ES2267096T3

ES2267096T3 - Proteinas bacterianas exportadas y vacunas acelulares basadas en las mismas.

Info

Publication number: ES2267096T3
Application number: ES94927328T
Authority: ES
Inventors: H. Robert Masure; Barbara J Pearce; Elaine Tuomanen
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1993-09-01
Filing date: 1994-09-01
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2014-09-01
Also published as: NZ273497A; NO321826B1; DE69434784T2; EP0721506B1; FI960977A; WO1995006732A2; EP0721506A1; NO960839D0; DE69434784D1; NO960839L; US5981229A; US5928900A; WO1995006732A3; FI960977A0; JPH09504686A; JP3722834B2; DK0721506T3; AU7680994A; AU709405B2; PT721506E

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA IDENTIFICACION DE PROTEINAS EXPORTADAS BACTERIANAS GRAM POSITIVAS, Y LOS GENES QUE LAS CODIFICAN. EN PARTICULAR, LA INVENCION SE REFIERE A LAS PROTEINAS EXPORTADAS DE ADHESION ASOCIADA, Y A ANTIGENOS COMUNES A MUCHAS O TODAS LAS CEPAS DE UNA ESPECIE DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A VACUNAS ACELULARES PARA PROPORCIONAR UNA PROTECCION FRENTE A LA INFECCION BACTERIAS GRAM POSITIVAS UTILIZANDO DICHOS GENES O PROTEINAS, Y A ANTICUERPOS CONTRA DICHAS PROTEINAS PARA SU USO EN EL DIAGNOSTICO Y TERAPIA INMUNE PASIVA. EN UNA REALIZACION PREFERIDA, SE DESCRIBEN FRAGMENTOS DE DIEZ GENES QUE CODIFICAN PROTEINAS EXPORTADAS DE S. PNEUMONIAE, Y SE DEMUESTRA LA ACTIVIDAD FUNCIONAL DE ALGUNAS DE ESTAS PROTEINAS EN LA ADHERENCIA.

Description

Proteínas bacterianas exportadas y vacunas acelulares basadas en las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la identificación de proteínas bacterianas exportadas y de los genes que codifican estas proteínas. La invención también se refiere a vacunas acelulares para proporcionar protección frente a una infección bacteriana usando estas proteínas y a anticuerpos frente a estas proteínas para su uso en diagnóstico y en inmunoterapia pasiva.

Antecedentes de la invención

Las proteínas exportadas en bacterias participan en muchas funciones celulares diversas y esenciales, tales como movilidad, transducción de señales, transporte y ensamblaje macromolecular, y en la adquisición de nutrientes esenciales. Para bacterias patogénicas, muchas proteínas exportadas son determinantes de virulencia que funcionan como adhesinas para colonizar y, de este modo, infectar al hospedador, o como toxinas para proteger a la bacteria frente al sistema inmune del hospedador (para una revisión, véase Hoepelman y Tuomanen, 1992, Infect. Immun. 60:1729-33).

Desde que Jenner desarrolló la vacuna frente a la viruela en el siglo XVIII, la vacunación ha sido un importante armamento en el arsenal frente a los microorganismos infecciosos. Antes de la introducción de los antibióticos, la vacunación era la principal esperanza para proteger a las poblaciones frente a la infección vírico o bacteriana. Con la llegada de los antibióticos a principio del siglo XX, la vacunación frente a infecciones bacterianas se volvió mucho menos importante. Sin embargo, la reciente aparición de cepas de bacterias infecciosas resistentes a antibióticos ha dado lugar al reestablecimiento de la importancia de las vacunas antibacterianas.

Una posibilidad para una vacuna antibacteriana es el uso de bacterias muertas o atenuadas. Sin embargo, las vacunas bacterianas completas tienen varias desventajas, incluyendo la posibilidad de una reversión de la bacteria muerta o atenuada a virulenta debido a una muerte o atenuación incompleta y a la inclusión de componentes tóxicos como contaminantes.

Otra vacuna alternativa es inmunizar con la cápsula bacteriana de hidratos de carbono. Actualmente, las vacunas frente a Streptococcus pneumoniae emplean conjugados compuestos de las cápsulas de los 23 serotipos más comunes de esta bacteria. Estas vacunas no son eficaces en los individuos más susceptibles a la infección patológica (jóvenes, ancianos e inmunodeprimidos) debido a su incapacidad para provocar una respuesta inmune de células T. Un estudio reciente ha mostrado que esta vacuna sólo protege al 50% de estos individuos (Shapiro y col., 1991, N. Engl. J. Med. 325:1453-60).

Una alternativa a las vacunas bacterianas completas son las vacunas acelulares o las vacunas de subunidades en las que el antígeno incluye una proteína de la superficie bacteriana. Estas vacunas potencialmente podrían superar las deficiencias de las vacunas bacterianas completas o basadas en cápsulas. Además, dada la importancia de las proteínas exportadas en la virulencia bacteriana, estas proteínas son un objetivo importante para la intervención terapéutica. De especial importancia son las proteínas que representan un antígeno común en todas las cepas de una especie de bacteria en particular para su uso en una vacuna que protegería frente a todas las cepas de la bacteria. Sin embargo, hasta la fecha sólo se ha identificado un pequeño número de proteínas exportadas de bacterias Gram positivas y ninguna de estas representa un antígeno común para una especie en particular de bacterias.

Se ha sugerido una estrategia para el análisis genético de proteínas exportadas en E. coli tras la descripción de fusiones traduccionales a un gen truncado de una fosfatasa alcalina (phoA) que carecía de secuencia señal funcional (Hoffman y Wright, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:5107-5111). En este estudio, la actividad enzimática se detectaba fácilmente en cepas que tenían fusiones génicas entre las regiones codificadoras de secuencias de señales heterólogas y phoA lo que indicaba que la actividad enzimática requería la translocación a través de la membrana citoplásmica. Posteriormente, se construyó un transposón modificado, TnphoA, para facilitar la detección sistemática rápida de las fusiones génicas traduccionales (Manoil y Beckwith, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:8129-8133). Esta poderosa herramienta se ha modificado y usado en muchos patógenos Gram negativos, tales como Escherichia coli (Guitierrez y col., 1987, J. Mol. Biol. 195:289-297), Vibrio cholera (Taylor y col., 1989, J. Bacteriol. 171:1870-1878), Bordetella pertussis (Finn y col., 1991, Infect. Immun. 59:3273-9; Knapp y Mekalanos, 1988, J. Bacteriol. 170:5059-5066) y Legionella pneumophila (Albano y col., 1992, Mol. Microbiol. 6:1829-39) para producir una gran cantidad de información para la identificación y caracterización de proteínas exportadas. Se ha usado con el mismo fin una estrategia similar basada en fusiones génicas a una forma truncada del gen de la \beta-lactamasa (Broome-Smith y col., 1990, Mol. Microbiol. 4:1637-1644). También se ha desarrollado una estrategia directa para mapear la topología de proteínas exportadas, basada en fusiones de tipo "sándwich" de genes a phoA (Ehrmann y col., 1990, 87:7574-7578).

