HU191292B - Process for the production of ribavirine - Google Patents

Description

A jelen találmány tárgya ribavirin előállítása új enzimatikus eljárással.

A ribavirin kémiai nómenklatúra szerint 1 -β-Όribofuranozil-l,2,4-triazol-3-karboxamid, melyet virazolnak is neveznek (márkanév), és olyan vegyiilelként ismert, mely DNS és RNS vírusokkal szemben szélesspektrumú és erős vírusellenes aktivitással rendelkezik. [Annalsof the New York Acadcmy of Sciences 284, 272-292 (1977).] 43 435-1818

A ribavirin előállítására olyan eljárások ismertek, melyek szintetikus, fermentatív és enzimatikus módszerek közé sorolhatók.

Az ismert, reprezentatív szintetikus módszerek magukba foglalják azokat az eljárásókat, melyekben 3metoxi-karbonil-1,2,4-triazolt l-O-acetil-2,3,5-tri-Oacil-/?-D-ribofuranozokkal reagáltatnak, a kapott 1 (2',3',5' - tri- O - acil - β - D - ribofuranozil) - 3 metoxi - karbonil - 1,2,4 - triazolt amidálás céljából ammóniával kezelik, majd a védőcsoportot eltávolítják (lásd 4469/1973, 80 070/1974 és 80 071/1974 számú japán nyilvánosságrahozatali iratokat]; ehhez a módszerhez hasonlóan azt az eljárást, melyben a triazolgyűríi 3-helyzetben aralkjl-oxi-szubsztituenst alkalmaznak [lásd 160 793/1980 számú japán nyilvánosságrahozatali iratot]; azt az eljárást, melyben 3metoxi-karbonil-l,2,4-triazolt trimetil-szililcznek és ezt 3,4,5-tri-0-benzoil-/?-D-ribofuranoz halogenidjével reagáltatják, majd ammóniával kezelik [lásd 4469/ 1973 és 86 372/19.74 számú japán nyilvánosságrahozatali iratokat]; és még más eljárásokat. Ezen szintetikus módszerek bármelyikében szükséges a kiindulási vegyületek aktív csoportjainak megvédése a reakció előtt, vagy a reakció lefolytatásában néha kívánatos lehet a ribóz aktiválása. Ilyen esetekben magasabb hőmérsékletre történő melegítés is szükséges. Továbbá, a reakció után védöcsoport-eltávolítás és amidálás végrehajtása szükséges, ami nehézkes reakciómüveletek problémáit hozza magával. Egy másik probléma az, hogy a kondenzáiási reakcióban a helyzeti szelektivitás, megítélésünk szerint, ezeknél a módszereknél nem magas.

A korábban ismert fermentatív eljárásokban az

1,2,4-triazo!-3-karboxamidot egyszerre vagy részletekben adják az alkalmazott mikroorganizmusok tenyésztéséhez szükséges szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen anyagokat és más tápanyagokat tartalmazó tenyészközeghez, mégpedig a Brevibacterium, a Corinebacterium, az Arlhrobacter, a Micrococcus vagy a bacillus nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok tenyésztésének megkezdése előtt, vagy a tenyésztés közben, és a tenyésztést 2-4 napon át végzik, miáltal a tenyészközegben ribavirin képződik és felszaporodik [lásd a 17 830/1979 számú japán nyilvánosságrahozatali iratot; Journal of the Agricultural Chemical Society of japan, 50 (9), 423-430 (1976)]. Ez a módszer a következő problémákat rejti magában:

(1) mivel a ribavirin termelését tápközegben, a mikroorganizmusok szaporodása közben végzik, ezért előbb a mikroorganizmusok szaporodásához különböző tápanyagforrást tartalmazó tény észközeget szükséges elkészíteni, ezenkívül nehézkes előkezelésre is szükség van, mint amilyen a tenyészközeg sterilizálása az oltómikroorganÍzmijSsal történő beoltás előtt;

(2) ribarivin termeléséhez a tenyésztést, melyet mikroorganizmusok elszaporodása kísér, általában — 40 °C közötti normál hőmérsékleten folytatják le, és ezért állandó ellenőrzés szükséges a különböző mikroorganizmusokkal való fertőzés miatt. Ezen túlmenően, ilyen körülmények között, a ribavirin elbomlásának lehetősége is fennáll, és ezzel a vegyület kitermelése is csökken;

(3) a mikroorganizmus szaporítását hosszabb ideig,

2-8 napori át kell végezni;

(4) a ribavirin különböző nukleozidjai, foszforilezett termékei, és mint melléktermékek, más metaboli tok képződnek, következésképpen, a ribavirin tenyészközegből való kinyerése megköveteli azt, hogy a ribavirint ne csak a kiindulási vegyületekböl, hanem a különböző melléktermékektől is elválasszák, ami viszont a kinyerést és a tisztítást nehézkessé teszi; és (5) a mikroorganizmust a ribavirin termelésének egész ideje alatt tenyészteni kell.

Az ismert enzimatikus módszerek abból állnak, hogy az l,2,4-triazol-3-karboxamidot ribóz-l-foszfáttal reagáltatják 5 - 9 pH-η cs 0 - 50 ’C közötti hőmérsékleten nukleozid-foszforilázok jelenlétében ^ro9 720/ 1075 számú japán nyilvánosságrahozatali irat). A módszernek az lehet a problémája, hogy a ribóz donorként használt ribóz-1-foszfát nem stabil, és nem könnyen hozzáférhető, ezenkívül az eljáráshoz használt tisztított enzim előállítása sem egyszerű.

Először azt találtuk, hogy a ribavirin mikroorganizmus-tenycszet, intakt mikroorganizmus-sejtek, vagy módosított mikroorganizmus-sejtek mint enzimforrás alkalmazásával, a mikroorganizmus nem szaporodó körülményei között enzimatikus reakcióval állítható ele.

A jelen találmány tárgya eljárás ribavirin előállítására oly módon, hogy l,2,4-triazol-3-karboxamidot vagy sóját, cs ribóz donort az alábbiakban megadott nemzetségek közül választott mikroorganizmusalapú enzimforrás jelenlétében, amely enzimet tartalmaz, mely l,2,4-triazol-3-karboxamidból és ribóz donorból a ribavirin képződési reakcióját az adott mikroorganizmus nem szaporodó körülményei között katalizálja, vizes közegben érintkeztetjiik, és a közegből á képződött ribavirint kinyerjük. Enzimforrásként alkalmazott mikroorganizmusok a következők: (1) a Brevibacterium, (2) a Corynebacterium, (3) az .Árthrobacter, (4) a Micrococcus, (5) a Bacillus, (6) a Flavobacterium, (7) a Microbacterium vagy Brochothric, (8) a Xanthomonas, (9) a pseudomonas vagy Alteromonas, (10) az Achromobacter, (11) az Escherichia, (12) az Aerobacter, (13) a Sarcina, (14) a Staphylococcus, (15) a Bacterium, (16) a Serratia, (17) a Proteus, (18) a Cellulomonas, (19) az Enterobacter, (20) a Mycoplana, (21) a Vibro, (22) az Erwinia, (23) a Klcbsiella, (24) az Acromonas, (25) a Mycotorula és (26) a Candida nemezclscgekhez tartozó mikroorganizmusok.

A jelen találmányban a „mikroorganizmus alapú enzimforrás” kifejezés alatt mikroorganizmus-tenyészetet, mikroorganizmus intakt sejtjeit vagy mikroor ganizmus módosított sejtjeit értjük.

A jelen találmány és a régebbi fermentál-v, valamint enzimatikus módszerek közötti legjellemzőbb különbség abban van, hogy a jelen találmányban a mikroorganizmus, tenyészetét, a mikroorganizmus intakt sejtjeit, vagy a mikroorganizmus módosított sejtjeit alkalmazzuk enzimkészítményként, és ezzel az

191 292 l,2,4-triazol-3-karboxamiíiot vagy sóját, és a ribóz donort a mikroorganizmus nem szaporodó körülményei között reagáltatjuk, miáltal az enzimatikps reak ciót optimumon tartjuk.

A jelen találmánynak a régebbi ferment.atív módszerekkel szembeni előnye az, hogy ' (1) a magasabb hőmérsékleten végzett reakció amely jellegzetesen a mikroorganizmus nem szaporodó körülményei között vezetett reakció — minimumra csökkenti a reakcióelegy nemkívánatos mikroorganizmusokkal való szennyeződését; csökkenti a már képződött ribavirin bomlását a nagy ribavirin kitermelés biztosítása mellett;

(2) a reakció enzimatikus, így a szükséges reakcióidő rövidebb, és a melléktermékek képződése kevesebb, mely viszont a szükséges tisztítást egyszerűbbé teszi;

(3) az enzimforrás ismételt vagy folyamatos felhasználása lehetséges; és (4) az enzimforrást tárolni lehet, és az enziinfoi rás termelése és felhasználása igy bármikor elvégezhető.

Továbbá, a jelen találmány a régebbi enzimatikus módszerekkel szemben azzal az előnnyel rendelkezik, hogy (!) az enzimforrást egyszerű elkészíteni; és (2) a ribóz donor könnyen hozzáférhető, mivel ez különböző anyagok széles köréből választható, mint amilyenek a nukleozidok és a nukleotidok.

A jelen találmány, amennyiben erre alkalmas enzimforrást használunk, a korábbi módszerekkel ellentétben, a ribavirint messzemenően nagyobb kitermeléssel állíthatja elő.

