2주의 균학적 성질을 이하에 표시한다.

TH 6-2의 균학적 성질

(A) 형태

① 세포의 모양 및 크기 : 단간상(Rod), 0.6∼1.1×2∼7㎛

② 포자의유무 : 있음

③ 포자중의 팽창의 유무 : 있음

④ 세포내의 포자의 부위 및 크기

말단부 또는 중앙부, 0.8±0.8∼1.0㎛

⑤ 그람 염색성

그람 가변성(배양초기는 그람 양성)

(B) 각 배지에서의 생육상태

① 육즙 한천 사면배지

생육의 양상 : 생육왕성, 표면평활, 불투명, 배지변화없음

② 육즙 한천 평판배지

생육의 양상 : 원형 콜로니 형성, 얇게 펴진다. 점성을 나타낸다. 불투명, 주변부는 물결모양.

③ 리트머스·밀크 배지

생육하지 않음

(C) 생리적 성질

① 산소 존재하에서의 생육 : 생육한다.

② 산소 비존재하에서의 생육 : 생육하지 않음

③ 카탈라아제 : 양성

④ V-P 테스트 : 음성

⑤ 메틸레드테스트(pH in V-P broth) : pH 6

⑥ 가수분해능 카세인 : 음성

젤라틴 : 음성

녹 말 : 음성

⑦ 시트르산의 이용 : 양성

⑧ 질산염의 환원 : 양성

⑨ 인돌의 생성 : 음성

⑩ 염화나트륨 또는 염화칼륨의 요구성 : 음성

⑪ 당질로부터의 산의 생성

양성 : 글루코오스, 아라비노오스, 크실로오스, 프럭토오스, 말토오스

음성 : 녹말, 글리세롤, 설탕, 라피노오스

⑫ 각 pH에 대한 생육

6.8에서 생육, 5.7에서 생육하지 않음

⑬ 염화나트륨 존재하에서의 생육

2% NaCl 존재하 : 생육한다.

5% NaCl 존재하 : 생육하지 않음

* 생육 범위

생육 pH 범위 : 6.5∼9.0

생육 온도범위 : 35∼65℃

* 글루코오스 존재하에서의 생육

글루코오스 0.5% 이상의 존재하에서 생육하지 않음

이들 균학적 성질을 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(제8판)의 분류기준과 합한 결과, 본 분리균은 바실루스·스테아로더모필러스에 속하는 것이 판명되고, 바실루스·스테아로더모필러스 TH 6-2로 명명하였다. 또 P-21, P-23도 같은 균학적 성질을 나타내었다.

또한 TH 6-2은 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 부다페스트 조약에 입각하여 기탁되어 있고, 수탁 번호로서 미공연조기 제2758호가 주어져 있다.

이 국제 기탁은 1989년 2월 4일에 상기 기탁기관에 국내 기탁된 미공연균기 제10526호로부터 1990년 2월 16일에 이관한 것이다.

TH 6-2, P-21, P-23은 어느것이나 바실루스·스테아로더모필러스에 속하는 것이지만, 균체 단위 중량당의 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성이 매우 높고, 그리고 뉴클레오시다제를 실질적으로 함유하고 있지 않는 점에서 공지의 미생물과는 명확히 구별된다.

예를들면, 아메리칸·타입·컬춰·콜렉션(ATCC)에 보존되어 있는 공지의 바실루스·스테아로더모필러스에 속하는 미생물과, 상기 본 분리균을 사용하여 균체 단위 중량당의 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성을 비교 검토한 결과, 제 표1와 같았다.

표1에서 TH 6-2, P-2 및 P-23의 균체 단위 중량당의 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성은 종래공지의 보유하는 효소 활성과 비교할때, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성보다 2배 가까이, 그리고 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성보다 2배 가까이, 그리고 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성보다 6배 이상 정도 각각의 활성이 높은 것을 알 수 있다.

구체적으로 상기의 본 분리균은 균체 단위 중량당의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 및 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성은 각각 13∼15U/g 습균체 및 20∼22U/g 습균체의 값을 표시하는 것이었다.

따라서, 본 분리균은 전술한 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성의 선정기준을 충분히 만족하는 것이고, 뉴클레오시드를 제조하기 위하여 사용되는 효소제조물의 제조원으로서 유용하다.

이것을 증명하기 위하여, 리바비린을 제조하고 목적화합물의 생성율을 공지균주와 비교하여 보았다.

그 결과, 본 발명 미생물군에 속하는 미생물을 사용하는 경우에는 표2에 표시하는 바와같이 어느것이나 90% 이상의 생성율을 나타내는데, 대하여 공지의 미생물은 기껏해야 40%의 생성율밖에 나타나지 않고, 본 발명의 미생물군에 속하는 미생물은 뉴클레오시드의 제조를 위한 효소원으로서 극히 유용하다는 것이 확인되었다.

