WO1998011248A1 - Procede pour preparer un glyconucleotide - Google Patents

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WO1998011248A1
WO1998011248A1 PCT/JP1997/003021 JP9703021W WO9811248A1 WO 1998011248 A1 WO1998011248 A1 WO 1998011248A1 JP 9703021 W JP9703021 W JP 9703021W WO 9811248 A1 WO9811248 A1 WO 9811248A1
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sugar
glucose
gdp
phosphate
dna
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PCT/JP1997/003021
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Kenji Takenouchi
Tomoki Hamamoto
Toshitada Noguchi
Original Assignee
Yamasa Corporation
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/305—Pyrimidine nucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a sugar nucleotide which is an important substrate for oligosaccharide synthesis.
  • oligosaccharides have been produced by extraction from natural products, chemical synthesis, or enzyme synthesis, or a combination of these methods.
  • Enzyme synthesis is considered to be a suitable method for mass production. Have been.
  • the enzyme synthesis method does not require complicated procedures such as protection and deprotection found in the chemical synthesis method, and the desired oligosaccharide can be synthesized quickly, and (2) the enzyme has a substrate specificity. This is because it is considered that oligosaccharides with extremely high structure specificity can be synthesized over other methods.
  • the development of recombinant DNA technology in recent years has resulted in the ability to produce various synthases at low cost and in large quantities, further enhancing the superiority of the enzyme synthesis method.
  • a method for producing oligosaccharide by an enzyme synthesis method two methods, a method using a reverse reaction of an oligosaccharide hydrolase and a method using a glycosyltransferase are considered.
  • the former method is based on the fact that low-cost monosaccharides can be used as substrates.
  • the reaction itself utilizes the reverse reaction of the decomposition reaction, and is not necessarily considered to be a dumpling method in terms of its synthesis yield and its application to the production of oligosaccharides with complex structures. Absent.
  • the latter is a synthesis method using glycosyltransferase, and is considered to be more advantageous than the former method in terms of synthesis yield and application to oligosaccharides having complex structures.
  • the mass production of various glycosyltransferases has also been a boost to the realization of the technology.
  • nucleotides which are sugar donors
  • UDPG lysine dilinic acid gelcoose
  • UDP glucose monophosphate
  • G-1-1P yeast cell method based on UMP and glucose
  • the present inventors studied a method for producing UDPG by a conventional yeast cell method using UMP and glucose as substrates, but the amount of UDPG produced was small, and 60% of the added UMP.
  • the above was converted to peridine triphosphate (UTP) or peridine dilinic acid (UDP), and was not a method of producing UDPG that could withstand practical use at all.
  • an object of the present invention is to improve the conventional yeast cell method and to provide a method for efficiently producing a sugar nucleotide such as UDPG. J ⁇ Jj disclosure
  • the present inventors have found that the synthesis of UDPG by yeast involves a reaction system for synthesizing UTP from UMP and a reaction system for synthesizing G-11P from glucose, and a reaction system for synthesizing G-11P from glucose. 1 It is important that the three reaction systems of the reaction system for synthesizing UDPG from P are effectively conjugated, while the synthesis of UTP from UMP anti-I: progresses relatively smoothly, whereas G- 1-P synthesizing activity and UDPG synthesizing activity from UTP and G-1P are weak, and they are effectively conjugated to I, none, resulting in low UDPG production ⁇ : I'm sorry.
  • the present invention provides a method for producing a sugar nucleotide from a nucleotide using a yeast cell, wherein a sugar nucleotide characterized by allowing nucleoside diphosphate-sugar pyrophosphorylase and sugar 1-phosphate to coexist in a reaction system. It is related to the manufacturing method of. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 1 shows the amount of UDPG generated over time.
  • Figure 2 shows the amount of GDP mannose generated over time.
  • sugar nucleotide in the present invention if it is a known sugar nucleotide, Not limited.
  • UDP sugars such as UDPG, UDP glucose, glucose, UDP glucuronic acid, etc.
  • ADP sugars such as ADP glucose
  • dTDP gel course ciTDP gel sugar
  • dTPP sugars such as tooth
  • CDP sugars such as CDP glucose.
  • any yeast that has been conventionally used for producing nucleotides, hammer nucleotides, and the like can be used without particular limitation. Windy, Zygosaccharomyces), Saccharomyces I Candida, Torulopsi., Hansenula, Debaryomyces, etc.
  • a yeast strain can be used. Such yeast may be either live yeast or dried yeast, but it is preferable to use dry yeast from the viewpoint of reaction yield.
  • the nucleoside diphosphate-sugar pyrophosphorylase coexisting in the reaction system is not limited to a specific source, but may be of any origin such as animal, plant, or microbial origin.
  • the microorganism nucleoside diphosphate-sugar pyrophosphorylase it is preferable to use the microorganism nucleoside diphosphate-sugar pyrophosphorylase from the viewpoint of simplicity of preparation. If the nucleoside diphosphate-sugar lipophosphorylase gene to be used has been cloned, use the cloned nucleoside diphosphate-sugar pyrophosphorylase gene to host E. coli or the like in a conventional manner. It is also possible to produce the enzyme in a large scale to prepare the recombinant bacterium.
  • nucleoside diphosphate monosaccharide pyrophosphorylase may be in any form as long as it has the activity. Specific examples include microbial cells, processed products of the cells, and enzyme preparations obtained from the processed products.
  • the cells of the microorganism can be prepared by using a medium in which the microorganism can grow, culturing by a conventional method, and collecting cells by centrifugation or the like. More specifically, for example, bacteria belonging to Banras II or Escherichia coli are described. Use LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% salt) or 2XYT medium (1.6% tryptone, 1% yeast extract, 0.5% salt), etc. After inoculating the medium with the inoculum, the culture is incubated at about 30 to 50 for about 1 () to 50 hours with stirring as necessary, and the resulting culture is centrifuged to separate the microbial cells. By collecting the cells, microbial cells having nucleoside diphosphate monosaccharide pyrophosphorase activity can be prepared.
  • the processed microbial cells include mechanical destruction of the above microbial cells (using a blending blender, French press, homogenizer, mortar, etc.), freeze-thawing, self-digestion, and drying (by freeze-drying, air-drying, etc.) , Enzyme treatment (eg, with lysozyme), ultrasonic treatment, chemical treatment (eg, with acid or alkali treatment), etc. A denatured product is obtained.
  • a fraction having a nucleoside diphosphate-sugar pyrophosphorylase activity from the above treated cells is purified by a usual enzyme purification means, for example, salting out treatment, isoelectric point precipitation treatment, organic solvent precipitation treatment, dialysis treatment
  • a crude enzyme or a purified enzyme obtained by performing various chromatographic treatments or the like can be used.
  • the sugar 1-phosphate and nucleotide (nucleoside monophosphate) to be added to the reaction solution are appropriately selected from known ones according to the target sugar nucleotide and are commercially available or prepared by a known method. Etc. may be used.