A találmány szerinti enzimatikus reakcióban alkalmazott enzimforrás, mint ahogy az előzőekben leírtuk, egy mikroorganizmuson, egy mikroorganizmustenyészeten, mikroorganizmus intakt sejtjeinek, vagy egy mikroorganizmus módosított sejtjeinek tenyésze tén alapul.

A jelen találmányban alkalmazott mikroorganizmusok azok, melyek tenyészete, intakt sejtjei vagy módosított sejtjei olyan enzimet tartalmaznak, mely a ribavirin képződéséhez az l,2,4-triazol-3-karboxamid és ribóz donor közötti reakciót katalizálni képes, ilyenek a Brevibacterium, a Corynebactferium, az Arthrobacter, a Micrococcus, a Bacillus, a Flavobacterium, a Microbacterium vagy Brochothris, a Xanthomonas, a Pseudomonas vagy Alteromonas, az Achromobacter, az Escherichia, az Aerobacter, a Sarcina, a Staphylococcus, a Bacterium, a Serratia, a Proteus, a Cellulomonas, az Enterobacter, a Mycoplana, a Vibrio, az Erwinia, a Klebsiella, az Aeromonas, a Mycotorula vagy a Candida nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok, melyek az előbb említett aktivitással rendelkeznek. A jelen találmányban, a mikroorganizmus-törzsek nem különösen korlátozódnak fajokra, amennyiben azok ilyen alaptulajdonságokkal rendelkeznek.

A következőkben megadjuk a mikroorganizmustörzsek azon példáit, melyek a szakember számára könnyen hozzáférhetők.

(1 — 1) Brevibacterium acetylicum AT-6-7 FERM P-6305 (ATCC 39 311) (1 — 2) Brevibacterium imperiale ATCC 8365 (2-1) Corynebacieriurn equi IÁM 1038 (3-1) Arthrobacter citreus 1FO 12 057 (ATCC

624) (3 -2) Arthrobacter globiformis IFO 12 137 (ATCC 8010) (4—1) Micrococcus luteus ATCC 4698 (IÁM 1056) (4 — 2) Micrococcus variáns IFO 3765 (ATCC 399) (4-3) Micrococcus roseus IFO 3768 (ATCC 186) (5-1) Bacillus sublilis STCC 14 593 (5 — 2) Bacillus cereus 1AM 1029 (6-1) Fiavobacterium arborescens IFO 3750 (ATCC 4358) (6-2) Flavobacterium lutescens IFO 3084 (1AM 1667) (ATCC 25 311) (6-3) Flavobacterium lutescens IFO 3085 (7-1) Microbacterium thermosphactum IFO

167 (Brochotrix thermosphacta ATCC 11 509) (8-1) Xanthonionas oryzae IFO 3312 (Xanthomonas campestrís ATCC 21 754) (9—1) Pseudomonas putrefaciens IFO 3908 (Alteromonas putrefaciens ATCC 8071) (9-2) Pseudomonas putrefaciens 1EO 3909 (Alteromonas putrefaciens ATCC 8072) (9-3) Pseudomonas putrefaciens IFO 3910 (Alteromonas putrefaciens ATCC 8073) (9 — 4) Pseudomonas schuylkillícnsis IÁM 1051 (9-5) Pseudomonas ovális 1ΛΜ 1002 (9-6) Pseudomonas dacunchae IÁM 1089 (10-1) Achromobacter parvulus IFO 13 182 (NRRL B-2395) (10 — 2) Achromobacter xerosis IFO 12 668 (11 — 1) Escherichia coli IFO 3301 '11-2) Escherichia coli IÁM 1268 (ATCC 11 303) (12- 1) Aerobacter aerogenes IÁM 1019

Ezt a mikroorganizmus-törzset a Fermentation Research Institute-nál, Agency of Industrial Science & echnology (a következőkben FERM-ként jelölve), Yatabe-machi, Ibaragi, Japán, 1983. május 24-én •ERM P-6358 letéti szám alatt helyeztük letétbe,

3 - 1) Sarvina marginata 1 AM 1130

Ezt a mikroorganizmus-törzset FERM-nél 1982. május 24-cn FERM P-6539 letéti szám alatt helyeztük letétbe.

(14- I) Staphylococcus aureus IÁM 1011 (ATCC 6538 P) (13-2) Staphylococcus aureus IFO 3060 (15-1) Bacterium succinicum IÁM 1017

Ezt a mikroorganizmus-törzset a FERM-nél 1982. május 24-én FERM P—6540 leteti szám alatt helyeztük letétbe.

(16— 1) Serratia marcescens IÁM 1105 (17-1) Proteus vulgáris 1AM 1025 (18 — 1) Cellulomonas flavigena 11Ό 3753 (18 — 2) Cellulomonas flavigena IFO 12680(ATCC

486) (19—1) Enterobacter aerogenes IFO 12010 (19 — 2) Enterobacter cloacae ATCC 7256 (70— 1) Mycoplana bullata IFO 13 290 (ATCC

4278)

191 292 (21-1) Vibrio anguillarum IFO 13 266 (ATCC 19 264) (22— 1) Erwinia carotovora subsp. carotovora IFO 12 380 (23 1) Klebsiella pneumoniae ATCC 8308 (24-1) Aeromonas hydrophila subsp. anaerogenes

IFO 13 282 (ATCC 15 647) (25— I) Mycotorula japonica OUT 6226 (26- 1) Candida polymorpha IFO 0836

Ezt a mikroorganizmus-törzset a FERM-nél 1982. május 24-én FERM P —6541 letéti szám alatt helyeztük letétbe.

Az előbbi mikroorganizmys-törzsek letéti számaiban az ATCC a The American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockvilte, Maryland, USA letéti számait jelenti: az IFO a Foundation Institulc fór Fcrmcntation, Osaka, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka, Japán, letéti számait jelenti; az IÁM az lnstitute of Applied Microbiology, University of Tokyo, Yayoi 1-1-1, Bunkyoku, Tokyo, Japán, letéti számait jelenti; illetve az OUT a Faculty of Enginccring, Osaka University, Yamada ue, Suita, Japáp, letéti számait jelenti. Az ATTC számmal rendelkező törzsek az American Type Culture Collection, Calalogue of Strains I, XV. kiadás, 1982, katalógusbap felsorolt törzstenyészetek. Az IFO, OUT és IÁM számmal rendelkező törzset a JFCC Catalogue of cultyres-ben, III. kiadás, 1979, vagy az lnstitute Tor Fcrmcntation Osaka, List of Cultures, VI. kiadás, 1978, katalógusban felsorolt törzstenyészetek. A nemzetségek és a fajok nevei, melyekhez ezek a mikroorganizmusok mint törzskultúrák tartoznak, a taxonómiai standardok változása miatt megváltozhatnak, azonban ezek a mikroorganizmustörzsek azonosnak tekinthetők az előbb példaként megadottakkal, amennyiben ezek azonos vagy egyenértékű bakteriológiai tulajdonságokkal rendelkeznek.

' Az· előbbi mikroorganizmusokból származó mutáns törzsek, vagyis mutagén módszerekkel, általában fizikai kezeléssel, mint UV-sugárral, X-sugárral vagy y-sugárral, vagy más mutagcnncl átalakított mutáns törzsek, vagy természetes okoknak tulajdonítható természetes mutációk a jelen találmányban~szintén felhasználhatók, amennyiben a ribavirin termelésében közreműködő enzimatikus aktivitásukat nem vesztik el.

A különböző mikroorganizmusok közül legelőnyösebb törzs a Brevibacterium acetylicum AT —6—7, melyet Koshien baseball pálya talajából izoláltunk, Nishinomiya-shi, Hyogo-ken, Japán. Ez a törzs a következő bakteriológiai tulajdonságokkal rendelkezik:

A) Morfológia (1) A sejtek alakja és mérete: rövid pálcika alakú, 0,8 - 1,0 x 1,0 - l ,2 ym;

(2) Spóraképződés nincs (3) Gratn-színezés: pozitív

B) Tenyésztés különböző tápközegben (1) Húsleves-agar Icmezkultúra (28 ’C, 48 óra)

1. Kolónia formáin: kör alakú

2. Kolónia felülete: lapos, sima

3. Méret: 2 — 4 mm

4. Színárnyalat: sárgától rózsaszínes sárgáig (2) Húsleves ferdetenyészet (28 ’C, 48 óra)

1. Növekedés: jó

2. Növekedés formája: tüskés (3) Húsleves folyékony tenyészet (28 ’C, 48 óra) Növekedés: a felületen gyűrűképződés, gyenge üledékképződés (4) Húsleves-zselatin szúrt tenyészet (20 ’C, 6 nap) Rétegesen elfolyósodik (5) Lakmusztej tenyészközeg (28 ’C, 4 nap)

Enyhe koagulálás, peptonizálás is megfigyelhető

C) Fiziológiai tulajdonságok (1) Nitrát redukciója (18 ’C, 5 nap): redukálás nincs (2) Hidrogén-szulfid képződés (28 ’C, 5 nap): nem képződik (3) Keményítő hidrolízise: hidrolizálható (4) Kataláz: pozitív (5) Indol-képződés: nem képződik (5) Peptonból és argininből ammóniafejlődés: negatív (7) Mctilvörös teszt: negatív (8) V-P teszt: pozitív (9) Viselkedése az oxigénhez: aerob (10) O-F teszt (Hugh Leifson módszerrel): F típus (fermentáció) (11) Cukorból savképződés pozitív: glükóz, mannóz, fruktóz, mattóz, szacharóz, trehalóz, negatív: arabinóz, xilóz, galaktóz, laktóz, szorbit, inozit, glicerin.