또한 상기의 비교시험에 있어서, 미생물의 균체를 후술의 실시예 1과 마찬가지로 제조하고, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴리아제 활성 및 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성의 측정을 후술의 역가의 측정법에 준하여 행하였다. 또 리바비린은 기질용액(40mM 1,2,4-트리아졸-3-카르복스아미드, 60mM 우리딘, 40mM 인산 이수소칼륨을 함유하는 pH 6.0의 수용액) 10㎖에 균체를 적절히 넣은 균체 현탁액 10㎖(습윤체로서 200㎎을 함유)을 첨가하여 50℃에서 24시간 교반함으로써 제조하였다.

상기 반응후, 반응액을 원심분리하고, 상층액을 50∼100배로 희석하여, 이를 HPLC법(컬럼 : YMC A-312 ((주) 야마무라 가가꾸 겐뀨우쇼제), 용출제 : 0.15M 인산 이수소칼륨 용액, 검출 : 220nm의 흡수)으로 리바비린의 생성량을 측정하였다.

생성률은 다음 식에 의하여 구하였다.

본 발명의 효소제조물은, 본 발명은 미생물군에 속하는 미생물을 배양하고, 배양하여 얻은 균체를 사용목적에 따라 사용상태에 적당히 가공처리함으로써 제조될 수 있다.

미생물을 배양하기 위한 배지로서는, 이들의 미생물이 이용 가능한 탄소원 및 질소원을 적당량 함유하고, 필요에 따라 금속염, 미량 발육촉진물질, 소포제 등을 첨가한 것이 사용된다.

구체적으로, 배지성분으로서는 당류(글루코오스, 슈크로오스등), 천연탄수화물(당밀, 폐당밀, 전분, 맥류, 밀기울, 쌀등), 알코올류, 지방산류, 탄화수소류등, 질소원으로서는, 육엑스, 효모엑스, 대두가수분해물, 카스아미노산, 각종 아미노산, 요소등, 무기염으로서는 아연, 철, 마그네슘, 나트륨, 칼슘, 칼륨등의 금속의 인산염, 염산염, 황산염 등, 미량 발육촉진물질로서는 비타민 B₁, 비타민 B₂, 판토텐산, 바이오틴등이 예시된다.

배양은, 통상의 액체배양법(진탕배양, 통기교반배양, 정치배양, 연속배양등)에 의하여 행하는 것이 바람직하다.

배양조건은 미생물 및 배지의 종류에 따라 다르고, 특정할 수는 없다.

보통, 배양개시의 pH를 6.5∼9.0으로 조정하고, 약 35∼65℃의 온도 조건하에서 목적하는 효소활성이 충분히 얻어질 때까지, 구체적으로는 5∼50시간 정도 배양한다.

이렇게 하여 얻어지는 생균체를 함유하는 배양액(이하, 배양물이라 함)을 사용하여 제조된 효소제조물의 상태는 특별히 제한되지 않으며, 예를들면, 미생물의 배양물 자체, 배양물로부터 통상의 분리수단(원심분리, 침전분리, 응집분리, 세척등)에 의하여 분리된 생균체, 또는 그 균체처리물에 예시할 수가 있다.

생균체의 균체처리물을 더욱, 구체적으로 예시하면, 생균체를 기계적 파괴(휠링(whirling)·블런더, 프렌치·프레스, 균질기, 유발등에 의한다), 동결융해, 건조(동결건조, 풍건, 아세톤 건조등에 의함), 자기소화(톨루엔, 아세트산 에틸등의 용매처리에 의함), 효소처리(리조자임등의 세포벽 용해 효소에 의함), 초음파처리, 침투압쇼크법, 화학적처리(염류용액, 산성용액, 알칼리성용액, 계면활성제, 킬레이트제등에 의한)등의 일반적 처리법에 따라 처리하여 얻은 생균체의 파괴물 또는 생균체의 세포벽 또는/및 세포막을 변성시킨 것, 또는 효소활성을 갖는 획분을 추출하고, 또한, 필요에 따라 효소활성을 갖는 추출획분의 일반적 효소정제법(염석처리, 등전점 침전처리, 유기용매 침전처리, 각종 크로마토그래피처리, 투석처리등에 의한)에 따라 처리하여 본 발명의 목적으로 하는 효소활동을 갖는 획분을 분획함으로써 얻어지는 조효소 또는 정제효소를 들 수가 있다.

이와같은 배양물, 생균체 및 균체 처리물은 고정화 처리를 실시하지 않는 유리상태로 사용하여도 좋고, 또 포괄법, 가교법, 흡착법등 통상의 방법에 의하여 고정화 처리를 실시한 고정화물로서 사용하여도 좋다.

균체 처리물의 한 형태인 정제효소에 관하여, 구체적 예를 들어 설명하면, 본 발명 미생물군에 속하는 바실루스·스테아로더모필러스 TH 6-2로부터 추출정제하여 얻어진 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 이하의 효소학적 성질을 갖는다.

