JP2001514896A - グアノシン二リン酸−６−デオキシヘキソースの酵素的生産方法およびオリゴ糖製造のためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、GDP-D-マンノース、マンノース-1-リン酸またはマンノース-6-リン酸から、適当な酵素、例えばGDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼおよび場合によりGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼまたはGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-4-レダクターゼの存在下で、GDP-6-デオキシヘキソースを酵素的・調製的に生産する方法に関する。また、本発明は、得られたGDP-活性化ヘキソースをグリコシルトランスフェラーゼ、例えばフコシルトランスフェラーゼを用いてオリゴ糖または多糖に結合させる方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、単純な栄養素からまたはGDP-D-マンノースから、グアノシン二リン
酸(GDP)-6-デオキシヘキソース、例えば、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース
、GDP-L-フコースおよびGDP-L-ペルオサミンを酵素的に合成する方法に関する。
本発明はまた、グリコシルトランスフェラーゼを用いてオリゴ糖または多糖を合
成するための、微生物においてまたはin vitroで生産されたGDP-6-デオキシヘキ
ソースの使用に関する。

【０００２】 D-グルコース、D-グルコサミン、D-マンノース、D-ガラクトースなどの自然界
に大量に存在するヘキソース類は、まず、それらをヌクレオシド三リン酸(NTP) で活性化してNDP-ヘキソース(UDP-、dTDP-、GDP-、CDP-ヘキソース)を形成させ 、次にそれらを対応する前駆体分子に特異的グリコシルトランスフェラーゼで移
すことにより、オリゴ糖や多糖に組み込まれる。しかし、これらの単純な糖は、
最初に、二次修飾されたNDP-活性化ヘキソース誘導体に生合成的に変換されるこ
とが多い。これらの糖分子の大きなグループであるNDP-6-デオキシヘキソース（
通常は、dTDP-、GDP-またはCDP-活性化ヘキソース誘導体）は6-ヒドロキシル基 の欠失を特徴とし、特有の機能をもつ多くの生物学的分子へ各種の修飾中に組み
込まれる。このグループの物質の典型的な例は、L-フコース(GDP-D-マンノース から)、L-ラムノース(dTDP-D-グルコースから)および腸内細菌の3,6-ジデオキシ
ヘキソース（例えば、CDP-D-グルコースからのD-コリトース）である。L-フコー
スやD-ペルオサミンなどのGDP-D-マンノースから作られる糖誘導体は多数の酵素
（約30種）により生産されるが、これらの酵素はしばしば最終産物により阻害さ
れる。これに関連して、ほんの弱い阻害しか示さない酵素または実際上フィード
バック阻害を全く示さない酵素、例えば、ManB（ホスホマンノムターゼ）、ManC
（マンノース-1-リン酸グアニルトランスフェラーゼ[GDP-マンノースピロホスホ
リラーゼまたはシンターゼ]）およびグラム陰性菌であるEscherichia coli由来 の酵素は宿主生物における過剰生産に有利である(Stevenson, G.ら, J. Bacteri
ol. 178 (16), 4885-4893, 1996)。

【０００３】 6-デオキシヘキソースの生合成経路は、典型的には、NDP-6-デオキシ-D-4-ヘ キスロースを形成するためのNAD(+)依存性NDP-ヘキソース-4,6-デヒドラターゼ により触媒される脱水反応から開始される（図１；Piepersberg, W., Crit. Rev
. Biotechnol. 14, 251-285, 1994; Liu, H.-W. & Thorson, J.S., Ann. Rev. M
icrobiol. 48, 223-256, 1994; Piepersberg, W. & Distler, J. In: Biotechno
logy (第2版), Vol.7, Products of Secondary Metabolism (Rehm, H.-J., Reed
, G., Puhler, A., Stadler, P.編), p.397-488, 1997) 。さらなる修飾反応がD
-立体配置のレベルで起こり、アミノ基転移、デヒドラーゼ反応による隣接する3
-ヒドロキシ基の脱ヒドロキシル化、または4-ヒドロキシ基を形成するエナンチ オ選択的還元のために、例えば4-ケト化合物が使用される。他の生合成経路では
、最初に、NDP-6-デオキシ-D-4-ヘキスロースがエピメラーゼ反応によりNDP-6- デオキシ-L-4-ヘキスロースに変換され、その過程で、通常は5位のほかにヘキソ
ースの3位の立体特異性が逆転する（図１）。

【０００４】 マンノースからのフコースの直接生産はヌクレオチド活性化形態で代謝中に起
こるだけである。それゆえに、生合成酵素は活性化すなわちヌクレオチド部分に
依存する。また、他の二次修飾すなわち強く修飾された糖は、例えばdTDP-L-ラ ムノースについて示されるように、ヌクレオチド活性化形態で生合成される(DE
195 37 217.4; Verseck, S., Dissertation, University, Wuppertal, 1997)。 これに関連して、dTDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘキスロースは生合成経路の中 間産物である。この物質の酵素的合成および単離もすでに記載されている(Marum
o, K.ら, Eur. J. Biochem. 204, 539-545, 1992)。