(12) Tenyésztés pH tartománya: PH 6,0-9,0

913) Optimális tenyésztési hőmérséklet: 25-37 ’C

Ezeket a baktcrológiai tulajdonságokat a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 7. kiadás (1957) szerinti taxonómiás standardokhoz viszonyítva vizsgáltuk. Ennek eredményeként, az AT-6-7 törzset, mely csaknem coccus formájú rövid pálcika alakú baktérium, nem képez szálakat, és szénhidrátokból savakat termel, a Brevibacterium nemzetséghez tartozó törzsként azonosítottuk, és mint Brevibacterium acetylicum AT -6-7 jelöltük.

Az előbbi mikroorganizmus-törzset, a Brevíbacterium acetylicum AT-6-7-et, Bergey’s Manual of Bacteriology, 7. kiadás szerint azonosítottuk, de lehetséges ezt, a taxonómiai standardokban levő némi változások miatt, különböző taxonómiai stardardok szerint, más fajokhoz vagy nemzetségekhez sorolni. Azonban, az előbb megjelöli mikroorganizmusokat az előzőekben említett letétbe helyezések és bakteriológiai tulajdonságok alapján minden kétséget kizáróan meg lehet határozni.

A Brevibacterium acetylicum AT-6-7 törzset FERM-nél 1982. január !3-án (FERM P-6305) helyeztük letétbe, és a törzset a FERM-től 1983. március

191 292

2-án ATCC 39 311 letéti szám alatt az ATCC közvetlenül megkérte.

Az előzőekben felsorolt különböző mikroorganizmus-törzsek közül előnyösek azok, melyek 50 %, vagy ennél magasabb ribavirin-tcrmelésre képesek. Ilyen mikroorganizmusok a következők:

Brcvibacterium acetylicum AT-6-7: FERM P-6305 (ATCC 39 311)

Flavobacterium lutescens: IFO 3084 (ATCC 25 311)

Xanthomonas oryzae: IFO 3312

Pseudomonas putrefacíens: ATCC 8072

Achromobacter xerosis: IFO 12 668

Escherichia coli: 1AM 1268 (ATCC 11 303)

Cellulomonas flavigena: IFO 12 680 (ATCC 486)

Ezek közül a Brcvibacterium acetylicum AT - 6 - 7 a legelőnyösebb.

Az enzimforrás előállításánál ezen mikroorganizmusok tenyésztésében a tenyészközeg és az alkalmazott tenyésztés módszere nem különösen korlázozott, amennyiben a tenyésztés ezen mikroorganizmusok fejlődését lehetővé teszik.

Tenyészközegként megfelelő mennyiségű szenforrást, és ezen mikroorganizmusok által asszimilálható nitrogénforrást tartalmazó táptalaj alkalmazható, melyhez tetszés szerint szervetlen sók, fejlődést elősegítő anyagok, habzásgátló szerek és hasonlók adhatók. Pontosabban meghatározva, szénfoprások közül kiválasztható egy vagy több anyag, megfelelően tekintetbe véve azt, hogy ez az alkalmazott mikroorganizmus által asszimilálható legyen: ilyenek a cukrok, például a glükóz, fruktóz, maltóz, galaktóz, ribóz, szacharóz, keményítő, keményítőhidrolizátum, melasz, hulladékmelasz és hasonlók, vagy ezek származékai, mint zsírsav-észterei; természetes szénhidrátok, mint búza, búzakorpa, rizs és hasonlók; alkoholok, mint glicerin, mannit, metanol, etanol és hasonlók; zsírsavak, mint glükonsav, piroszőlősav, ecetsav, citromsav és hasonlók; szénhidrogének, .,.int normál paraffinok, kerozin és hasonlók; aminosavak, mint glicin, glutaminsav, ghri-min, alanin, aszparagin és hasonlók. Nitrogénforrások közül kiválasztható egy vagy többféle anyag, megfelelően tekintetbe véve azt, hogy ez az alkalmazott mikroorganizmus által asszimilálható legyen: ilyenek a szerves nitrogéntartalmú anyagok, például a húsextrakt (húsleves), élesztőextrakt, szárított élesztő, szójába .v-hidrolizá tűm, szójababpor, tejkazein, kazaminsav, különböző aminosavak, kukoricalekvár, gyapotmagliszt vagy hidrolizátuma, halliszt vagy hidrolizátuma, más állati, növényi anyagok, mikroorganizmusok stb. hidrolizátumai, szervetlen nitrogénvegyületek, mint az ammónia, ammóniumsók, például ammónium-nitrát, ammóniumszulfát, ammónium-klorid, ammónium-foszfát, ammónium-karbonát, ammónium-acetát és hasonlók, nitrátok, mint a nátrium-nitrát, karbamjd és hasonlók. Továbbá, szervetlen sóként csekély mennyiségben megfelelően egy vagy több só is hozzáadható, mint amilyen a magnézium, mangán, vas, cink, réz, nátrium, kalcium, kálium stb. foszfát, klorid, szulfát, karbonát, nitrát, aceiát és más sói. Szükség esetén a tenyészközeghez habzásgátló szer, mint növényi olaj vagy felületaktív anyag, csekély mennyiségű fejlődést elősegítő anyag, mint Bl, B2 vitaminok, nikotinsav, pantoténsav, biotin, p-amino-benzoe-sav és hasonló is hozzáadható. Ha egy olyan mikroorganizmust alkalmazunk, amelynek további tápanyag igénye van, akkor ezeket a növekedéshez szükséges nnyagokat is a tenyészközeghez adagoljuk.

A tenyésztés folyékony közegben folytatható le, mely az előbb megadott komponenseket tartalmazza, kiválasztva a szokásos tenyésztési módszerek közül az alkalmazott mikroorganizmusnak megfelelő tenyésztési módszert, mint ameilyen a rázótenyészlés, levegőztetett kevert tenyésztés, állótenyésztés, folyamatos tenyésztés és mások.

A tenyésztés körülményei az alkalmazott mikroorganizmustól és a tenyészközegtől függően választhatók meg, azonban a tenyésztés megkezdése előtt általában a pH-t 6-8 értékre állítjuk be, cs a tenyésztést 25— 35 °C közötti hőmérsékleten folytatjuk le. Λ tenyésztés ideje az alkalmazott mikroorganizmus szaporodásához szükséges időtartam általában 1 - 3 nap.

A jelen találmányban alkalmazott enzimforrás egy olyan enzimet tartalmaz, mely a ribavirjn termeléséhez az l,2,4-triazol-3-karboxamid ribóz donorral való reakcióját katalizálja. A jelen találmány szerint az enzimatikus reakcióban feltétlenül szükséges enzim főleg nukleozid-foszforiláz, így a találmány szerint alkalmazott enzimforrásnak elsősorban ilyen enzimatikus antivitássa! kell rendelkeznie. Ezen túlmenően, amikor egy olyan vegyületet alkalmazunk ribóz donorként, mely közvetlenül ncin képes a nukleozidfoszforiláz szubsztrátuma lenni, akkor az enzimforrásnak legyen olyan enzimatikus aktivitása, mely a ribóz donort az enzim szubsztrátumává alakítja. A ribózdonor elengedhetetlen, de ebben a megvalósítási formában nem szükséges külön az enzimatikus reakciórendszerhez adagolni, mivel az enzimforrás kell, hogy tartalmazzon vagy egy ribóz donort, vagy egy olyan metabolizinust, amely ribóz donor termelésére képes.

A tenyésztés után a mikroorganizmus, mint ahogy az előbbiekben leírtuk, a tenyészet, a mikroorganizmus intakt sejtjei - melyet a tenyészetből szokásos módszerrel, mint centrifugálással, ülcpítcscs elválasztással, agglomerációs elválasztással különítünk el — vagy a mikroorganizmus módosított sejtjei — melyet az intakt sejtek megfelelő kezelésével kapunk — a jelen találmányban enzimforrásként alkalmazhatók. A „tenyészet” kifejezés itt a termek olyan állapotára vonatkozik, ahol a táptalaj és a tenyésztett mikrobás sejtek a tenyésztés után még nincsenek egymástól elválasztva. A mikroorganizmus „módosított sejtjei” kifejezés száraz mikrobás sejtekre, denaturált sejtmembránnal és/vagy sejtfallal rendelkező mikrobás sejtekre, préselt mikrobás sejtekre, rögzített mikrobás sejtekre, mikrobás sejtextraktumra, a találmány szerinti ríbavirin termelésében résztvevő enzimaktivitással rendelkező mikrobás scjtcxtraktuin proteinfrakciójára, vagy ennek tisztított termékére, továbbá, a proteinfrakciók rögzített termékére, vagy ennek tisztított termékére, és hasonlókra vonatkozik.

A mikrobás sejtek módosításának módszerét a következők szemléltetik. Vagyis, módosított mikrobás sejtek a következő módszerekkel állíthatók elő:

(1) Intakt mikrobás sejteken egyszerű vagy kombinált fizikai kezelés alkalmazása, ilyen a fagyasztó5

191 292 olvasztó kezelés, liofilizálás, légszárítás, acetonos szárítás, savas vagy alkálikus körülmények közötti melegítés, őrlés, ultrahangos kezelés, ozmotikus kezelés és hasonló, vagy kémiai vagy biokémiai kezelés, mint enzimes kezelés zizozimmal, enzimek sejtfal oldása stb., kontakt kezelés oldószerekkel, mint toluollal, xilollal, butil-alkohollal vagy felületaktív szerekkel;

(2) Mikrobás sejtek extraktumán egyszerű vagy kombinált enzimelválasztás és tisztítás alkalmazása, mint amilyen a kisózás, izoelektromos ponton történő lecsapás, szerves oldószerekkel való lecsapás, különböző kromatográfiás kezelés, dialízis és mások; vagy (3) Intakt mikrobás sejtek, mikrobás sejtextraktumok vagy ezek tisztított termékeinek rögzítése, mint sejlzárvány készítése, térhálósító kezelés, adszorpciós kezelés hordozóanyagra és hasonlók.