Por diversas razones, el uso de fusiones génicas como selección genética para proteínas exportadas en organismos Gram positivos ha encontrado un éxito limitado. Se han diseñado vectores plasmídicos que crearán fusiones traduccionales en dos o tres partes con los genes de la fosfatasa alcalina, \beta-lactamasa y a-amilasa de Bacillus subtilis y Lactococcus lacti (Payne y Jackson, 1991, J. Bacteriol. 173:2278-82; Perez y col., 1992, Mol. Gen. Genet. 234:401-11; Smith y col., 1987, J. Bacteriol. 169:3321-3328; Smith y col., 1988, Gene 70:351-361). Se han usado fusiones génicas entre phoA y el gen de la proteína A (spa) de Staphylococcus aureus para determinar la localización celular de esta proteína (Schneewind y col., 1992, Cell. 70:267-81). En este estudio, sin embargo, no se recoge la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina.

Las estrategias de mutagénesis en diversas especies de estreptococos también se han visto limitadas por diversas razones. No se han desarrollado transposones eficaces para estreptococos similares a aquellos que son las herramientas principales para el estudio de bacterias Gram negativas. La mutagénesis por inserción de duplicación con vectores plasmídicos que no se replican ha sido una alternativa eficaz en Streptococcus pneumoniae (Chen y Morrison, 1988, Gene. 64:155-164; Morrison y col., 1984, J. Bacteriol. 159:870). Esta estrategia ha llevado a la mutagénesis, aislamiento y clonación de diversos genes de neumococos (Alloing y col., 1989, Gene. 76:363-8; Berry y col., 1992, Microb. Pathog. 12:87-93; Hui y Morrison, 1991, J. Bacteriol. 173:372-81; Lacks y Greenberg, 1991, Gene.104: 11-7; Laible y col., 1989, Mol. Microbiol. 3:1337-48; Martin y col., 1992, J. Bacteriol. 174:4517-23; McDaniel y col., 1987, J. Exp. Med. 165:381-94; Prudhomme y col., 1989, J. Bacteriol. 171:5332-8; Prudhomme y col., 1991, J. Bacteriol. 173:7196-203; Puyet y col., 1989, J. Bacteriol. 171:2278-2286; Puyet y col., 1990, J. Mol. Biol. 213:727-38; Radnis y col., 1990, J. Bacteriol. 172:3669-74; Sicard y col., 1992, J. Bacteriol. 174:2412-5; Stassi y col., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:7028-7032; Tomasz y col., 1988, J. Bacteriol. 170:5931-5934; Yother y col., 1992, J. Bacteriol. 174:610-8).

La proteína A de la superficie del neumococo (PspA) destaca en la búsqueda de proteínas exportadas de neumococos que podrían ser objetivos atractivos para una vacuna (véase Yother y col., 1992, anterior). Se ha descrito que PspA es una candidata para una vacuna frente a S. pneumoniae ya que hasta la fecha se ha encontrado en todos los neumococos; la proteína purificada puede usarse para provocar una respuesta inmune protectora en ratones y los anticuerpos frente a la proteína confieren inmunidad pasiva en ratones (Talkington y col., 1992, Microb. Pathog. 13:343-355). Sin embargo, PspA muestra variabilidad antigénica entre las cepas en la mitad del extremo N-terminal de la proteína, que contiene los epítopos inmunogénicos y que inducen protección (Yother y col., 1992, anterior). Esta proteína no representa un antígeno común para todas las cepas de S. pneumoniae y, por tanto, no es un candidato óptimo para vacuna.

Recientemente, en especies de bacterias Gram positivas y Gram negativas se han exportado proteínas de fusión aparente que contenían PhoA a (Pearce y Masure, 1992, Abstr. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol. 92:127, resumen D-188). Este resumen describe la inserción de ADN de neumococo antes del extremo 5' del gen phoA de E. coli que carece de sus secuencias señal y promotora en un vector conductor capaz de la expresión tanto en E. coli como en S. pneumoniae, y sugiere que deben encontrarse rutas similares para la translocación de proteínas exportadas a través de las membranas plasmáticas para ambas especies de bacterias.

Estudios recientes han demostrado que la transferencia genética en diversas especies bacterianas depende de un mecanismo de respuesta a señales entre células individuales. La transferencia por conjugación de plásmidos está mediada por homoserina lactonas en Agrobacterium tumefaciens (Zhang y col., 1993, Science 362:446-448) y mediante polipéptidos secretados en Enterococcus faecalis (para revisión, véase Clewell, 1993, Cell 73:9-12). Se han descrito activadores peptídicos de bajo peso molecular que inducen la transformación en S. pneumoniae (Tomasz, 1965, Nature 208:155-159; Tomasz, 1966, J. Bacteriol. 91:1050-61; Tomasz y Mosser, 1966, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:58-66) y en Streptococcus sanguis (Leonard y Cole, 1972, J. Bacteriol. 110:273-280; Pakula y col., 1962, Acta Microbiol. Pol. 11:205-222; Pakula y Walczak, 1963, J. Gen. Microbiol. 31:125-133). Se ha descrito un activador peptídico que regula tanto la esporulación como la transformación en B. subtilis (Grossman y Losick, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4369-73). Además, las evidencias genéticas sugieren que las permeasas peptídicas pueden mediar en estos procesos tanto en E. faecalis (Ruhfel y col., 1993, J. Bacteriol. 175:5253-59; Tanimoto y col., 1993, J. Bacteriol. 175:5260-64) como en B. subtilis (Rudner y col., 1991, J. Bacteriol. 173:1388-98).

En S. pneumoniae, la transformación tiene lugar como un suceso programado durante un estado fisiológicamente definido como "competente". Inducido por una señal desconocida de manera dependiente de densidad, las células muestran un único ciclo de competencia entre 5 x 10^{6} y 1-2 x 10^{7} ufc/ml que es el principio del crecimiento logarítmico (Tomasz, 1966, anterior). Con la inducción, se expresa un conjunto único de proteínas asociadas con la competencia (Morrison y Baker, 1979, Nature 282:215-217) lo que sugiere una regulación global de los genes asociados con la transformación. Las bacterias competentes unen y transportan el ADN exógeno, que si es homólogo se incorpora mediante recombinación al genoma de la célula receptora. Al cabo de una o dos divisiones celulares, las bacterias ya no siguen siendo competentes. Como con la inducción, la inactivación de la competencia tiene lugar mediante un mecanismo desconocido.

Las referencias citadas en este documento no se interpretará como una admisión de que ésta es una técnica previa a la presente invención.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a genes que codifican proteínas exportadas en una bacteria Gram positiva y las proteínas codificadas por estos genes. En especial, la presente invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 y el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

La invención además se refiere a una vacuna para la protección de un sujeto animal frente a la infección con una bacteria Gram positiva que comprende un vector que contiene un gen que codifica una proteína exportada de una bacteria Gram positiva unida de forma operativa con un promotor capaz de expresar directamente el gen en el sujeto, en la que la proteína exportada es una permeasa, en la que dicho gen contiene una secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1.

En otro aspecto, la invención se dirige a una vacuna para la protección de un sujeto animal frente a una infección con una bacteria Gram positiva que comprende una cantidad inmunogénica de una proteína exportada de una bacteria Gram positiva y un adyuvante, en la que la proteína exportada es una permeasa, en la que dicha proteína exportada contiene una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2. Preferiblemente, estas vacunas contienen la proteína conjugada covalentemente con una cápsula o cápsulas bacterianas de una o más cepas de bacterias. Más preferiblemente, en la vacuna se incluyen las cápsulas de todas las cepas comunes de una especie de bacterias.