【０００５】 GDP-L-フコースは、例えば、一例としてブタ唾液腺を用いてChangらにより示 されるように(J. Biol. Chem., 263, 1693-1697, 1988)、2〜3の連続した酵素的
工程でGDP-D-マンノースから生産され、また、これは細菌におけるL-ラムノース
とL-(ジヒドロ)ストレプトースの生合成からも類推されている(Marumo, K.ら, E
ur. J. Biochem. 204, 539-545, 1992; Verseck, S., Dissertation, Wuppertal
, 1997)。Escherichia coliでの遺伝的証拠に基づいて、Reevesら(J. Bacteriol
. 178, 4885-4893, 1996)は、GDP-L-フコースへの変換にはコラン酸合成用の遺 伝子クラスター中の2個の遺伝子、gmd (GDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼ)
とwcaG (GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース 3,5-エピメラーゼII-4-ケトレ ダクターゼ) で十分であると推定している。その結果、dTDP-D-グルコースから のdTDP-L-ラムノースの合成とは対照的に、GDP-D-マンノースからのGDP-L-フコ ースの合成には3種ではなく2種の酵素で十分である(Marumo, K.ら, Eur. J. Bio
chem. 204, 539-545, 1992; Verseck, S., Dissertation, Wuppertal, 1997)。 さらに、Changら(J. Biol. Chem. 263, 1693-1697, 1988)は、GDP-D-マンノース
が最初に特異的デヒドラターゼによりGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノースに変
換され、続いてこれがエピメラーゼおよびケトレダクターゼ活性を有する酵素に
よりGDP-L-フコースに変換されると記載している。さらに、他のデオキシヘキソ
ース類はおそらく共通の中間産物 GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース、例え ば、腸内細胞 Vibrio choleraeの遺伝子rfbEの存在に起因されるアミノ基転移産
物 GDP-D-ペルオサミンから誘導されると考えられる(Manning, P.A.ら, Gene 15
8, 1-7, 1995)。L-フコースの直接生産とは対照的に、D-ペルオサミンおよびD- マンノースから出発するGDP-6-デオキシヘキソース生合成経路の他の誘導体は、
特定のヌクレオチド基の非存在下では商業上関心のある量で生産することができ
ない。

【０００６】 L-フコースとD-ペルオサミンは細胞外多糖類、糖タンパク質、その他の細胞表
面グリココンジュゲート（例えば、シアリル LewisX のような四糖類）の重要な
構成単位である。さらに、L-フコースとD-ペルオサミンはマクロライド系抗生物
質であるペリミシン(perimycin)のような他の天然物質の重要な成分でもある。G
DP-活性化前駆物質からこのような（偽）サッカライド最終産物への糖の転移は 、通常、特異的なグリコシルトランスフェラーゼにより行われる。ヒトサンプル
を含めて、フコシルトランスフェラーゼの様々な供給源が知られている。すなわ
ち、Fut1 (Flegel W.A., Dissertation University Ulm, 1998)、Fut2 (Kelly,
R.J.ら, J. Biol. Chem. 270 (9), 4640-4649, 1995)またはFut3 (Cameron, H.S
.ら, J. Biol. Chem. 270 (34), 20112-20122, 1995) および種々の細菌、例え ば、Escherichia coli由来(Stevenson, G.ら, J. Bacteriol. 178 (16), 4885-4
893, 1996)、Yersinia enterocolitica 由来(Zhang, L.ら, Mol. Microbiol. 23
, 63-76, 1997)またはHelicobacter pylori 由来(Martin, S.L., Glycobiology
(印刷中))のものである。

【０００７】 したがって、本発明の課題は、グアノシン二リン酸(GDP)-6-デオキシヘキソー
ス化合物を製造するための、工程数が可能な限り少ない簡便な方法を提供するこ
とである。

【０００８】 本発明の課題は、GDP-D-ヘキソースの酵素的生産方法により達成され、この方
法は、出発物質としてのGDP-D-マンノースまたはGDP-D-マンノースに変換可能な
化合物を、GDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼ(Gmd, RfbD)および場合により
GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ(WcaG)
またはGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-4-アミノトランスフェラーゼ(RfbE
)活性を有する1種または数種の酵素の存在下でインキュベートし、目的の産物を
単離することを含む。酵素的合成に必要とされる酵素は、好ましくは、これらの
酵素をコードする遺伝子またはDNA断片をクローニングし、1種または数種のベク
ターに挿入し、細菌または真菌宿主細胞に形質転換することにより、本発明に従
って単離される。前記方法は特に、E. coliなどの適当な宿主生物での対応する 生合成酵素の過剰生産によるGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノースまたはGDP-L-
フコースの調製的in vitro生産および精製に適している。生合成酵素はホスホマ
ンノムターゼ(ManB)、GDP-D-マンノースシンターゼ(ManCまたはピロホスホリラ ーゼ、マンノース-1-リン酸グアニルトランスフェラーゼ)、GDP-D-マンノース-4
,6-デヒドラターゼ(Gmd, RfbD)および／またはGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノ
ース-3,5-エピメラーゼ-4-ケトレダクターゼ (WcaGまたはGDP-L-フコースシンタ
ーゼ)であり、E. coliに由来するものが好ましい(Stevenson, G.ら, J. Bacteri
ol. 178, 4885-4893, 1996)。

【０００９】 さらに、本発明による方法はGDP-D-ペルオサミンの調製的生産に適しており、
GDP-D-ペルオサミンシンターゼ(RfbE、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-4-
アミノトランスフェラーゼ)をVibrio cholerae O1から過剰生産させることを含 む。

【００１０】 その結果、本発明によれば、対応する酵素をコードする次の遺伝子またはDNA 断片が好適である。すなわち、manB、manC、gmd、rfbD、rfbEおよびwcaGである 。必要に応じて、遺伝子または適切なDNA領域を、発現に使用する前に、例えば 適当なプライマーを用いて特定的に増幅することができる。

【００１１】 適当な細菌または真菌宿主生物は、例えば、E. coli、Bacillus subtilis、Co
rynebacterium sp.、Staphylococcus carnosus、Streptomyces lividans、Sacch
aromyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Hansenula polymorphaおよ
びPichia stipidisである。

【００１２】 前記方法の好ましい実施形態では、最初に、マンノース-6-リン酸とGTPを、ホ
スホマンノムターゼ(ManB)およびGDP-D-マンノースシンターゼ(ManC)の存在下で
インキュベートし、場合により、GDP-D-マンノースを分離してその後の合成に使
用し、そして得られた目的の産物、例えばGDP-L-フコースを単離する。