  • the concentration used is preferably about 1 to 20 OmM, and more preferably about 10 to 10 OmM.
  • Table 1 shows specific examples of combinations of nucleoside diphosphate-sugar pyrophosphorylase, nucleotides, and sugar monophosphate used in the synthesis of sugar nucleotides.
  • ADP glucose AMP glucose 11-line 1 ADP glucose pyrophosphorylase
  • a system for producing sugar 1-monophosphate instead of sugar 1-monophosphate may coexist in the reaction solution.
  • a G-11-P production system using a combination of sucrose and sucrose phosphorylase E. Vanda painting e et al., Adv. Appl. Microbiol .. 32, 163-201 (1987)
  • a G--1-P generation system PH Strausbauch et al., Methods in Enzymology. 11.671-675
  • glycogen and glycogen phosphorylase can be used.
  • an inorganic phosphoric acid and an energy source it is preferable to add an inorganic phosphoric acid and an energy source to the reaction system.
  • a phosphate such as potassium phosphate can be used as it is, and it is preferable to use it as a phosphate buffer.
  • concentration used is preferably about 100 to 500 mM, particularly preferably about 100 to 300 mM.
  • pH of the phosphate buffer can be appropriately set within the range of about 6.0 to 9.0.
  • sugars such as glucose, fructoses and sucrose, and organic acids such as acetic acid and citric acid can be used.
  • nucleoside diphosphate-sugar pyrophosphorylase is preferably added to a phosphate buffer.
  • Sugar 1-phosphate and nucleoside diphosphate-sugar pyrophosphorylase may be added at the start of the reaction, but after the reaction starts, the production of nucleoside triphosphate corresponding to the added nucleotide was maximized.
  • the reaction solution is subjected to a heat treatment at about 60 ° C or lower for 5 minutes or more to deactivate yeast-derived enzymes, and then sugar 1-phosphate and nucleoside diphosphate-sugar pyrophosphorylase are added. It is desirable to carry out the enzymatic reaction continuously.
  • the sugar nucleotide obtained in this manner can be isolated and purified by a common means for isolating and purifying the sugar nucleotide (ion exchange chromatography, adsorption chromatography, salting out, etc.).
  • DNA preparation, cutting with restriction enzymes, DNA ligation with T4 DNA ligase, and a method for transforming E. coli were all described in "lilolecular cloning J (Maniat) s' et al., Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)) Restriction enzymes, Amp1i Taq DNA polymerase and T4 DNA ligase were obtained from Takara Shuzo Co., Ltd. The separation was carried out using an ODS-AQ312 column manufactured by YMC, using a 0.5 M monopotassium phosphate solution as the eluent.
  • the (ga1U) gene (Weissborn et al., J. Bacteriol., 176, 2611 (1994)) was amplified. Width.
  • Amplification of the ga1U gene by PCR is as follows: 50 mM potassium chloride, 10 mM tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, 0.1 ⁇ ⁇ g of temperate DNA, primer DNA (A) (B) 0.2 mM ⁇ Amp 1 i Ta q DNA polymerase 2.5 ⁇ l of the reaction mixture (100 units) was prepared using a Dutch Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus Instrument) By repeating 25 times the steps of thermo-transformation (94 ° C, 1 minute), annealing '(55 ° C, 1.5 minutes), and polymerase (72 ° C, 1.5 minutes) went.
  • the reaction solution was treated with a phenol-nocloform form (1: 1) mixture, and twice the volume of ethanol was added to the water-soluble fraction to precipitate DNA.
  • the DNA recovered by precipitation was separated by agarose gel electrophoresis according to the method described in the literature (Molecular cloning, described above), and a DNA fragment corresponding to 1.0 kb was purified.
  • the DNA was cleaved with restriction enzymes EcoRI and Sa1I, and also digested with restriction enzymes EcoRI and Sa1I, plasmid pTrc99A (obtained from Pharmacia Biotech.). And T4 DNA ligase. Using the ligation reaction solution, E.
  • coli JM109 teeth were transformed, and plasmid pTrc—galU was isolated from the resulting ampicillin-resistant transformant.
  • pTr c—gal u is an EcoRI-Sa1 I DNA containing the E. coli ga1U gene at the EcoRI-Sa1I cleavage site downstream of the trc promoter of rc99A. The fragment was inserted.
  • Escherichia coli JM109 carrying the plasmid pTrc-ga1U was inoculated in 30 Om ⁇ of 2 X YT medium containing 10 Omg / L of ampicillin, and cultured with shaking at 37. Once at the 4 X 1 0 8 bacteria / m, it was added I PTG to a final concentration of 1 mM to the culture solution was continued for an additional 2.5 hours with shaking cultured at 37 ° C. The suspension was suspended in 60 m of a buffer solution having the composition of mM tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.% Triton X—100, 0.2 mg gZm lysozyme.
  • mM tris-hydrochloric acid pH 7.5
  • 5 mM EDTA 0.% Triton X—100, 0.2 mg gZm lysozyme.
  • the ⁇ ⁇ position (unit :) of UDP glucose pyrophosphorylase activity was measured and calculated by the following method. That is, an enzyme preparation is added to 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 5 mM magnum chloride, 6 mM UTP, and 6 mM G-I-P, and incubated at 37 ° C. Perform the reaction, inactivate the enzyme by heat treatment at 100 ° C for 5 minutes, quantify the UDPG in the reaction solution by HP LC method, ⁇ The UDPG generation activity of e was set to 1 unit (unit).
  • the mixture was treated at 100 ° C for 5 minutes, and the yeast cells were removed by centrifugation (2,000 xg, 10 minutes).
  • the collected supernatant fraction was analyzed by HP LC, it was found to be 7.9 mM UDPG. 2 1. 9mM UTP was confirmed to be generated.
  • UDPG was synthesized in the same manner as in (3) and (4) of Example 1. However, UDP glucose pyrophosphorylase to be added was performed using an enzyme of 0 unit, 0.5 unit 'or 5 unit of enzyme unit.
  • Figure 1 shows the amount of UDPG generated over time.
  • Chromosomal DNA of Escherichia coli K12 strain JM109 was prepared by the method of Saito and Niura (Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)).
  • the following two primers DNA are synthesized according to a conventional method, and the E. coli maltodextrin phosphorylase (ma1P) gene (Nature. 313 (6002), 500-502 (1985; )) was amplified.
  • the amplification of the ma1P gene by PCR was performed using 5 OmM potassium chloride, 1 OmM tris-hydrochloric acid (pH 8.3), 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, Template DNA O. 1 ⁇ g, Primer-DNA (C) (D) each (). 2 mM, Amp 1 i Taq DNA Polymerase 2.5 Unit of reaction solution 10 ⁇ with DNA Thermal Cycler (Perkin -Perform 25 steps of heat denaturation (94 min, 1 min), annealing (60 ° C, 1.5 min), volume re-merification (72 ° C, 3 min) using ELmer Cetus Instrument Performed by repeating.
