CN104232672A - 一种克隆番鸭小鹅瘟病毒基因组编码区全序列的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种克隆番鸭小鹅瘟病毒基因组编码区全序列的方法，通过从含有番鸭小鹅瘟病毒番鸭胚尿囊液中提取病毒基因组DNA，通过设计的特定引物，以病毒基因组DNA为模板扩增包含编码区全序列的基因片段，将目的基因片段与载体连接，挑取阳性菌落进行测序直接获取番鸭小鹅瘟病毒基因组编码区段全序列。与传统方法相比，本发明的方法具有扩增的目的片段长度长，实验工作量小、成本低、效率高的特点。

Description

一种克隆番鸭小鹅瘟病毒基因组编码区全序列的方法

技术领域

 本发明涉及一种克隆番鸭小鹅瘟病毒（Muscovy duck origin goose parvovirus，MDGPV）基因组编码区全序列的方法。

背景技术

小鹅瘟（Gosling Plague，GP）又称鹅细小病毒（Goose Parvovirus，GPV）感染或Derzsy’s病，是由GPV引起的一种主要侵害小鹅和雏番鸭的高度接触性传染病，临床上以渗出性肠炎、小肠黏膜表层坏死脱落、肠道栓塞为特征性病变。临床上番鸭小鹅瘟与番鸭细小病毒（Muscovy duck Parvovirus，MDPV）病（俗称“三周病”）常在同一地区同一番鸭群中流行，雏番鸭对GPV和MDPV均易感，而小鹅仅对GPV易感。番鸭小鹅瘟是1997年以来引起福建莆田等地番鸭饲养区内雏番鸭发生不同程度腹泻、部分病鸭粘膜脱落形成栓塞为主要特征的疫病，经病原分离和鉴定确认该病病原为一种新基因型番鸭鹅细小病毒（Muscovy duck origin goose parvovirus，MDGPV），。

水禽细小病毒（GPV、MDPV与MDGPV）在分类学上均为细小病毒科细小病毒属成员，是无囊膜、线性、单链DNA病毒，基因组长约5 kb，两端由相同的回文ITR序列折叠形成发卡结构，中间为编码区含有两个主要开放阅读框架（Open Read Frame，ORF），两个ORF之间间隔18 bp。左侧ORF（LORF）长1884 bp，编码2种非结构蛋白（Rep），即调节蛋白NS1、NS2；右侧ORF（RORF）长2199 bp，编码3种结构蛋白（VP），即VP1、VP2、VP3。各编码区内基因相互重叠，非结构基因和结构基因分别终止于同一个终止密码子，右侧ITR前有一个多聚Poly（A），在报道的水禽细小病毒全基因中，所有的NS和VP基因的长度均相同。MDGPV-PT株为新基因型番鸭小鹅瘟病毒福建代表株，（1）NS蛋白编码区：MDGPV-PT与GPV-B，MDPV-FM核苷酸同源性分别为82.9%，99.4%；（2）VP蛋白主要免疫功能区：MDGPV-PT与GPV-B，MDPV-FM核苷酸同源性分别为92.1%，85.9%。

目前对于如何有效地得到MDGPV基因组编码区全序列本领域研究甚少，做为传统方法的分段PCR 克隆法在MDGPV基因组编码区扩增上存在诸多缺陷，必须将目的基因分成若干段分别克隆，分成几段就需做几次亚克隆，然后做亚克隆测序拼接，造成成本高，工作量大，且有序列碱基错读的可能。

发明内容

 针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种克隆方法，能够简单、快捷的获取MDGPV基因组完整编码区序列，本发明公开的方法具有目的片段长度明确，实验工作量小，实验成本小的特点。

本发明采用以下技术方案：

一种克隆MDGPV基因组编码区全序列的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）提取MDGPV基因组DNA；

（2）以步骤（1）的DNA作为模板，用引物P1和P2对MDGPV进行PCR扩增，得到相应的编码区全长基因；

（3）回收和纯化上述PCR产物，获得目的基因片段；

（4）将上述PCR获得的目的基因片段与pcDNA3.1D/V5-His-TOPO载体连接加入到JM109感受态细胞中进行转化培养，筛选其中的阳性菌落进行培养，以菌液为模板进行PCR即得MDGPV编码区基因全序列。