【００１３】 さらに、本発明による方法の好ましい実施形態では、全ての出発物質または基
質を含むバッファー溶液を、（合成用）酵素が固定化されている固相支持材料上
に連続してパーコレートさせる。

【００１４】 さらに、前記方法は、本発明に従って、バッチ法でまたは酵素−膜反応器で連
続的に実施する場合に有利であることが分かった。

【００１５】 本発明のさらなる主題は、本発明により製造されたGDP-6-デオキシヘキソース
をグリコシド、オリゴ糖または多糖に、グリコシルトランスフェラーゼ活性をも
つタンパク質の存在下で結合させる方法である。特に、本発明は、適当な基質へ
のグリコシル転移を行うことにより、また、GDP-L-フコースなどのGDP-活性化ヘ
キソースの十分量を提供することにより、L-フコシル化またはD-ペルオサミニル
化する方法に関する。グリコシル転移は酵素的に、すなわち、フコシルトランス
フェラーゼおよび／またはペルオサミントランスフェラーゼ活性をもつタンパク
質によって起こることが好ましい。

【００１６】 GDP-L-フコースは、例えば2-フコシル-β-ガラクトシドまたは3-フコシル-β-
N-アセチルガラクトサミンなどのオリゴ糖の適当なフコシルトランスフェラーゼ
を用いる酵素的合成に使用することができる。GDP-D-ペルオサミンは、同様に、
適当なグリコシルトランスフェラーゼ、例えばVibrio cholerae O1または他のグ
ラム陰性菌もしくはグラム陽性菌由来のペルオサミニルトランスフェラーゼを用
いる、オリゴ糖などの適当なレセプター分子または二次代謝産物（例えば、ペリ
ミシンのようなマクロライド）のグリコシル化に使用することができる。

【００１７】 したがって、GDP-ヘキソースの生合成および転移のための酵素（グリコシルト
ランスフェラーゼ）の組換え生産方法のほかに、本発明はまた、グアノシン二リ
ン酸-D-マンノース、グアノシン二リン酸-6-デオキシ-D-ヘキスロース（例えば 、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース）、グアノシン二リン酸-6-デオキシ-L-
ヘキソース（例えば、GDP-L-フコース）、およびグアノシン二リン酸-4,6-ジデ オキシ-D-ヘキソサミン（例えば、GDP-D-ペルオサミン）の酵素的生産方法に関 する。本発明の特に有利な点は、これまで大量生産ができなかったGDP-活性化糖
を調製的規模で生産できるようになったこと、さらに、得られた構成単位を価値
のある活性物質のin vitroまたはin vivo合成のために使用できることである。 前記方法は、前記の目的および用途に利用できるようにするために、細菌から適
当な遺伝子を単離し、それらの遺伝子を新たな宿主生物に、好ましくは遺伝子産
物のより強力で制御可能な発現のための適当な制御エレメント（例えば、プロモ
ーター）の制御下に、または他の遺伝子との新たな代謝関係へと、遺伝子工学的
手法により組み込む点に特徴がある。

【００１８】 以下で、実施例に基づいて本発明の方法をより詳細に説明する。

【実施例】実施例１ E.coli株の培養、プラスミドDNAの調製およびDNA断片の単離 E.coli DH5αおよびE.coli BL21(DE3)を好ましくはLB培地（10g/lトリプトン 、5g/l酵母抽出物、5g/l塩化ナトリウム）中で37℃にてインキュベートした。プ
ラスミド保有細菌を抗生物質（100μl/mlアンピシリン、30μl/mlクロラムフェ ニコール）の選択圧力下に維持した。培養は循環シェーカー上で270rpmにて行っ
た。少なくとも12時間インキュベートした調製物を一晩培養物と称した。 選択圧力下でインキュベートした1.5mlの一晩培養物から得た細胞を用いてプ ラスミドDNAを調製した。プラスミドをアルカリSDS-溶解法により単離した(Birn
boim, H.C., Doly, J., Nucleic Acid Res. 7, 1513, 1979)。 制限エンドヌクレアーゼをもっぱらメーカーの取扱説明書（Gibco BRL, Eggen
stein）にしたがって用いることにより、ベクターDNAを加水分解した。10μgの プラスミドDNAの制限に対して各制限エンドヌクレアーゼを5U（単位）用いて、3
7℃にて2時間インキュベートした。完全に加水分解するために同量の制限エンド
ヌクレアーゼを再度加え、少なくとも1時間再インキュベートした。 切断されたDNAを1％水平アガロースゲルを利用して電気泳動により分離した。
DNA断片を含むゲル片を溶出用の滅菌メスを用いて切断した。DNA断片をJETsorb キット（Genomed, Bad Oeynhausen）の取扱説明書にしたがってアガロースから 溶出した。

【００１９】実施例２ 染色体DNAの単離（改良型、Pospiech, A., Neumann, B., TIG 11, 217-218, 199
5) E.coli DH5α細胞について、1.5mlの一晩培養物をLB培地中で37℃にて増殖さ せ、遠心分離（5分、7000rpm）によって採取した。細胞沈殿物を567μlのTE緩衝
液に再懸濁して、30μlのSDS(10％)、20μlのリゾチーム溶液(20mg/ml)および3 μlのプロテイナーゼK(20mg/ml)とともに37℃にて1時間インキュベートした。そ
の後、100μlの5M塩化ナトリウム溶液および80μlのCTAB溶液（臭化ヘキサデシ ルトリメチルアンモニウム）を加えて、数回転回させ、65℃で10分間インキュベ
ートした。800μlのクロロホルム／イソアミルアルコールを加えた後、5分間遠 心分離し(3000rpm)、水相を同容量のフェニル／クロロホルムと新しい容器中で 混合した。遠心分離によって再度相を分離させ、水相を0.6容量部の2-プロパノ ールに加え、析出したDNAを遠心分離した。DNAを1mlのエタノール(70％)で1回洗
浄し、RTで乾燥した後100μlのTE緩衝液(10mM Tris/HCl pH8、1mM EDTA）に再懸
濁した。