A találmány szerinti enzimatikus reakcióban reakciószubsztrátum az l,2,4-triazoI-3-karboxamid és a ribóz donor.

Az l,2,4-triazol-3-karboxamidot lehetséges szabad vagy só formában, mint nátriumsó formában alkalmazni.

A jelen találmányban a ribóz donor egy ribóz származékot jelent, mely a találmány szerint alkalmazott mikroorganizmus enzimforrásának hatására a Dribóz-maradék l,2,4-triazol-3-karboxamidra történő átvitelre képes, és magában foglalja azokat az anyagokat, amelyeket külön adagolunk és azokat is, amelyeket az enzimforrásként használt mikroorganizmus sejtjei már mint sejten belüli komponenseket tartalmazzák ; ezek vagy a jelen találmány szerinti reakcióban résztvevő enzim reakciószubsztrátumai lehetnek, vagy a jelen találmány reakciókörülményei között mint prekurzor anyagok, az előbbi reakció szubsztrátumává alakulhatnak. Ilyen anyagokként különböző ribonukleozidok, vagy a D-ribóz, vagy ezek különböző foszforészterei említhetők meg.

A jelen találmány felöleli az alkalmazott enzimforrásban jelenlevő, vagy az enzimatikus reakcióban „in situ” képződött ribóz donor hasznosítását, de egy előnyös megvalósítási forma magába foglalja a reakciórendszerhez külön hozzóadott ribóz donor használatát is.

A ribóz donor, mint ahogy az előzőekben leírtuk, bármilyen ribonukleozid, vagy D-ribóz, vagy ezek különböző foszforészterei lehetnek. Másszóval, lehetséges bármilyen ribonukleozid alkalmazása, melynek egyik alkotórésze vagy purin-típus, vagy pirimidintípus, függetlenül attól, hogy ez a ribonukleozid egy természetben előforduló termék, vagy kémiai szintézisből származik. A ribonukleozidok vagy a D-ribóz foszfátjai monofoszfát, difoszfát vagy trifoszfál részt tartalmaznak a 2-, 3- és 5-hclyzcl bármelyik egy, két vagy mindegyik helyzetén. Ezek a foszfátok vagy szabad formában, vagy szokásos alkálisók formájában, mint nátrium, kálium, kalcium, magnézium, ammónium, trietil-ammónium és hasonló sók formájában lehetnek. A ribóz donor jellemző példái magukba foglalják a ribonukleozidokat, ilyen az mozin, adenozin, guanozin, xantozin, uridin és á citidin; a ribonukleotidokat, ilyen az 5'-ionozinsav, 5'-adenilsav, 5' guanilsav, 5'xantilsav, 5'-uridilsav, 5'-citidilsav, 2'(3')-inozinsav, 2'(3')-adenilsav, 2'(3')-guanilsav, 2'(3')-xantilsav, 2'(3')-uridilsav, és a 2'(3')-citidilsav; továbbá a D-ribóz, D-ribóz-1-foszfát és hasonlók.

A jelen találmány szerinti enzimatikus reakcióhoz használt reakciószubsztrátum oldat alapjában egy vizes folyadék, mely az előbb említet reakciószubsztrátumot vizes közegben oldva vagy szuszpendálva tartalmazza.

A vizes folyadék, az előbb említett reakciószubsztrátumon túlmenően, tetszés szerint az enzimatikus reakció serkentéséhez, a reakciószubsztrátum oldhatóságának javításához, vagy az enzim cs a rcakciószubsztrátum közötti érintkeztetés elősegítéséhez különböző anyagokat tartalmazhat, mint amilyenek a foszfátion donorok, a szerves oldószerek, a felületaktív anyagok, femsök, koenzimek, savak, bázisok, cukrok cs hasonlók.

Az enzimatikus reakciókhoz vizes közeg, előnyösen a víz, vagy különböző puffer lehet [például foszfátpuffer, imidazol-(hidrogén-klorid)-puffer, veronál(hidrogén-kloridj-pufTer, trisz-(hidrogcn-klorid)puffer], mely foszfátiont átadó forrást, és kívánt esetben különböző anyagokat is tartalmazhat.

A jelen találmány szerinti enzimatikus reakciót főleg nuklcozid-foszforilázzal katalizáljuk, ezért a reakcióközegben a foszfáton jelenléte szükséges. Következésképpen, ha a közeg foszfátiont nem tartalmaz, akkor az enzimatikus reakcióközeghez foszfátiont átadó anyagot kell hozzáadni.

Foszfátiont átadó anyagok közül bármelyik, vizes közegben foszfátionra disszociálható vegyűlet alkalmazható, mint amilyen maga a foszforsav, szervetlen foszfátok, mint az alkálifémsók, például a nátrium, kálium és hasonlók; az alkáliföldfémsók, például a kalcium, magnézium és hasonlók; vagy az ammóniumsók. Ugyancsak, foszfátiont átadó anyagok közül olyan rendszer is használható, mely az enzimreakció oldatában foszfátionok felszabadítására képes, mint amilyen a különböző foszforészterek alkalmazása foszfatázokkal kombinálva, és a ribonukleotidok nukleotidázokkal kombinálva. Az ilyen rendszerben az enzimeket, jelen találmányban alkalmazott enzimforrás tartalmazza, vagy az ilyen enzimatikus aktivitással rendelkező más enzimek, mikrobás sejtek vagy módosított mikrobás sejtek, külön is hozzáadhatok a reakcióközeghez. Az ilyen foszfát átadó rendszer a reakció közben vagy külön, vagy az alkalmazott enzimforrás komponenseként adható a rendszerhez. Vagyis, amennyiben az előbbi anyagok az enzimatikus reakció szempontjából hasznosítható formában vannak, akkor vagy egyedül, vagy két vagy több anyag kombinációjából álló rendszer, vagy a fenti anyagokat tartalmazó mikrobás sejtek, vagy módosított sejtjeinek formájában külön adhatók a reakciórendszerhez az enzimatikus reakció közben, vagy más változat szerint, az alkalmazott mikroorganizmusban sejtkomponensként ilyen alkotórészeket tartalmazó anyagok is hozzáadhatok.

Szerves oldószerként használható például a metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, aceton, metil-etil-keton, etil-acetát, toluol, tetrahidrofurán, dioxán, dimetil-szulfoxid, dimeíil-acetamid, dimetilformamid, 2-metoxi-etanol, 2-etoxi-etanol, és az 1,2dimetoxi-etán.

A jelen találmány szerinti reakció az előbb megadott enzimforrás és a reakciószubsztrátum érintkeztetésével vizes közegben, az adott mikroorganizmus nem szaporodó körülményei között végezhető el.

-611

191 292

Az érintkeztctés megfelelően választható meg az alkalmazott enzimforrás formájától függően. Rendszerint ehhez szakaszos rendszer alkalmazható, melyben az enzimforrást a reakciószubsztrátum oldatában vagy szuszpendáljuk vagy oldjuk, és előnyösen melegítés közben keverjük vagy rázzuk, vagy a reakciószubsztrátumot adagoljuk az enzimforrás szuszpenziójába vagy oldatába, vagy folyamatos reakcióval, melyben az enzimforrást tetszés szerint erre alkalmas hordozóanyaggal vagy adszorbenssel keverjük, vagy ezen rögzítjük, és a reakciószubsztráturp-oldatot folyamatosan érintkeztetjük az enzimforrással.

A rcakciószubsztrátum cs enzimforrás koncentrációját vagy mennyiségét a következők szerint jellemezzük.

A reakció lefolytatásában, a reakcióelegyben, a szubsztrátum koncentrációja nem különösen korlátozott, azonban az adott hőmérsékleten, az alkalmazott vizes közeghez viszonyítva, általában a Szubsztrátum telített koncentrációja alatti szubsztrátkoncentrációt alkalmazunk, de lehetséges a szubsztrátkoncentráció növelése is a reakciószubsztrátum oldatához adagolt előbb említett oldószerektől, felületaktív szerektől és más anyagoktól függően. A szubsztráturpok a reakcióelegyben a telített koncentráció fölötti mennyiségben szuszpendált állapotban is lehetnek, melyben az illető szubsztrátumok a reakció előrehaladásával oldódnak. A szubsztrátumok reakció közben folytonosan is adagolhatok a reakcióelegyhez, hogy ezek koncentrációját megfelelő szinten tartsuk. Ha a szubsztrátum oldódik, akkor az 1,2,4-triazol-3-karboxamidra vagy sójára a szubsztrátkoncentráció általában mintegy 5-200 mmól, előnyösen 10-100 mmól. Ribóz donorra, ha külön adjuk a reakcióelegyhez, a koncentráció általában mintegy 5 — 300 mmól, előnyösen 10-150 mmól.

