CN115896215A - 阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物 - Google Patents

阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物。其中，阿糖类核苷一锅法生物合成的方法包括：底物、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶，共同混合后进行生物合成，一锅法直接制备获得阿糖类核苷。尿嘧啶核苷磷酸化酶包括SEQ ID NO：1所示的UP；嘧啶核苷磷酸化酶包括SEQ ID NO：2所示的PyNP；嘌呤核苷磷酸化酶包括SEQ ID NO：3所示的PNP；底物包括阿糖尿苷和底物碱基。能够解决现有技术中生物合成两步法制备阿糖类核苷操作复杂的问题，适用于酶催化领域。

Description

阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物
技术领域
本发明涉及酶催化领域，具体而言，涉及一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物。
背景技术
阿糖类核苷是将脱氧核糖替换为阿拉伯糖的核苷，在被掺入DNA后可阻止DNA的复制进而影响细胞的分裂和增殖，因而可作为抗病毒和抗肿瘤类药物用于相关疾病的治疗，如疱疹，肿瘤、艾滋病、乙肝等。目前，阿糖核苷类主要以化学法(CN1042939C，CN107556356A,CN1128270A,CN103467468A，CN107892707A)和生物法合成(CN106929553A，JPH10286097A，CN105237602A)。其中，化学合成工艺过程复杂，成本较高，且反应条件苛刻，需使用重金属，有机溶剂等，会对人员健康造成危害并对引起环境污染等问题。而生物法是利用微生物表达的酶作为催化剂，在温和条件下即可将底物转化为相关产品，操作步骤简单，且反应条件则相对温和，不需要使用重金属和有机试剂等对人体和环境有害的物质。
专利CN106929553A公开了一种两步法合成阿糖腺苷的方法，可通过使用尿苷磷酸化酶将阿糖尿苷转化为阿糖-1-磷酸，经分离后再利用腺嘌呤核苷磷酸化酶将其和腺嘌呤合成阿糖腺苷，其转化率达90％以上。魏晓琨等人发表了一种两步法合成阿糖鸟苷的方法，首先利用可表达嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)将阿糖尿苷和2,6-二氨基嘌呤合成2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷，然后利用来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的腺苷脱氨酶将2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷脱去氨基进一步生成阿糖鸟苷，当底物浓度低于10mM时，2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷转化率为80％；但底物浓度高于10mM时，2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷的转化率则显著降低至50％以下。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物，以解决现有技术中生物合成两步法制备阿糖类核苷操作复杂的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法，该方法包括：底物、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶，共同混合后进行生物合成，一锅法直接制备获得阿糖类核苷；其中，尿嘧啶核苷磷酸化酶包括UP、或与UP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，UP为SEQ IDNO：1所示的蛋白质；嘧啶核苷磷酸化酶包括PyNP、或与PyNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，PyNP为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；嘌呤核苷磷酸化酶包括PNP、或与PNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，PNP为SEQ ID NO：3所示的蛋白质；底物包括阿糖尿苷、底物碱基和底物磷酸盐。
进一步地，方法包括：阿糖尿苷和底物磷酸盐在尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶的催化下，生成阿拉伯糖-1-磷酸和游离碱基；阿拉伯糖-1-磷酸在嘌呤核苷磷酸化酶的催化下，底物碱基取代磷酸基团，获得阿糖类核苷。
进一步地，底物碱基为式I所示的碱基，R1选自-NH2、＝O、-OMe或-Cl，R2选自-H、-NH2、-Cl或-F；优选地，底物碱基包括2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氯腺嘌呤或2-氟腺嘌呤；
Figure BDA0003902966500000021
进一步地，嘌呤核苷磷酸化酶、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。