Alternativamente, la proteína puede usarse para inmunizar un animal apropiado para generar anticuerpos policlonales o monoclonales, como se describe en detalle a continuación. De este modo, la invención además se refiere a anticuerpos que reaccionan con proteínas exportadas de bacterias Gram positivas. Estos anticuerpos pueden usarse en inmunoensayos para diagnosticar una infección con una cepa o especie de bacteria en particular. En un aspecto específico, la especie de bacteria es S. pneumoniae. Los anticuerpos también pueden usarse para la inmunización pasiva para tratar una infección con bacterias Gram positivas.

De este modo, es objeto de la presente invención proporcionar genes que codifican proteínas exportadas de bacterias Gram positivas.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar una vacuna acelular frente a una bacteria Gram positiva, superando, de este modo, las deficiencias de las vacunas de bacterias completas muertas o atenuadas y vacunas capsulares.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna capsular que provoque una respuesta inmune de células T colaboradoras.

Aún un objeto adicional de la invención es proporcionan el diagnóstico de una infección con una bacteria Gram positiva.

Otro objeto de la invención es proporcionar terapia inmune pasiva para una infección bacteriana Gram positiva, especialmente una infección por una bacteria resistente a un antibiótico.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Construcción de vectores de fusión de PhoA diseñados para la mutación e identificación genética de proteínas exportadas en S. pneumoniae. (A) El fragmento de 2,6 kb de pPHO7 que contenía una forma truncada de phoA se insertó en los sitios SmaI o BamHI de pJDC9 para generar pHRM100 y pHRM104, respectivamente. T1T2 son terminadores de transcripción y las flechas indican la orientación del gen. (B) Mecanismos de mutagénesis por inserción de duplicación conjugado con la fusión génica. La actividad de PhoA depende de la clonación de un fragmento génico interno que está en fase y después del extremo 3' del gen que codifica una proteína exportada. La transformación en S. pneumoniae da lugar a la duplicación del fragmento diana y a la consecuente alteración del gen.

Figura 2. Detección y susceptibilidad a la tripsina de las fusiones de PhoA en S. pneumoniae. Los lisados celulares completos (50 \mug de proteína) de R6x (carril 1; cepa parental); SPRU98 (carril 2); SPRU97 (carril 3) y SPRU96 (carril 4) se aplicaron en un gel de poliacrilamida al 8%-25% en presencia de SDS. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con un anticuerpo anti-PhoA. Los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron mediante quimioluminiscencia potenciada con un anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa. SRPU96 y 97 contienen los plásmidos pHRM100 y pHRM104 integrados de forma aleatoria en el cromosoma. A la izquierda se indican los patrones de peso molecular. Las bacterias completas de la cepa SPRU98 se trataron con (carril 5) y sin (carril 6) 50 \mug/ml de tripsina durante 10 min a 37ºC. Ambas muestras se trataron con un exceso molar de 40 veces de inhibidor de tripsina de soja. En los lisados celulares completos (50 \mug de proteína) se ensayó la presencia de material inmunoreactivo con PhoA, como se describe a continuación. A la izquierda se indican los patrones de peso molecular.

Figura 3. Los productos de fusión de PhoA son más estables cuando las bacterias se cultivan en presencia de oxidantes de disulfuro. Los cultivos de SPRU98 se cultivaron en presencia de 2-hidroxietil disulfuro 600 \muM (carril 1), DsbA 10 \muM (carril 2) o sin ningún añadido (carril 3). Los lisados celulares completos (50 \mug de proteína) se aplicaron en un gel de poliacrilamida en presencia de SDS al 8-25%. A continuación, se ensayó la presencia de material inmunoreactivo en las proteínas con un anticuerpo anti-PhoA como se describe en la Figura 2.

Figura 4. Secuencias de aminoácidos derivados de los loci genéticos recuperados de los mutantes PhoA^{+} de neumococos. Cada uno de los plásmidos recuperados de las nueve cepas PhoA^{+} de S. pneumoniae (véase la Tabla 1) se transformó en E. coli y tenía inserciones de 400 a 700 pares de bases. Cada plásmido se secuenció usando un cebador para el extremo 5' de phoA, de aproximadamente 200 a 500 pares de bases del ADN del neumococo inmediatamente antes del extremo 5' de phoA y se estableció una región codificadora en fase con PhoA. Las secuencias de aminoácidos derivadas de las fusiones se representan como Exp1 [ID SEC Nº 2], Exp2 [ID SEC Nº 24], Exp3 [ID SEC Nº 6], Exp4 [ID SEC Nº 8], Exp5 [ID SEC Nº 10], Exp6 [ID SEC Nº 12], Exp7 [ID SEC Nº 14], Exp8 [ID SEC Nº 16] y Exp9a [ID SEC Nº 18]. La secuencia derivada del extremo 5' de la inserción de Exp9 también está representada en Exp9b [ID SEC Nº 20].

Figura 5. Alineamientos de secuencia de las secuencias de aminoácidos derivadas de los loci Exp recuperados de los mutantes PhoA^{+}. Se representan los valores de coincidencia mayores para cada inserción. A la derecha se representa el porcentaje de identidad (%ID) y el porcentaje de similitud (%SIM) para cada alineamiento. (A) Exp1 [ID SEC Nº 2] y AmiA de S. pneumoniae [ID SEC Nº 23] (Alloing y col., 1990, Mol. Microbiol. 4:633-44). B) Exp2 [ID SEC Nº 24] y PonA de S. pneumoniae [ID SEC Nº 24] (Martin y col., 1992, J. Bacteriol. 174:4517-23). C) Exp3 [ID SEC Nº 25] y PilB de N. gonorrhoeae [ID SEC Nº 26] (Taha y col., 1988, EMBO J. 7:4367-4378). La histidina (H_{408}) conservada en PilB no está presente en Exp3 pero se sustituye por asparragina (N_{124}). D) Exp4 [ID SEC Nº 27] y CD4B del tomate [ID SEC Nº 28] (Gottesman y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3513-7). E) Exp5 [ID SEC Nº 29] y PtsG de B. subtilis [ID SEC Nº 30] (Gonzy-Tréboul y col., 1991, Mol. Microbiol. 5:1241-1294). F) Exp6 [ID SEC Nº 31] y GlpD de B. subtilis [ID SEC Nº 32] (Holmberg y col., 1990, J. Gen. Microbiol. 136:2367-2375). G) Exp7 [ID SEC Nº 33] y MgtB de S. thyphimurium [ID SEC Nº 34] (Snavely y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:815-823). El ácido aspártico conservado (D_{554}) necesario para la autofosforilación también está presente en Exp7 (D_{37}). H) Exp8 [ID SEC Nº 35] y CyaB de B. pertussis [ID SEC Nº 36] (Glaser y col., 1988, Mol. Microbiol. 2:1930; Glaser y col., 1988, EMBO J. 7:3997-4004). I) Exp9 y DeaD de E. coli (Toone y col., 1991, J. Bacteriol. 173:3291-3302). La secuencia superior de Exp9 [ID SEC Nº 37] deriva del extremo 5' de la inserción plasmídica recuperada y es comparable a DeaD 135-220 [ID SEC Nº 38]. La secuencia inferior de Exp9 [ID SEC Nº 20] deriva del extremo 3' de la inserción plasmídica recuperada justo en dirección 5' y es comparable a DeaD 265-342 [ID SEC Nº 39]. Se subraya la secuencia DEAD conservada.