Áz alkalmazandó enzimforrás mennyiségét a szakember például előzetes kísérletekkel könnyen meg tudja határozni, figyelembe véve az alkalmazott enzimforrás formáját, a reakció hatékonyságát, valamint a gazdaságosságot. Ezek szerint, szakaszos rendszer esetén, például intakt (nedves) mikrobás sejtek alkalmazásánál a mennyiség 10-150 mg/ml szubsztrr‘oldatra, vagy száraz mikrobás sejtek esetén 2-30 mg/ml szubsztrátoldatra számítva. Folyamatos reakciórendszerben a megfelelő mennyiség a szakaszos rendszerhez hasonló lehet.

A reakció körülményei nem különösén korlátozottak, kivéve azt, hogy az enzimforrást a reakció nem szaporodó körülményei között alkalmazzuk, vagyis olyan feltételek mellett, ahol a mikrobás sejtek nem működnek vagy elpusztultak. ,

Ahhoz, hogyazenziinforrásná! a mikroorganizmus nem szaporodó körülményeit biztosítsuk, különböző módszereket alkalmazhatunk. Ilyenek például

- az enzimatikus reakciót olyan hőmérsékleten végezzük, amelyen az alkalmazott mikroorganizmus nem szaporodik (feltéve, hogy ezen a hőmérsékleten a reakcióban résztvevő enzim nem dezaktiválódik), vagy — .a mikroorganizmus sejteket az előzőekben leirt valamely fizikai, kémiai vagy biokémiai kezeléssel nem-szaporodóvá tesszük, vagy

- valamely, a szaporodást gátló anyag, például toluol adagolásával akadályozzuk meg a mikroorganizmusok szaporodását. Ezek a módszerek különkülön vagy egymással kombinálva is alkalmazhatók, de legelőnyösebb a reakcióhőmérscklet megfelelő beállítása.

A jelen találmány szerinti reakcióban a rcakcióhömérséklet fontos lényező, mint azt az előzőekben leírtuk. Bár a reakció 37 — 80 °C közötti hőmérsékleten végbemehet, azonban a 40- 70 °C közötti hőmérséklet különösen előnyös. Az optimális hőmérsékleti körülményeket, mely az alkalmazott rcakciószubsztrátumtól függően vállozik, egy szakember előzetes kísérletekkel vagy más módon, egyszerűen meg tudja határozni.

Az enzimatikus reakció 40 °C fölött történő lefolytatásával a mikroorganizmus szaporodása könnyen gátolható. Például l,2,4-triazol-3-karboxamidból a ribavirin kitermelése és a reakció után az alkalmazott mikroorganizmus százalékos túlélése közötti viszonyt - ha az I. példában használt azonos mikroorganizmus intakt sejtjeit alkalmazzuk, mint ahogy a későbbiekben leírjuk, és a reakciót 28 - 60 ’C között különböző hőmérsékleteken folytatjuk le — az alábbi 1.

táblázat mutatja. A mikroorganizmus túlélési százalékát a túlélő mikroorganizmus-populáció/ml reakció utáni százalékos értékében adjuk meg a reakció kezdete előtti értékre vonatkoztatva.

1. táblázat

Reakcióhőmérséklet

CC)

Ribavirin kitermelés (%)

A mikroorganizmus túlélési százaléka (%)

60 75,25	0
50	71,82	0
45	55,95	0,15
37	28,01	2,13
28	0	91,30

45____ ____:_________

Mint ahogy már leírtuk, a találmány szerinti reakciót az alkalmazott mikroorganizmus nem szaporodó körülményei között kell lefolytatni, mégpedig olyan

5θ körülmények között, ahol az alkalmazott mikroorganizmus sejtjeinek többsége nyugvó állapotban van, vagy elpusztult.

Továbbá, a jelen találmányban, a rcakcióhőmcrséklet előzőekben meghatározott tartományban való tartása nem csak a ribavirint termelő enzimatikus reakció sebességét növeli, hanem kísérletileg bizonyítva, a képződött ribavirin bomlási reakcióját is visszaszorítja. Példaként, a 2. táblázat a ribavirin maradék százalékát (%) mutatja, ha 1 ml 20 mmól ribavirint tartalmazó oldathoz az 1. példában alkalmazott mikroorganizmus intakt sejtjeinek 1 ml szuszpenzióját adjuk, és ezután 28-60 °C közötti hőmérsékleten 20 óra hosszat inkubáljuk.

-713

191 292

2. táblázat

Reakcióhőmérséklet (’C)	Maradék ribavirin (%)
60	100
50	100
45	100
37	92,80
28	90,14

Ezekből az eredményekből ipegállapítható, hogy ebben a megvalósítási formában a 45 °C, vagy ennél magasabb hőmérséklet az előnyös.

A reakciószubsztrál-oldat általában 4-10 közötti pH-η, előnyösen 6-8 pH-η tartható. Ha reakció közben a pH változik, akkor valamely sav, mint sósav, kénsav, vagy foszforsav, vagy valamely alkália, mint nátrium-hidroxid, kálium-hidroxid, vizes ammónia, vagy ammóniagáz alkalmazható az előnyös pH-tartomány beállítására.

Szakaszos rendszernél a reakcióidő, mely a kívánt termékre vonatkoztatva a reakciószubsztrátum átalakulásával határozható meg, általában 2 — 45 óra, előnyösen 24-36 óra. Folyamatos eljárásnál a reakció, a szakaszos rendszerhez hasonlóan, megfelelő körülmények beállításával folytatható le.

Az enzimforrás szokásos eljárásokkal történő elválasztása, mint szűrése, centrifugálása vagy agglomerációs leválasztása után, kívánt esetben, a reakcióterméket elválasztjuk és a ribavifjnt tisztítjuk.

A ribavirin elválasztása és tisztítása ismert módszerek szerint, vagy ezek módosításával folytatható le. Például, szokásos elválasztási/tisztítási módszerek alkalmazhatók, melyek önmagukban, vagy megfelelően kombinálva használhatók; ilyenek a különböző kromatográfiás eljárások, beleértve az ioncserélő kromatográfiát, adszorpciós kroma.tpgráfiát, eloszlásos kromatográfiát, gélszűrést és hasonlókat, a két folyadékfázis közötti eloszlást alkalmazó módszer, mint az ellenáramú eloszlás, ellenáramú extrakció és hasonlók, vagy betöményítéssel, hűtéssel, szerves oldószer hozzáadásával és hasonlóval elért oldhatósági különbséget hasznosító módszerek.

A jelen találmányban a ribavirin és az 1,2,4-triazol3-karboxamid analízisét és azonosítását nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) végezzük. Ha az analízist az alábbiakban megadott műszerrel és körülmények között végezzük, akkor a ribavirin 3,50 perc körüli retenciós idővel, míg az 1,2,4-triazol-3karboxamid 2,65 perc körüli retenciós idővel eluálható, és a megfelelő mennyiségek kalibrációs görbékből kiszámíthatók.

Műszer: Shimadzu High Performancc Liquid Chromatograph; Model LC - 3A (gyártja: Shimadzu Corporation).

Oszlop: Micro-BONDAPAK, C_Ig, 4,6x250 mm (gyártja: Nippon Waters Limited).

Eluálószer: 20 mmól trisz-spsav-pufler (pH = 7,5), 2 % acetonitrilt tartalmaz.

Átfolyási sebesség: I ml/perc.

Mérési hullámhossz: 225 nm.

Oszlop működési hőmérséklete: szobahőmérséklet. A jelen találmányt a következő példákkal részletesebben mutatjuk be.

1. példa

Brevibacterium acetylicum AT —6 —7 mikroorganizmust porított húsleves (gyártja: Kyokuto Seiyaku Kogyo Co., Ltd.) 5 liter 2 %-os vizes oldatába oltjuk, és a rázótenyésztést 28 °C hőmérsékleten 24 óra hoszszat végezzük.'

A tenyésztés befejezése után a tenyészetet centrifugáljuk, mossuk és sterilizált vizet adunk hozzá, hogy 250 ml sejtszuszpenziót kapjunk. 750 ml 66,7 mmól

1.2.4- triazo!-3-karboxainidot, 66,7 mmól inozint és 100 mmól monokálium-dihidrogén-foszfálot tartalmazó vizes oldathoz hozzáadjuk az előbbi 250 ml sejtszuszpenziót, és a reakciót 60 °C hőmérsékleten 24 óra alatt elvégezzük (ribavirin kitermelése: 74,88 %).

A ribavirin kitermelése az 1,2,4-triazol-3-karboxamid ribav'rinné történő konverziójára (%) vonatkozik.

A reakcióelegyet a mikrobás sejtek eltávolítására centrifugáljuk, majd kationcserélő gyantán (H ⁺ forma) átengedjük, az átfolyt oldatot és a mosóvizet egyesítjük, és aktív szénnel töltött oszlopon átfolyatjuk. Az aktív szénről a ribavirint etanol-ammónia oldattal eluáljuk, és az eluátumot, az etanol eltávolítása után, anioncserélő gyantán átengedjük. Az átfolyt oldatot cs a mosóvizet egyesítjük, csökkentett nyomáson 50 ml-re betöményítjük és lehűtjük. A lehűtött oldatból kristályos anyag válik ki, melyet szűrünk és szárítunk, így 6,5 g kristályos ribavirint kapunk, op-ja

169.5- 170 ’C.

A terméket az előzőekben leírtak szerint kromatografálva (HCLP), a kapott retenciós idő (3,5 perc) azonos a ribavirin standard retenciós idejével. Az NMR és ÍR vizsgálatok eredményei szintén megegyeznek a standard minták adataival.