在本发明中，为了保持病毒基因组DNA的完整性和纯度，步骤（1）采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取并纯化病毒DNA。市场上已有多种此类试剂盒在销售，具体的操作方法按照其说明书即可。

在本发明中，PCR引物需满足如下要求：

1）设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计，设计的引物以便能一个PCR反应对MDGPV基因组DNA编码区全序列进行阳性扩增；

2）设计PCR引物时按pcDNA3.1D/V5-His-TOPO载体的要求，在上游引物5’端加上CACC四个碱基。

根据以上要求，所述的步骤（2）的扩增引物P1和P2的序列为：

上游引物P1：5’-CACCCGCATGCGCCCGATCTGCC-3’；

下游引物P2：5’-GCATGCGCCCGATCAGCCTTGACAACCG-3’；

其中，所述的步骤（2）PCR扩增产物经胶回收大小为4693 bp。

在本发明中，按pcDNA3.1D/V5-His-TOPO载体的要求，步骤（2）采用具有3’→5’核酸外切酶活性的高保真酶做为针对MDGPV编码区全基因的DNA扩增酶。市场上已有多种此类3’→5’核酸外切酶活性的高保真PCR酶在销售，具体的操作方法按照其说明书即可。

在本发明中，为了提高回收和纯化速度，步骤（3）采用纯化回收试剂盒回收PCR产物。市场上已有多种此类试剂盒在销售，具体的操作方法按照其说明书即可。

在本发明中，为了提高长片段外源基因的连接效率，步骤（4）采用的pcDNA3.1D/V5-His-TOPO载体可接纳长片段的DNA，在该载体上插入长片段的外源DNA时，不会破坏载体的自我复制性质。

在本发明中，目的基因片段与pcDNA3.1D/V5-His-TOPO的连接参照pcDNA3.1D/V5-His-TOPO载体试剂盒使用说明书操作即可，市场上有多家供应商供应成熟稳定的pcDNA3.1D/V5-His-TOPO载体试剂盒。

在本发明中，JM109感受态细胞既可以从试剂公司购买，也可以采用本领域常见方法，例如氯化钙法制备。

在本发明中，还包括步骤（4）所得MDGPV编码区基因全序列进行同源性比对的步骤，用来验证所得序列的准确性。

本发明的有益效果：整个克隆过程工作量小，效率高，准确率高，可以简单、快捷的获取MDGPV基因组的编码区全序列。

 

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

步骤1、病毒分离株：

新基因型GPV福建代表株MDGPV-PT由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。

步骤2、病毒DNA提取：

MDGPV-PT株基因组DNA由AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒提取，具体操作步骤为：

a. 收集200 μL MDGPV病毒番鸭胚尿囊液，转入1.5 mL 离心管中。

b. 加200 μL Buffer V-L，漩涡振荡混合均匀，静置5 min。

c. 加75 μL Buffer V-N，漩涡振荡混合均匀，12,000×g 离心5 min。

d. 将上清转移到新的2 mL 离心管（试剂盒内提供）中，加300 μL 异丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6-8 次，混合均匀。

e. 将制备管置于2 mL 离心管（试剂盒内提供）中，取步骤d 中的混合液移入制备管中，6,000×g离心1 min。

f. 弃滤液，将制备管置回到2 mL 离心管中，加500 μL Buffer W1A，室温静置1 min。12,000×g 离心1 min。

g. 弃滤液，将制备管置回到2 mL 离心管中，加800 μL Buffer W2，12,000×g 离心1 min。

h. 将制备管置回到2 mL 离心管中，12,000×g 离心1 min。

i. 将制备管置于洁净的1.5 mL 离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加40-60 μL Buffer TE（nuclease-free），室温静置1 min。12,000×g 离心1 min 洗脱病毒DNA。