Figura 6. Localización subcelular de la fusión Exp9-PhoA. Las fracciones de membrana (carril 1) y citoplásmica (carril 2) (50 \mug de proteína de cada muestra) de SPRU17 se aplicaron en un gel de poliacrilamida al 10-15% en presencia de SDS. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y se incubaron con un anticuerpo anti-PhoA. A la izquierda se indican los patrones de peso molecular.

Figura 7. Adherencia de neumococos de tipo 2AII (\blacksquare) o no encapsulado R6 (\medcirc) a células alveolares de tipo II de conejo. El ensayo de adherencia se realizó como se describe en el Ejemplo 2, a continuación.

Figura 8. Valoración de la adherencia de mutantes de neumococos a células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Las cepas mutantes ensayadas se enumeran en la Tabla 1. Las mutaciones de exp1, cepa SPRU98 (\medbullet); exp2, cepa SPRU64 (\medcirc); exp3, cepa SPRU40 (\blacksquare); exp10, cepa SPRU25 1000 y amiA, cepa SPRU121 (\blacklozenge) dan lugar a un descenso en la capacidad de la cepa mutante para adherirse. La cepa R6 (\blacksquare) es S. pneumoniae natural.

Figura 9. Adherencia de mutantes de neumococos a células de pulmón de Tipo II. La mutación del gen exportado y las denominaciones de la cepa se describen en la Figura 8.

Figura 10. Secuencias de nucleótidos y deducida de aminoácidos para el locus genético recuperado del mutante SPRU25, exp10. La secuencia de nucleótidos se obtuvo como se describe en la Figura 4 y en el Ejemplo 1, a continuación.

Figura 11. Secuencias de nucleótidos (ID SEC Nº 46) y de la proteína derivada (ID SEC Nº 47) de pIpA. La secuencia consenso de modificación de la lipoproteína se señala con un asterisco sobre el resto de cisteína donde podría tener lugar la escisión. Después del extremo 3' de la región codificadora se subraya un posible terminador de transcripción independiente de rho. Se indican las posiciones de las fusiones de PhoA en Leu_{197} de SPRU58 y en Asp_{492} de SPRU98. (Número de acceso a Genbank: PENDIENTE DE ASIGNACIÓN).

Figura 12. Análisis de secuencia de proteínas de unión a péptidos. A; alineamiento de secuencia de PIpA (ID SEC Nº 47) y AmiA (ID SEC Nº 48). Se han enmarcado los restos idénticos. B; alineamientos de secuencia de las proteínas de unión al sustrato de las permeasas de diferentes especies bacterianas: PIpA, S. pneumoniae (este estudio); AmiA, S. pneumoniae. La secuencia descrita para amiA (Alloing y col., 1990, Mol. Microbiol. 4:633-6454) se ha cambiado ahora debido a un error de secuenciación y la secuencia corregida está ahora en Genbank); Spo0KA, B. subtilis (Perego y col., 1991, Mol. Microbiol. 5:173-185; Rudner y col., 1991, J. Bacteriol. 173:1388-98); HbpA, H. influenzae (Hanson y col., 1992, Infect. Immun. 60:2257-66); DciAE, B. subtilis (Mathiopoulos y col., 1991, Mol. Microbiol. 5:1903-13); OppA (Ec), E. coli (Kashiwagi y col., 1990, J. Biol. Chem. 265:8387-91); TraC, E. faecalis (Tanimoto y col., 1993, J. Bacteriol. 175:5260-64); DppA, E. coli (Abouhamad y col., 1991, Mol. Microbiol. 5:1035-47); PrgZ, E. faecalis (Ruhfel y col., 1993, J. Bacteriol. 175:5253-59); OppA (St) S. typhimurium (Hiles y col., 1987, J. Mol. Biol. 195:125-142) y SarA, S. gordonii. Las secuencias de aminoácidos derivadas se alinearon con el grupo de programas de software MACAW (Schuler y col., 1993, Proteins Struct. Funct. Genet. 9:180-190). Los recuadros negros y los recuadros rayados indican las regiones de mayor similitud de secuencia con valores de probabilidad menores o iguales a 1,3 x 10^{-7}, con el tamaño eficaz de la búsqueda de espacio derivada de las longitudes de todas las secuencias en la base de datos.

Figura 13. Localización subcelular y marcaje de PIpA-PhoA. Panel superior: Las fracciones subcelulares (50 \mug de proteína total) de SPRU98 (PhoA^{+}, pHRM104::pIpA) se aplicaron en un gel de poliacrilamida al 8-25% en presencia de SDS, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con antisueros anti-PhoA. Los anticuerpos unidos se detectaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa y se visualizaron con quimioluminiscencia potenciada. Los carriles son A, sobrenadante del cultivo; B, membranas; C, citoplasma y D, pared celular. Panel inferior: Los inmunoprecipitados con anti-PhoA de lisados celulares completos del cultivo de bacterias en un medio químicamente definido con [^{3}H]-ácido palmítico se aplicaron en un gel de poliacrilamida al 8-25% en presencia de SDS, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sometieron a autorradiografía. Los carriles son E, cepa parental R6x; F, SPRU100 (PhoA^{+}, pHRM104::zzz) y G, SPRU98 (PhoA^{+}, pHRM104::pIpA). La flecha marca la banda de 93 kDa que corresponde con la proteína de fusión PIpA-PhoA inmunoprecipitada.

Figura 14. Análisis por inmunotransferencia del ARN total de permeasas de péptidos de neumococos. Los preparados de ARN (10 \mug) de SPRU107 (pJDC9::pIpA) (carriles A y C) y de R6x (carriles B y D) se hibridaron con sondas de ADN de pIpA (carriles A y B) o amiA (carriles C y D). Se indican los pesos moleculares.

Figura 15. Eficacia de transformación de mutantes de permeasas de neumococos. En diversas cepas que contienen las construcciones génicas cromosómicas mostradas con lesiones en pIpA o en ami se ensayó la incorporación de un marcador cromosómico de resistencia a la estreptomicina como medida de la eficacia de transformación. La eficacia de transformación de cada cepa se representa como porcentaje de la cepa parental, R6x, que produce de forma rutinaria el 0,3% de transformantes Str^{r} en la población total de células susceptibles de transformación. Los valores representados son la media de al menos tres valores con el error típico de la media. Los resultados son representativos de ensayos realizados en tres ocasiones independientes. E es resistencia a eritromicina codificada por el vector.