进一步地，一锅法生物合成的催化时间为4～20h；优选地，一锅法生物合成的催化温度为50～80℃，更优选为60～70℃；优选地，阿糖尿苷的浓度为2～320mM，底物碱基的浓度为1～200mM，底物磷酸盐的浓度为1～100mM。
进一步地，阿糖类核苷包括2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、奈拉滨、2-氯腺嘌呤阿拉伯糖苷或氟达拉滨；底物磷酸盐包括磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或多种，或磷酸缓冲液，或磷酸盐缓冲液。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种组合物，该组合物包括尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶；尿嘧啶核苷磷酸化酶包括UP、或与UP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，UP为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；嘧啶核苷磷酸化酶包括PyNP、或与PyNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，PyNP为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；嘌呤核苷磷酸化酶包括PNP、或与PNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，PNP为SEQ ID NO：3所示的蛋白质；
进一步地，嘌呤核苷磷酸化酶、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。
进一步地，组合物还包括阿糖尿苷、底物碱基和底物磷酸盐；优选地，底物磷酸盐包括磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或多种，或磷酸缓冲液，或磷酸盐缓冲液。
进一步地，底物碱基为式I所示的碱基，R1选自-NH2、＝O、-OMe或-Cl，R2选自-H、-NH2、-Cl或-F；优选地，底物碱基包括2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氯腺嘌呤或2-氟腺嘌呤；优选地，阿糖尿苷的浓度为2～320mM，底物碱基的浓度为1～200mM，底物磷酸盐的浓度为1～100mM；
Figure BDA0003902966500000031
应用本发明的技术方案，利用嘌呤核苷磷酸化酶、以及嘧啶核苷磷酸化酶或尿嘧啶核苷磷酸化酶，能够以阿糖尿苷和底物碱基为底物，一锅法生物合成制备目标产物阿糖类核苷，无需进行中途补料或中间产物纯化再投料等操作，相较于两步法制备，操作更简单，利用工业化放大生产。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例2的以阿糖尿苷和2,6-氨基嘌呤为底物合成2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷的HPLC图谱。
图2示出了根据本发明实施例3的以阿糖尿苷和2,6-氨基嘌呤为底物放大合成2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷的HPLC图谱。
图3示出了根据本发明实施例4的以阿糖尿苷和2-氨基-6-甲氧基嘌呤为底物合成奈拉滨的HPLC图谱。
图4示出了根据本发明实施例5的以阿糖尿苷和2-氨基-6-甲氧基嘌呤为底物放大合成奈拉滨的HPLC图谱。
图5示出了根据本发明实施例6的以阿糖尿苷和2-氯腺嘌呤为底物合成2-氯腺嘌呤阿拉伯糖苷的HPLC图谱。
图6示出了根据本发明实施例7的以阿糖尿苷和2-氟腺嘌呤为底物合成氟达拉滨的HPLC图谱。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有技术中生物合成阿糖腺苷多采用两步法，操作繁琐，所需时间长，不利于实现工业化的大量生产。因而，在本申请中发明人尝试探究一种一锅法生物合成制备阿糖类核苷的方法，因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法，该方法包括：底物、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶，共同混合后进行生物合成，一锅法直接制备获得阿糖类核苷；其中，尿嘧啶核苷磷酸化酶包括UP、或与UP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，UP为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；嘧啶核苷磷酸化酶包括PyNP、或与PyNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，PyNP为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；嘌呤核苷磷酸化酶包括PNP、或与PNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，PNP为SEQ ID NO：3所示的蛋白质；底物包括阿糖尿苷和底物碱基；底物还可包括底物磷酸盐，用于提供反应所需的磷酸基团；阿糖类核苷为由阿拉伯糖结构和碱基结构组合的核苷。