Összehasonlító példák

Az 1. példa szerintivel azonos mikroorganizmustörzs alkalmazásával, ribavirin termelésére a kísérletet a kiindulási triazolvegyüíct hozzáadásával, a mikroorganizmus szaporodó körülmények között, a 17 830/ 1979. számú japán szabadalmi leírás f. példájában leírt eljárás szerint folytattuk le. Részletesen: a mikroorganizmus-törzset 10 ml táptalajba oltjuk (pH 7,6), melynek összetétele 530 g glükóz, 1 g monokáliumdihidrogén-foszfát, 3 g dikálium-monohidrogén-foszfát, 1 g magnézium-szulfát, 0,1 g kalcium-k’orid, 10 mg vas(Il)-szulfát, 5 mg cink-szulfát, 10 mg mangánszulfát, 5 mg B, vitamin, 10 mg kalcium-pantotenát, 20 mg cisztin, 30 pg biotin, 10 g húsextrakí, 2 g ammónium-szulfát és 2 g karbamid (külön sterilizálva) 1 literben, és a tenyésztést rázás közben 28 °C hőmérsékleten folytatjuk le, miközben a pH-t minden 12 órában vizes ammóniával 7,2 pH-ra állítjuk be. A tenyésztés kezdete után 24 órával a tenyészethez 2 mg/ml koncentrációban 1,2,4-triazol-3-karboxami-815

191 292 dót adunk, és a tenyésztést még 4 napig folytatjuk. A tenyészközeget centrifugáljuk, és a felső folyadékfázist analizáljuk, mellyel ribavirin képződése egyáltalán nem mutatható ki.

2. példa

Az I. példa szerintivel azonos mikroorganizmustörzset az I. példához hasonlóan tenyésztjük (de mindegyik tenyészközeg 10 ml), majd ezután a tenyésztett sejteket centrifugáljuk, és mindegyikhez 1 ml steril vizet adunk, hogy sejtszuszpenziót készítsünk.

Mindegyik szuszpenzióhoz 1 ml vizes oldatot adunk (pH = 7,0), mely 20 mmól l,2,4-trjazol-3karboxamidot, az alábbi táblázatban felsorolt 20 mmól különböző ribóz donor egyiket és 25 mmól monokálium-dihidrogén-foszfatot tartalmaz. A reakciót 60 ’C hőmérsékleten 24 óra alatt folytatjuk le. A reakció befejezése után a sejteket centrifugálással eltávolítjuk és a felső folyadékfázist analizáljuk. Ribavirin kitermelésére a kapott eredményeket a 3. táblázat mutatja. A ribavirin fizikai adatai azoposak az 1. példánál megadottakkal.

majd a kapott elegyet 15 perc állás után centrifugáljuk. A centrifugált sejtekhez 50 ml acetont adunk és ezt a kezelést azonos módon megismételjük, majd vákuumban szárítjuk. A száraz mikrobás sejt-termékhez annyi vizet adunk, hogy 10 ml kezelt mikrobás sejtszuszpenziót kapjunk.

2. Fagyasztás-olvasztás

Intakt mikrobás sejteket egy éjjelen át -80 ’C hőmérsékleten fagyasztjuk, majd másnap felmelegedni hagyjuk, és az olvadt termékhez annyi vizet adunk, hogy 10 ml kezelt mikrobás sejtszuszpenziót kapjunk.

3. Ozmotikus kezdés

Intakt mikrobás sejtekhez 100 ml telített vizes nátrium-klorid oldatot adunk, és az elegyet egy éjjelen át jéghüléssel állni hagyjuk, majd másnap centrifugáljuk. A felső folyadékfázist döntjük, és az elválasztott mikrobás sejtekhez annyi vizet adunk, hogy 10 ml kezelt mikrobás sejtszuszpenziót kapjunk.

3. táblázat

Ribóz donor	Ribavirin kitermelés (%)
mozin
75,66
5'-inozinsav	73,23
adenozin	59,30
5'-adeniIsav	70,82
guanozin	76,15
5'-guanilsav	67,12
citidin	88,60
5'-citídiIsav	77,83
uridin	85,19
5'-uridilsav	83,93
ribóz	29,02
ribóz-1-foszfát	30,84

3. példa

100-100 ml 2 %-os húsleves tápközeget az 1. példa szerinti mikroorganizmus-törzzsel beoltunk, majd rázással 28 ’C hőmérsékleten 22 óra hosszat tenyésztjük, hogy mindegyikből mikrobás sejtek tenyészetét kapjuk, amelyeket centrifugálunk, az intakt sejteket elválasztjuk és ezután, a megfelelő módosított sejtek szuszpenziójának előállításához, mindegyiket a következők szerint kezeljük.

7. Aceton hozzáadás-szárítás Intakt mikrobás sejtekhez 50 ml acetont adunk,

4. Ultrahangos kezelés

Intakt mikrobás sejteket víz hozzáadásával 10 mire beállítjuk, és 20 percig 1,6 KV kapocsfeszültségen ultrahanggal kezeljük.

Az előzőek szerint kezelt mikrobás sejtek mindegyik 10 ml-es szuszpenziójához, és az 1. példa eljárásával azonos módon kapott nem kezelt mikrobás sejtek 10 ml-es szuszpenziójához 10-10 ml rcakciószubsztrát-oldatot (pH = 7,0), melyek mindegyike 20 mmól l,2,4-triazol-3-karboxamidot, 20 mmól inozint és 25 mmól monokálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz. A reakciót 24 óra alatt 60 ’C hőmérsékleten folytatjuk le. A ribavirin analízisével kapott eredményeket a 4. táblázat mutatja. A fizikai állandók azonosak az 1. példánál megadottakkal.

4. táblázat

Enzimforrás, sejtek kezelése	Ribavirin kitermelése (%)
aceton hozzáadás-szárítás	72,31
fagyasztó-olvasztó kezelés	73,89
ozmotikus kezelés	71,50
ultrahangos kezelés	70,11
nem kezelt	68,12

4. példa

Az 1. példa szerinti mikroorganizmus-törzset 25 ml 2 %-os húsleves táptalajba oltjuk, és rázással 28 ’C

-917

191 292 hőmérsékleten 24 óra hosszat tenyésztjük. A tenyésztés után a sejteket elkülönítjük, és annyi vizet adunk hozzá, hogy 2,5 ml-es sejtszuszpenziókat kapjunk. Mindegyik 2,5 ml-es sejtszuszpenzióhoz 2,5 ml 3. példa szerinti reakciószubsztrát-oldatot adunk, és a tenyésztést 20 óra alatt különböző hőmérsékleten (5. táblázat) folytatjuk le. Analízis szerint, a ribavirin kitermelését az 5. táblázat mutatja. A fizikai adatok azonosak az 1. példánál megadottakkal.

elválasztjuk. Az elválasztott sejtekhez 10 ml vizet adunk, és a kapott eíegyet használjuk a következő reakcióhoz. Eképpen, az előbbi reakciót azonos módon tízszer megismételjük. Az első reakció kitermelését 100-nak véve, az illető reakció ehhez viszonyított ribavirin kitermelését a 7. táblázat mutatja.

7. táblázat

5. táblázat

Ribavirin

Reakcióhőmérséklet (’C)	Ribavirin kitermelése (%)	15	Reakció ismétlése	relatív kitermelése
1	100,00
			2	96,33
28	6,1	20	4	/'94,37
37	27,3		6	88,10
45	48.0		8	88,02
50	59,6		10	88,00
55	71,4
60	81,1
65	82,8	zb
70	33,8		7. példa
			1 liter 2 %-os húsleves tápközeget az 1	. példa szerin-

5. példa

Az 1. példa szerinti mikroorganizmus-törzs alkalmazásával a 4. példában megadott módon 2,5 ml-es sejtszuszpenziókat készítünk. Mindegyik szuszpenzióhoz 2,5 — 2,5 ml alábbi (A) vagy (B) rcakciószubszlrát-oldatol adunk, és a reakciót 20 óra alatt 60 ’C hőmérsékleten folytatjuk le. Analízis szerint, a ribavirin kitermelését a 6. táblázat mutatja. A fizikai adatok azonosak az 1. példánál megadottakkal.

(A) rcakciószubsztrát-oldat: 20 mmól 1,2,4-triazoI3-karbaxamid és 20 mmól inozin;

(B) reakciószubsztrát-oldat: az előbbi (A) reakciószubsztrátumot azonos mennyiségeihez 25 ml monokálium-dihidrogén-foszfátot adunk.

6. táblázat

Reakciószubsztrát-oldat

Ribavirin kitermelés (%) (A) 69,00 (B) 72,76 ti mikroorganizmus-törzzsel beoltjuk, és rázással 22 óra hosszat 30 ’C hőmérsékleten tenyésztjük, majd a tenyésztett terméket centrifugáljuk. Ilyen módon intakt mikrobás sejteket kapunk.

A mikrobás sejtekhez 20 ml A folyadékot [24 ml 1 ₃₅ N sósav, 3.425 g triszés 0,23 ml TEMED (Ν,Ν,Ν',Ν'letrainetil-etilén-diamin) oldásával és vízzel és 100 ml-re való hígításával készítjük], 20 ml B folyadékot [vizes oldat, 30 g akrilamid és 0,8 g BIS [N,N-metilénbisz(akrilamid)] oldásával és vízzel 100 ml-re való hígításával készítjük], és 40 inl C folyadékot (vizes oldat, 0,3 g ammónium-perszulfát oldásával és vízzel 200 ml-re való hígításával készítjük) adunk, és az eíegyet a sejtek rögzítésére állni hagyjuk. A rögzítés után, a terméket homogenizátor segítségével eloszlatjuk, így 180 ml rögzített mikrobás sejteket kapunk.

