CN114107413B - 一种酶催化胞嘧啶生产胞苷的方法及应用 - Google Patents

一种酶催化胞嘧啶生产胞苷的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶催化胞嘧啶生产胞苷的方法及应用，属于酶工程和生物催化领域。本发明通过采用重组表达技术对α‑D‑核糖基转移酶进行过量表达，获得过量的α‑D‑核糖基转移酶；将表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α‑D‑核糖基转移酶的重组菌，或氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α‑D‑核糖基转移酶，添加至含有胞嘧啶、α‑D‑核糖‑1‑磷酸盐的反应体系中，对底物胞嘧啶进行催化，可以高效生产胞苷，促进了其在医药等领域中的应用。这种高效α‑D‑核糖基转移酶可用于实现胞苷的工业化生产，利于降低其生产成本及环境污染，实现绿色生物制造。

Description

一种酶催化胞嘧啶生产胞苷的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种酶催化胞嘧啶生产胞苷的方法及应用，属于酶工程和生物催化领域。
背景技术
胞苷三磷酸(胞苷，CTP)是一个由胞嘧啶、核糖、三磷酸单位组成的核苷酸。胞苷是机体细胞内的一种正常成分，它在体内参与核酸和磷脂类的生物合成、提供能量，并具有神经调节功能，缓解血管硬化，改善脂肪代谢等功能。主要用纸治疗植物神经紊乱，脑震荡及其后遗症，脑神经疾患，神经官能症及脂肪肝等，是一种重要的心脑血管类生物药物。同时，胞苷也是合成寡聚糖、CDP-胆碱等多种药物的中间体。
胞苷在上世纪80年代具有较高的关注度，国内的主要生产方法为通过酵母体内的自身酶系对胞苷酸(CMP)进行转化，生产工艺较为成熟。但该工艺存在诸多缺点，例如1)原材料胞苷酸价格较高，按照成本计算只能达到中试要求；2)酵母不能重复利用，该生产方法不能连续生产；3)产品有效期短，质量不稳定，导致无法实现产业化生产。目前，胞苷的生产主要集中在中国，利用四乙酰核糖、胞嘧啶、四氯化锡(催化剂)来化学合成胞苷，生产中使用的催化剂四氯化锡不仅成本高，而且容易造成污染。
因此，一种高效、绿色的胞苷生产工艺开发，可以有效实现胞苷大规模工业化生产，降低胞苷的生产成本并降低污染。
发明内容
为了得到一种高效、绿色的胞苷生产工艺开发，可以有效实现胞苷大规模工业化生产，降低胞苷的生产成本并降低污染，本发明采用重组表达技术对α-D-核糖基转移酶进行过量表达，获得过量的α-D-核糖基转移酶，对底物胞嘧啶进行催化，高效生产胞苷，促进其在医药等领域中的应用。
本发明提供了一种α-D-核糖基转移酶在催化胞嘧啶生产胞苷中的应用，所述α-D-核糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相似度大于30％的，且具有相应α-D-核糖基转移酶活性的蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述α-D-核糖基转移酶来源于大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明的一种实施方式中，编码所述α-D-核糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相似度大于30％的，且具有相应α-D-核糖基转移酶活性的蛋白；
或编码所述α-D-核糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或与SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列相似度大于30％的，且具有相应α-D-核糖基转移酶活性的蛋白。
本发明还提供了一种酶催化胞嘧啶生产胞苷的方法，所述方法为，将表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-D-核糖基转移酶的重组菌，或氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-D-核糖基转移酶，添加至含有胞嘧啶、α-D-核糖-1-磷酸盐的反应体系中进行反应，制备得到胞苷。
在本发明的一种实施方式中，编码所述α-D-核糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示或如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述胞嘧啶在反应体系中添加的终浓度为：10～100mM。
在本发明的一种实施方式中，所述α-D-核糖-1-磷酸盐在反应体系中添加的终浓度为：10～100mM。
在本发明的一种实施方式中，所述α-D-核糖基转移酶在反应体系中的添加的蛋白浓度为：10～150mg/L。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中的磷酸盐为：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液，所述磷酸盐在反应体系中添加的终浓度为：10～200mM。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，反应条件为：30～40℃、20～200rpm、pH为6.0～8.0。