本申请中所使用尿嘧啶核苷磷酸化酶来源于克氏锥虫Trypanosoma cruzi，为SEQID NO：1所示的蛋白质，命名为UP。嘧啶核苷磷酸化酶来源于嗜热栖热菌Thermusthermophiles，为SEQ ID NO：2所示的蛋白质，命名为PyNP。嘌呤核苷磷酸化酶来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus，为SEQ ID NO：3所示的蛋白质，命名为PNP。利用嘌呤核苷磷酸化酶以及如下任一种酶：尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶，能够以阿糖尿苷和底物碱基为底物，通过一锅法进行生物合成，无需对中间产物进行纯化后再进行转化，能够直接获得目标产物阿糖类核苷。上述尿嘧啶核苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶或嘌呤核苷磷酸化酶，均分别包括与UP、PyNP或PNP具有80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％以上同源性且具有相同功能(即相同催化功能)的蛋白质。
如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)，丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
取代、替换等规则，一般情况下，哪些氨基酸性质类似，替换后的效果也类似。例如，在上述同源蛋白中，可发生保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”包括但不限于：
疏水性氨基酸(Ala、Cys、Gly、Pro、Met、Val、Ile、Leu)被其他疏水性氨基酸取代；
侧链粗大的疏水性氨基酸(Phe、Tyr、Trp)被其他侧链粗大的疏水性氨基酸取代；
侧链带正电的氨基酸(Arg、His、Lys)被其他侧链带正电的氨基酸取代；
侧链有极性不带电的氨基酸(Ser、Thr、Asn、Gln)被其他侧链有极性不带电的氨基酸取代。
本领域技术人员也可以根据现有技术中的“blosum62评分矩阵”等本领域技术人员熟知的氨基酸替换规则对氨基酸进行保守替换。
在一种优选的实施例中，方法包括：阿糖尿苷和底物磷酸盐在嘧啶核苷磷酸化酶或尿嘧啶核苷磷酸化酶的催化下，生成阿拉伯糖-1-磷酸和游离碱基；阿拉伯糖-1-磷酸在嘌呤核苷磷酸化酶的催化下，底物碱基取代磷酸基团，获得阿糖类核苷。
上述方法的反应路线如下：
Figure BDA0003902966500000051
首先底物阿糖尿苷在尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶的催化下，来源于底物磷酸盐的磷酸基团取代阿糖尿苷的碱基部分连接在阿拉伯糖结构上，形成磷酸化阿拉伯糖和尿嘧啶(Uracil)。之后在嘌呤核苷磷酸化酶的催化下，底物碱基取代磷酸化阿拉伯糖上的磷酸基团，获得阿糖类核苷。
在现有技术中，通常使用两步法合成阿糖类核苷，影响一锅法的收率。而本申请中，从功能类似的酶中进行了筛选，获得上述酶的组合，利用上述酶的组合，能够在一锅法制备阿糖类核苷，从而提高底物的转化率和目标产物阿糖类核苷的产率。上述一锅法生物合成的方法，转化率与现有技术中的两步法相当，而反应操作更加简单，也无需对中间产物进行分离纯化，易于工业生产中大批量制备，能够降低反应所需的时间和成本。
在一种优选的实施例中，底物碱基为式I所示的碱基，R1选自-NH2、＝O、-OMe或-Cl，R2选自-H、-NH2、-Cl或-F；优选地，底物碱基包括2，6-二氨基嘌呤(即2-氨基腺嘌呤)、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氯腺嘌呤或2-氟腺嘌呤；
Figure BDA0003902966500000052
在一种优选的实施例中，嘌呤核苷磷酸化酶、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。
在催化反应中，上述3种酶可以为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶等多种形式存在，均能够催化合成含有保护基的核苷。将表达PyNP和/或UP和/或PNP的基因克隆在宿主细胞中，诱导蛋白表达后，破碎宿主细胞即能够获得含有目标蛋白的粗酶液。粗酶液的制备简单，且有良好的催化能力，且能够降低催化反应的生产成本。
在一种优选的实施例中，酶催化的催化时间为4～20h；优选地，酶催化的催化温度为50～80℃，更优选为60～70℃；优选地，阿糖尿苷的浓度为2～320mM，底物碱基的浓度为1～200mM，底物磷酸盐的浓度为1～100mM。底物磷酸盐不限定特定种类，包括但不限于现有技术中常用的磷酸盐，包括但不限于磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或多种，或是现有技术中常见的如市售的磷酸缓冲液(PB)、或磷酸盐缓冲液(PBS)等混合物。其中，磷酸缓冲液包括一定浓度的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲液。磷酸盐缓冲液包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、和氯化钠、氯化钾等盐组成的缓冲液。