步骤3、引物设计及PCR反应：

根据已发表的鹅细小病毒B株全基因序列（登录号为U25749.1）、番鸭细小病毒FM株全基因序列（登录号为NC_006147.2）与番鸭小鹅瘟细小病毒PT株全基因序列（登录号为JF926695.1）设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计，设计的引物为：

上游引物P1：5’-CACCCGCATGCGCCCGATCTGCC-3’；

下游引物P2：5’-GCATGCGCCCGATCAGCCTTGACAACCG-3’；

用MDGPV基因组DNA为模板进行高保真PCR操作扩增MDGPV基因组编码区全长基因。PCR反应体系为50 μL体系（10 μL的5×PrimeSTAR GXL Buffer，上下游引物各1 μL，2 μL的病毒DNA，4 μL的dNTP Mixture，2 μL的PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，32 μL的ddH₂O），反应条件为95℃预变性5min；35个循环（94℃，30s；59℃，40s；72℃，2min），最后72℃ 10min。

反应结束后将约有4693 bp 的PCR 产物收集到一个EP 管中并切胶回收，将回收的基因片段克隆到质粒载体中，然后挑取阳性菌进行PCR 反应，产物送测序公司测序。

步骤4、PCR 产物的回收和纯化：

PCR 产物用OMEGA胶回收试剂盒纯化回收，具体操作步骤为：

a. 电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来，并尽量去除多余的凝胶；

b. 称取空离心管的重量，切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积。加入等倍凝胶体积的Binding Buffer，把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次；

c. 转移700 μL的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBind DNA柱子，并把柱子装在一个干净的2mL收集管内，室温下10,000×g离心1min，弃去液体；

d. 将柱子重新套回收集管中，加300 μL Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中，室温下10,000×g离心 1min，去弃滤出液；

e. 将柱子重新套回收集管中，加入700 μL SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下10,000×g离心1min，去弃滤出液；

f. 将柱子重新套回收集管中，重复加入700 μL SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下10,000×g离心1min，弃去滤出液，将空柱子重新套回收集管中，10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体；

g. 把柱子装在一个干净的1.5 mL离心管上,加入30~50 μL洗脱液或灭菌水上柱子膜上，10,000×g离心1min，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，保存于-20℃。

步骤5、克隆：

5.1 目的片段与载体连接：将回收、检测后的目的片段与pcDNA3.1D/V5-His-TOPO载体连接，操作连接体系（参考Life的pcDNA3.1D/V5-His-TOPO载体试剂盒使用说明书）为：

纯化回收后的PCR片段	2 μL
		Salt Solution	1 μL
Sterile Water	2 μL
		pcDNA3.1D/V5-His-topO vector	1 μL
Total	6 μL

以上操作在冰上进行，稍离心混匀，16℃在PCR仪中连接过夜，-20℃保存备用。

5.2 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl₂法）：

a. 将保存好的JM109 菌种划线接种于LB/Amp⁺琼脂平板上，37℃过夜培养16h-18h；

b. 从37°C过夜培养平皿内挑取一个直径约为2到3 mm的JM109单菌落。把这样的单菌落接种于一只装有5 mL LB肉汤的30 mL灭菌试管中，于37°C 200rpm振荡培养过夜；

c. 转移0.2 mL过夜培养物于一只装有15或20 mL LB的50 mL灭菌三角瓶中，于37°C 200rpm振荡摇菌培养至OD600=0.6；

d. 室温下，4000×g离心5 min收集对数期细胞。弃培养基，保留细胞沉淀；

e. 加入10 mL冰冷的CaCl₂ 溶液，并轻微打匀；

f.  4°C下，4000×g离心10分钟min收集细胞；

g. 弃CaCl₂ 溶液，保留细胞沉淀；

h. 加入0.8 mL （每25 mL初始培养物加入1 mL）冰冷的0.1M的CaCl2 溶液，并轻微打匀，4℃在冰箱中放置过夜；

i. 按200 μL /份加入15％冰预冷甘油，混匀分装，-80℃冻存备用。

5.3 连接产物的转化：

a. 将6 μL的连接产物加入到200 μL制备好的感受态细胞JM109中，混匀并冰浴30 min；

b. 把转化管转移至放于42℃循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90s（此时不能摇动转化管）；

c. 把试管迅速转移至冰浴2到3 min；

d. 向每只试管中加入加入800 μL无抗生素的LB 液体培养基，37℃，200 r/min 培养45 min；

e. 转移适量体积（如果使用90 mm平板，一半涂布量不应超过100 μL）的经转化处理的感受态细胞，涂布于已提前涂布了IPTG和X-gal并含有相应抗生素的LB/Amp⁺琼脂平板上，于37°C倒置平板培养过夜。