(A) 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제

(1) 작용

퓨린 뉴클레오시드+인산퓨린 염기+펜토오스-1-인산

본 발명의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 상기의 인산 첨가분해반응을 촉매한다. 이때문에, 국제효소 분류의 E.C. 2.4.2.1에 속한다.

(2) 기질특이성

각종의 퓨린 뉴클레오시드를 기질에 인산첨가 분해반응을 행하게 한 결과를 제3표에 표시한다.

표3에서, 본 발명의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는, 시험한 범위내에 있어서는 이노신, 2'-데옥시 이노신, 구아노신 및 2'-데옥시 구아노신에 특이적이다.

(3) 최적의 pH 및 pH 안정성

가장 알맞는 pH는 7∼8, 안정pH 범위는 pH 5∼9이다(제1도 참조)

(4) 가장 알맞는 온도 및 온도 안정성

가장 알맞는 온도는 60∼80℃, 안정온도 범위는 60℃까지이다(제2도 참조)

(5) 분자량

SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동법으로 측정한 분자량이 약 45,000이다.

(6) 역가(비활성(比活性))

80%의 효소의 정제 정도로 400(U/㎎) 이상의 비활성을 나타내고, 90%의 효소의 정제 정도로 450(U/㎎)의 비활성을 나타낸다.

(B) 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제

(1) 작용

피리미딘 뉴클레오시드+인피리미딘 염기+펜토오스-1-인산

본 발명의 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 상기의 인산 첨가분해반응을 촉매한다.

이때문에 국제 효소 분류의 E.C. 2.4.2.2에 속한다.

(2) 기질 특이성

각종의 피리미딘 뉴클레오시드를 기질에 인산 첨가 분해반응을 실행한 결과를 제4표에 표시한다.

표4로부터, 본 발명의 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 시험한 범위내에 있어서는 우리딘, 2'-데옥시 우리딘, 리보프라노실티민, 티미딘에 특이적이다.

(3) 가장 적당한 pH 및 pH 안정성

가장 알맞은 pH는 pH 7∼9, 안정 pH 범위는 pH 5∼9이다(제3도 참조).

(4) 가장 알맞은 온도 및 온도 안정성

가장 알맞은 온도는 60∼70℃, 안정온도 범위 60℃까지이다(제4도 참조).

(5) 분자량

SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동법으로 측정한 분자량은 약 31,000이다.

(6) 역가(비활성)

80%의 효소의 정제 정도로 비활성이 250(U/㎎)이상을 나타내고, 90%의 효소의 정제 정도로 297(U/㎎)을 나타낸다.

더욱, 상기의 효소적 성질은 이하에 나타내는 방법으로 측정하였다.

① 역가의 측정

[퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성]

기질 용액(20mM 이노신 및 0.1M 인산=수소칼륨을 함유하는 pH 8.0의 수용액) 1.0㎖에 효소용액(정제 효소로서 1㎍를 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 6.0) 20㎕를 가하여 50℃로 10분간 반응시킨 후, 염산을 최종농도가 0.1N이 되도록 가하여 반응을 정지시킨다.

동시에 0℃에서 10분간 냉각한다. 다음에, 반응액을 원심분리하고, 얻어진 상층액을 HPLC법(컬럼 : YMC, A-312((주) 야마무라 가가꾸 겐꾸우쇼제), 용출제 : 아세토니트릴 5.0% 함유 20mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5), 검출 : 260nm)로 생성하는 하이포크산틴(hypoxanthine)을 정량한다.

1분간에 1㎛ol의 하이포크산틴을 생성하는 효소량을 1단위(「U」)로 한다.

[피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성]

기질용액중의 이노신 대신에 우리딘을 사용하고, HPLC 법으로 우라실을 정량하는 이외는 상기의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성의 측정법과 마찬가지로 행한다. 1분간 1㎛ol의 우라실을 생성하는 효소량을 1단위로 한다.

② 기질특이성

기질용액으로서 10mM의 각종 뉴클레오시드 및 50mM 의 인산=수소칼륨을 함유하는 pH 8.0의 수용액을 사용하고, 50℃에서 10분간 반응시켜, 반응후, HPLC법으로 각종 뉴클레오시드의 염기를 정량하는 이외는 류린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성의 측정법과 마찬가지로 행한다.

③ 가장 알맞은 pH

뉴클레오시드(20mM의 이노신 또는 우리딘) 및 0.1M의 인산-수소칼륨을 용해시켜, 묽은 염산 또는 묽은 수산화 나트륨의 각 수용액으로 pH4∼10으로 조정한 기질용액을 사용한 것 이외에는 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성의 측정법과 마찬가지로 하여 행한다.

④ 안정한 pH

0.2M의 아세트산 완충액(pH3.5∼6) 및 트리스-염산완충액(pH7∼9)중에서 37℃에서 16시간 간직한 효소용액을 사용한 이외는, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 또는 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성의 측정법과 마찬가지로 하여 행한다.