Figura 16. Perfiles de competencia de mutantes de permeasas de neumococos. El porcentaje de células susceptibles de transformación se determinó a DO específicas durante el crecimiento logarítmico temprano de R6x n, SPRU107 I (pJDC9::pIpA) y SPRU114 s (pJDC9::amiA). Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 17. Efecto de una mutación de pIpA en la expresión del locus rec que regula la competencia. La actividad fosfatasa alcalina se midió en SPRU100, n (PhoA^{+}, pHRM104::exp10) y SPRU156, s (PhoA^{+}, pHRM104::exp10; pWG5::pIpA) durante el crecimiento logarítmico de neumococos que producen un ciclo de competencia normal. Cada valor es la media de dos valores con un error típico de la media que no excedía del 10% de éste punto. Estos resultados son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 18. Mapa físico de pIpA y de plásmidos recombinantes generados a partir de diversos procedimientos de clonación. Plásmidos con las inserciones que contiene el inicio de pH en el vector de PhoA, pHRM104 mientras que los plásmidos con las inserciones que contiene en el inicio de pJ en el vector pJDC9. La mayoría de los plásmidos se crearon por "desplazamiento sobre el cromosoma" con el plásmido integrado pJpIp1. El plásmido pJpIp9 se creó mediante "clonación por homología" con los oligonucleótidos lipo1 y P1. Véanse los procedimientos experimentales para los detalles. Se muestran los sitios para endonucleasas de restricción: H (HindIII), Hc (HincII), E (EcoRI), K (KpnI), P (PstI), R (EcoRV), Sau (SauIIIa), S (SphI).

Figura 19. Adherencia de R6 natural (\boxempty) y mutante Pad1(\blacksquare) de neumococos a las células pulmonares de tipo II. Este ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 2.

Figura 20. (A) Localización subcelular de la fusión Pad1-PhoA detectada mediante análisis por inmunotransferencia con un antisuero anti-PhoA. Las células se separaron en los componentes de membrana (Carriles A-C) y componentes citoplásmicos (Carriles D-F). Carriles A,D: células naturals (parentales) R6; B,E: células mutantes Pad1; C,F: células mutantes Pad1b. (B) Sonda de lisado bacteriano con el anticuerpo frente a la bacteria completa mediante análisis por inmunotransferencia. Los carriles A, B y C se corresponden con (A). Los mutantes Pad1 carecen de la proteína inmunogénica de 17 kDa asociada a membrana encontrada en la bacteria R6.

Figura 21. Adherencia de la bacteria R6 y de los mutantes Pad1 cultivados en presencia o ausencia de acetato. El cultivo en acetato corrige el defecto de la adherencia de Pad1.

Figura 22. Cultivo del mutante Pad1 y de la bacteria R6 en presencia o ausencia de acetato. El mutante Pad1 se cultivó en un medio de cultivo químicamente definido para S. pneumoniae en presencia del 0% (\medcirc), 0,1% (\Diamond) y 0,5% (\boxempty) de acetato. R6 se cultivó en presencia de 0% (cuadrados con aspa) y 0,5% (\Delta).

Figura 23. Secuencias de nucleótidos (ID SEC Nº 55) y de aminoácidos deducida de Pad1 (ID SEC Nº 56), también denominado poxB. Están subrayados el posible sitio de unión a ribosomas, los sitios -10 y -35 y se marca el codón de inicio.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y de recombinación de ADN dentro de la experiencia en la materia. Estas técnicas se explican en detalle en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en este documento "Sambrook y col., 1989"); "DNA Cloning: A Practical Approach", volúmenes I y II (D.N. Glover editor, 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait editor 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames y S.J. Higgins editores (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames y S.J. Higgins, editores (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, editores (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Por lo tanto, cuando aparezcan en este documento, las expresiones siguientes tendrán las definiciones establecidas a continuación.

Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, capaz de replicarse bajo su propio control.

Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN que lleva, de ese modo, a la replicación del segmento unido.

La expresión "vector vírico" se refiere a un virus que contiene un ácido nucleico recombinante, a través del cual el virus puede introducir el ácido nucleico recombinante en una célula, es decir, el virus puede transformar la célula. Según la presente invención, estos vectores pueden usarse para la administración de una vacuna basada en ácido nucleico, como se describe en este documento.

Una célula se ha "transformado" mediante un ADN exógeno o heterólogo cuando este ADN se ha introducido dentro de la célula. El ADN transformante puede o no integrarse (unido covalentemente) en el ADN cromosómico para formar parte del genoma celular. En células procarióticas, de levaduras y de mamíferos por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episomal tal como un plásmido. Un "clon" es una población de células derivadas por mitosis de una única célula o de un predecesor común.

Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a la forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN") en forma de hebra sencilla o de una hélice de hebra doble. Son posibles las hélices de hebra doble de ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. La expresión molécula de ácido nucleico y, en particular molécula de ADN o ARN, se refiere sólo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a ninguna forma terciaria en particular. De este modo, esta expresión incluye ADN de hebra doble encontrado, entre otros, en moléculas de ADN lineal o circular (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Para la descripción de la estructura de las moléculas de ADN de doble hebra en particular, en este documento las secuencias pueden describirse según la convención normal de dar sólo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de ADN (es decir, la hebra que tiene una secuencia homóloga al ARNm). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha experimentado una manipulación por biología molecular.

Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" con otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico o ARN, cuando una forma de hebra sencilla de la molécula de ácido nucleico puede condensar con la otra molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución (véase Sambrook y col., 1989, anterior). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles errores de apareamiento entre bases. La rigurosidad apropiada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Preferiblemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 10 nucleótidos, más preferiblemente de al menos aproximadamente 15 nucleótidos.

Una "secuencia codificadora" de ADN es una secuencia de ADN de doble hebra que se transcribe y traduce in vivo en un polipéptido cuando se sitúa bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan mediante un codón de inicio en el extremo 5' (amino) terminal y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxilo) terminal. Una secuencia codificadora puede incluir, pero sin limitaciones, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamífero) e incluso secuencias de ADN sintético. Si la secuencia codificadora está destinada a su expresión en una célula eucariótica, normalmente se localizará 3' de la secuencia codificadora, una señal de poliadelinación y una secuencia de terminación de la transcripción.

Las secuencias de control de transcripción y de traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificadora en una célula hospedadora. En células eucarióticas, las señales de poliadenilación son secuencias control.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora después del extremo 3' (dirección 3'). Con el propósito de definir la presente invención, la secuencia promotora se une a su extremo 3' terminal mediante el sitio de iniciación de transcripción y se extiende antes del extremo 5' (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo.

Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de la transcripción (convenientemente definido mediante el mapeo con la nucleasa S1), así como dominios de unión a proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos contendrán a menudo, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT".

Una secuencia codificadora está "bajo el control" de las secuencias de control de transcripción y traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificadora a ARNm, que a continuación se traduce a la proteína codificada a partir de la secuencia codificadora.

Puede incluirse una "secuencia señal" antes de la secuencia codificadora. Esta secuencia codifica un péptido señal, en el extremo N-terminal del polipéptido, que dirige a la célula hospedadora para que el polipéptido se transloque a la superficie celular o secrete el polipéptido al medio, y la célula degrada selectivamente este péptido señal tras la exportación. Las secuencias señal puede encontrarse asociadas con diversas proteínas nativas de procariotas o eucariotas.

Como se usa en este documento, la expresión "proteína exportada" se refiera a una proteína que contiene una secuencia señal y, de este modo, se encuentra asociada a o fuera de la membrana celular. De este modo, las proteínas secretadas, proteínas integrales de membrana, proteínas de superficie y similares están incluidas en la clase de proteínas exportadas. La expresión "proteína de superficie" como se usa en este documento pretende especialmente referirse a una proteína que está accesible en la superficie celular, por ejemplo, para unirse con un anticuerpo.