5.4 阳性菌落的筛选：

随机挑选菌落接种于LB/Amp⁺培养液中，培养至中等浓度后以菌液为模板，以目的基因PCR 扩增时的相同引物和反应条件进行菌液PCR扩增。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物与目的片段大小一致的菌液0.5mL 装入1.5ml EP 离心管中，交送生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序。

5.5 检验试验的正确性：

将测序结果在NCBI 上运用Blast 在线比对软件以验证序列的正确性和该方法的可靠性。结果表明该方法获得的MDGPV-PT株基因组完整编码区序列的核苷酸序列与其他已在GenBank中登录的MDGPV分离株编码区全长序列的同源性为99％～100％；与其他已在GenBank中登录的MDPV分离株编码区全长序列的同源性为94.2％～94.4％；与其他已在GenBank中登录的GPV分离株编码区全长序列的同源性为85.2％～91.3％。表明该方法能达到获得MDGPV基因组完整编码区序列的目的。

获得的MDGPV-PT株编码区全长序列为：

ATGGCATTTTCTAGGCCTCTTCAGATTTCTTCTGACAAATTCTATGAAGTTATCATCAGGCTACCCTCGGATATTGATCAAGATGTGCCTGGTTTGTCTCTTAACTTTGTAGAATGGCTTTCTACGGGGGTCTGGGAGCCCACCGGAATATGGAATATGGAGCATGTGAATCTCCCCATGGTTACTCTGGCAGACAAAATCAAGAACATTTTCATCCAGAGATGGAACCAATTCAATCAGGACGAAACGGATTTCTTCTTTCAATTGGAAGAAGGCAGTGAGTACATCCATCTGCATTGCTGCATTGCCCAGGGGAATGTCCGATCTTTTGTTCTGGGGAGATACATGTCTCAAATTAAAGACTCAATTCTGAGAGATGTGTATGAAGGGAAACAGGTAAAAATCCCGGATTGGTTTTCTATAACTAAAACCAAACGGGGAGGGCAAAATAAGACCGTGACTGCTGCTTATATTCTGCATTACCTGATTCCTAAAAAACAACCGGAATTACAATGGGCTTTTACCAATATGCCCCTTTTCACTGCTGCTGCTTTATGCCTCCAAAAGAGGCAAGAGTTACTGGATGCTTTTCAGGAAAGTGAGATGAATGCTGTAGTGCAGGAGGATCAAGCTTCAACTGTAGCTCCCCTTATTTCCAACAGAGCAGCAAAGAACTATAGCAATCTGGTTGATTGGCTCATTGAGATGGGTATCACCTCTGAAAAACAGTGGCTAACTGAAAATAAAGAGAGCTACCGGAGCTTTCAGGCTACATCTTCAAACAACAGACAAGTAAAAGCAGCACTTGAAAATGCCCGAGCAGAAATGCTACTAACAAAAACTGCCACAGACTATTTGATTGGAAAAGACCCAGTTCTGGACATTACTAAAAATCGGATCTATCAAATTCTGAAGTTGAATAACTATAACCCTCAATATGTAGGGAGCATCCTATGCGGATGGGTGAAAAGAGAATTCAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCTACGGACCTGCGACCACCGGAAAGACCAACATAGCCGAGGCTATTGCCCATGCTGTACCCTTCTATGGCTGTGTTAACTGGACTAATGAGAACTTCCCATTCAATGACTGCGTTGATAAAATGCTTATATGGTGGGAGGAGGGAAAAATGACCAATAAAGTAGTGGAATCCGCAAAAGCGATACTGGGGGGGTCTGCTGTACGAGTTGATCAAAAGTGTAAGGGGTCTGTTTGTATTGAACCTACTCCTGTAATAATTACCAGTAATACTGATATGTGCATGATTGTGGATGGAAATTCTACTACAATGGAACACAGAATTCCTTTGGAGGAAAGAATGTTCCAGATTGTTCTTTCCCATAAGCTGGAAGGAAATTTTGGAAAAATTTCAAAAAAGGAGGTAAAAGAGTTTTTCAAATGGGCCAATGATAATCTTGTTCCAGTAGTTTCTGAGTTCAAAGTCCCTACGAATGAACAAACCAAACTTACTGAGCCCGTTCCTGAACGAGCGAATGAGCCTTCCGAGCCTCCTAAGATATGGGCTCCACCTACTAGGGAGGAGCTAGAGGAGATATTAAGAGCGAGCCCCGAGCTCTTTGCTTCAGTTGCTCCTCTGCCTTCCAGTCCGGAGAGATCTCCTGAGAGAAAGAAAACCCGTCGGGACTATCAGGTACGCTGTGCTATGCACAGTTTAGATAACTCTATGAATGTTTTTGAATGCCTGGAGTGTGAAAGAGCTAATTTTCCTGAATTTCAGAGTCTGGGTGAAAACTTTTGTAATCAACATGGGTGGTATGATTGTGCATTCTGTAATGAACTGAGAGATGACATGAATGAAATTGAACATGTTTTTGCTATTGATGATATGGAGAATGAACAATAAAGATTGTACAAAATAGCTATGTCTACTTTTTTAGAGAAATTTGAAGACTGGTATGAGACTGCAGCCGCATCTTGGCGGCATTTGAAAGCTGGAGCCCCCAAGCCAAAATCAAACCAACAATCTCAGTCTGTGTCTACAGACAGAAAACCCCAACGAAAAGACAATAATAGGGGCTTTGTACTTCCTGGCTATAAGTATCTTGGGCCTGGTAACGGCCTTGATAAAGGGCCACCTGTCAATAAAGCGGACAGCGTCGCGCTTGAGCACGATAAAGCGTACGACCAGCAGCTCAAGGCAGGAGACAACCCCTATATAAAATTTAATCACGCAGATCAAGAATTTATAGATAATCTGCAAGGTGATACCTCCTTTGGAGGCAACCTCGGAAAAGCCGTATTCCAAGCTAAAAAAAGAATTCTAGAGCCTTTAGGCCTAGTAGAAGAACCTGTAAACACGGCTCCTGCTAAAAAGAGTAGTGGAAAACTAACAGATCACTACCCTATAGTAAAGAAGCCTAAATTATCTGAAGAAAACTCTCCTTCACCTAGTAATAGTGGAGGAGAAGCAAGTGCAGCTGCCACCGAAGGCTCCGAACCTGTGGCAGCACCTAACATGGCAGAGGGAGGAAGCGGAGCTATGGGCGACTCTGCAGGGGGTGCCGATGGAGTGGGTAATGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGAGACACAGTCATCACAAAGACCACCAGAACCTGGGTCCTGCCAAGCTACAACAACCACATCTACAAAGCGATTACCAGTGGAACCTCTCAAGATGCAAATGTCCAGTATGCAGGATACAGTACCCCCTGGGGGTACTTTGATTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCTCCAAGAGACTGGCAGAGACTTATCAACAACCATTGGGGAATCAGACCCAAGTCTCTTAAATTCAAGATCTTCAATGTCCAAGTCAAAGAAGTCACAACGCAGGATCAGACGAAGACCATTGCAAACAATCTCACGTCAACAATTCAAGTCTTTACGGATGACGAGCATCAACTCCCGTATGTCCTGGGCTCGGCTACAGAAGGCACCATGCCGCCGTTCCCGTCGGATGTCTATGCCCTGCCGCAGTACGGGTACTGCACCATGCACACCAACCAGAATGGAGCACGGTTCAATGACCGTAGTGCATTCTACTGCTTAGAGTACTTCCCTAGTCAGATGCTAAGAACAGGCAACAACTTTGAGTTCACATTTGACTTTGAAGAAGTTCCTTTCCATAGCATGTTCGCTCATTCACAGGACTTAGACAGGCTGATGAACCCCCTAGTGGATCAATACCTCTGGAATTTCAATGAGGTAGACAGCAACAGAAATGCTCAATTTAAAAAGGCTGTGAAAGGCGCTTATGGCACCATGGGCCGCAATTGGCTGCCAGGACCTAAATTCCTGGACCAGAGAGTTAGGGCCTATCCAGGCGGAACAGATAATTATGCAAACTGGAACATCTGGAGTAATGGAAACAAGGTTAATTTGAAGGACAGGCAGTACCTCCTGCAACCTGGACCTGTATCAGCTACTCACACAGAAGCAGAGGCTTCCAGCATCCCAGCCCAAAATATTTTAGGTTTAGCTAAAGATCCATACAGATCTGGCAGCACTGCAGCAGGAATAAGTGATATTATGGTCACGGACGAGCAGGAAGTAGCACCTACAAACGGCGTAGGGTGGAAACCATATGGCAAGACTGTAACGAATGAACAAAACACTACTAGAGCTCCTACGAGTTCAGATCTTGATGTTCTTGGAGCTTTACCAGGAATGGTTTGGCAGAACAGAGATATATATCTACAGGGTCCTATATGGGCTAAAATACCCAAAACAGATGGGAAATTTCATCCTTCTCCAAACCTGGGAGGTTTTGGTCTCCATAATCCACCTCCCCAGGTCTTTATTAAAAATACTCCTGTTCCTGCAGATCCTCCACTAGAGTATGTAAATCAGAAGTGGAATTCTTACATTACACAGTATTCAACAGGGCAGTGTACTGTAGAAATGGTCTGGGAACTCAGAAAAGAAAACTCCAAGAGATGGAACCCTGAGATCCAATTTACCAGTAACTTTGGAAATAGAACAAGTACTATGTTTGCTCCAAGTGAGACTGGAGGCTATGTAGAAGATAGGCTGATTGGTACCAGATATTTGACTCAGAATCTGTAA。