⑤ 최적온도

반응을 30∼80℃의 각 온도에서 행하는 이외는 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 또는 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성의 측정법과 마찬가지로 하여 행한다.

⑥ 안정한 온도범위

20∼80℃에서 15분간 가열한 효소용액을 사용하는 이외는 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 또는 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성의 측정법과 마찬가지로 하여 행한다.

상술의 본 발명 미생물군중의 미생물에서 얻어진 효소의 특징은, 최적온도가 비교적 고온이고 안정한 온도범위를 가지며, 비활성이 현저히 높은 것이다. 따라서 이와같은 특징을 갖는 효소를 함유하는 제조물을 뉴클레오시드의 제조에 사용하면, 반응에 사용되는 소량의 효소제조물로도 반응이 종결될 수 있고, 약간의 효소량으로 뉴클레오시드를 양호한 수율로 제조할 수가 있다. 또한, 반응을 비교적 고온(45℃ 이상)으로 행하게 되므로 잡균 미생물에 의한 오염을 방지할 수가 있다.

Ⅱ 뉴클레오시드의 제조

상술의 효소조제물을 사용하는 뉴클레오시드의 제조는 반응용기내에 있어서 후술의 염기공여체, 당잔기공여체 및 인산공여체와 효소 제조물을 접촉반응시킴으로서 실시할 수가 있다.

① 염기 공여체

본 발명 방법으로 사용하는 염기공여체는 반응계에 염기를 공급하는 것이다. 사용하는 염기공여체는 목적으로 하는 뉴클레오시드에 따라 선택하면 좋고, 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 작용에 의하여 당잔기공여체의 당부분과 N-글루코시드 결합을 형성할 수 있는 복소환(heterocyclic)염기 또는 그 유도체를 예시할 수가 있다.

복소환 염기의 구체예는, 예를들면, 퓨린 및 그의 유도체, 피리미딘 및 그의 유도체, 트리아졸 및 그 유도체, 이미다졸, 및 그 유도체, 데아자퓨린(deazapurine) 및 그의 유도체, 아자퓨린 및 그의 유도체, 아자피리미딘 및 그의 유도체 또는 피리딘 및 유도체등이다.

또 염기공여체로서는, 복소환 염기 그 자체는 물론 복소환 염기를 갖는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 등이라도 좋다.

구체적으로는, 퓨린 염기의 1위,2위, 6위 도는 8위의 1 또는 2이상의 위치에 치환기(예를들면, 아미노기,치환아미노기, 수산기, 옥소기, 메르캅토기, 아실기, 알킬기, 치환알킬기, 알콕시기, 할로겐원자 등)을 갖는 퓨린유도체, 예를들면 아데닌, 구아닌 히포크산틴, 크산틴, 6-메르캅토류린, 6-티오구아닌, N-알킬 또는 아실아데닐, 2-알콕시 아데닌, 2-티오아데닌, 2,6-디아미노퓨린등, 피리미딘의 2위, 4위 또는 5위의 1 또는 2이상의 위치에 전기와 마찬가지의 치환기를 갖는 피리미딘 유도체, 예를들면, 시토신, 우라실, 티민 5-할로게노우라실(5-플로오로우라실, 5-요오도 우라실등), 5-할로게노 시토신(5-플로오로 시토신 등)5-트리할로게노메틸 우라실(5-트리플루오로메틸 우라실등), 2-티오시토신, 4-티오우라실, N-아실시토신, 5-할로게노비닐 우라실등 ; 1,2,4-트리아졸의 3위에 치환기를 갖는 1,2,4-트라이졸 유도체, 예를들면, 1,3,4-트리아졸-3-카르복스아미드 1,2,4-트리아졸-3-카르복시산, 1,2,4-트리아졸-3-카르복시산 알킬에스테르등 ; 이미다졸의 4위 및 5위에 치환기를 갖는 이미다졸 유도체, 예를들면 5-아미노-4-이미다졸 카르복스아미드, 4-카르바모일-이미다졸-5-올레이트, 벤즈이미다졸등 ; 퓨린의 1위, 3위 또는 7위에 있어서 데아자퓨린 유도체, 예를들면 1-데아자아데닌, 3-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 7-데아자구아닌 또는 이들에게 전기퓨린 유도체와 마찬가지의 치환기를 갖는 화합물등, 8-아자아데닌, 7-데아자-8-아자히포크산틴(아조퓨린올)등의 아자퓨린유도체 ; 5-아자티민, 5-아자시토닌, 6-아자우라실등의 아자피리미딘 유도체 ; 3-데아자우라실, 니코틴산, 니코틴산아미드등의 피리딘 유도체가 예시된다.

② 당잔기공여체

당잔기공여체는 반응계에 당잔기를 공급하는 것이다.

즉, 당잔기공여체로서는 목적으로 하는 뉴클레오시드에 따라 선택하면 좋고, 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 작용에 의하여 염기공여체의 염기부분과 N-글루코시드 결합을 형성할 수 있는 리보오스 화합, 데옥시리보오스 화합물을 예시할 수가 있다.