【００２０】実施例３ ポリメラーゼ連鎖反応 選択されたDNA領域の特異的in vitro増幅にPCRを用いた。 メーカーの取扱説明書(New England Biolabs, Schwalbach)にしたがって反応 にVent DNAポリメラーゼを用いた。反応はサーモサイクラー(Biometra, Gotting
en)中で行った。 PCR法（ポリメラーゼ連鎖反応、Saikiら, 1985）によるDNA断片の増幅は、100
μlの標準混合物中で行った（表１）。

【００２１】

【表１】 * プライマーは、PCRに用いる前に1:10に希釈した。PCR混合物において、濃度は
50pmol/100μlに相当し、OD260＝1.0/100μl＝100pmolであった。PCR混合物の総
容量はそれぞれの場合において100μlであり、60μlの滅菌鉱油で薄くおおった 。 特定のDNA領域の増幅のためのPCR混合物を表に示した温度プログラム（表２）
にかけた。

【００２２】

【表２】 * 各ステップ間の温度変化（ランピング率）は2℃/sであった。 ** ポリメラーゼは最初の95℃ステップの加熱開始後に加えた。 PCRプログラムサイクルは、ステップ２〜４が1回の運転で6回繰り返され、ス テップ５〜７が30回繰り返されるように選択した。

【００２３】

【表３】 * 新たに形成された切断部位が表に示されており、そのヌクレオチド配列に下線
が引かれている。

【００２４】実施例４ 発現ベクターにおけるmanB、manC、gmd、rfbD、rfbEおよびwcaGのリーディング フレームのクローニング PCRによって単離されたリーディングフレームを、E.coliにおいてmanB、manC 、Gmd、RfbD、RfbEおよびWcaGを過剰発現させるために発現ベクターにクローニ ングした。この場合において、好ましくはNovagen社製の発現ベクターpET11aお よびpET16b（Studier, F.W.ら, Methods Enzymol. 189, 113-130, 1990)を発現 ベクターに選んだ。これらのベクターは、E.coliにおける組換えタンパク質のた
めの強力なクローニングおよび発現系である。 ベクターへのクローニングのために、これらを制限エンドヌクレアーゼNdeIま
たはNcoIおよびBamHIによる加水分解を利用して線状化した。NdeIまたはNcoIお よびBg/IIまたはBamHIで加水分解したmanB、manC、gmdおよびwcaGのPCR産物の断
片を、予めNdeIまたはNcoIおよびBamHIで加水分解した発現ベクター（pCAW13.1(
rfbD); pCAW14.1(rfbE); pCAW19.1(manB); pCAW20.1(manC); pCAW21.1(gmd); pC
AW22.1(wcaG); pCAW21.2(his-gmd); pCAW22.2(his-wcaG)、図２〜９を参照され たい）において線状化し、E.coliに形質転換した。pETベクターのNdeIまたはNco
I切断部位へのクローニングにより、開始コドンが維持され、ベクター上のシャ イン・ダルガノ配列に対して最適距離のところに存在することが保証された。 ベクターpET16bのリーダー配列(his)により、Ni-アガロースカラムによるタン
パク質の精製のための必要条件である過剰発現タンパク質のN-末端への12ヒスチ
ジン残基の融合が可能になる。この手法において形成された組換えタンパク質は
、下記においてHis-GmdまたはHis-WcaGと呼ばれており、これらのタンパク質を コードする遺伝子はhis-gmdまたはhis-wcaGと呼ばれる。 ライゲーション：ライゲートされる断片およびベクターをアガロースゲルから
の溶出（実施例１）により精製した。DNA断片と突出(overhanging)末端（付着末
端）とのライゲーションの場合、ライゲートされる断片を切断されたベクターの
4倍過剰で用いて、RTで1UのT4-DNAリガーゼとともに4時間インキュベートした。 E.coli細胞を用いる形質転換：コンピテント細胞(Hanahan, D., J. Mol. Biol
. 166, 557-580, 1983)を氷上で解凍し、２〜20μlのDNA溶液を加えた。氷上で 少なくとも30分間インキュベートした後、細胞を42℃で90秒間加熱し（熱ショッ
ク）、続いて氷上に少なくとも2分間置いた。再生のために800μlのSOC-培地（2
.0％のトリプトン、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、0.5％の酵母抽出物、10mMのMgCl₂ 、10mMのMgSO₄、20mMのD-グルコース）をピペットで細胞に加えて、37℃で45分
間インキュベートした。100〜1000μlのかかる細胞懸濁液を選択寒天プレート上
に入れ、37℃で一晩保存した。

【００２５】実施例５ DNA配列決定 単離されたリーディングフレームのDNA配列決定をSangerらの方法（Sanger, F
.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977）にしたがって組換えp
ETIIaプラスミドを用いて行った。A.L.F.発現シーケンサー（Pharmacia, Freibu
rg）による自動配列分析のために、フルオレセイン標識「termi」および「promo
」プライマーおよび7-デアザ-ｄGTPを用いる熱シークエナーゼ蛍光標識プライマ
ーサイクル配列決定キットをメーカーの取扱説明書にしたがって用いて配列反応
を行った。 termiプライマー 5'GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG3' promoプライマー 5'GAAATAAATACGACTCACTATAGGG3'