在本发明的一种实施方式中，所述表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-D-核糖基转移酶的重组菌为，以大肠杆菌BL21、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌JM109中的任一种为宿主细胞，以pET22b质粒、pET28a质粒、pRSFDuet-1质粒、pETDuet-1质粒、pACYCDuet-1质粒、pCDFDuet-1质粒中的任一种为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述α-D-核糖基转移酶的制备方法为：
(1)设计引物PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.2所示的α-D-核糖基转移酶基因ppnP，将α-D-核糖基转移酶基因ppnP和表达载体采用酶切位点NdeI和EcoR I连接，获得重组载体；
(2)将重组载体转化入宿主大肠杆菌中，制备得到重组大肠杆菌；
(3)将重组大肠杆菌进行诱导发酵制备得到α-D-核糖基转移酶。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主大肠杆菌包括但是不限于：大肠杆菌BL21、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌JM109。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体包括但是不限于：pET22b质粒、pET28a质粒、pRSFDuet-1质粒、pETDuet-1质粒、pACYCDuet-1质粒、pCDFDuet-1质粒。
本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-D-核糖基转移酶，或核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的α-D-核糖基转移酶基因，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的α-D-核糖基转移酶基因的重组质粒，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的α-D-核糖基转移酶基因的重组细胞在催化胞嘧啶生产胞苷或含有胞苷的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
有益效果
重组酶及生物催化在重要化学品等的生产过程中具有重要作用与意义。通过采用重组表达技术对α-D-核糖基转移酶进行过量表达，获得过量的α-D-核糖基转移酶，对底物胞嘧啶进行催化，高效生产胞苷(转化率达93.5％)，促进其在医药等领域中的应用。
附图说明
图1：α-D-核糖基转移酶催化胞嘧啶生产胞苷反应示意图。
图2：α-D-核糖基转移酶过量表达后SDS-PAGE图。
图3：α-D-核糖基转移酶催化胞嘧啶产胞苷的HPLC图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中所涉及的α-D-核糖-1-磷酸盐、胞嘧啶购自：阿拉丁。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。
TB液体培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72mol/LKH2PO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g KH2PO4溶在足量的水中，使终体积为100mL)。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
α-D-核糖基转移酶酶活的检测：
α-D-核糖基转移酶酶活力测定方法：10mM胞嘧啶；20mMα-D-核糖-1-磷酸盐；磷酸盐缓冲液(pH 7.0)；37℃反应15min；取200μL反应液，迅速在沸水浴中加热2min，终止反应。将反应液进行HPLC检测。
酶活力单位定义为：催化底物，每分钟生成1μmol产物(胞苷)所需的酶量，为一个酶活力单位U。
胞苷、胞嘧啶的含量的检测：
液相色谱仪岛津10A，色谱柱：INERTSIL ODS-SP 5μm 4.6*250mm，流动相：缓冲液配制：0.1mol/L磷酸二氢钾水溶液：0.01mol/L的四丁基氢氧化铵：甲醇＝95：95：10，然后磷酸调节pH至4.5，波长：276nm，流速：1.0mL/min。
胞苷转化率的计算方法(％)：(尿嘧啶初始含量-尿嘧啶剩余含量)*100/尿嘧啶初始含量。
实施例1：重组质粒的制备
具体步骤如下：
(1)本实施例采用分子生物学手段，设计引物PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的α-D-核糖基转移酶基因ppnP，采用质粒pET28a过量表达α-D-核糖基转移酶。
具体采用引物：OverEx_ppnP-FW:GGAATTCCATATGATGCTTCAAAGTAATGAGTA和OverEx_ppnP-RS:CGGAATTCTTACAGATAGCGGCACAGAT。
PCR扩增的条件：预变性98℃，5min；变性95℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃(酶的延伸速度为1kb/min，具体时间根据扩增片段的长度来设置)；设置循环30次；再延伸72℃，10min；最后16℃保温。
PCR扩增的体系：5×PS buffer 20μL，dNTP 10μL，上游/下游引物(10μmol·L-1)2μL，模板1μL，酶1μL，水66μL。
将上述获得的α-D-核糖基转移酶基因ppnP和pET28a质粒采用酶切位点NdeI和EcoR I连接在质粒pET28a上，获得重组质粒pET28a-ppnP。同时将该序列送至测序公司测序验证正确。即，制备得到重组载体：pET28a-ppnP。