⁵ 10 ml rögzített mikrobás sejtekhez 20 ml reakciószubsztrát-oldatot (pH ==7,0) adunk, mely 20 minői 1,2,4-triazol-3-karboxamidot, 20 mmól inozint és 25 inniól monokálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz, és a reakciót 24 óra alatt 60 ’C hőmérsékleten lefolytatjuk. A reakcióelegy elemzése 62,89 % ribavirinképződést mutat. Ha a reakciót azonos körülmények között intakt mikrobás sejtek alkalmazásával folytatjuk le, akkor a ribavirin kitermelése 65,48 %. A fizikai adatok azonosak az 1. példánál megadottakkal.

8. példa

6. példa

Az 5. példa szerinti 2,5 ml mjkrobás sejtszuszpenzióhoz az 5. példa szerinti 2,5 ml (B) reakciószubsztrát-oldatot adunk és a reakciót 20 óra alatt 60 ’C hőmérsékleten lefolytatjuk, majd a mikrobás sejteket θθ A 8. táblázatban megadott mikroorganizmustörzsek mindegyikét az 1. példa szerinti 50-50 ml húsleves táptalajba oltjuk, és rázással 24 óra hosszat 28 ’C hőmérsékleten tenyésztjük, majd a sejteket centrifugáljuk, és ezután a sejtekhez sterilizált vizet g5 adunk, hogy 5 ml-es sejtszuszpenziókat kapjunk.

-1019

191 292

Mindegyik 5 ml-es mikrobás sejtszuszpenziós £· ml vizes oldatot (pH = 7,0) adunk, mely 20 mmól 1,2,4triazol-3-karboxamidot, 20 mmól inozint és 25 mmól monokálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz, és a reakciót 24 óra alatt 60 ’C hőmérsékleten lefolytatjuk. A reakció befejezése után a ribavirin kitermelését analízissel meghatározzuk. Az eredményeket a 8. táblázat mutatja. A kapott termék fizikai állandói mindegyik esetben megegyeznek az I. példában megadottakkal.

8. táblázat

Mikroorganizmus-tőrzs	Ribavirin kitermelés (%)
Brevibacterium imperiale ATCC 8365 Corynebacterium equi IÁM 1038 Bacillus subtilis ATCC 14 593 Micrococcus variáns IFO 3763 Arthrobacter citreus IFO 12 957 Arthrobacter globiformis IFO 12 137 Micrococcus luteus ATCC 4698 Micrococcus roseus IFO 3768 Bacillus cereus IÁM 1029	21.55 35.17 10,64 26.56 11,97 8,32 21,77 11.18 3,30
9. példa
A 9. táblázatban megadott mikroorganizmustörzsek mindegyikét porított húsleves 50-50 ml vizes oldatába oltjuk, és 24 óra hosszat 28 ’C hőmérsékleten végzett rázótenyésztés után a sejteket centrifugáljuk. A sejtekhez sterilizált vizet adunk, hogy 5 ml-es sejtszuszpenziókat kapjunk. Ezen 5 ml-es sejtszuszpenziók mindegyikéhez 5-5 ml vizes oldatot (pH = 7,0) adunk, mely 20 mmól 1,2,4-triazol-3-karboxamidot, 20 mmól inozint és 25 mmól monokálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz, és a reakciót 20 óra alatt 60 ’C hőmérsékleten lefolytatjuk. A reakció befejezése után a sejteket centrifugáljuk, és a ribavirin kitermelését analízissel meghatározzuk. Az eredményeket a 9. táblázat mutatja. A kapott termék fizikai állandói mindegyik esetben meg egyeznek az I. példában megadottakkal.
9. táblázat
Mikroorganizmustörzsek	Ribavirin kitermelés (%)
Flavobacteriuin arborescence IFO 3750 Flavobacterium lutescens IFO 3084 Flavobacterium lutescens IFO 3085 Microbacterium thermosphacturo IFO 12 167	25,54 76,26 7,45 9,00

20 9. táblázat folytatása
Mikroorganizmustőrzsek	Ribavirin kitermelés (%)
Xanthomonas oryzae IFO 3312	69,25
Alteromonas putrefaceiens ATCC
3071	11,68
Alteromonas putrefaceiens ATCC
3072	47,35
Mtcromonas putrefaceiens ATCC
3073	21,14
Pseudomonas schuytkilliensis IÁM
1051	10,50
Pseudomonas ovális IÁM 1022	11,11
Pseudomonas dacunhae IÁM 1089	7,98
Achromobacter pnrvulus IFO 13 182	27,84
\chromobacter xerosis IFO 12 668	51,84
Escherichia coli IFO 3301	7,37
Escherichia coli 1AM 1268	61,47
Aerobacter aerogenes 1AM 1019
(FERM P —6538)	12,18
Staphylococcus aureus 1AM 1011	18,61
Staphylococcus aureus IFO 3060	18,25
Sarcina marginata IÁM 1130 (FERM
P — 6539)	14,04
Bacterium suceinicum IÁM 1017
(FERM P-6540)	16,74
Serratia marcescens IÁM 1105	8,32
Proteus vulgáris IÁM 1025	11,88
Ccllulomonas flavigena IFO 3753	12,75
Cellulomonas flavigena IFO 12 680	22,10
Enterobacter aerogenes IFO 12 010	10,53
Enterobacter cloacae ATCC 7256	12,18
Mycoplana bullata IFO 13 290	10,38
Vibrio anguillarum IFO 13 266	12,71
Erwinia carotovora subsp. carotovo-
ra IFO 12 280	11,98
Klebsiella pneumoniae ATCC 8308	9,39
Aeromonas hydrophila subsp. ánae-
rogenes IFO 13 282	16,16
Mycotorula japonica OUT 6226	33,37
Candida polymorpha IFO 0836
(FERM P —6541)	23,15

10. példa

Pseudomonas putrefacciens ATCC 8072 törzset a 9. példa szerint tenyésztjük (de mindegyik táptalaj 10 ml), tenyésztés után a sejteket centrifugáljuk, és mindegyikhez 1 ml sterilizált víz hozzáadásával sejtszuszpenziókat készítünk.

Mindegyik sejtszuszpcnzióhoz 1-1 ml vizes oldatot (pH = 7,0) adunk, mely 20 mmól l,2,4-triazol-3karboxamidot, 20 ml 10. táblázatban megadott különböző ribóz donort és 25 mmól monokálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz, és a reakciót 20 óra alatt 60 ’C hőmérsékleten lefolytatjuk. A reakció befejezése után a mikrobás sejteket centrifugálással eltávolítjuk, és a felső folyadékfázist analizáljuk. Ribavirin kiter11

-1121

191 292 melésére az eredményeket a 10. táblázat mutatja. A fizikai állandók megegyeznek az I. példánál megadottakkal.

10. táblázat

Ribóz donor	Ribavirin kitermelése (%)
inozin	49,16
5'inozinsav	39,06
adenozin	34,65
5'-adenilsav	30,80
guanozin	54,70
5'-guanilsav	46,94
citidin	62,77
S'-citidilsav	62,00
uridin	72,20
5'uridilsav	73,42
ribóz	44,05

ll. példa

A reakciót a 10. példa eljárása szerint folytatjuk le azzal a különbséggel, hogy Staphylococcus aurcus IÁM 1011 és Flavobacterium arborescens IFO 3750 törzseket, és nukleotidokként all. táblázatban megadott ribóz donorokat használunk. Az eredményeket
all. táblázat 1. példánál m	mutatja. A fizikai állandók azonosak az egadottakkal.
	ll. táblázat
. ’ 1	Ribavirin kitermelés (%)
Ribóz donor	Sta. aurcus IÁM 1011	F. arborescens IFO 3750
5'-inozinsav	23,50	15,99
5'-adenilsav	14,85	13,85
5'-guanilsav	22,50	10,69
5'-citidilsav	10,60	14,79
5'-uridilsav	18,29	18,74

12. példa

Flavobacterium lutescens IFO 3084 törzset 2 liter porított húsleves 2 %-os vizes oldatába oltjuk, és a tenyésztést rázással 22 óra alatt 28 °C hőmérsékleten lefolytatjuk.

A tenyésztés befejezése után a sejteket elkülönítjük, és mossuk, majd sterilizált vizet adunk hozzá, hogy 200 ml sejtszuszpenziót kapjunk.

Ehhez a sejtszuszpenzióhoz 800 ml vizes oldatot adunk, mely 50 mmól l,2,4-triazol-3-karboxamidot, 75 mmól inozint és 50 mmól monokálium-dihidrogénfoszfátot tartalmaz, cs a reakciót 24 óra alatt 60 ’C hőmérsékleten lefolytatjuk. A ribavirin kitermelése

72,55 %,

A reakció befejezése után a sejteket centrifugálással eltávolítjuk, a felső folyadekfázist csökkentett nyomáson 250 ml térfogatra bctöinényítjük és lehűtjük. A képződött hipoxantin és inozin eltávolítása után a maradék elegyet kationcserélő gyantán (H⁺ forma) átengedjük, majd az áteresztett oldatot és a mosóvizet aktív szénen átfolyatjuk. Az aktív szénről a ribavirint etanol-ammónia oldattal eluáljuk. Az eluátumból az etanol eltávolítása után, a maradékot anioncserélő gyantával töltött oszlopon átengedjük, majd az átfolyt oldatot cs a mosóvizet egyesítjük, csökkentett nyomáson 25 ml térfogatra betőmenyíljük és lehűtjük. A hűtésre kivált kristályos anyagot elválasztjuk, szárítjuk, így 6,6, g kristályos ribavirint kapunk, amelynek fizikai állandói azonosak az 1. példánál megadottakkal.