  • the reaction solution was treated with a mixture of phenol Z-cloth form (1: 1), and twice the volume of ethanol was added to the water-soluble fraction to precipitate DNA.
  • the DNA collected by precipitation was separated by agarose gel electrophoresis according to the method described in the literature (Molecular cloning, described above), and a DNA fragment corresponding to 2.0 kb was purified.
  • the DNA was digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI, and digested with the restriction enzymes EcoRI and BamHI, and the plasmid pTrc99A (manufactured by Pharniacja Biotech. ⁇ ) was used. Ligation was performed using T4 DNA ligase. Using the reaction mixture, W.
  • enterococcus JM109 was transformed with W, and plasmid pTrc-malP was isolated from the resulting ampicillin-resistant transformant.
  • pTrc-malP is an Ec0RI containing the promoter and structural gene of Escherichia coli ma1P gene at the EcoRI-BamHI cleavage site downstream of the trc promoter of pTrc99A. -BamHI DNA fragment was introduced.
  • the ⁇ position (unit) of maltodextrin phosphorylase activity in the present invention was measured and calculated by the following method. That is, maltodextrin was added to 5 mM magnesium chloride, 6 mM UTP, 0.5% dextrin (WZV, 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing lUZm-rich UDPG pyrophosphorylase). The reaction was performed by adding a phosphorylase enzyme preparation and keeping the temperature at 30.Then, the enzyme was inactivated by adding 70% ethanol equivalent to the reaction amount, and UDPG in the reaction solution was analyzed by HPLC. The activity of producing 1 ⁇ moe of UDPG per minute in 30 minutes was defined as 1 unit (unit).
  • Amplification of the man C gene by PCR was performed using 50 mM potassium chloride, l () mM Tris-HCl ( ⁇ 8.3), 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% zetin, and temperate DNA 0 ⁇ G, Primer-DNA (E) (F) 0.2 mM each, anti-ampliquot of Amp1 i Taq DNA polymerase 2.5 units; solution 10) was applied to DNA Thermal Cycler (Perkin-Eller Cetus instrument). Repeat the steps of thermotransformation (94, 1 minute), annealing (55 ° C ⁇ 2 minutes), and polymerase (72, 3 minutes) 25 times using Tsuji Was performed.
  • the reaction solution was treated with a mixture of phenol and black CJ form (1: 1), and ethanol was added twice to the water-soluble fraction to precipitate DNA.
  • the DNA collected by precipitation was separated by agarose gel electrophoresis according to the method described in the literature (Molecular cloning, described above), and a DNA fragment corresponding to 1.8 kb was purified.
  • the DNA was digested with the restriction enzyme EcoRI, and ligated with plasmid pUC18 (obtained from Takara Shuzo Co., Ltd.) also digested with the restriction enzyme EcoRI using T4DNA ligase.
  • Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction solution, and plasmid pUC18-manC was isolated from the resulting ampicillin-resistant transformant.
  • pUC18-manC is an EcoRI DNA fragment containing the E. coli manC gene inserted into the EcoRI cleavage site downstream of the 1 ac promoter of pUC18 all night. is there.
  • Escherichia coli JM109 carrying plasmid pUC18-manC was inoculated into 300 ml of 2 XYT medium containing 100 mg_ / L of ampicillin, and cultured with shaking at 37 ° C. When the culture reached 4 ⁇ 10 8 bacteria / m ⁇ , IPTG was added to the culture solution to a final concentration of i mM, and shaking culture was continued at 37 ° C for 5 hours.