【００２６】実施例６ ManB、ManC、Gmd、RfbD、RfbE、WcaG、His-GmdおよびHis-WcaGの過剰発現 遺伝子産物は、好ましくはE.coli BL21(DE3)中でT7-RNAポリメラーゼ／プロモ
ーター系を利用して過剰発現させることができる（Studierら, 1990）。かかる 目的のために、対応する遺伝子を、標的遺伝子の開始コドンから最適な距離に適
当なSD配列を有するベクターpET16bまたはpETIIa（実施例４を参照されたい）の
MCSのφ10プロモーターの後方にクローニングした。得られた組換えプラスミド をE.coli株BL21（DE3)のコンピテント細胞への形質転換により組み込んだ。 E.coli BL21(DE3)pLysSにおける過剰発現：LB培地（アンピシリン、クロラム フェニコール含有）に適当なプラスミドを含有する株の一晩培養物をOD_540nm が
0.05になるまで接種し、OD_540nm が0.6〜0.8になるまでシェーカーにおいて37℃
にてインキュベートした。1.0mMのイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を加え ることによってT7-RNAポリメラーゼを誘導した。IPTGを加えた90分後に細胞を採
取した。 E.coli過剰発現クローンからタンパク質抽出物を得るために、細胞を遠心分離
によって採取し、細胞溶解緩衝液で2回洗浄した。再懸濁のために1.5mlの細胞溶
解緩衝液を1.0gの細胞に加えた。二者択一的な方法を用いて細胞を溶解させた。
その選択はどのくらいの量の緩衝液が再懸濁に必要であるかに依存していた。5m
l未満の容量については、細胞は超音波を利用することにより溶解した。この場 合、細胞を超音波で5分間処理し（50サイクル、15sパルスおよび15s間隔）、同 時に氷／水混合物で冷却した。抽出物を顕微鏡で調べて溶解が完全であることを
監視した。 細胞を5ml以上の容量の溶解緩衝液に再懸濁した場合、細胞はフレンチプレス （American Instrument Company, メリーランド, USA）により1300psiで2回溶解
され得る。 溶解された細胞を含む懸濁物を、ss-34ローター（Sorvall, DuPont, Bad Nauh
eim）において16000rpmにて30〜45分間遠心分離して細胞断片を沈殿させた。酵 素タンパク質を、酵素調製の古典的方法により高度に精製された状態で、または
His Tag融合タンパク質（実施例７を参照されたい）として調製し、安定な状態 で保存した。

【００２７】

【表４】

【００２８】実施例７ 組換えタンパク質の精製 組換えタンパク質の精製は、好ましくはヒスチジン含有オリゴペプチドとのC-
またはN-末端融合により促進される（実施例４）。この精製は、Qiagen社(Haan)
製のNi-NTAアガロースを利用することにより、QIAexpressプロトコルにしたがっ
て行った。このアフィニティクロマトグラフィーは、特異的に構築された組換え
タンパク質（His-Gmd、His-WcaG）のHis-タグへのNi-NTAアガロースのニッケル イオンの結合に基づくものである。液体クロマトグラフィーコントローラ（LCC-
500plus, Pharmacia社）、二段ピストンポンプ(P500, Pharmacia社）、フロース
ルーUVモニター(UV-1, l_280nm , Pharmacia社）、2-チャンネルレコーダー(Rec4
82, Pharmacia社）およびフラクションコレクター(Frac100, Pharmacia社）から
構成されるFPLC系を精製に用いた。

【００２９】実施例８ タンパク質のゲル電気泳動単離 SDSポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質の変性分離およびクーマシー染 料によるそれらの染色

【表５】

【００３０】 電気泳動をSERVA Blue-Vertical 100/C装置（BioRad, ミュンヘン）（ゲル体 、80×100×0.75mm）を用いて行った。分析される試料のタンパク質濃度を、BSA
を用いて検量線を作成するタンパク質アッセイ（BioRad、ミュンヘン）により測
定した。Sigma（Deisenhofen)製のVIILダルトンマーカー(14.2kDa〜66kDa）を分
離されたタンパク質の分子量についての標準として用いた。

【００３１】実施例９ 酵素活性の測定 ホスホマンノムターゼ活性の測定 ホスホマンノムターゼ活性をVerseck, S.ら（Glycobiology 6, 591-597, 1996
)にしたがって測定した。 酵素混合物： トリス/HCl、pH8.0 50 mM MgCl₂ 10 mM NADP⁺ 1 mM グルコース-1,6-二リン酸 0.25 mM マンノース-1-リン酸 1 mM 粗抽出物、ManC 可変 グルコース-1,6-リン酸デヒドロゲナーゼ 0.5 U/ml ホスホマンノースイソメラーゼ 0.5 U/ml ホスホグルコースイソメラーゼ 0.5 U/ml 最終容量 500μl 反応をマンノース-1-リン酸を加えることにより開始させた。反応の進行をλ_{3 40nm} の吸光度により30℃にて分光学的に監視した。

【００３２】 GDP-D-マンノセピロホスホリラーゼ活性の測定 GDP-D-マンノセピロホスホリラーゼ活性をSigma(Deisenhofen)製のPP_i 試薬を
用いて測定した。 酵素混合物： PP_i 試薬 170 μl トリス/HCl、pH8.0 50 mM MgCl₂ 10 mM GTP 2 mM マンノース-1-リン酸 10 mM 粗抽出物ManB 可変 最終容量 500 μl マンノース-1-リン酸を加えることにより反応を開始させた。37℃におけるNAD
Hの減少をλ_340nm にて分光学的に監視した。NADH₂ のモル吸光係数は、ε₃₄₀ ＝6.22×10⁶ l/(mol×cm)であった。