13. példa

A 12. táblázatban megadott különböző mikroorganizmus-törzsek mindegyikét 10Ó-IÖ0 ml porított húsleves 2 %-os vizes oldatába oltjuk, és rázással 22 óra hosszat 30 ’C hőmérsékleten tenyésztjük, majd a sejteket elkülönítjük, cs a megfelelő sejtekhez annyi vizet adunk, hogy mindegyikből 10 ml-es sejiszuszpenziókat kapjunk.

Az előbbi sejtszuszpenziók mindegyikéhez 10-10 mi vizes oldatot (pH = 7,0) adunk, mely 20 mmól 1,2,4triazol-3-karboxamidot, 30 mmól nátrium-uridilátot és 25 mmól monokáhiim-dihidrogén-fosznítot tártál máz, cs a reakciót 23 óra alatt 45 °C hőmérsékleten lefolytatjuk. A reakció befejezése után a sejteket centrifugálással eltávolítjuk, és a ribavirin kitermelését analízissel meghatározzuk. Az eredményeket a 12. táblázat mutatja. A fizikai állandók értéke azonos az

1. példánál megadottakkal.

12. táblázat

M ikroorganizmustörzsek	Ribavirin kitermelés (%)
Flavobacterium arborescence IFO
3750	26,98
Alteromonas putrefacicns ATCC
8072	44,40
Alteromonas putrefaciens ATCC
8073	18.62
Escherichia coli IÁM 1268	10,63
Staphylococcus aurcus 1ΛΜ 1011	20,33
Staphylococcus aurcus IFO 3060	27,75
Cellulomonas fiavigena IFO 12 6S0	67,65

-1223

12. táblázat folytatása

Ribavirin

Mikroorganizmustörzsek kitermelés (%)

Enterobacter aerogenes IFO 12 010 14,34

Enterobacter cloacae ATCC 7256 10,42

Vibrio anguillarum IFO 13 266 19,76

Erwinia carotovora subsp.

carotovora IFO 12 380 41,99

Klebsiella pneumoniae ATCC 8308 9,69

14. példa

A 13. táblázatban megadott mikroorganizmustörzsek mindegyikét 50-50 ml porított húsleves 2 %-os vizes oldatába oltjuk, ée rázással 24 óra hosszat 28 °C hőmérsékleten tenyésztjük, majd a sejteket eltávolítjuk, és mindegyik sejthez annyi vizet adunk, hogy mindegyikből 5 ml-es sejtszuszpenziót kapjunk.

Az előbbi 5 ml-es sejtszuszpenziók mindegyikéhez 10-10 ml vizes oldatot (pH = 7,0) adunk, mely 20 mmól 1,2,4-triazo!-3-karboxamidot és 25 mmól monokálium dihidrogén-foszfátot tartalmaz, és a reakciót 24 óra alatt 45 C hőmérsékleten lefolytatjuk. A reakció befejezése után a sejteket centrífugálással eltávolítjuk, és a ribavirin kitermelését analízissel meghatározzuk. Az eredményeket a 13. táblázat mutatja. A fizikai állandók azonosak az 1. példánál megadott értékkel.

13. táblázat
	Mikroorganizmus-törzs	Ribavirin . kitermelés (%)

Brevibacterium acetylicum

AT -- 6 - 7 FERM P - 6305 (ATTC

311) 24,52

Brevibacterium imperiale ATCC 8365 2,00

Corynebacterium equi IÁM 1038 10,40

Bacillus subtilis ATCC 14 593 2,25

Micrococcus variáns IFO 3765 1,83

15. pclda liter 1,5 %-os élesztőextrakt táptalajba (pH-7,5) 250 ml Brevibacterium acetylicum AT — 6 - 7 (FERM P-6305, ATCC 39 311) előtenyészetét oltjuk és a tenyésztést 24 óra alatt 28 °C hőmérsékleten lefolytatjuk. A táptalajból a mikrobás sejteket centrífugálással eltávolítjuk és 500 ml sejtszuszpenzióra beállítjuk.

500 ml vizes oldathoz (pH = 7,0), mely 20 mmól

1.2,4~triazol-3-karboxamidot és 25 ml mmól monokáliun.-dihidrogén-foszfátot tartalmaz, 500 ml előbbi sejtszuszpenziót hozzáadjuk és a reakciót 24 óra alatt 45 ’C hőmérsékleten lefolytatjuk. A rcakcióclcgybcn a ribavirin kitermelése 24,38 %.

A mikrobás sejtek eltávolítása után az oldatot az át nem alakult l,2,4-triazo!-3-karboxamid eltávolítására, kationcserélő gyantával (H ' forma) kezeljük, rr.ajd a ribavirin! a kezelt oldatból aktív szénen adszorbeáljuk. A ribavirint ezután 2 % ammóniát tartalmazó 50 %-os etil-alkohol oldattal eluáljuk, az etanolt ledesztilláljuk, és a visszamaradt oldatot anioncserélő gyantán (bázis forma) átengedjük. Az átfolyt oldatot betöményítjük, így 475 mg kristályos ribavirint kapunk, amelynek fizikai állandói azonosak az 1. példában megadottakkal.

Claims (10)

1. Eljárás ribavirin előállítására, amelynél 1,2.,4-triazoI-3-karboxamidot vagy sóját és ribóz donort cnzimforrással érintkeztetünk, amely olyan enzimet tartalmaz, amely l,2,4-triazol-3-karboxamidból és ribóz donorból a ribavirin képződést katalizálja, azzal jellemezve, hogy enzimforrásként a ribóz donor és 1,2,4triazol-3-karboxamid reakciójának katalizálására vizes közegben Brevibacterium, Cornynebacterium, Arthrobacter, Micrococcus vagy Bacillus nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok tenyészetét, intakt sejtjeit vagy módosított sejtjeit alkalmazzuk a mikroorganizmusok nem szaporodó körülményei között és a képződött ribavirint a reakcióközegből kinyerjük, (Elsőbbsége: 1982. április 30.)

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ribóz donorként ribonukleozidokat, D-ribózt vagy ezek foszforsav-észterét alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1982. április 30.)

3. Az igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Brevibacterium acetylicum AT —6 —7 (ATCC 39 311) mikroorganizmus iörzset alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1982. április 30.)

4. Eljárás ribavirin előállítására, amelynél 1,2,4-triazol-3-karboxamidot vagy sóját és ribóz donort enzimforrással érintkeztetünk, amely olyan enzimet tartalmaz, amely az l,2,4-triazol-3-karboxamidból és a ribóz donorból a ribavirin képződését katalizálja, azzal jellemezve, hogy enzimforrásként a ribóz donor és ,z l,2,4-triazol-3-karboxamid reakciójának katalizálására vizes közegben Flavobacterium, Microbacterium (Brochotrix), Xanthomonas, Pseudomonas (Alteromonas), Achromobacter, Escherichia, Aerobacter, Sarcina, Staphylococcus, Bacterium, Scrratia, Protens, Cellulomonas, Enterobacter, Mycoplana, Vibrio, Erwinia, Klebsiella, Aeromonas, Mycotorula vagy Candida nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok tenyészetét, intakt sejtjeit vagy módosított sejtjeit alkalmazzuk a mikroorganizmusok nem-szaporodó körülményei között és a képződött ribavirint a reakcióközcgböl kinyerjük.

(Elsőbbsége: 1982. június 11.)

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,

-1325

191 292 hogy a ribóz donort külön adagoljuk az enzimatikus rendszerhez.

(Elsőbbsége: 1982. június 11.)

6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ribóz donort vagy ribóz donor termelésére képes metabolizmust tartalmazó enzimforrást alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1982. június 11.)

7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ribóz donorként ribonukleozidokat, D-ribózt vagy ezek foszforsav-észtereit alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1982. június 11.)

8. A 4 - 7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy FlaVobacterium hitesccns (ATCC 25 311), Xanlhomonas oryzac (IFO 3312), Alteromonas putrefaceicns (ATCC 8072), Aclirotnobacter xerosis (IFO 12 668), Escherichia coli (ATCC 11 303) vagy Cellulomonas (lavigena (ATCC 486) mikroorganizmus törzset alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1982. június 11.)

9. Eljárás ribavirin előállítására, amelynél 1,2,4-t ri azol-3-karboxamidot vagy sóját olyan enzimrendszerrel érintkeztetünk, amely olyan enzimet tartalmaz, amely l,2,4-triazol-3karboxamidból cs ribóz donorból a ribavirin képzőg dését katalizálja, és ribóz donort tartalmaz, azzal jellemezve, hogy enzimforrásként a ribóz donor és l,2,4-triazol-3-karboxamid reakciójának kataIizálására vizes közegben Hrcvibactcrium, Coryncbacterium, Arthrobacter, Micrococcus vagy bacillus nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok tenyészetét, intakt sejtjeit vagy módosított sejtjeit alkalmazzuk a mikroorganizmusok nem szaporodó körülményei között és a képződött ribavirint a reakciókö15 zegből kinyerjük.

(Elsőbbsége: 1982. július 5.)

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Brevibaetcrium acetyíicúm AT-6-7 (ATCC 39 311) mikroorganizmus

2Q törzset alkalmazunk.