  • the cells were collected by centrifugation (9,000 X g, 10 minutes), and 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.
  • the suspension was suspended in 60 m of a buffer having a composition of 100, 0.2 mg gZm and lysozyme.
  • sonication was performed to disrupt the bacterial suspension, and the bacterial cell raft was removed by centrifugation (20,000 xg, 10 minutes).
  • the supernatant fraction thus obtained was used as an enzyme preparation.
  • the GD @ mannose pyrophosphorase activity of the enzyme preparation is shown in Table 4 below together with the control bacteria (Escherichia coli JM109 carrying pUC18).
  • JM109 / pliC18-macC0.23 The unit (unit) of GDP mannose pyrophosphorylase activity was measured and calculated by the following method. That is, a 5 OmM potassium phosphate buffer containing magnesium chloride, 5 mM GTP, and 5 mM mannose-1-P.
  • GDP mannose was synthesized in the same manner as (3) and (4) in Example 4. However, GDP mannose pyrophosphorylase to be added was carried out using an enzyme having an enzyme unit of 0.025.0.050.1 units. Figure 2 shows the amount of GDP mannose produced over time. Industrial applicability

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Description

W 明 細 書 糖ヌクレオチドの製造法 技術分野
本発明は、 ォリゴ糖合成の重要な基質である糖ヌクレオチドの製造法に関する ものである。 背景技術
近年、 糖鎖についての研究が急速に進み、 その機能が明らかになるにつれ、 生 理活性を存するオリゴ糖の医薬品または機能性素材としての用途開発が注目を集 めている。 し力、し、 現在市販されているオリゴ糖はごく限られた種類のものしか なく、 しかも極めて高価である。 また、 そのようなオリゴ糖は試薬レベルでしか 製造できず、 必ずしもその大量製造法が確立されているとは限らない。
従来、 オリゴ糖の製造は天然物からの抽出法、 化学合成法あるいは酵素合成法、 さらにはそれらの併用により行われていたが、 その中でも酵素合成法が大量製造 に適した方法であると考えられている。 すなわち、 （ 1 ) 酵素合成法が化学合成 法にみられる保護、 脱保護といった煩雑な手順を必要とせず、 速やかに目的のォ リゴ糖を合成できる点、 （2 ) 酵素の基質特異性により、 きわめて構造特異性の 高いォリゴ糖を合成できる点などが他の方法より有利と考えられるためである。 さらに、 近年の組換え D N A技術の発達により種々の合成酵素が安価にしかも 量に生産できるようになりつつあること力、、 酵素合成法の優位性をさらに押し上 げる結果となっている。
酵素合成法によりォリゴ糖を製造する方法としては、 ォリゴ糖の加水分解酵素 の逆反応を利用する方法および糖転移酵素を利用する方法の 2通りの方法が考え られている。 前者の方法は、 基質として単価の安い単糖を用いることができると いう利点はあるものの、 反応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、 合 成収率や複雑な構造を持つォリゴ糖製造への応用といった点では必ずしも餃良の 方法とは考えられていない。
一方、 後者は糖転移酵素を用いる合成法であり、 合成収率や複雑な構造を持つ ォリゴ糖製造への応用といった点で前者の方法よりも有利であると考えられてお り、 また、 近年の組換え DN A技術の進歩により各種糖転移酵素の量産化も該技 術の実¾化への後押しとなつている。
しかしながら、 糖転移酵素を用し、る合成法で t、る糖供与-体である犍ヌクレオ チドは、 一部のものを除き依然として高価で、 的にも試薬レベルのわずか な供給量でしか提供し得ないのが現状である。 例えば、 多くの牛.理活性糖銷 のコア部分に含まれるグルコースの供与体であるゥ リ ジンニリ ン酸ゲルコー ス （UD P G) についてもゥ リ ジル酸 （UMP) とグルコース 1 一 リ ン酸 (G— 1 一 P) から化学的に合成する方法あるいは UMPとグルコースを基晳と して用いた酵母菌体法 （T. Tochikura et al., J. Ferment. Technoし 46, 957 (1968), S. S irota, et al. , Agric. Biol. Chem. , 35, 325 (1971), S. Watanabe and I Takeda, Agric. Biol. Chem. , 36, 2265 (1972)) などが報告さ れているものの、 工業的生産の現実化までにはまだまだ検討の余地が残されてし、 る。
本発明者らは、 UMPとグルコースを基質として用いた従来の酵母菌体法によ る U DP Gの生産法を検討したが、 UDPGの生成量はわずかであり、 添加した UMPの 6 0 %以上はゥリジン三リン酸 （UTP) もしくはゥリジンニリ ン酸 (UDP) に変換されており、 UDPGの生産方法としては到底実用化には耐え うる方法ではなかった。
したがって、 本発明は、 従来の酵母菌体法を改良し、 UDPGなどの糖ヌクレ ォチドを効率よく製造する方法を提供することを目的とするものである。 発》Jjの開示
本発明者らは上記目的を達成すべく研究を重ねた結果、 酵母による UDPGの 合成は、 UMPから UTPを合成する反応系とグルコースから G— 1一 Pを合成 する反応系と UTPと G - 1一 Pから UDPGを合成する反応系の 3つの反応系 が効果的に共役することが重要であるところ、 U M Pから U T Pを合成する 反 I :は比較的スムーズに進行するのに対し、 G— 1 - P合成活性と UTPと G - 1一 Pからの UDPG合成活性が微弱であり、 しかもそれらが効果的に共役して I、なし、がために結果として 的とする U D P Gの生産量が低くなることを突き ιί: めた。
この問題を解決すべく、 更に研究を進めた結 ¾、 酵母においては UDPGでは なく、 UTPの合成を主眼とし、 反応系に U DPゲルコースピロホスホリラーゼ と G— 1—Pを共存させることでそれぞれの酵素反応を効果的に共役させること ができ、 もって目的とする U D P Gを高収率で製造することができることを見出 した。 しかも、 この方法は UDPGに限らず、 他の糖ヌクレオチドの合成にも適 用可能であることを確認し、 本発明を完成させた。