本技术简单、快捷的获取了MDGPV 基因组的完整编码区序列，为进一步研究水禽细小病毒基因组奠定了基础。

本发明设计的简并引物不会出现影响PCR 反应的发夹结构，引物二聚体，上下游引物交联。

该技术相比较分段克隆技术而言，能完成长片段PCR扩增，工作量小( 只需克隆一次)，具有成本低，效率高的优势。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

 

序 列 表

  SEQUENCE LISTING

<110>  福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>  一种克隆番鸭小鹅瘟病毒基因组编码区全序列的方法

<130>  1

<140>  1/FJ

<141>  2014-08-21

<160>  3     

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  4101

<212>  DNA

<213>  Muscovy duck origin goose parvovirus

<400>  1

atggcatttt ctaggcctct tcagatttct tctgacaaat tctatgaagt tatcatcagg     60

ctaccctcgg atattgatca agatgtgcct ggtttgtctc ttaactttgt agaatggctt    120

tctacggggg tctgggagcc caccggaata tggaatatgg agcatgtgaa tctccccatg    180

gttactctgg cagacaaaat caagaacatt ttcatccaga gatggaacca attcaatcag    240

gacgaaacgg atttcttctt tcaattggaa gaaggcagtg agtacatcca tctgcattgc    300

tgcattgccc aggggaatgt ccgatctttt gttctgggga gatacatgtc tcaaattaaa    360

gactcaattc tgagagatgt gtatgaaggg aaacaggtaa aaatcccgga ttggttttct    420

ataactaaaa ccaaacgggg agggcaaaat aagaccgtga ctgctgctta tattctgcat    480

tacctgattc ctaaaaaaca accggaatta caatgggctt ttaccaatat gccccttttc    540

actgctgctg ctttatgcct ccaaaagagg caagagttac tggatgcttt tcaggaaagt    600

gagatgaatg ctgtagtgca ggaggatcaa gcttcaactg tagctcccct tatttccaac    660

agagcagcaa agaactatag caatctggtt gattggctca ttgagatggg tatcacctct    720

gaaaaacagt ggctaactga aaataaagag agctaccgga gctttcaggc tacatcttca    780

aacaacagac aagtaaaagc agcacttgaa aatgcccgag cagaaatgct actaacaaaa    840

actgccacag actatttgat tggaaaagac ccagttctgg acattactaa aaatcggatc    900

tatcaaattc tgaagttgaa taactataac cctcaatatg tagggagcat cctatgcgga    960

tgggtgaaaa gagaattcaa caaaagaaat gccatatggc tctacggacc tgcgaccacc   1020

ggaaagacca acatagccga ggctattgcc catgctgtac ccttctatgg ctgtgttaac   1080

tggactaatg agaacttccc attcaatgac tgcgttgata aaatgcttat atggtgggag   1140

gagggaaaaa tgaccaataa agtagtggaa tccgcaaaag cgatactggg ggggtctgct   1200

gtacgagttg atcaaaagtg taaggggtct gtttgtattg aacctactcc tgtaataatt   1260

accagtaata ctgatatgtg catgattgtg gatggaaatt ctactacaat ggaacacaga   1320

attcctttgg aggaaagaat gttccagatt gttctttccc ataagctgga aggaaatttt   1380