리보오스 화합물로서는, 이노신, 구아노신, 우리딘, 리보프라노실 티민등의 리보뉴클레오시드 및 리보오스-1-인산을 데옥시리보오스 화합물로서는, 2'-데옥시이노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시우리딘, 티미딘, 2',3'-디데옥시이노신, 2',3'-디옥시구아노신, 2',3'-디데옥시 우리딘, 3'-데옥시 티미딘등의 데옥시 뉴클레오시드 및 2-데옥시 리보오스-1-인산, 2,3-디데옥시 리보오스-1-인산등을 각각 에시할 수 있다. 또 효소제조물로서는 정제효소이외의 것을 사용하는 경우에는, 상기의 당잔기공여체를 가하거나 또는 아데노신, 시티딘, 크산토신등의 리보오스 화합물 및 2'-데옥시 아데노신, 2'-데옥시 시티딘, 2'-데옥시크산토신 등의 데옥시 리보오스 화합물도 사용할 수 있는 가능성을 갖는다.

③ 인산공여체

인산공여체로서, 반응액중에서 인산이온으로 해리될 수 있는 것의 어느 것을 사용하여도 좋고, 예를들면 유리형의 인산 또는 인산염( 예를들면, 나트륨, 칼륨등의 알칼기 금속염, 암모늄염등)이 적당하게 사용된다.

또 인산공여체로서는, 반응액중에 인산이온을 유리할 수 있는 시스템, 예를들면 각종 인산 에스테르 유도체와 포스파타아제의 조합, 뉴클레오티드와 뉴클레오티다아제의 조합등을 들 수 있다.

④ 반응조건

반응액으로서는, 염기공여체, 당잔기공여체, 및 인산공여체가 물 또는 완충액에 용해 또는 현탁된 것을 사용하고, 이 반응액과 전술의 효소 조성물을 접촉시켜, 사용한 염기공여체에 대응하는 뉴클레오시드를 효소적으로 제조한다. 염기공여체, 당잔기공여체, 인산공여체의 사용농도는 0.1∼500mM의 범위로부터 적당히 선정하면 좋다.

반응은 통상 35∼80℃의 범위에서 좋은 효율로 진행되지만, 특히 40∼70℃ 정도의 반응온도가 바람직하다. 반응온도가 35℃ 이하일때는 반응속도가 느리고, 반응효율이 좋지 않다. 또 80℃ 이상의 반응온도에서는 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성을 저하시킬 우려가 있다.

반응액의 pH는 통상 pH5∼10, 바람직하게는 pH5∼9의 범위로 유지되면 좋다. 반응중에 pH가 변동할때는 산 또는 알칼리를 사용하여 바람직한 pH 범위로 보정하면 좋다.

반응후, 반응액과 효소조성물을 분리하고, 목적하는 뉴클레오시드를 분리정제공정에 제공한다.

생성한 뉴클레오시드는 공지의 방법 또는 이를 응용한 방법에 의하여 분리정제할 수가 있다. 예를들면, 이 온교환 크로마토그래피, 흡착크로마토그래피, 분배크로마토그래피, 겔여과법등 각종의 크로마토그래피, 향류(向流)분배 향류추출등 2액상간의 분배를 이용하는 방법, 농축, 냉각, 유기용매첨가등 용해도의 차를 이용하는 방법등의 뉴클레오시드의 분리정제로 사용되고 있는 일반적인 분리정제법을 단독으로, 또는 적당히 조합하여 실행하면 좋다.

[실시예]

이하, 실시예 및 비교예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

효모 엑스(Difco 사제) 0.5%, 펩톤(Difco 사제) 1.0%, 육류 추출물(Difco 사제) 0.7% 및 식염 0.3%를 포함하는 살균된 배지(pH 7.0) 500㎖에 바실루스·스테아로더모필러스 TH 6-2(미공연조기제 2758호)를 접종하고 50℃에서 18시간 진탕 배양하였다.

얻어진 배양액을 원심분리하여 균체를 집균하고, 세척후, 살균수를 가하여 250㎖의 균체 현탁액을 제조하였다. 이 균체 현탁액을 10㎖씩 분취하여, 40mM 염기공여체, 40mM당 잔기공여체 및 40mM 인산 이수소칼륨을 함유하는 기질 용액(pH 6.0) 10㎖를 첨가하여 40∼60℃로, 교반 조건하에 반응시켰다.

반응후, 각종 뉴클레오시드의 생성량은, 고속 액체 크로마토그래피(컬럼 : YMC A-312((주) 야마무라 가가꾸 겐꾸우쇼 제), 용출제 : 2.5∼5% 아세토니트릴 함융 20mM 트리스 염산환충액(pH 7.5), 검출 : 250∼260nm에서의 흡수)를 사용하여 측정하였다.

뉴클레오시드의 생성율을 아래식에 의하여 구하였다.

그 결과를 표5에 나타낸다.