すなわち、 本発明は、 酵母菌体を用いてヌクレオチドから糖ヌクレオチドを製 造する方法において、 反応系にヌクレオシドニリン酸ー糖ピロホスホリラーゼと 糖 1—リン酸とを共存させることを特徴とする糖ヌクレオチドの製造法に関する ものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 UDPGの経時的な生成量を示したものである。
図 2は、 GDPマンノ一スの経時的な生成量を示したものである。 発明を実施するための最良の形態
本発明における糖ヌクレオチドとしては、 公知の糖ヌクレオチドであれば特に 限定されない。 具体的には UDPG、 UDPガラク ）、一ス、 UDPグルクロン酸 などの UDP糖、 GDPマンノース、 GDPフコー-ス、 GDPグルコースなどの GDP糖、 ADPグルコースなどの ADP糖、 dTDPゲルコース、 ciTDPガ ラク ト一スなどの d TD P糖、 C D Pグルコースなどの C D P糖などを例小する ことができる。
反応に使用する酵母としては、 従来、 ヌクレオチド、 槌ヌクレオチドなど の製造に使用されていた酵母であれば特に制限なく使用することかできる。 風体的には、 チゴサッカロミセス （Zygosaccharomyces ) )¾、 サッカロ ミセス (Saccharomyces) I カンディ ダ (Candida) 厲、 トル□プシス (Torulopsi .) 厲、 ハンセヌラ （Hansenula ) 属、 デバリオミセス （Debaryomyces) 厲などの K に J¾する酵母を使用することができる。 このような酵母は、 生酵母、 乾燥酵母い ずれであつてもょレ、が、 反応収率の点から乾燥酵母を用し、るのが好ましい。 反応系に共存させるヌクレオシドニリン酸—糖ピロホスホリラ一ゼとしては、 特定の由来のものに限定されず、 動物由来、 植物由来、 微生物由来など、 すべて の由来のものを使用することができるが、 酵素調製の簡便性などの点から微生物 山来のヌクレオシドニリン酸ー糖ピロホスホリラ--ゼを使用するのが好ましい。 また、 使用するヌクレオシドニリン酸ー糖ピ口ホスホリラーゼ遺伝子がクローン 化されている場合には、 そのクローン化されたヌクレオシドニリン酸ー糖ピロホ スホリラ一ゼ遺伝子を用し、て常法により大腸菌などを宿主として大量生産させ、 当該組換え菌ょり当該酵素を調製することも可能である。
このようなヌクレオシドニリン酸一糖ピロホスホリラ一ゼは、 当該活性を有す る限りどのような形態であってもよい。 具体的には、 微生物の菌体、 該菌体の処 理物または該処理物から得られる酵素調製物などが挙げられる。
微生物の菌体の調製は、 当該微生物が生育可能な培地を用い、 常法により培養 後、 遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。 具体的に、 バンラス厲また は大腸菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、 培地としてはブイョン培地、 L B培地 （ 1 % 卜リプトン、 0 . 5 %ィーストエキストラク ト、 1 %食塩） また は 2 X Y T培地 （ 1 . 6 %トリプトン、 1 %イーストエキストラク 卜、 0 . 5 % 食塩） などを使用することができ、 当該培地に種菌を接種後、 約 3 0〜 5 0でで 約 1 ()〜5 0時間程度必要により撹拌しながら培養し、 得られた培養液を遠心分 離して微生物菌体を集菌することによりヌクレオシドニリン酸一糖ピロホスホリ ーゼ活性を有する微生物菌体を調製することができる。
微生物の菌体処理物としては、 上記微生物菌体を機械的破壊 （ワーリ ングブレ ンダ --、 フレンチプレス、 ホモジナイザ一、 乳鉢などによる） 、 凍結融解、 自已 消化、 乾燥 （凍結乾燥、 風乾などによる） 、 酵素処理 （リゾチームなどによる） 、 超音波処理、 化学処理 （酸、 アルカリ処理などによる） などの一般的な処理法に 従つて処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性 物が举げられる。
酵素調製物としては、 上記菌体処理物からヌクレオシドニリン酸—糖ピロホス ホリラーゼ活性を有する画分を通常の酵素の精製手段、 例えば塩析処理、 等電点 沈澱処理、 有機溶媒沈澱処理、 透析処理、 各種クロマトグラフィ一処理などを施 して得られる粗酵素または精製酵素を使用することかできる。
反応液に添加する糖 1―リン酸及びヌクレオチド （ヌクレオシドモノ リン酸） は、 目的とする糖ヌクレオチドに応じ、 既知のものから適宜選択して市販されて いるもの、 あるいは公知の方法で調製したもの等を使用すればよい。 使用濃度と しては、 各々約 1 〜2 0 O m Mが好ましく、 約 1 0〜 1 0 O m Mか特に好ま しい。
糖ヌクレオチドの合成に使用するヌクレオシドニリン酸—糖ピロホスホリラ一 ゼ、 ヌクレオチドおよび糖 1 一リ ン酸の組み合わせの具体例を、 下記表 1 に示す。 表 1
+[15 1 Λί¾ fii— in '
① U D Ρ糖
11 Π Ρ 'し，ース U Μ Ρ グ ' コース i一リ ン s$ LI D Pグノしコースビロホスホリ ラーセ'
(E. C . 2. 7. 7. 9) し' D Ρガラク 1'一ス UM Ρ ガラク トース 1—リ ン LI D Pガラク トースピロホスホリ ラーゼ
(E. C. 2. 7. 7. 10)
U D Ρク-ルクロン UMP グノしクロネ一 ト 1—リ ン! ¾ U D Pグルクロン 8 ピロホスホリ ラーセ
C E . C . 2. 7. 7. 44 )
② G D P?;l
GDPマンノース GM Ρ マンノース 1一リ ン ¾ G D Pマンノースビロホスホリ ラーゼ
(E . C . 2. 7. 7. 13)
G D Pフコース GM Ρ フコース 1—リ ン G D Pフコースビロホスホリ ラーゼ
(E . C . 2. 7. 7. 30)
G D Pク"ノしつース GMP グルコース i—リ ン G D Pグルコースピロホスホリ ラーゼ
(E. C. 2. 7. 7. 34)
③ A D P
A D Pグルコース AMP グルコース 1一リ ン ¾ A D Pグルコースピロホスホリ ラーゼ
(E. C. 2. 7. 7. 27)
④ d τ D ?
d T D Pグノしコース d Τ Μ Ρ グルコース iーリ ン d T D Pグルコースピロホスホリラ一ゼ
CE. C. 2. 7. 7. 24) dTDPガラク トース d ΤΜΡ ガラク ス ：！一リ ン d T D Pガラク トースビロホスホリ ラ一ゼ
(E. C. 2. 7. 7. 32)
©C DP til
C D Pグルコース CM Ρ グルコース i一リ ン C D Pグルコースピロホスホリ ラ一ゼ
CE. C. 2. 7. 7. 33)
また、 糖 1 一リン酸の代わりに糖 1 一リ ン酸の生成系を反応液に共存させても よレ、。 例えば、 ショ糖とショ糖ホスホリラ一ゼの組み合わせによる G— 1 一 P生 成系 （E. Vanda画 e et al. , Adv. Appl. Microbiol..32, 163-201(1987) ) 、 ク" リコ--ゲンとグリコ一ゲンホスホリラ一ゼの組み合わせによる G - - 1 - P生成系 (P.H. Strausbauch et al., Methods in Enzymology.11.671-675) などを利用す ることができる。
上記酵素及び基質以外に、 反応系には無機リン酸とエネルギー源を添加するの が好ましい。