上述方法，能够进行放大反应，在反应体系中，阿糖尿苷的浓度包括2mM、10mM、20mM、50mM、100mM、200mM，乃至能够达到320mM甚至更多，底物碱基的浓度包括1mM、2mM、10mM、20mM、50mM、100mM，乃至能够达到200mM甚至更多，从而进行大规模的阿糖类核苷的制备。
在上述适宜的催化温度和催化时间内，该酶催化反应即能够完成，且底物碱基的转化率，即反应收率较高。在反应中途也无需补加酶或其他试剂，也无需将中间产物进行分离纯化后，再进行后续催化。利用一锅法催化即能够完成反应，适宜在工业化放大生产上的应用。反应条件温和易控制，也能够降低生产的装置成本、能源成本及危险性。
在一种优选的实施例中，阿糖类核苷包括但不限于2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、奈拉滨(9-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤-2-胺)、2-氯腺嘌呤阿拉伯糖苷或氟达拉滨(9-β-D-阿拉伯呋喃糖-2-氟腺苷)。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包括尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶；尿嘧啶核苷磷酸化酶包括UP、或与UP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，UP为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；嘧啶核苷磷酸化酶包括PyNP、或与PyNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，PyNP为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；嘌呤核苷磷酸化酶包括PNP、或与PNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，PNP为SEQ ID NO：3所示的蛋白质。
在一种优选的实施例中，嘌呤核苷磷酸化酶、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。
在一种优选的实施例中，组合物还包括阿糖尿苷、底物碱基和底物磷酸盐。底物磷酸盐不限定特定种类，包括但不限于现有技术中常用的磷酸盐，包括但不限于磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或多种，或是现有技术中常见的如磷酸缓冲液中等混合物。
在一种优选的实施例中，底物碱基为式I所示的碱基，R1选自-NH2，＝O，-OMe或-Cl，R2选自-H，-NH2，-Cl或-F；优选地，底物碱基包括2，6-氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氯腺嘌呤或2-氟腺嘌呤；
Figure BDA0003902966500000071
在一种优选的实施例中，阿糖尿苷的浓度为2～320mM，底物碱基的浓度为1～200mM，底物磷酸盐的浓度为1～100mM。
阿糖尿苷的浓度包括2mM、10mM、20mM、50mM、100mM、200mM，乃至能够达到320mM甚至更多，底物碱基的浓度包括1mM、2mM、10mM、20mM、50mM、100mM，乃至能够达到200mM甚至更多。
上述尿嘧啶核苷磷酸化酶来源于克氏锥虫Trypanosoma cruzi，为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，命名为UP。嘧啶核苷磷酸化酶来源于嗜热栖热菌Thermus thermophiles，为SEQ ID NO：2所示的蛋白质，命名为PyNP。嘌呤核苷磷酸化酶来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus，为SEQ ID NO：3所示的蛋白质，命名为PNP。上述组合物能够催化底物碱基和阿糖尿苷发生反应，生产阿糖类核苷。组合物中的酶，能够分别独立选自纯化蛋白、粗酶液或固定化酶等形式，均能够发挥催化作用。
上述组合物还可以制备成试剂盒等产品形式。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1
1、菌株构建
本申请中所使用尿嘧啶核苷磷酸化酶来源于克氏锥虫Trypanosoma cruzi(命名UP，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)。嘧啶核苷磷酸化酶来源于嗜热栖热菌Thermusthermophiles(命名PyNP，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)。嘌呤核苷磷酸化酶来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus(命名PNP，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)。密码子优化后获得编码三个个酶的DNA序列，编码UP的DNA序列为SEQ ID NO：4；编码PyNP的DNA序列为SEQ ID NO：5；编码PNP的DNA序列为SEQ ID NO：6。将其分别克隆到表达载体pET28a(+)上。将得到的质粒化转至大肠杆菌BL21(DE3)宿主感受态中，获得单克隆菌株。