(2)将α-D-核糖基转移酶基因ppnP(SEQ ID NO.2)依据大肠杆菌系统密码子偏好性进行密码子优化，优化后α-D-核糖基转移酶基因序列ppnP’为SEQ ID NO.3，由金维智公司进行全基因合成。
将上述获得的α-D-核糖基转移酶基因ppnP’采用酶切位点NdeI和EcoR I连接在质粒pET28a上获得重组质粒pET28a-ppnP’。同时将该序列送至测序公司测序验证正确。即，制备得到重组载体：pET28a-ppnP’。
实施例2：α-D-核糖基转移酶粗酶液的制备
具体步骤如下：
(1)重组大肠杆菌的制备
分别将实施例1中构建得到的重组质粒pET28a-ppnP、pET28a-ppnP’转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主中，构建获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-ppnP和E.coli BL21(DE3)/pET28a-ppnP’。
(2)α-D-核糖基转移酶粗酶液的制备
分别将步骤(1)制备得到的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-ppnP和E.coliBL21(DE3)/pET28a-ppnP’接种至种子培养基中，在37℃、200rpm条件下培养8h，制备得到种子液；
将制备得到的种子液按照1％(v/v)的接种量接种至TB液体培养基中，在37℃培养至菌浓OD600＝0.6～0.8时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，在25℃诱导发酵36h，制备得到发酵液。
将发酵液离心，获得菌体细胞，采用超声破碎方法破壁菌体细胞。分别制备得到含有ppnP的粗酶液和含有ppnP’的粗酶液，对粗酶液进行琼脂糖-凝胶电泳分析，结果如图1所示，结果显示，在12Kda处有条带，证明α-D-核糖基转移酶得到了表达。
(3)分别检测制备得到的α-D-核糖基转移酶粗酶液的酶活，结果显示，含有ppnP的粗酶液的酶活为：6.7U/mL，含有ppnP’的粗酶液的酶活为：9.2U/mL。
实施例3：胞苷的制备
分别采用实施例2制备得到的α-D-核糖基转移酶粗酶液，即含有ppnP的粗酶液和含有ppnP’的粗酶液，催化胞嘧啶生产胞苷(如图2～3所示)。
具体步骤如下：
(1)将实施例2制备得到的含有α-D-核糖基转移酶ppnP的粗酶液按照100mg/L(蛋白浓度)的添加量，添加至含有终浓度为30mM的胞嘧啶和终浓度为50mM的α-D-核糖-1-磷酸盐的反应体系(1mL)中；采用100mM磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液将反应体系的pH调节至7.0；
(2)将上述反应体系置于37℃，反应时间为6.0h；检测反应结束后，反应液中的胞苷的含量，结果为：含量为27.9mM，计算胞苷转化率，结果为：93.0％。
证明过量表达的α-D-核糖基转移酶ppnP及其催化体系，具有高效的胞苷转化率。
(3)采用步骤(1)～(2)的具体实施方式，区别在于，将含有α-D-核糖基转移酶ppnP的粗酶液调整为：添加含有α-D-核糖基转移酶ppnP’粗酶液进行反应；
检测反应结束后，反应液中的胞苷的含量，结果为：含量为28.5mM，计算胞苷转化率，结果为：93.5％。证明采用α-D-核糖基转移酶ppnP’进行催化胞嘧啶生产胞苷，催化6.0h时，产生了大量的胞苷，胞苷转化率可达93.50％。
实施例4：胞苷制备过程中的反应条件的优化
由于α-D-核糖基转移酶ppnP和优化之后α-D-核糖基转移酶ppnP’效果差异不大，本实施例仅以ppnP’为例，进行反应条件的优化，具体步骤如下：
1、针对其酶蛋白添加量在酶催化胞嘧啶生产胞苷的应用中的影响进行优化
具体实施步骤同实施例3的步骤(1)～(2)，区别在于，分别将α-D-核糖基转移酶ppnP’的粗酶液按照10mg/L、20mg/L、60mg/L、100mg/L、140mg/L的添加量进行反应，检测反应结束后的胞苷的转化效率，结果显示，当添加100mg/Lα-D-核糖基转移酶ppnP’蛋白时，催化6h时，胞苷的转化效率最高，达93.5％；而当α-D-核糖基转移酶ppnP’蛋白浓度分别为10mg/L、20mg/L、60mg/L、140mg/L，胞苷的转化效率分别为51％、60％、87％、92％。
2、针对底物胞嘧啶的添加浓度进行优化
具体实施步骤同实施例3的步骤(1)～(2)，区别在于，分别将添加至含有终浓度为30mM的胞嘧啶调整为，分别采用的胞嘧啶添加浓度为10mM、20mM、30mM、50mM、100mM进行反应；检测反应结束后的胞苷的转化效率，结果显示，胞苷的转化效率分别为87％、90％、93.5％、91％、88％，其中当胞嘧啶添加浓度为30mM时，胞苷的转化效率最高。
综上所述，α-D-核糖基转移酶ppnP’催化胞嘧啶生产胞苷的最适条件为α-D-核糖基转移酶ppnP’蛋白浓度100mg/L和胞嘧啶添加浓度30mM。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏香地化学有限公司
江南大学
<120> 一种酶催化胞嘧啶生产胞苷的方法及应用
<130> BAA211253A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Leu Gln Ser Asn Glu Tyr Phe Ser Gly Lys Val Lys Ser Ile Gly
1 5 10 15
Phe Ser Ser Ser Ser Thr Gly Arg Ala Ser Val Gly Val Met Val Glu
20 25 30