使用する無機リン酸としては、 リン酸カリゥムなどのリン酸塩をそのまま使用 することもできる力、、 リン酸緩衝液として使用するのか好ましい。 使用濃度は、 約 1 0〜 5 0 0 mMが好ましく、 約 1 0 0〜 3 0 0 mMが特に好ましし、。 また、 リン酸緩衝液の p Hも約 6. 0〜 9. 0の範囲から適宜設定することかできる。 エネルギー源としては、 グルコース、 フラク 卜一ス、 シュクロースなどの糖類、 酢酸、 クェン酸などの有機酸を使用することができる。
糖ヌクレオチドの合成反応は、 リン酸緩衝液中に酵母菌体、 ヌクレオチド、 糖 1 —リン酸、 エネルギー源としての糖類もしくは有機酸を添加し、 さらにヌクレ ォシドニリン酸—糖ピロホスホリラーゼを好ましくは約 0. 0 0 1ュニッ 卜 z m β以上、 さらに好ましくは約 0. 0 1〜 1 0 0ユニッ ト Zm 添加し、 好まし くは約 3 0て以下、 より好ましくは約 5〜 2 0でで約 1〜 5 0時間程度、 必要に より撹拌しながら反応させることにより実施できる。
なお、 糖 1 —リン酸とヌクレオシドニリン酸ー糖ピロホスホリラーゼは、 反応 開始時に添加してもかまわないが、 反応開始後、 添加したヌクレオチドに対応す るヌクレオシド三リン酸の生産が最大となったところで、 反応液を約 6 0 °C以ヒ、 5分間以上の熱処理などの酵母由来の酵素を失活させる処理を行ったのち、 糖 1 ―リン酸とヌクレオシドニリン酸ー糖ピロホスホリラーゼを添加して酵素反応を 続けて行わせるのが望ましい。 このようにして得られた糖ヌクレオチドは、 糖ヌクレオチドの通常の単離精製 手段 （イオン交換クロマトグラフィ一、 吸着クロマ卜グラフィ --、 塩析など） に より単離精製することかできる。 実施例
以下、 実施例を示し、 本発明を ¾体的に説明するが、 本発明はこれに限； ^され るものではない。
なお、 以下の実施例における DNAの調製、 制限酵素によるヒ刀断、 T4 DNA リガーゼによる DNA連結、 並びに大腸菌の形質 換法は全て 「lilolecular cloning J (Maniat】s'ら編、 Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. New York(1982)) に従って行った。 また、 制限酵素、 Amp 1 i Ta q DNAポリメラ一ゼ、 T 4 DNAリガーゼは宝酒造 （株） より入手した。 さらに、 反応液中の糖ヌクレオチドの定量は H P L C法により行つた。 具体的には、 分離 には YMC社製の ODS— AQ 3 1 2カラムを用い、 溶出液として 0. 5Mリ ン 酸一カリウム溶液を用いる系、 分離には丫1\ (：社製の005— [^ 30 3カラム を用い、 溶出液として 0. 2Mトリェチルァミ ン—酢酸 （ρΗ8. ϋ ) を fflいる 系などを採用した。 実施例 1 ： 110 〇の合成1
( 1 ) 大腸菌 UDPグルコ一スピロホスホリラーゼ遺伝子のクロ一ニンク" 大腸菌 K 1 2株 JM 1 09菌 （宝酒造 （株） より入手） の染色体 DNAを斉藤 と三浦の方法 （Biochim. Biophys. Acta. , 72, 619 (1963)) で調製した。 この DNAをテンペレートとして、 以下に示す 2種類のプライマー DN Aを常法 に従って合成し、 PCR法により大腸菌 U D Pグルコースピロホスホリラ一ゼ
(g a 1 U) 遺伝子 (Weissborn et al., J. Bacteriol. , 176, 2611(1994)) を增 幅した。 幅した。
プライマー （ A ) : 5' -GCGAATTCTGATATACTGGGATGCGATAC-3'
プライマ— （ B ) ： 5' -ACGTCGACACCGATACGGATGTATCTT-3'
PCRによる g a 1 U遺伝子の増幅は、 50mM塩化カリウム、 1 0mM卜 リ ス塩酸 （pH 8. 3) 、 1. 5 mM塩化マグネシウム、 0. 00 1 %ゼラチン、 テンペレート DNA0. 1〃 g、 プライマー DNA (A) (B) 各々 0. 2mMヽ Amp 1 i Ta qDNAポリメラ一ゼ 2. 5ユニッ トの組成の反応液 1 0 0〃 を匪 Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus Instrument社製) を用いて、 熱変 性 （ 94 °C、 1分） 、 アニーリ ング' （ 55 °C\ 1. 5分） 、 ポリ メラィゼ一シ ン （72°C、 1. 5分） のステップを 25回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、 反応液をフエノールノクロ口ホルム （ 1 : 1 ) 混合液で処理し、 水溶性画分に 2倍容のェ夕ノールを添加し D N Aを沈殿させた。 沈殿回収した DNAを文献 (Molecular cloning 、 前述） の方法に従ってァガロースゲル電 泳動により分離し、 1. 0 kb相当の DNA断片を精製した。 該 DNAを制限酵 素 E c oR I及び Sa 1 Iで切断し、 同じく制限酵素 E c oR I及び S a 1 Iで 消化したプラスミ ド p T r c 9 9 A (Pharmacia Bi otech.社より入手） と T 4 D N Aリガーゼを用レ、て連結した。 連結反応液を用し、て大腸菌 J M 1 0 9歯 を形質転換し、 得られたァンピシリ ン耐性形質転換体よりプラスミ ド p T r c — ga l Uを単離した。 pTr c— ga l Uは、 p丁 r c 99 Aの t r cプロモ 一夕一下流の E c oR I— S a 1 I切断部位に大腸菌 g a 1 U遺伝子を含有する E c o R I -S a 1 I DNA断片が挿入されたものである。
(2) 大腸菌 UDPグルコースピロホスホリラ一ゼの調製
プラスミ ド pTr c -ga 1 Uを保持する大腸菌 J M 1 09菌を、 1 0 Omg /Lのアンピシリンを含有する 2 X YT培地 30 Om^に植菌し、 37でで振と う培養した。 4 X 1 08 菌 /m に達した時点で、 培養液に終濃度 1 mMになる ように I PTGを添加し、 さらに 37°Cで 2. 5時間振とう培養を続けた。 mM卜リス塩酸 （pH 7. 5 ) 、 5 mM EDTA、 0. 】 ％トライ トン X— 1 0 0、 0. 2 m gZm リゾチームの組成の緩衝液 6 0 m に懸濁した。 3 7 でで 1 時間保温した後、 超音波処理を行い、 菌体を破砕し、 さらに遠心分離 ( 20, 0 0 0 g , 1 0分） により菌体残 を除去した。 このように得られた 上清画分を酵素標品とした。 酵素標品における UDPグルコースピロホスホリラ ーゼ活性を対照菌 （pTr c 9 9 Aを保持する大腸菌 JM 1 () 9蘭） と共に下記
¾ 2に示す。
表 2
Γ¾' 株 UDPダルコ- スピロホスホリっーゼ活性
(ュ：ニッ h/m )
J M 1 0 9 / p T r c 9 9 A '：、 0. 5
J 1 0 9 / p T r c - g a 1 u 20. 4 なお、 U D Pグルコースピロホスホリラ一ゼ活性の维位 （ュニッ ト：） は、 以下に示す方法で測：^、 算出した。 すなわち、 5 mM塩化マグネンゥム、 6mM UTP、 6m G— 1 — Pを含有する 5 0 mMトリス塩酸緩衝液 （ p H 8. 0 ) に酵素標品を添加して 3 7 °Cで保温することで反応を行し、、 1 0 0 °C、 5分問の 熱処理により酵素を失活させた後、 HP L C法により反応液中の UD P Gを定量 し、 3 7 °Cで 1分間に 1 m o ^ eの U D P Gを生成活性を 1単位 （ュニッ ト） とした。
( 3) 乾燥パン酵母を用いた UDPG - UTP液の調製
4 OmM UMP、 1 0 OmM グルコース、 20 0 mM リ ン酸ナト リウム