SEQ ID NO：1：
MSKATHTHGLMKDPDLPVTADGVTYHLNCKSDQLADRILLVGDPGRVDTVAACFDAGSVRFRSENREIFIATGTYKGTPVSVLSTGMGTDNVEIVINEIHLLKEYDFERCSWRPRVGDADVPPGAKVFDPSSVKMIRVGTCGSPFPDMPLAALAITRHVIGMDNTCLYYKVKEQMQKSKDLQEVQRVVKEQTSLGAIDVYATKAHPAITNGIVAACKAFNDNLPAGATEQLYVVGATATASGFYACQGRAVGRFREHLLVPKLVEELSKVQFDVSEGKEIVANIEMETSAVCFLSHLLGYQAGSMCVVVAKRAGAEHLFTTSEQSGQALKNAIQIALEAIVAVG。
SEQ ID NO：2：
MNPVAFIREKREGKKHRREDLEAFLLGYLRDEVPDYQVSAWLMAAFLRGLDPEETLWLTETMARSGKVLDLSGLPHPVDKHSSGGVGDKVSLVVGPILAASGCTFAKMSGRGLAHTGGTIDKLESVPGWRGEMTEAEFLERARRVGLVIAAQSPDLAPLDGKLYALRDVTATVESVPLIASSIMSKKLAAGARSIVLDVKVGRGAFMKTLEEARLLAKTMVAIGQGAGRRVRALLTSMEAPLGRAVGNAIEVREAIEALKGEGPGDLLEVALALAEEALRLEGLDPALARKALEGGAALEKFRAFLEAQGGDPRAVEDFSLLPLAEEHPLRAEREGVVREVDAYKVGLAVLALGGGRKRKGEPIDHGVGVYLLKKPGDRVERGEALALVYHRRRGLEEALGHLREAYALGEEAHPAPLVLEAI。
SEQ ID NO：3：
MSVHIGAKEHEIADKILLPGDPLRAKYIAETFLEGATCYNQVRGMLGFTGTYKGHRISVQGTGMGVPSISIYITELMQSYNVQTLIRVGTCGAIQKDVKVRDVILAMTSSTDSQMNRMTFGGIDYAPTANFDLLKTAYEIGKEKGLQLKVGSVFTADMFYNENAQFEKLARYGVLAVEMETTALYTLAAKFGRKALSVLTVSDHILTGEETTAEERQTTFNEMIEVALETAIRQ。
SEQ ID NO：4：
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SEQ ID NO：5：
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SEQ ID NO：6：
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2、蛋白表达
将表达UP、PyNP和PNP的大肠杆菌菌株分别接种于试管，37℃培养16h后以1％接种量，接种于含500mL Luria-Bertani培养基的2L摇瓶，37℃培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.1M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白的表达，20℃培养18h。将培养结束的菌液7000rpm离心10min收集菌体，备用。
3、酶液制备
称取0.1g菌泥，添加1mL pH为7.5的磷酸钾缓冲液，震荡混匀后，用超声破碎仪，将菌体混悬液破碎，功率30％，时间5min。
4、检测方法
HPLC检测方法：色谱柱：Agilent Eclipse plus C18，4.6*100mm，3.5μm，流动相为水和乙腈，流苏1.5mL/min，温度40℃，UV：254nm。
实施例2 2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷(2,6-Diamino-9-(beta-D-arabinofuranosyl)purine)的合成
在2mM磷酸缓冲液(pH 7.5)配制1mL反应体系，其中包括80mM阿糖尿苷(1-beta-D-Arabinofuranosyluracil)，20mM 2,6-氨基嘌呤(2,6-Diaminopurine)，4.88mg菌泥制备的UP酶液和6.01mg菌泥制备的PNP酶液，60℃反应16h，如图1所示，2,6-氨基嘌呤转化率为98.78％。
Figure BDA0003902966500000101
实施例3 2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷合成的放大反应
在2mM磷酸缓冲液(pH 7.5)配制1mL反应体系，其中包括320mM阿糖尿苷(1-beta-D-Arabinofuranosyluracil)，200mM 2,6-氨基嘌呤(2,6-Diaminopurine)，19.54mg菌泥制备的UP酶液和60.06mg菌泥制备的PNP酶液，60℃反应6h，2,6-氨基嘌呤转化率为89.74％；反应16h，如图2所示，2,6-氨基嘌呤转化率为96.74％，2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷产量为54.61g/L。