ggaaaaattt caaaaaagga ggtaaaagag tttttcaaat gggccaatga taatcttgtt   1440

ccagtagttt ctgagttcaa agtccctacg aatgaacaaa ccaaacttac tgagcccgtt   1500

cctgaacgag cgaatgagcc ttccgagcct cctaagatat gggctccacc tactagggag   1560

gagctagagg agatattaag agcgagcccc gagctctttg cttcagttgc tcctctgcct   1620

tccagtccgg agagatctcc tgagagaaag aaaacccgtc gggactatca ggtacgctgt   1680

gctatgcaca gtttagataa ctctatgaat gtttttgaat gcctggagtg tgaaagagct   1740

aattttcctg aatttcagag tctgggtgaa aacttttgta atcaacatgg gtggtatgat   1800

tgtgcattct gtaatgaact gagagatgac atgaatgaaa ttgaacatgt ttttgctatt   1860

gatgatatgg agaatgaaca ataaagattg tacaaaatag ctatgtctac ttttttagag   1920

aaatttgaag actggtatga gactgcagcc gcatcttggc ggcatttgaa agctggagcc   1980

cccaagccaa aatcaaacca acaatctcag tctgtgtcta cagacagaaa accccaacga   2040

aaagacaata ataggggctt tgtacttcct ggctataagt atcttgggcc tggtaacggc   2100

cttgataaag ggccacctgt caataaagcg gacagcgtcg cgcttgagca cgataaagcg   2160

tacgaccagc agctcaaggc aggagacaac ccctatataa aatttaatca cgcagatcaa   2220

gaatttatag ataatctgca aggtgatacc tcctttggag gcaacctcgg aaaagccgta   2280

ttccaagcta aaaaaagaat tctagagcct ttaggcctag tagaagaacc tgtaaacacg   2340

gctcctgcta aaaagagtag tggaaaacta acagatcact accctatagt aaagaagcct   2400

aaattatctg aagaaaactc tccttcacct agtaatagtg gaggagaagc aagtgcagct   2460

gccaccgaag gctccgaacc tgtggcagca cctaacatgg cagagggagg aagcggagct   2520

atgggcgact ctgcaggggg tgccgatgga gtgggtaatg cctcaggaaa ttggcattgc   2580

gattcccaat ggctgggaga cacagtcatc acaaagacca ccagaacctg ggtcctgcca   2640

agctacaaca accacatcta caaagcgatt accagtggaa cctctcaaga tgcaaatgtc   2700

cagtatgcag gatacagtac cccctggggg tactttgatt tcaacagatt ccactgccac   2760

ttctctccaa gagactggca gagacttatc aacaaccatt ggggaatcag acccaagtct   2820

cttaaattca agatcttcaa tgtccaagtc aaagaagtca caacgcagga tcagacgaag   2880

accattgcaa acaatctcac gtcaacaatt caagtcttta cggatgacga gcatcaactc   2940

ccgtatgtcc tgggctcggc tacagaaggc accatgccgc cgttcccgtc ggatgtctat   3000

gccctgccgc agtacgggta ctgcaccatg cacaccaacc agaatggagc acggttcaat   3060

gaccgtagtg cattctactg cttagagtac ttccctagtc agatgctaag aacaggcaac   3120

aactttgagt tcacatttga ctttgaagaa gttcctttcc atagcatgtt cgctcattca   3180