( H 8. 0 ) 、 1 OmM 塩化マグネシゥムの組成の反応液 2 0 m を 1 0 0 m 容ビ一カーに調製し、 これに 2 gの乾燥パン酵母 （オリエンタル酵母工業株 式会社） を懸濁し、 2 0てで 9時間撹拌反応させた。 反応終了後、 反応液を
1 0 0°C、 5分問処理し、 遠心分離 （2, 0 0 0 xg、 1 0分間） により酵母菌 体を除去した。 回収した上清画分を HP LCで分析したところ、 7. 9mM UDPG. 2 1. 9mM UT Pの生成が確認された。
( 4) UDPG— UTP液への UDPピロホスホリラーゼ及び G— 1 一 P添加に よる UDPGの合成
上述の UDPG— UTP液 1 0 Om ^に終濃度 3 OmMとなるように G— 1 ― Pを添加し、 さらに 0. 5ユニッ ト/ m UDPグルコースピロホスホリ ー ゼとなるように実施例 2記載の酵素標品を添加し、 30°Cで 3 0時間反応させた c 反応液中の UDPG濃度を HPLCで分析したところ、 3 0. 9mMの UDPG の生成か確認された。 実施例 2 ： UDPGの合成 2
実施例 1の （3) および （4) と同じ方法にて UDPGを合成した。 ただし、 添加する U D Pグルコースピロホスホリラ一ゼは 0ユニッ ト、 0. 5ュニッ 卜 'よ たは 5ュニッ トの酵素単位の酵素を用いて行つた。
UDPGの経時的な生成量を図 1に示す。
'太:施例 3 ： UDPGの合成 3
( 1 ) 大腸菌マルトデキストリンホスホリラ一ゼ遺伝子のクローニング
大腸菌 K 1 2株 JM 1 0 9菌 （宝酒造 （株） より入手） の染色体 DNAを斉藤 と二浦の方法 （Biochim. Biophys. Acta. , 72, 619 (1963)) で調製した。 この DNAをテンペレートとして、 以下に示す 2種類のプライマー DN Aを 常法に従って合成し、 PCR法により大腸菌マルトデキストリンホスホリラーゼ (ma 1 P) 遺伝子 (Nature. 313(6002), 500〜502(1985；))を増幅した。
プライマー （ C ) ： 5' -TAGAATTCAACTCCTCCCTGCCTAATCCCCC-3'
プライマ一 （ D ) ： 5' -TTGGATCCCGGCATTATCCAGACGTTTGCTT-3'
PCRによる ma 1 P遺伝子の増幅は、 5 OmM塩化カリウム、 1 OmM卜リ ス塩酸 （pH 8. 3) 、 1. 5 mM塩化マグネシウム、 0. 0 0 1 %ゼラチン、 テンペレート DNA O. 1〃 g、 プライマー- DNA (C) (D) 各々 （）. 2mM、 Amp 1 i T a q DNAポリメラーゼ 2. 5ユニッ トの組成の反応液 1 0〃 を DNA Thermal Cycler (Perkin- ELmer Cetus Instrument社製) を用いて、 熱変性 ( 94で、 1分） 、 アニーリング （ 60 °C、 1. 5分） 、 ボリ メラィゼーション (72°C、 3分） のステップを 25回繰り返すことにより行った。
遺伝子增幅後、 反応液をフヱノール Zクロ口ホルム （ 1 : 1 ) 混合液で処理し、 水溶性画分に 2倍容のェ夕ノールを添加し DN Aを沈殿させた。 沈殿回収した DNAを文献 （Molecular cloning 、 前述） の方法に従ってァガロースゲル 泳動により分離し、 2. 0 k b相当の DNA断片を精製した。 該 DN A を制限酵素 E c oR I及び BamH Iで切断し、 同じく制限酵素 E c o R I及ぴ B a mH Iで消化したプラスミ ド p T r c 9 9 A (Pharniacja Biotech. 丄よ り人手） と T 4 DNAリガーゼを用いて連結した。 迚結反応液を Wいて人腸 菌 JM 1 0 9菌を形質転換し、 得られたアンピシリ ン耐性形質転換体よりプラス ミ ド pTr c— ma l Pを単離した。 pTr c— ma l Pは、 pTr c 9 9 Aの t r cプロモーター下流の E c oR I - BamH I切断部位に大腸菌 ma 1 P遺 伝千のプロモ—夕—及び構造遺伝子を含有する E c 0 R I - B amH I DNA断 片が揷入されたものである。
(2) 大腸菌マルトデキス卜リンホスホリラ一ゼの調製
プラスミ ド p T r c— m a 1 Pを保持する大腸菌 J M 1 09菌を、 1 00 m g /Lのアンピシリンを含有する 2 xYT培地 300 m ?に植菌し、 37°Cで 8時 問振とう培養した。 4 x 1 08 菌ノ m に達した時点で、 培養液に終濃度 I mM になるように I P T Gを添加し、 さらに 37 で 5時問振とう培養を続けた。 培養終了後、 遠心分離 （ 9， 0 0 0 X g, 1 0分） により菌体を 収し、 5 OmMトリス塩酸 （pH 7. 5) 、 5 mM EDTA、 0. 1 %トライ トン X— 1 00、 0. 2mg/m リゾチームの組成の緩衝液 6 Omfに懸濁した。 37 °Cで 1時間保温した後、 超音波処理を行い、 菌体を破砕し、 さらに遠心分離 ( 9， 000 xg、 1 0分） により菌体残さを除去した。 このように得られた上 淸兩分を酵素標品とした。 酵素標品におけるマル卜デキス卜リンホスホリラ一ゼ 活性を対照菌 （pTr c 9 9 Aを保持する大腸菌 JM1 0 9菌） と共に Τ\ιΰ¾3 に示す。 表 3 菌 株 マルトデキストリンホスホリラーゼ活性
(ュニッ 卜/ mg蛋白質）
JM 1 0 9/pTr c 99A 1. 5
JM 1 0 9 pTr c -ma 1 P 9 3. 8 なお、 本発明におけるマルトデキストリンホスホリ 一ゼ活性の^位 （ュニッ ト） は、 以下の方法で測定、 算出したものである。 すなわち、 5mM塩化マグネ シゥム、 6mM UTP、 0. 5 %デキス ト リ ン （WZV 、 l UZm ¾質 の U D P Gピロホスホリラーゼを含有する 50 mMりん酸カリゥ厶緩衝液 （ p H 7. 0) にマルトデキストリンホスホリラ一ゼ酵素標品を添加して 30でで保温 することで反応を行い、 反応量と等量の 70%エタノールを添加することにより 酵素を失活させ、 HPLCにより反応液中の UDPGを定量し、 30てで 1分問 に 1〃mo eの UDPGを生成する活性を 1単位 （ュニッ 卜） とした。
(3) UDPG-UT P酵母反応液への U D Pピロホスホリラ一ゼ、 マル卜デキ ストリンホスホリラーゼおよびデキストリン添加による UDPGの合成 実施例 1の （ 3 ) で調製した UDPG - UTP液 l O Omiに終濃度 2 % (W XV) となるようにデキストリン （Difico社製） を添加し、 さらに 0. 5ュニッ ト となるように U DPグルコースピロホスホリラーゼ及びマル卜デキスト リンホスホリラ一ゼ標品を添加し、 30°Cで 30時間反応させた。 反応液中の UDPG濃度を HPLCで分析したところ、 3 1. 0 mMの U D P Gの生成が確 認された。 実施例 4 ： GDPマンノースの合成
( 1 ) 人腸菌 GDPマンノースピロホスホリラ一ゼ遺伝子のクローニング 大腸菌 ATC C 4 1 5 7の染色体 DNAを齐藤と二浦の方法 (Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963) ) で調製した。 この DNAをテンペレートと して、 以下に示す 2種類のプライマ一 DNAを常法に従って合成し、 PCR法に より大腸菌 G D Pマンノ一スピロホスホリラーゼ （ m a n C ) 遺伝子 （Gordon Stevenson et al. , J. Bacterid . , 178, 4885(1996)) を增幅した。
プライマー （ E ) ： 5' -ATGCCGAATTCCCGTCGAAACTGA-3'