实施例4奈拉滨(Nelarabine，9-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤-2-胺)的合成在2mM磷酸缓冲液(pH 7.5)配制1mL反应体系，其中包括4mM阿糖尿苷(1-beta-D-Arabinofuranosyluracil)，1mM 2-氨基-6-甲氧基嘌呤(2-Amino-6-methoxypurine)，0.24mg菌泥制备的UP酶液和0.33mg菌泥制备的PNP酶液，70℃反应6h，如图3所示，2-氨基-6-甲氧基嘌呤转化率为98.48％。
Figure BDA0003902966500000102
实施例5奈拉滨(9-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤-2-胺)的放大反应
在2mM磷酸缓冲液(pH 7.5)配制1mL反应体系，其中包括320mM阿糖尿苷(1-beta-D-Arabinofuranosyluracil)，80mM 2-氨基-6-甲氧基嘌呤(2-Amino-6-methoxypurine)，19.54mg菌泥制备的UP酶液和26.42mg菌泥制备的PNP酶液，70℃反应16h，6-甲氧基嘌呤转化率为74.82％。反应40h，2-氨基-6-甲氧基嘌呤转化率为94.96％，如图4所示，奈拉滨的产量为22.58g/L。
实施例6 2-氯腺嘌呤阿拉伯糖苷(2-chloroadeninearabinoside)的合成
在2mM磷酸缓冲液(pH 7.5)配制1mL反应体系，其中包括2mM阿糖尿苷(1-beta-D-Arabinofuranosyluracil)，1mM 2-氯腺嘌呤(2-Chloroadenine)，0.12mg菌泥制备的PyNP酶液和适量菌泥制备的PNP酶液，70℃反应20h。如图5所示，2-氯腺嘌呤转化率为93.97％。
Figure BDA0003902966500000111
实施例7氟达拉滨(Fludarabine，9-β-D-阿拉伯呋喃糖-2-氟腺苷)的合成
在2mM磷酸缓冲液(pH 7.5)配制1mL反应体系，其中包括2mM阿糖尿苷(1-beta-D-Arabinofuranosyluracil)，1mM嘌呤类似物2-氟腺嘌呤(2-Fluoroadenine)，0.12mg菌泥制备的PyNP酶液和适量菌泥制备的PNP酶液，70℃反应20h。如图6所示，2-氟腺嘌呤转化率为92.51％。
Figure BDA0003902966500000112
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请中利用上述嘌呤核苷磷酸化酶、以及嘧啶核苷磷酸化酶或尿嘧啶核苷磷酸化酶，能够以阿糖尿苷和底物碱基为底物，一锅法生物合成制备目标产物阿糖类核苷，无需进行中途补料或中间产物纯化再投料等操作。相较于现有技术中两步法生物合成的操作更简单，反应所需时间短；相较于现有技术中的一锅法生物合成，反应速率更快，底物转化率更高，能够耐受较高的底物浓度，在较短的反应时间内实现大规模的工业化生产；相较于化学合成，反应所需条件更温和，工艺过程简单，成本低且对环境友好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法，其特征在于，所述方法包括：
底物、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶，共同混合后进行生物合成，一锅法直接制备获得所述阿糖类核苷；
其中，所述尿嘧啶核苷磷酸化酶包括UP、或与所述UP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，所述UP为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；
所述嘧啶核苷磷酸化酶包括PyNP、或与所述PyNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，所述PyNP为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；
所述嘌呤核苷磷酸化酶包括PNP、或与所述PNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，所述PNP为SEQ ID NO：3所示的蛋白质；
所述底物包括阿糖尿苷、底物碱基和底物磷酸盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
所述阿糖尿苷和所述底物磷酸盐在所述尿嘧啶核苷磷酸化酶或所述嘧啶核苷磷酸化酶的催化下，生成阿拉伯糖-1-磷酸和游离碱基；
所述阿拉伯糖-1-磷酸在所述嘌呤核苷磷酸化酶的催化下，所述底物碱基取代所述阿拉伯糖-1-磷酸上的磷酸基团，获得所述阿糖类核苷。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物碱基为式I所示的碱基，R1选自-NH2、＝O、-OMe或-Cl，R2选自-H、-NH2、-Cl或-F；
Figure FDA0003902966490000011
优选地，所述底物碱基包括2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氯腺嘌呤或2-氟腺嘌呤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嘌呤核苷磷酸化酶、所述尿嘧啶核苷磷酸化酶或所述嘧啶核苷磷酸化酶中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一锅法生物合成的催化时间为4～20h；