caggacttag acaggctgat gaacccccta gtggatcaat acctctggaa tttcaatgag   3240

gtagacagca acagaaatgc tcaatttaaa aaggctgtga aaggcgctta tggcaccatg   3300

ggccgcaatt ggctgccagg acctaaattc ctggaccaga gagttagggc ctatccaggc   3360

ggaacagata attatgcaaa ctggaacatc tggagtaatg gaaacaaggt taatttgaag   3420

gacaggcagt acctcctgca acctggacct gtatcagcta ctcacacaga agcagaggct   3480

tccagcatcc cagcccaaaa tattttaggt ttagctaaag atccatacag atctggcagc   3540

actgcagcag gaataagtga tattatggtc acggacgagc aggaagtagc acctacaaac   3600

ggcgtagggt ggaaaccata tggcaagact gtaacgaatg aacaaaacac tactagagct   3660

cctacgagtt cagatcttga tgttcttgga gctttaccag gaatggtttg gcagaacaga   3720

gatatatatc tacagggtcc tatatgggct aaaataccca aaacagatgg gaaatttcat   3780

ccttctccaa acctgggagg ttttggtctc cataatccac ctccccaggt ctttattaaa   3840

aatactcctg ttcctgcaga tcctccacta gagtatgtaa atcagaagtg gaattcttac   3900

attacacagt attcaacagg gcagtgtact gtagaaatgg tctgggaact cagaaaagaa   3960

aactccaaga gatggaaccc tgagatccaa tttaccagta actttggaaa tagaacaagt   4020

actatgtttg ctccaagtga gactggaggc tatgtagaag ataggctgat tggtaccaga   4080

tatttgactc agaatctgta a                                             4101

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  PCR上游引物

<400>  2

cacccgcatg cgcccgatct gcc                                             23

<210>  3

<211>  28

<212>  DNA

<213>  PCR下游引物

<400>  3

gcatgcgccc gatcagcctt gacaaccg                                        28

Claims (6)

1. 一种克隆番鸭小鹅瘟病毒基因组编码区全序列的方法，其特征在于包括下述步骤：

1) 从含有MDGPV番鸭胚尿囊液中提取病毒基因组DNA ；

2) 以步骤1) 的DNA 作为模板，采用下述引物进行PCR ：

上游引物P1：5’-CACCCGCATGCGCCCGATCTGCC-3’；

下游引物P2：5’-GCATGCGCCCGATCAGCCTTGACAACCG-3’；

3) 回收和纯化上述PCR产物，获得目的基因片段；

4) 将目的基因片段与pcDNA3.1D/V5-His-TOPO vector载体连接加入到JM109感受态细胞中进行转化培养，筛选其中的阳性菌落进行培养，以菌液为模板进行PCR 即得MDGPV基因组编码区全序列。

2. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于步骤1) 从含有MDGPV番鸭胚尿囊液中提取病毒基因组DNA。

3. 根据权利要求2 所述的方法，其特征在于采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取并纯化病毒DNA。

4. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于步骤2) 采用高保真PCR。

5. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于步骤3) 采用纯化回收试剂盒回收PCR 产物。

6. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于还包括将步骤4) 所得MDGPV-PT株基因组编码区全序列与其它水禽细小病毒分离株基因组编码区全序列进行同源性比对验证的步骤。