【００３３】 GDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼ活性の測定 GDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼ活性を、Kornfeldら, 1965にしたがっ て測定した。 酵素混合物： トリス/HCl、pH7.5 50 mM GDP-D-マンノース 4 mM 粗抽出物GmdまたはRfbD 可変 最終容量 300 ml 50μlの試料を所定の時間に取り出し、950μlの1N NaOHに加え、37℃でさらに
20分間インキュベートした。吸光度をλ_320nm (ε₃₂₀ ＝4600 l/(mol×cm))で測
定した。陰性対照においては、GDP-D-マンノースを水に置き換えた。

【００３４】 GDP-4-ケト-6-デオキシマンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ活性の測 定 酵素混合物： トリス/HCl、pH7.5 50 mM GDP-4-ケト-6-デオキシマンノース 2 mM NADPH₂ 1 mM 粗抽出物、WcaG 可変 最終容量 0.5 ml 試験される粗抽出物を加えることによって反応を開始させた。NADPH₂ の減少 をλ_340nm (ε₃₄₀ ＝6.22×10⁶ l/mol×cm)で温度37℃にて測定した。

【００３５】 GDP-D-ペルオサミンシンターゼ活性の測定 酵素混合物： トリス/HCl、pH7.5 50 mM GDP-4-ケト-6-デオキシマンノース 2 mM L-グルタミン酸 2.5 mM ピロドキサールリン酸 8 mM 塩化マグネシウム 1 mM 粗抽出物、RfbE 可変 最終容量 0.5 ml アミノ酸であるL-グルタミン酸をアミノドナーとして使用した。 酵素混合物を37℃でインキュベートし、水浴中で100℃で1分間加熱することに
よって反応を停止させた。遠心分離によりタンパク質を除去した後、溶液をHPLC
分析にかけた。 各過剰発現クローンを、RfbD、RfbE、ManB、ManC、WcaGおよびGmdと呼ぶ（実 施例６を参照されたい）。

【００３６】実施例１０ D-マンノース-6-リン酸のGDP-D-マンノースへの調製的変換用の混合物 ManBおよびManCを用いる調製的変換用の混合物 トリス/HCl、pH8.0 50 mM マンノース-6-リン酸 150 μmol MgCl₂ 10 mM 粗抽出物ManB 120 nkat 粗抽出物ManC 120 nkat GTP 150 μmol 最終容量 6 ml E.coli BL21(DE3)pLysS pCAW19.1またはpCAW20.1の粗抽出物をGDP-D-マンノー
スへの変換に用いた。混合物を37℃にて1時間インキュベートした。1分間煮沸す
ることによって反応を終了させた。タンパク質をmicrosep管（排除サイズ3kDa；
Amicon, ハイデルベルク）中で8000rpm（SS-34ローター；Sorvall DuPont, Bad
Nauheim）にて限外濾過することによって一晩かけて分離した。

【００３７】実施例１１ GDP-D-マンノースのGDP-4-ケト-6-デオキシマンノースの調製的変換 GmdまたはRfbDを用いる調製的変換用の混合物 トリス/HCl、pH7.5 300 μmol GDP-D-マンノース 165 μmol(100mg) 粗抽出物GmdまたはRfbD 120 nkat 最終容量 6 ml E.coli BL21(DE3)pLysS pCAW21.1もしくは2またはpCAW13.1の粗抽出物をGDP-D
-マンノースの変換に用いた。混合物を37℃で1時間インキュベートした。1分間 煮沸することによって反応を終了させた。microsep管（排除サイズ3kDa；Amicon
, ハイデルベルク）中で8000rpm（SS-34ローター；Sorvall DuPont, Bad Nauhei
m）にて限外濾過することによってタンパク質を一晩かけて分離した。上清を、G
DP-L-フコースまたはGDP-D-ペルオサミンなどのその他のGDPヘキソースの調製的
合成にさらに用いた。

【００３８】実施例１２ GDP-4-ケト-6-デオキシマンノースのGDP-L-フコースへの調製的変換 WcaGを用いる調製的変換用の混合物 トリス/HCl、pH7.5 400 μmol GDP-4-ケト-6-デオキシマンノース 82 μmol(50mg) NADPH₂ 123 μmol 粗抽出物WcaG 3.5 U 最終容量 8 ml 酸化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP⁺)またはニコチンア ミドアデニンジヌクレオチド(NAD⁺)を再生するために、イソクエン酸デヒドロゲ
ナーゼによって触媒されるイソクエン酸との酵素反応により還元した。 GDP-4-ケト-6-デオキシマンノースを実施例１１に記載された調製物から誘導 した。E.coli BL21(DE3)/pLysS pCAW22.1(WcaG)を変換に用いた。これらの混合 物を37℃にて1時間インキュベートした。次いで、反応混合物を氷上で冷却し、1
50μlの0.3M 過塩素酸を加えた。この手法で沈殿させたタンパク質を30000gで1 時間遠心分離することにより除去した。次いで、上清を1Mの水酸化カリウムで中
和した。

【００３９】実施例１３ GDP-4-ケト-6-デオキシマンノースのGDP-D-ペルオサミンへの調製的変換 RfbEを用いる調製的変換用の混合物 トリス/HCl、pH7.5 400 μmol GDP-4-ケト-6-デオキシマンノース 82 μmol(50mg) L-グルタミン酸 123 μmol 粗抽出物RfbE 3.5 U ピリドキサールリン酸 100 μmol 最終容量 8 ml GDP-4-ケト-6-デオキシマンノースを実施例１１に記載された調製物から誘導 した。E.coli BL21(DE3)/pLysS pCAW14.1(RfbE)を変換に用いた。これらの混合 物を37℃にて1時間インキュベートした。次いで、反応混合物を氷上で冷却し、1
50μlの0.3M 過塩素酸を加えた。この手法で沈殿させたタンパク質を30000gで1 時間遠心分離することにより除去した。次いで、上清を1Mの水酸化カリウムで中
和した。