1) 당 잔기 공여체에 대한 바로 나타낸다.

[실시예 2]

염기공여체로서 알로퓨린올 20mM, 당 잔기공여체로서 우리딘 30mM 및 인산이수소칼륨 75mM을 함유하는 기질용액(pH6.0)을 사용하여 실시예 1과 마찬가지로 하여 60℃에서 8시간 반응시켜 알로퓨린올의 리보프라노실 유도체를 95%의 수율(알프리놀에 대한 비)로 제조하였다.

[실시예 3]

염기공여체(알로퓨린올, 벤즈이미다졸, 6-메르캅토퓨린, 퓨린, 6-티오구아닌) 20mM, 당잔기공여체(우리딘, 2'-데옥시 우리딘) 30mM 및 인산 이수소칼륨 30mM을 사용하여, 실시예 1과 마찬가지로 하여 50℃에서 8시간 반응시켜서 각종 염기공여체를 염기로서 보유하는 리보프라노실 유도체 또는 2'-데옥시리보프라노실 유도체를 제조하였다.

그 결과를 표6에 나타낸다.

[실시예 4]

염기공여체로서 40mM 1,2,4-트리아졸-3-카르복사미드(이하, 「트리아졸」이라 함), 당잔기공여체로서 40mM의 우리딘, 이노신, 시티딘, 아데노신 또는 구아노신, 40mM 인산이수소칼륨을 함유하는 기질용액(pH6.0)을 사용하여 실시예 1과 마찬가지로 리바비린을 제조하였다.

그 결과를 표7에 표시한다.

또한, 시티딘, 아데노신에 관하여는 본 발명의 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 기질로서 인식되지 않기 때문에, 공존하는 디아미나제(deaminase)에 의하여 각각 우리딘, 이노신으로 변환된 후, 기질로서 이용되어 왔다고 사료된다.

[실시예 5]

염기공여체로서 트리아졸 40mM, 당잔기공여체로서 이노신 60mM, 및 인산이수소 칼륨 40mM를 함유하는 기질용액(pH 6.0)을 사용하여 실시예 1과 마찬가지로 각반응온도(40∼70℃)로 24시간 반응시켜 리바비린을 제조하였다. 그 결과를 제8표에 표시한다.

[실시예 6]

실시예 1과 마찬가지로 배양하여 얻어진 배양물을 원심분리하여 생균체를 얻었다. 다음에 생균체 2.0g를 0.1M 트리스 염산완충액(pH 7.0) 1.0㎖에 현탁하여, 별도로 작성한 광경화성수지(ENT-2000 ; 칸사이페인트(주)제) 8.0g에 광중합개시제로서 벤조인 에틸에테르 0.08g을 가한 수지액에 상기 균체 현탁액을 첨가하여 충분히 혼합한 후, 투명 필름상에 흘려넣어 360nm 전후의 광선을 필름면의 표리에 동시에 3분간 조사하여 광중합물을 얻었다.

이 고정화물로부터 균체량으로서 0.2g를 포함하는 부분을 취하고, 세단하여 40mM 트리아졸, 40mM 우리딘 및 60mM 인산 이수소칼륨을 포함하는 기질 용액(pH 6.0) 10㎖에 상기 고정화물을 투입하고, 60℃ 8시간 교반하면서 리바비린을 제조하였다.

전술의 HPLC법으로 생성율을 측정한 결과, 리바비린의 생성율은 트리아졸에 대한 비가 90%였다.

또한, 이 반응을 10회 연속하여 행하였는데, 리바비린의 생성율은 90%를 유지하고, 효소활성의 저하는 볼 수 없었다.

[실시예 7]

실시예 1과 마찬가지로하여 얻어진 배양물에 트리아졸, 우리딘 또는 이노신, 인산이수소칼륨을 최종농도로 40mM되도록 가하여, 50℃(우리딘을 사용한 경우) 또는 65℃(이노신을 사용한 경우)로 더욱 24시간 진탕배양을 향하였다. 배양후 원심분리상측액에 대하여 HPLC법에 의하여 리바비린의 생성율은 트리아졸에 대한 비로 91.9%, 이노신을 사용한 경우는 65.9%의 생성율이었다.

[실시예 8]

[정제효소의 제조]

바실루스·스테아로더모필러스 TH 6-2를 브이욘 슬런트(bouillon slant)로부터의 펩톤 1.0%, 육즙 0.7%, 효모엑스 0.5%, 식염 0.3%를 포함하고 pH 7.2로 조정된 배지 10㎖를 넣은 대형 시험관에 종균하고, 50℃에서 하룻밤 배양하였다. 얻어진 배양물을 동조성, 동일 pH의 배지 30ml 용적의 플라시크에 옮기고, 50℃에서 8시간 배양하고, 이를 종(種)배양으로서 전량을 상기 배지 3를 포함하는 5용량의 병(jar)·발효기에 가하고, 50℃, 회전수 350r.p.m, 통기량 1.0v.v.m의 조건으로 18시간 배양하였다.