Una "proteína asociada a la adhesión" es una proteína que está implicada directa o indirectamente en la adherencia de bacterias a las células diana, tales como células endoteliales o células de pulmón. La expresión "proteína asociada a la adhesión" incluye proteínas que pueden tener otras actividades funcionales, tales como movilidad, traducción de señal, ensamblaje de la pared celular o transporte macromolecular. Una "adhesina" es una proteína asociada a la adhesión encontrada en la superficie de una célula, tal como una bacteria, que esta implicada directamente en la adherencia y, de este modo, causa cierto grado de adherencia o adhesión a otra célula. De particular importancia para la presente invención son las adhesinas de bacterias Gram positivas que promueven la adhesión a células eucarióticas, es decir, que están implicadas en la virulencia de bacterias. Las adhesinas, para ser eficaces en la estimulación de la adherencia, deberían ser proteínas de superficie, es decir, estar accesibles en la superficie de la célula. La accesibilidad también es importante para determinar la antigenicidad. Una vacuna que provoca anticuerpos frente a una adhesina puede proporcionar anticuerpos que se unen a un determinante antigénico accesible e interferir directamente con la adherencia, previniendo, de este modo, la infección. Una adhesina de la invención no necesita ser la única adhesina o mediador de adhesión de una bacteria Gram positiva, y la expresión contempla a cualquier proteína para la que se demuestra cierto grado de actividad de adhesión, ya sea relativamente fuerte o relativamente débil.

Un "determinante de virulencia" es cualquier producto bacteriano requerido para la supervivencia bacteriana dentro de un hospedador infectado. De este modo, los determinantes de virulencia también son atractivos candidatos para vacuna puesto que la neutralización de un determinante de virulencia puede reducir la virulencia de la bacteria.

Una "toxina" es cualquier producto bacteriano que daña activamente a un hospedador infectado. De este modo, las toxinas bacterianas son dianas importantes para una respuesta inmune que neutralice su toxicidad.

Una molécula es "antigénica" cuando es capaz de interaccionar específicamente con una molécula de reconocimiento del antígeno del sistema inmune, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o el receptor de antígeno de célula T. Un polipéptido antigénico contiene al menos aproximadamente 5, y preferiblemente al menos aproximadamente 10 aminoácidos. Una porción antigénica de una molécula puede ser aquella porción que es inmunodominante para el anticuerpo o para el reconocimiento del receptor de la célula T, o puede ser una porción usada para generar un anticuerpo frente a la molécula conjugando la porción antigénica con una molécula portadora para la inmunización. Una molécula que es antigénica no necesita ser en sí misma inmunogénica, es decir, capaz de provocar una respuesta inmune sin un portador.

Una composición que comprende "A" (donde "A" es una proteína, molécula de ADN, vector, etc., único) está sustancialmente libre de "B" (donde "B" comprende una o más proteínas, moléculas de ADN, vectores, etc., contaminantes) cuando al menos aproximadamente el 75% en peso de las proteínas, ADN, vectores (dependiendo de la categoría de la especie a la que pertenecen A y B) de la composición es "A". Preferiblemente, "A" comprende al menos aproximadamente el 90% en peso de las especies A+B de la composición, mas preferiblemente al menos aproximadamente el 99% en peso. También se prefiere que una composición, que está sustancialmente libre de contaminación, contenga sólo una especie de peso molecular único que tiene la actividad o característica de la especie de interés.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y típicamente no producen una reacción alérgica adversa o similar, tal como molestias gástricas, mareos y similar, cuando se administra a un humano. Preferiblemente, como se usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o Estatal o incluido en la Farmacopea de los EE.UU. o en otra farmacopea generalmente reconocida, para su uso en animales y, más en particular, en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el compuesto. Estos portadores farmacéuticos puede ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Preferiblemente se emplean como portadores, especialmente para soluciones inyectables, agua o soluciones salinas acuosas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol.

El término "adyuvante" se refiere a un compuesto o mezcla que potencia la respuesta inmune a un antígeno. Un adyuvante puede servir como un depósito tisular que libera lentamente el antígeno y también como un activador del sistema linfoide que potencia de forma inespecífica la respuesta inmune (Hood y col., Immunology, Segunda Edición, 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, pág. 384). A menudo, una inmunización primaria con un antígeno sólo, en ausencia de un adyuvante, no conseguirá provocar una respuesta inmune humoral o celular. Los adyuvantes incluyen, pero sin limitaciones, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas superficiales, tales como lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o de hidratos de carbono, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes potencialmente útiles para humanos, tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Preferiblemente, el adyuvante es farmacéuticamente aceptable.

En este primer aspecto, la presente solicitud describe la identificación y aislamiento de un gen que codifica una proteína exportada en una bacteria Gram positiva. La proteína exportada puede ser una proteína de función conocida o desconocida. En este documento, todas las proteínas exportadas, de función conocida o desconocida, se denominan como "Exp" (del inglés exported protein, proteína exportada) y los genes que codifican estas proteínas se denominan como genes "exp". En particular, la solicitud describe el aislamiento de genes que codifican proteínas asociadas con la adhesión de bacterias Gram positivas, preferiblemente adhesinas, determinantes de virulencia, toxinas y antígenos inmunodominantes.

En particular, la solicitud describe diversas proteínas exportadas de S. pneumoniae (véase la Tabla 1, a continuación), algunas de las cuales tienen actividad demostrada como adhesinas. Por ejemplo, la solicitud describe fragmentos génicos de las siguientes proteínas exportadas: también se describen Exp1 [ID SEC Nº 2], cuya secuencia de longitud completa, denominada Plp1 [ID SEC Nº 47], codificada por exp1 [ID SEC Nº 1] y plp1 [ID SEC Nº 46], respectivamente, una proteína que parece estar relacionada con la familia de proteínas permeasas y que está, por tanto, sorprendentemente asociada con la adhesión; Exp2 [ID SEC Nº 3], codificado por exp2 [ID SEC Nº 4], cuya secuencia de ácido nucleico es idéntica a ponA, que codifica la proteína de unión a penicilina 1A (Martin y col., 1992, J. Bacteriol. 174:4517-4523) y que inesperadamente está asociada con la adhesión; Exp3 [ID SEC Nº 6], codificada por exp3 [ID SEC Nº 5], que está asociada con la adhesión; Exp4 [ID SEC Nº 8], codificada por exp4 [ID SEC Nº 7], que se asocia con la adhesión; Exp5 [ID SEC Nº 10], codificada por exp5 [ID SEC Nº 9]; Exp6 [ID SEC Nº 12], codificado por exp6 [ID SEC Nº 11]; Exp7 [ID SEC Nº 14], codificada por exp7 [ID SEC Nº 13]; Exp8 [ID SEC Nº 16], codificado por exp8 [ID SEC Nº 15]; Exp9 [ID SEC Nº 18 y 20], codificada por exp9 [ID SEC Nº 17 y 19, respectivamente]; Exp10 [ID SEC Nº 22], codificada por exp10 [ID SEC Nº 21] y Pad1 [ID SEC Nº 56], codificada por pad1 [ID SEC Nº 55], que es un homólogo de la piruvato oxidasa. Las denominaciones de las cepas de bacterias mutantes en las que se han identificado las proteínas Exp1-9, se describen en la Tabla 1. La denominación de la cepa del mutante en el que se ha identificado Exp10 es SPRU25. Los solicitantes también han aislado un mutante de S. pneumoniae (SPRU121) en el que se ha mutado el gen amiA que codifica la proteína AmiA y por primera vez se ha demostrado que ésta es una proteína asociada con la adhesión y, de este modo, esta proteína puede usarse en una vacuna para provocar una respuesta inmune frente a una proteína asociada a la adhesión.