优选地，所述一锅法生物合成的催化温度为50～80℃，更优选为60～70℃；
优选地，所述阿糖尿苷的浓度为2～320mM，所述底物碱基的浓度为1～200mM，所述底物磷酸盐的浓度为1～100mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阿糖类核苷包括2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、奈拉滨、2-氯腺嘌呤阿拉伯糖苷或氟达拉滨；
优选地，所述底物磷酸盐包括磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或多种。
7.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶；
所述尿嘧啶核苷磷酸化酶包括UP、或与所述UP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，所述UP为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；
所述嘧啶核苷磷酸化酶包括PyNP、或与所述PyNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，所述PyNP为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；
所述嘌呤核苷磷酸化酶包括PNP、或与所述PNP具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，所述PNP为SEQ ID NO：3所示的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述嘌呤核苷磷酸化酶、所述尿嘧啶核苷磷酸化酶或所述嘧啶核苷磷酸化酶中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。
9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括阿糖尿苷、底物碱基和底物磷酸盐。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述底物碱基为式I所示的碱基，R1选自-NH2、＝O、-OMe或-Cl，R2选自-H、-NH2、-Cl或-F；
Figure FDA0003902966490000021
优选地，所述底物碱基包括2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氯腺嘌呤或2-氟腺嘌呤；
优选地，所述底物磷酸盐包括磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或多种；
优选地，所述阿糖尿苷的浓度为2～320mM，所述底物碱基的浓度为1～200mM，所述底物磷酸盐的浓度为1～100mM。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117070514A (zh) * 2023-10-16 2023-11-17 吉林凯莱英医药化学有限公司 非天然rna的制备方法及产品

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3864357B2 (ja) * 1997-08-04 2006-12-27 有機合成薬品工業株式会社 プリンヌクレオシド化合物の製造方法
CN101113420A (zh) * 2007-06-29 2008-01-30 上海蔚平生物科技有限公司 一种高产核苷磷酸化酶的菌种及阿糖核苷的合成方法
EP2338985A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-29 Institut Univ. de Ciència i Tecnologia, s.a. Thermostable biocatalyst combination for nucleoside synthesis
CN106191172A (zh) * 2015-05-06 2016-12-07 普拉斯米亚生物技术有限公司 胞嘧啶核苷类似物的酶法制备
CN106929553B (zh) * 2015-12-31 2021-02-19 上海鑫欣生物科技有限公司 一种酶法合成阿糖腺苷的方法
CN106834176B (zh) * 2017-02-13 2020-05-05 南京工业大学 一种核苷磷酸化酶、编码基因及其高产菌株和应用
CN113373100A (zh) * 2021-04-20 2021-09-10 河南师范大学 一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌及应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117070514A (zh) * 2023-10-16 2023-11-17 吉林凯莱英医药化学有限公司 非天然rna的制备方法及产品
CN117070514B (zh) * 2023-10-16 2024-04-26 吉林凯莱英医药化学有限公司 非天然rna的制备方法及产品

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