이렇게 하여 얻어진 배양액으로부터 원심분리에 의하여 약 30g의 습균체를 얻고, 이를 1.5ℓ의 0.1% 트리톤 X-100(시그마), 5mM EDTA)를 포함하는 50mM 트리스-염산완충액(pH 7.2)에 현탁하고, 750㎎의 라이소(시그마)를 가하고, 37℃에서 1시간 유지시켰다.

용균액을 8,000r.p.m으로 원심분리하여 균체잔사를 제거한 후, 2N 염산을 가하여 pH 6.0으로 조정하고, 50℃에서 5분간 가열 처리하고, 8,000r.p.m으로 원심분리하여 상층액을 조 효소액으로 얻었다.

이 조 효소액을 황산 암모늄을 사용하여 염석(鹽析)에 의한 분획을 행하고, 40%∼90% 포화로 얻어진 단백질 침전을 50mM 아세트산·아세트산 나트륨 완충액(pH 6.0)에 용해시켜, 대량의 동일한 완충액에 대하여 하룻밤 투석하고, 얻어진 내액을 원심분리하여 투석중에 생성한 침전을 제거하였다.

상층액을 상기의 아세트산 완충액(이하 완충액 A라 기록함)으로 평행화한 DEAE 도요펄(도오스-(주)제)컬럼(2.2×60cm)에 통과시키고, 흡착한 단백질 0∼0.5M 식염의 선형구배법(완충액-A 사용)으로 용출하고, 프린뉴클레오시드 포스포릴라아제 단편과 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 단편을 각각 회수하였다. 각각의 활성단편을 완충액 A에 대하여 투석한 후, 25ml용 주사통(데루모(주)제)에 충전한 20ml DEAE 도요펄 수지를 사용하여 상기와 같은 조작에 의하여 컬럼 크로마토그래피를 행하여, 가각의 활성단편을 회수하였다.

다음에 활성단편을 각각 완충액 A로 평형화한 도요펄 HW-55S(도오소-(주)제) 컬럼(2.4×80㎝)을 사용하여 겔 여과하여 양 효소를 거의 균일한 정제품으로서 회수하였다.

양 효소의 정제과정에서의 활성단편의 단백질, 총활성 및 정제정도를 표9에 나타낸다.

더욱, 정제정도는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법에 의하여 얻어진 영동패턴을 농도계(densitometor)를 사용하여 각 밴드의 상대비율을 측정하는 방법에 의하여 구했다.

① 총단밸질량은 6080㎎이다.

② 총단백질량은 3770㎎이다.

[비교예 1]

브레비 박테리움·아세틸리캄(Brevivacterium acetylicum) AT 6-7(ATCC 39311) 및 바실루스·스테아로더모필러스 TH 6-2의 각 사면으로부터 배지(펩톤 1%, 육엑스 0.7%, 식염 0.3% 효모엑스 0.5%, pH 7.2) 10㎖를 포함하는 대형시험관에 접종하고, 각각 28℃(AT 6-7의 경우) 및 50℃(TH 6-2의 경우)에서 18시간 진탕배양하였다. 배양후, 각각의 배양액을 원심분리하여 균체를 분리하였다. 세척후, 이 습윤 중량의 균체를 각각 10㎖의 탈이온수에 현탁하였다.

이 균체현탁액 각각에 0.4mM 트리아졸 0.4mM 우리딘 및 0.4mM 인산 이수소칼륨을 함유하는 기질용액(AT 6-7의 경우는 pH 7.0, TH 6-2의 경우는 pH 6.0로 조정) 10㎖를 첨가하여 밀폐계에서 45℃또는 65℃에서 교반하면서 반응시키고 정기적으로 샘플링하여 전술의 HPLC법으로 리바비린의 생성율을 측정하였다.

이 결과를 제5도에 나타낸다.

제5도에 명백한 바와같이 본 발명의 미생물로부터 조제한 효소 제조물을 사용한 경우, 종래, 극히 우수한 효소 제조원이었던 AT 6-7보다도 더욱 단시간에 목적화합물을 제조할 수가 있고, 효소 제조물의 사용량도 소량으로 종료할 수 있음이 명백하게 되었다.

이상과 같이, 본 발명의 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 함유하는 효소제조물은 비활성이 높고, 내열성이 있는 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 다량으로 함유하고, 균체단위중량당 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성이 높은 바실루스 속의 효열균에 속하는 미생물군의 1종 또는 2종 이상의 미생물의 균체로부터 유래하는 것이고, 이와 같은 효소 제조물을 뉴클레오시드의 제조에 사용하면, 이하의 특징으로 갖고, 실용성이 풍부한 극히 유용한 방법이 된다.

① 비활성이 높은 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 다량으로 함유하고 있고 뉴클레오시드의 제조에 사용되는 경우에 소량의 효소량으로 양호한 수율로 뉴클레오시드를 제조할 수가 있다.