Gly Glu Tyr Thr Phe Ser Thr Ala Glu Pro Glu Glu Met Thr Val Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Leu Asn Val Leu Leu Pro Asp Ala Thr Asp Trp Gln Val
50 55 60
Tyr Glu Ala Gly Ser Val Phe Asn Val Pro Gly His Ser Glu Phe His
65 70 75 80
Leu Gln Val Ala Glu Pro Thr Ser Tyr Leu Cys Arg Tyr Leu
85 90
<210> 2
<211> 285
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcttcagt cgaatgaata tttttctggt aaggtaaaat ctatcgggtt ttccagctca 60
agtacagggc gtgcgtcggt aggagtcatg gtagagggtg agtacacatt ttcgactgcg 120
gaaccggaag aaatgacagt tatctctgga gcactgaatg tgcttctgcc ggatgccacg 180
gattggcaag tgtacgaagc cggctcggta ttcaatgttc ccggccattc cgaatttcat 240
cttcaagtag cggaaccaac ttcatattta tgtcgttatc tgtaa 285
<210> 3
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<212> DNA
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gagccggaag agatgacggt aatcagtggc gcgctgaatg tgttactgcc tgacgcgacc 180
gactggcagg tgtatgaagc cggttcggtg tttaatgttc ccggtcacag tgagtttcat 240
ctgcaagttg ccgaacccac ctcttatctg tgccgctatc tgtaa 285

Claims (9)

1.一种α-D-核糖基转移酶在催化胞嘧啶生产胞苷中的应用，其特征在于，所述α-D-核糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。
2.一种酶法催化胞嘧啶生产胞苷的方法，其特征在于，所述方法为，将表达氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的α-D-核糖基转移酶的重组菌，或氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的α-D-核糖基转移酶，添加至含有胞嘧啶、α-D-核糖-1-磷酸盐的反应体系中进行反应，制备得到胞苷。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，编码所述α-D-核糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示，或编码所述α-D-核糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胞嘧啶在反应体系中添加的终浓度为：10~100 mM；所述2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸盐在反应体系中添加的终浓度为：10~100 mM。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述α-D-核糖基转移酶在反应体系中的添加的蛋白浓度为：10~150 mg/L。
6.如权利要求2~5任一所述的方法，其特征在于，所述表达氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的α-D-核糖基转移酶的重组菌为，以大肠杆菌BL21、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌JM109中的任一种为宿主细胞，以pET22b质粒、pET28a质粒、pRSFDuet-1质粒、pETDuet-1质粒、pACYCDuet-1质粒、pCDFDuet-1质粒中的任一种为表达载体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，采用磷酸盐将反应体系的pH为调节至6.0~8.0，所述磷酸盐为：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液。
8.核苷酸序列如SEQ ID NO .2或SEQ ID NO .3所示的α-D-核糖基转移酶基因，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO .2或SEQ ID NO .3所示的α-D-核糖基转移酶基因的重组质粒，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO .2或SEQ ID NO .3所示的α-D-核糖基转移酶基因的重组细胞在催化胞嘧啶生产胞苷或含有胞苷的产品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品为化学品。
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