【００４０】実施例１４ 実施例１０〜１３に記載したバッチプロセスにおける酵素反応に加えて、その
周りに基質および緩衝溶液を好ましくは温度30〜37℃で流す固定化酵素を用いる
ことによっても反応を行った。

【００４１】実施例１５ GDP-ヘキソースの精製 DOWEXイオン交換クロマトグラフィー GDP-L-フコースの合成における副産物NADP⁺ またはNAD⁺ および残留基質NADPH ₂ またはNADH₂ 、またはGDP-D-ペルオサミンの合成におけるピリドキサールリン
酸、L-グルタミン酸およびα-ケトグルタール酸を分離するために、対イオンと してギ酸イオンを有する1×8 DOWEX樹脂（メッシュ＝200〜400；Serva、ハイデ ルベルク）を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーを選択した。樹脂をSR25/5
0カラム(Pharmacia、フライブルク）に充填した。ゲル床の高さは12.5cmであり 、総容量は61mlであった。λ_254nm 用のUVモニターフィルターを有するFPLC系(P
harmacia、フライブルク）を分離に用いた。溶出を下記のようにして行った： 溶出容量(ml)： Dowex緩衝液Ａ（％）： 1200 50 1400 100 l 総容量は1400mlであり、流量は6ml/分であった。5mlの画分を回収した。溶出 は5℃で行った。次いで、画分のHPLC分析を行った後、GDP-活性化ヘキソースを 含む画分をプールした。続いて、約25℃で攪拌しながら高真空（ロータリー−ゲ
ートバルブ真空ポンプRD4、Vacuubrand GmbH+Co、Wertheim）にてこの溶液を10 〜20mlまで濃縮した。各運転後、カラムを185mlの4M ギ酸で再生し、中性pHが測
定されるまでH₂ Oですすいだ。

【００４２】 ゲル濾過 イオン交換クロマトグラフィーにより得られた画分を脱塩するために、sephad
ex G-10カラム(SR25/100カラム、Pharmacia、フライブルク）を用いた。ゲル床 の高さは81cmであり、総容量は398mlであった。GDP-活性化ヘキソースをUVモニ ター（Uvicord SII、I_254nm 、Pharmacia、フライブルク）および2-チャンネル レコーダー（Rec 482、Pharmacia、フライブルク）により検出した。試料をフラ
クションコレクター(Frac100、Pharmacia、フライブルク）で回収した。陰イオ ン交換クロマトグラフィーの濃縮画分をペリスタルティックポンプ（ポンプP-1 ；Pharmacia、フライブルク）を用いて流量0.5ml/分でカラムに加えた。溶出は 、H₂ Oを用いて、最初は0.5ml/分の流量で20〜30分間、その後は1ml/分にて行っ
た。次いで、画分のHPLC分析を行った後、GDP-活性化ヘキソースを含む画分をプ
ールした。

【００４３】 陰イオン交換膜を用いた再加塩 残留ギ酸アンモニウムをNaClで交換するために、ゲル濾過画分を10ml/分で膜 陰イオン交換モジュールQ15（Sartorius、Gottingen）（ポンプP-1；Pharmacia 、フライブルク）上にポンピングした。その後、陰イオン交換モジュールを20〜
50mlのH₂ Oですすいで、活性化ヘキソースを150mMのNaClで膜から溶離させた。 流量は10ml/分であった。その後、この溶液を約25℃で攪拌しながら高真空（ロ ータリー−ゲートバルブ真空ポンプRD4、Vacuubrand GmbH＋Co、Wertheim）にて
10〜20ml/分に濃縮した。各運転後、膜を20〜30mlの0.2M NaOHで再生し、中性pH
が測定されるまでH₂ Oですすいだ。

【００４４】 ゲル濾過および凍結乾燥 再加塩後に得られた溶液を上記のsephadex G-10カラムで脱塩した。 脱塩後、GDP-活性化ヘキソースのプールを液体窒素中で凍結させ、RTで凍結乾
燥した（Cryograph LCD-1、Christ GmbH、Osterode am Harzおよびロータリー−
ゲートバルブ真空ポンプRD4、Vacuubrand GmbH＋Co、Wertheim）。

【００４５】実施例１６ 高速液体クロマトグラフィー(HPLC) 高速液体クロマトグラフィーを用いて反応を監視し、ヌクレオチド活性化糖を分
析した。UV検出器166、ポンプモジュール125およびオートサンプラー502から構 成されるBeckmann社（Beckmann Instruments、ミュンヘン）製の機器を用いてHP
LC分離を行った。下記の分離系を用いた（Payne, S.M.およびAmes, B.N., Anal.
Biochem. 123, 151-161, 1982）。

【００４６】 逆相クロマトグラフィー カラム：Eurospher 100 C18；粒径5mm；250×4.6mm(Knauer, Berlin) 移動溶媒A ：リン酸カリウム緩衝液、pH６ 30 mM 硫酸水素テトラブチルアンモニウム 5 mM アセトニトリル 2 ％ 移動溶媒B ：アセトニトリル 100 ％ 溶出プログラム： 流量 1.5 ml/分 ０％〜40％移動溶媒B： 60 分 100％移動溶媒A： 15 分 全移動溶媒を、MF12膜（直径0.2μm；Schleicher & Schull、Dassel）を含む 滅菌フィルターユニットに使用する前に濾過し、脱気した。全クロマトグラフィ
ーにおいて、試料ループの容量は20μlであった。検出は260nmにて行った。溶出
特性をコンピュータプログラムGold Version7.11U（Beckmann Instruments、ミ ュンヘン）を用いて評価した。ヌクレオチド活性化糖を同時クロマトグラフィー
(co-chromatography)および標準物質との保持時間の比較により同定した。糖を 定量化するために、標準物質を用いてピーク面積対濃度の三点補正を行った。