② 최적온도 및 안정온도범위가 비교적 고온역에 있는 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 함유하고 있다. 이 때문에, 반응을 고농에서 행할수가 있고 잡균의 오염에 의한 효소의 활성상실, 반응생성물의 분해등을 억제할 수가 있다.

③ 뉴클레오시드 포스포릴라아제로서 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제와 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 양쪽의 효소를 함유하는 제조물을 얻을 수도 있고, 이와같은 제조물을 뉴클레오시드 제조에 사용하면 예를들면, 하기의 반응식에 표시한 바와 같이 두개의 효소가 공동하여 적용하기 때문에, 1종류의 뉴클레오시드 포스폴리라아제만을 함유하는 효소조제물과 비교하여 2배 이상의 속도로 뉴클레오시드를 제조할 수가 있다.

또, 본 발명의 미생물은 비교적 고온에서 생육하여 생육속도도 빠르고, 배양하여 얻어진 균체에는 전술한 바와 같은 뉴클레오시드의 제조에 적합한 효소를 다량으로 함유하고 있기 때문에 뉴클레오시드 제조에 사용하기 위하여 효소조제물 또는 그 제조원으로 극히 유용하다.

더욱, 본 발명의 효소조제물로서 미생물의 배양물을 사용하면 균체의 자기소화를 방지할 수도 있다.

또, 상기 본 발명의 미생물로부터 얻어지는 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 높은 비활성을 갖고, 그리고 비교적 고온역의 최적온도와 안정온도범위를 가지는 특징에 의해 공지의 뉴클레오시드 포스포릴라아제와는 명확히 구별되는 것이다. 또 이와같은 효소를 뉴클레오시드의 제조에 사용하면 상술의 ① 및 ②의 효과를 갖는다. 또 본 발명의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제와 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 양쪽의 효소를 사용하면 상술의 ③의 효과를 이룰 수 있다.

[산업상의 이용가능성]

본 발명의 뉴클레오시드의 제조법은, 바실루스속의 호열균에 속하는 비활성이 높고, 내열성이 있는 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 대량 함유하고, 균체단위 중량당 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성이 높은 미생물균의 미생물 균체에 유래하는 효소 제조물을 뉴클레오시드 제조를 위하여 효소원으로서 사용하고 있고, 약간의 효소량으로 수율좋게 목적으로 하는 뉴클레오시드를 제조할 수도 있고, 극히 실용적인 방법이다.

Claims

염기공여체, 당잔기공여체 및 인산공여체를 뉴클레오시드 포스포릴라아제가 함유된 효소제조물을 사용하여 반응시킴으로써 염기공여체의 염기부분과 당잔기공여체의 효소제조물을 사용하여 반응시킴으로서 염기 공여체의 염기부분과 당잔기공여체의 당부분 사이에 N-글루코시드 결합을 형성시켜 뉴클레오시드를 제조하는 방법에 있어서, 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 함유하는 효소조제물로서 수탁번호 FERM BP-2758을 갖는 바실루스 스테아로더모필러스 스트레인으로부터 유래하는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드의 제조법.
제1항에 있어서, 효소조제물로서 균체단위중량당 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성이 이하의 조건을 적어도 한가지 만족시키는 상기 바실루스 스테아로더모필러스 스트레인으로부터 유래하는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드의 제조법 ;

① 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성

10U/g 습균체이상

② 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성

10U/g 습균체이상
제1항에 있어서, 효소제조물로서 균체단위중량당의 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성이 이하의 조건을 동시에 만족하는 상기 바실루스 스테아로 더모필러스 스트레인으로부터 유래하는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드의 제조법 ;

① 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성

10U/g 습균체이상

② 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성

10U/g 습균체이상
제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 효소제조물의 형태가 상기 바실루스 스테아로더모필러스 스트레인의 배양물, 상기 바실루스 스테아로더모필러스 스트레인의 생균체 또는 상기 바실러스 스테아로더모필러스 스트레인의 균체처리물인 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드의 제조법.
다음과 같은 성질을 갖고, 수탁번호 FERM BP-2758을 갖는 바실루스 스테아로더모필러스 스트레인의 배양물로부터 효소를 추출하는 방법에 의해 획득할 수 있는 것을 특징으로 하는 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 ;

① 온도안성성 : 60℃, 15분간 가열처리에 있어서도 안정함.

② 비활성 : 80%의 효소의 정제정도로 400(U/㎎) 이상.
다음과 같은 성질을 갖고, 수탁번호 FERM BP-2758을 갖는 바실루스 스테아로더모필러스 스트레인의 배양물로부터 효소를 추출하는 방법에 의해 획득할 수 있는 것을 특징으로 하는 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 ;

① 온도안성성 : 60℃, 15분간 가열처리에 있어서도 안정함.

② 비활성 : 80%의 효소의 정제정도로 250(U/㎎) 이상.
수탁번호 FERM-BP 2758을 갖는 바실루스 스테아로더모필러스 스트레인.