プライマー （ F ) ： 5' -GGAATTCCGTTGGGGAAATTGCCG-3'
PCRによる ma n C遺伝子の増幅は、 5 0 mM塩化カリウム、 l ()mMトリ ス塩酸 （ρΗ 8. 3) 、 1. 5 mM塩化マグネシウム、 0. 0 0 1 %ゼ チン、 テンペレー ト DNA 0. 】 〃 g、 プライマー- DNA (E) (F) 各々 0. 2mM、 Amp 1 i Ta qDNAポリメラーゼ 2. 5ュニッ トの組成の反 ;液 1 0 ) を DNA Thermal Cycler (Perkin- El er Cetus instrument辻製） を用いて、 熱変 性 （ 9 4で、 1分） 、 アニーリ ング （ 5 5 °C\ 2分） 、 ポリ メラィゼ一シ ン ( 72で、 3分） のステップを 25回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、 反応液をフヱノール/クロ CJホルム （ 1 : 1 ) 混合液で処理し、 水溶性画分に 2倍溶のエタノ一ルを添加し D N Aを沈殿させた。 沈殿回収した DNAを文献 （Molecular cloning 、 前述） の方法に従ってァガロースゲル電気 泳動により分離し、 1. 8 k b相当の DNA断片を精製した。 該 DNAを制 限酵素 E c o R Iで切断し、 同じく制限酵素 E c o R Iで消化したプラスミ ド pUC 1 8 (宝酒造 （株） より入手） と T 4 DN Aリガ一ゼを用いて連結した。 連結反応液を用いて大腸菌 JM 1 0 9菌を形質転換し、 得られたアンピシリン耐 性形質転換体よりプラスミ ド pUC 1 8— ma nCを単離した。 pUC l 8 - ma n Cは、 pUC 1 8の 1 a cプロモ一夕一下流の E c oR I切断部位に大腸 菌 ma n C遺伝子を含有する E c oR I DNA断片が揷入されたものである。 (2) 大腸菌 GDPマンノ一スピロホスホリラーゼの調製
プラスミ ド pUC l 8—ma n Cを保持する大腸菌 JM 1 09菌を、 1 00m g_/Lのアンピシリンを含有する 2 X Y T培地 300 m ^に植菌し、 37てで振 とう培養した。 4 X 1 08 菌 /m^に達した時点で、 培養液に終濃度 i mMにな るように I PTGを添加し、 さらに 37 °Cで 5時間振とう培養を続けた。
培 ¾終了後、 遠心分離 （9, 000 X g, 1 0分） により菌体を回収し、 50 mMト リス塩酸 （pH 7. 5) 、 5 mM EDTA、 0. 卜％ ト イ ト ン X 1 00、 0. 2 m gZm £リゾチ—ムの組成の緩衝液 60 m に懸濁した。 37 でで 1 B寺間保温した後、 超音波処理を行い、 菌休を破砕し、 さらに遠心分離 (20, 000 x g、 1 0分） により菌体筏澄を除 ίした。 このように得られた 上清画分を酵素標品とした。 酵素標品における G D Ρマンノースピロホスホリ ーゼ活性を対照菌 （pUC 1 8を保持する大腸菌 JM 1 0 9菌） と共に下記表 4 に示す。
表 4 菌 株 G D Pマンノ —スピロホスホリラーゼ 活性 （ュニッ ト Zmg蛋白質）
JM 1 0 9/pl IC 1 8 < 0. 0 1
JM 1 0 9/pl iC 1 8 -m a c C 0. 23 なお、 GD Pマンノースピロホスホリ ラ一ゼ活性の単位 （ュニッ ト） は、 以下に示す方法で測定、 算出した。 すなわち、 1 塩化マグネシウム、 5mM GTP、 5mM マンノース一 1— Pを含有する 5 OmMリ ン酸カリウム緩衝液
(pH7. 6) に酵素標品を添加して 37 Cで保温して反応を行い、 1 00°C、 5分間の熱処理により酵素を失活させた後、 HP LC法により反応液中の G DP マンノースを定量し、 37°Cで 1分間に 1 mo^ eの GDPマンノースを生成 活性を 1単位 （ュニッ ト） とした。
(3) 乾燥パン酵母を用いた G DPマンノース一 G TP液の調製 4 Om GMP 2 0 OmM グルコース、 2 0 0mM リ ン酸カリウム (pH 8. 0 ) 1 OmM 塩化マグネシゥ厶の組成の反応液 20 m ?を 1 0 0 m 容ビー力一に調製し、 これに 2 gの乾燥 ン酵母 （オリエン タル酵 :工業株 式会社） を懸濁し、 2 (TCで 7時間撹拌反応させた。 反応終 Γ後、 反応液を 1 0 0°C\ 5分間処理し、 遠心分離 （2 00 0 g , 1 0分間） により酵母 f 体を除去した。 回収した上淸画分を HPL Cで分析したところ、 1 1. 2mI i GDPマンノース、 1 0. I mM GTPのノ 成が確認された。
( 4) GDPマンノース一 G T P液への G D Pマンノ一スピロホスホリ -— ゼ 及びマン ノ ース— 1 — P添加による GDPマン ノ ースの合成
ヒ述の G D Pマンノース一 G T P液 20 0 (！に終濃度 2 0 m Mとなるように マンノ ース-一 1 — Pを添加し、 さらに 0. 1ユニッ ト/ m£ GDPマ ノ ース ピロホスホリラーゼとなるように上記酵素標品を添加し、 水で全量を 4 0 0 u β とした上で 3 7°Cで 8時間反応させた。 反応液中の GDPマン ノ -ス濃度を HP LCで分析したところ、 1 0. 5 mMの G DPマンノースの生成が確認された。 雄例 5
実施例 4の （ 3 ) および （ 4 ) と同じ方法にて G D Pマ ンノースを合成し た。 ただし、 添加する GDPマンノースピロホスホリラ一ゼは 0 0. 0 25 0. 0 5 0. 1ユニットの酵素単位の酵素を用し、て行つた。 G D Pマン ノ ース の経時的な生成量を図 2に示す。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 従来の酵母菌体法では生産性の低かった各種糖ヌクレオチド を効率的よく製造することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 醉:母菌体を用いてヌクレオチドから糖ヌクレオチドを製造する方法において、 反応系にヌクレオシドニリン酸ー糖ピロホスホリ 一ゼと糖 1―リン酸とを ¾ 存させることを特徴とする糖ヌクレオチドの製造法。
2. 糖ヌクレオチドが UDP糖、 GDP槌、 ADP糖、 dTDP糖および CDP よりなる群から選択されたものである、 請求¾ 1記載の製造法。
3. 糖ヌクレオチドか次の①〜⑤ょりなる A群から選択されたものである、 請求 項 1記載の製造法。
(A群）
① U D P槌； U D Pダルコース、 U D Pガラク ト一ス及び U D Pゲルク口ン酸
(I)GDP糖； GDPマンノース、 GDPフコースおよび G DPグルコース
③ A DP糖； ADPグルコース
④ dTDP糖； dTDPグルコースおよび d TDPガラク ト一ス
⑤ CD P糖； CD Pグルコース
4. 糖 1 -リン酸の代わりに糖 1―リン酸生成系を共存させる、 請求項 1記載の 製造法。
5. 糖 1一リン酸生成系がホスホリラーゼを用いたものである、 請求項 4記載の 製造法。
6. 糖 1ーリン酸生成系がグルコース— 1一リン酸 （G— 1— P) 生成系である、 請求項 4記載の製造法。
7. 糖 1—リン酸生成系がショ糖とショ糖ホスホリラーゼの組み合わせによる G 一 1一 P生成系、 グリコ一ゲンとグリコーゲンホスホリラ一ゼの組み合わせに よる G— 1一 P生成系またはデキストリンとマルトデキストリンホスホリラ一 ゼの組み合わせによる G - 1 - P生成系である、 請求項 4記載の製造法。
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