【表６】

【００４７】実施例１７ NMR分光法 GDP-活性化糖をNMR分光法により同定した。¹H、¹³Cおよび³¹Pスペクトルを400
MHz装置（Bruker AC400、Bruker-Franzen Analytik社、ブレーメン）にて記録し
た。測定される試料をD₂ Oに溶解した。測定は室温で行った。GDP-β-L-フコー スについての対照標準として化学合成で得たビス（トリエチルアンモニウム)-β
-L-フコピラノシル-グアノシン-5'-ピロリン酸についての¹H-NMRデータが利用可
能であった（Schmidt, R.ら, Liebigs Ann. Chem., 121-124, 1991）。

【００４８】実施例１８ GDPヘキソースおよびフコシル化またはペルオサミニル化オリゴ糖のin vivo産生
クローン遺伝子（実施例４を参照されたい）を通常の転写ユニットにある構成
性または誘導性プロモーターの調節下でベクターにクローニングし、微生物、好
ましくはE.coli、Streptomyces種またはSaccharomyces cerevisiaeに形質転換し
た。培養槽培養または固定化細胞を有する反応器における酵素の一定の最適合成
を確保するために、遺伝子を、好ましくは、例えばlacPのような低発現率のプロ
モーターの調節下にクローニングした。一方、固有のプロモーターを有する天然
遺伝子も用いた。活性化糖は、適当なグリコシルトランスフェラーゼ、例えば、
Yersinia enterocokiticaまたは Escherichia coli(RffT)由来のWebH（ガラクト
シド-2-L-フコシルトランスフェラーゼ）を利用して、細胞内の、宿主細胞にお いて生合成により産生されるか、外部から加えられる適当な基質、例えばβ-ガ ラクトシド上に移入される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 GDP-β-L-フコースおよびGDP-D-ペルオサミンの酵素的合成。

【図２】 組換えプラスミドpCAW20.1

【図３】 組換えプラスミドpCAW19.1

【図４】 組換えプラスミドpCAW21.1

【図５】 組換えプラスミドpCAW22.1

【図６】 組換えプラスミドpCAW13.1

【図７】 組換えプラスミドpCAW14.1

【図８】 組換えプラスミドpCAW21.2

【図９】 組換えプラスミドpCAW22.2

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (72)発明者 ディストラー，ユルゲン ドイツ連邦共和国 ディー‐42107 ヴペ ルタル，デュッペレール シュトラーセ 44 (72)発明者 アルベルマン，クリストフ ドイツ連邦共和国 ディー‐42369 ヴペ ルタル，ブライト シュトラーセ 109 (72)発明者 ティッシェール，ウィルヘルム ドイツ連邦共和国 ディー‐82380 パイ ッセンベルグ，フィンケンヴェッグ ５

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グアノシン二リン酸(GDP)-6-デオキシヘキソースの酵素的生
   産方法であって、GDP-D-マンノースまたはその前駆物質を、GDP-D-マンノース-4
   ,6-デヒドラターゼ(Gmd、RfbD)活性および場合によりGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-
   マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ(WcaG)またはGDP-4-ケト-6-デオ キシ-D-マンノース-4-アミノトランスフェラーゼ(RfbE)活性を有する１種または
   数種の酵素の存在下でインキュベートし、そして目的産物を単離することを含ん
   でなる上記方法。
2. 【請求項２】 GDP-D-マンノースからGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース
   、GDP-L-フコースまたはGDP-D-ペルオサミンを生産する、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 酵素的合成に必要とされる酵素が、該酵素をコードする遺伝
   子またはDNA断片のクローニング、1種または数種のベクターへの挿入、および細
   菌または真菌宿主細胞の形質転換により得られる、請求項１または２記載の方法
   。
4. 【請求項４】 最初に前記遺伝子または対応するDNA領域を増幅する、請求 項３記載の方法。
5. 【請求項５】 前記遺伝子またはDNA断片がmanB、manC、gmd、rfbD、rfbEお
   よび／またはwcaGである、請求項３または４記載の方法。
6. 【請求項６】 宿主細胞がE. coli、Bacillus subtilis、Corynebacterium
   sp.、Staphylococcus carnosus、Streptomyces lividans、Saccharomyces cerev
   isiae、Schizosaccharomyces pombe、Hansenula polymorphaおよびPichia stipi
   disである、請求項３〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 【請求項７】 マンノース-6-リン酸とGTPを、ホスホマンノムターゼ(ManB)
   およびGDP-D-マンノースシンターゼ(ManC)の存在下でインキュベートし、そして
   GDP-D-マンノースまたはその二次産物を単離する、請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 前記方法をバッチ法で実施する、請求項１〜７のいずれか１
   項記載の方法。
9. 【請求項９】 前記方法を酵素−膜反応器で連続的に実施する、請求項１〜
   ７のいずれか１項記載の方法。
10. 【請求項１０】 基質または他の出発物質を含むバッファー溶液を、酵素が
    固定化されている固相支持材料上に連続してパーコレートする、請求項１〜７お
    よび９のいずれか１項記載の方法。
11. 【請求項１１】 グリコシド、オリゴ糖または多糖に結合させるための請求
    項１〜１０のいずれか１項記載の方法により製造されたGDP-6-デオキシヘキソー
    スの使用。
12. 【請求項１２】 前記結合を、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する
    タンパク質の存在下で行う、請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 フコースまたはペルオサミンを含むオリゴ糖または多糖の
    製造方法であって、GDP-活性化ヘキソースを、フコシルトランスフェラーゼ ペ
    ルオサミントランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を用いてオリゴ糖または
    多糖に転移させることを含んでなる上記方法。