Una vez que se aíslan los genes que codifican las proteínas exportadas, pueden usarse directamente como una vacuna in vivo basada en ácidos nucleicos. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos de los genes puede usarse para preparar sondas oligonucleotídicas o cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para diagnosticar la infección con una cepa en particular o con especies de bacterias Gram positivas.

Alternativamente, pueden expresarse las proteínas codificadas por los genes aislados y usarse para preparar vacunas para la protección frente a la cepa de bacterias de la que se ha obtenido la proteína exportada. Si la proteína exportada es una proteína asociada con la adhesión, tal como una adhesina, es una candidata especialmente atractiva para vacunas ya que la inmunidad puede interferir con la capacidad bacteriana para adherirse a las células hospedadoras e infectar, de este modo, es decir, colonizar y sobrevivir dentro del organismo hospedador. Si la proteína exportada es un determinante de virulencia, la inmunidad puede interferir con la virulencia. Si la proteína exportada es una toxina, la inmunidad puede interferir con la toxicidad. Si la proteína exportada es un antígeno común a todas o a la mayoría de las cepas de una especie de bacteria en particular, es una candidata ideal para una vacuna frente a todas o la mayoría de las cepas de esta especie, por ejemplo, S. pneumoniae.

Alternativamente, la proteína puede usarse para inmunizar un animal apropiado para generar anticuerpos policlonales o monoclonales, como se describe en detalle a continuación. Estos anticuerpos pueden usarse en inmunoensayos para diagnosticar una infección con una cepa o especie de bacteria en particular. De este modo, pueden usarse proteínas exportadas específicas de cepa para generar anticuerpos específicos de cepa para el diagnóstico de la infección con esta cepa. Alternativamente, pueden usarse antígenos comunes para preparar anticuerpos para el diagnóstico de la infección con esta especie de bacteria, por ejemplo, S. pneumoniae.

Si la Exp es una adhesina, la proteína soluble puede administrarse a un sujeto sospechoso de sufrir una infección para inhibir la adherencia de la bacteria.

Aislamiento de genes de proteínas exportadoras

La presente solicitud describe varios fragmentos génicos que pueden usarse para obtener el gen de longitud completa que codifica antígenos exportados de bacterias Gram positivas, en especial, adhesinas exportadas.

La solicitud además describe un procedimiento, usando un vector que codifica una proteína indicadora que es funcional sólo cuando una bacteria la exporta, tal como el vector phoA descrito en este documento, para seleccionar genes que codifican proteínas exportadas de neumococos. Por ejemplo, puede colocarse una forma truncada de phoA en un vector conductor de neumococos, tal como el vector pJDC9 (Chen y Morrison, 1988, Gene 64:155-164). Puede localizarse un sitio de clonación que contiene un sitio de restricción único, por ejemplo, SmaI o BamHI, inmediatamente 5' de phoA, para permitir la inserción de ADN que puede codificar una proteína exportada. Preferiblemente, los sitios de clonación en el vector están flanqueados por dos sitios de restricción para facilitar la identificación fácil de una inserción. En una realización específica, el sitio de restricción es un sitio KpnI, aunque puede usarse cualquier endonucleasa de restricción. Los fragmentos génicos que codifican las Exp se seleccionan basándose en la tinción azul alrededor de la bacteria, lo que indica la exportación de la enzima PhoA. Los genes de fusión exp-phoA pueden expresarse en E. coli, aunque puede requerirse la fusión de un promotor en este caso. Cuando el gen de fusión exp-phoA se integra en el genoma de un organismo Gram positivo, es una fusión traduccional implicada en mutagénesis por duplicación y se expresa en una bacteria Gram positiva. En una realización específica, se identifican proteínas exportables de neumococos con esta técnica, que requiere la clonación de un fragmento génico interno en el vector previo a la integración.

La solicitud también describe la selección de genes que codifican proteínas exportadas asociadas con la adhesión, realizada en transformantes PhoA-positivos, probando la perdida de adherencia de una bacteria Gram positiva a una célula primaria o a una línea celular a la que normalmente se adhiere. Estos ensayos de adhesión pueden realizarse en cualquier línea celular eucariótica. Preferiblemente, si la infección en humanos es importante, la célula o línea celular deriva de una fuente humana o se ha demostrado que se comporta como células humanas en un ensayo in vitro en particular. Las células y líneas celulares adecuadas incluyen, pero sin limitaciones, células endoteliales, células de pulmón, leucocitos, células bucales, células adenoides, células de la piel, células conjuntivas, células ciliadas y otras células representativas de los órganos infectados. Como se demuestra en un ejemplo, a continuación, puede usarse una línea de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que está disponible en Clonetics (San Diego, CA). En otro ejemplo, a continuación, se usan células alveolares de pulmón de Tipo II, que pueden prepararse como se describe en el Ejemplo 2 o pueden obtenerse como una línea celular disponible en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso ATCC A549. Alternativamente, puede probarse la adherencia a macrófagos derivados de monocitos humanos, obtenidos de la sangre. Otras células diana, especialmente para S. pneumoniae, son las células orofaríngeas, tales como las células epiteliales bucales (Andersson y col. 1988, Microb. Pathogen. 4:267-278; 1983, J. Exp. Med. 158:559-570; 1981, Infect. Immun. 32:311-317).

Generalmente, puede usarse cualquier ensayo de adherencia conocido en la técnica para demostrar la pérdida de adhesión debida a la mutagénesis de Exp. Uno de estos ensayos es el siguiente: las células en las que se va a ensayar la adherencia se cultivan durante 4-8 días (Wright y Silverstein, 1982, J. Exp. Med. 156:1149-1164) y, a continuación, se transfieren a placas de Terasaki 24 horas antes del ensayo de adherencia para permitir la formación de una monocapa confluente (Geelen y col., 1993, Infect. Immun. 61:1538-1543). Las bacterias se marcan con fluoresceína (Geelen y col., anterior), se ajustan a una concentración de 5 x 10^{7} ufc/ml y se añaden en un volumen de 5 \mul a al menos 6 pocillos. Tras la incubación a 37ºC durante 30 min, las placas se lavan y se fijan con PBS/glutaraldehído al 2,5%. Las bacterias unidas se cuentan visualmente usando un microscopio de fluorescencia, tal como un Microscopio Diaphot Invertido de Nikon equipado con epifluorescencia.

Puesto que la adherencia de una bacteria Gram positiva, en particular S. pneumoniae, a una célula diana está determinada por dos mecanismos, las proteínas de la pared celular y las adhesinas, puede ser importante distinguir si la mutación en la proteína exportada que inhibe la adherencia es una mutación de una proteína implicada en la síntesis de la pared celular o de una adhesina. La mutación de la primera tendría un efecto indirecto en la adherencia, mientras que la mutación en la segunda afectaría directamente a la adherencia. Pueden usarse los siguientes ensayos para distinguir si la proteína mutada es una adhesina o no: (1) puesto que la adherencia a macrófagos está mediada principalmente por proteínas exportadas, los ensayos de adherencia a macrófagos indicarán inmediatamente si la mutación es en una adhesina; (2) la adición independiente de la pared celular bacteriana tendrá un efecto mínimo en la adherencia si la mutación fuese en una proteína implicada directamente en la adherencia y una inhibición adicional de la adherencia si se añade un mutante mutado en una adhesina; (3) el tratamiento previo de la bacteria con una proteasa, tal como tripsina, dará lugar a una inhibición adicional de la adherencia si la mutación es en una proteína implicada indirectamente en la adherencia, pero no tendrá efecto si la proteína mutada es una adhesina; (4) una vez que se aísla el gen exp de longitud completa, la posible adhesina puede expresarse en E. coli o en otro tipo celular, o la posible adhesina puede asociarse covalentemente con diferentes soportes tales como una bacteria, un eritrocito o una perla de agarosa, y puede evaluarse la capacidad de la posible adhesina para mediar en la adherencia; (5) puede evaluarse la estructura de la pared celular de los mutantes usando técnicas convencionales, en particular, trazado del perfil de HPLC, para determinar si la mutación da lugar a cambios en la estructura de la pared celular, que es indicativo de una mutación en una proteína implicada indirectamente con la adherencia.

La presente solicitud también describe genes identificados que codifican determinantes de virulencia exportados. Generalmente, los determinantes de virulencia pueden identificarse probando la virulencia la cepa mutante en un modelo animal, por ejemplo, evaluando la DL_{50} del animal infectado con la cepa. Un aumento en la DL_{50} es indicativo de una pérdida de virulencia y, por tanto, de la mutación ocurrida en un locus requerido para la virulencia.

La solicitud también describe la identificación de una Exp que es un antígeno común a todas o muchas de las cepas de una especie de bacterias, o en especies de bacterias muy relacionadas. Esto se consigue fácilmente usando un anticuerpo específico de una Exp (cuya preparación se describe en detalle a continuación). La capacidad del anticuerpo para esta cepa en particular y para todas o muchas otras cepas de esta especie, o para especies muy relacionadas, demuestra que la Exp es un antígeno común. Este ensayo de anticuerpo es especialmente preferido ya que es más relevante inmunológicamente, puesto que la Exp, que es un antígeno común, es un candidato atractivo para vacuna.

Generalmente, la solicitud también describe la identificación de una propiedad funcional de una proteína producida por un gen exp comparando la homología de la secuencia de aminoácidos deducida o de nucleótidos con la secuencia de aminoácidos de una proteína conocida, o la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína.

Cualquier célula bacteriana Gram positiva potencialmente puede servir como la fuente de ácido nucleico para la clonación molecular de un gen exp. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden aislarse a partir de Streptococcus, Bacillus, Mycobacterium, Staphylococcus, Enterococcus y otras fuentes de bacterias Gram positivas, etc. El ADN puede obtenerse mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica de clonación de ADN (por ejemplo, una "biblioteca" de ADN), mediante síntesis química, mediante clonación de ADNc o mediante la clonación de ADN genómico, o fragmentos de los mismos, purificados a partir de la célula deseada (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, anterior, Glover, D. M. (editor), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, Reino Unido Vol. I, II). Cualquiera que sea la fuente, el gen se clonará molecularmente en un vector adecuado para la propagación del gen.

En la clonación molecular del gen a partir de ADN genómico, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán el gen deseado. El ADN puede escindirse en sitios específicos usando diversas enzimas de restricción. Alternativamente, puede usarse una ADNasa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN puede romperse físicamente, por ejemplo, mediante sonicación. A continuación, los fragmentos de ADN lineal pueden separarse según el tamaño mediante técnicas convencionales que incluyen, pero sin limitaciones, electroforesis en geles de agarosa y poliacrilamida y cromatografía en columna.

Una vez que se generan los fragmentos de ADN, la identificación del fragmento de ADN específico que contiene el gen exp deseado puede llevarse a cabo de varias formas. Por ejemplo, si se dispone de una cantidad de una porción de un gen exp o de un fragmento del mismo y puede purificarse y marcarse, los fragmentos de ADN generados pueden seleccionarse mediante hibridación de ácidos nucleicos con la sonda marcada (Benton y Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein y Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). Aquellos fragmentos de ADN con homología sustancial con la sonda hibridarán. La presente invención proporciona ejemplos específicos de fragmentos de ADN que pueden usarse como sondas de hibridación para las proteínas exportadas de neumococos. Estas sondas de ADN pueden basarse, por ejemplo, en las ID SEC Nº 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ó 21. Alternativamente, la técnica de detección sistemática de la invención puede usarse para aislar fragmentos de genes exp adicionales para su uso como sondas.

También es posible identificar el fragmento apropiado mediante digestión o digestiones con enzimas de restricción y comparando los tamaños de los fragmentos con los esperados según un mapa de restricción conocido si se dispone de éste. Puede realizarse una selección adicional basándose en las propiedades del gen.

Como se describe anteriormente, la presencia del gen puede detectarse mediante ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de su producto de expresión. Por ejemplo, los clones de ADN que producen una proteína que, por ejemplo, tiene migración electroforética, comportamiento en electroenfoque, mapas de digestión proteolítica, actividad proteolítica, propiedades antigénicas o propiedades funcionales, especialmente actividad de adhesión, como se conoce (o en el caso de una proteína asociada a la adhesión, se desconoce) similares o idénticos para una Exp en particular. En un ejemplo específico, a continuación la capacidad de una proteína Exp de neumococos para mediar en la adhesión se demuestra mediante la inhibición de la adhesión cuando la proteína está mutada. La expresión de Exp en otras especies, tales como E. coli, puede demostrar directamente si el exp codifica una
adhesina.

Las alternativas al aislamiento del ADN genómico de exp incluyen, pero sin limitaciones, sintetizar químicamente la secuencia misma del gen a partir de una secuencia conocida que codifica una Exp. Por ejemplo, clonando el ADN de un gen exp puede aislarse a partir de una bacteria Gram positiva mediante PCR usando oligonucleótidos degenerados. Son posibles otros procedimientos.

A continuación, el gen identificado y aislado puede insertarse en un vector de clonación apropiado. Pueden usarse un gran número de sistemas vector-hospedador conocidos en la técnica. Los posibles vectores incluyen, pero sin limitaciones, plásmidos o virus modificados, pero el sistema vector debería ser compatible con la célula hospedadora usada. Por ejemplo, la secuencia codificadora de exp puede insertarse en un vector de clonación de E. coli. Otros ejemplos de vectores incluyen, pero sin limitaciones, bacteriófagos tales como derivados de lambda o plásmidos tales como derivados de pBR322 o derivados del plásmido pUC, por ejemplo, vectores pGEX, pma1-c, pFLAG, etc., La inserción en un vector de clonación puede, por ejemplo, obtenerse ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. Sin embargo, los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN puede modificarse enzimáticamente. Alternativamente, puede producirse cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (enlazadores) en los extremos del ADN; estos enlazadores ligados pueden comprender oligonucleótidos específicos sintetizados químicamente que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. Pueden introducirse moléculas recombinantes en células hospedadoras mediante transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de modo que se generan muchas copias de la secuencia génica.

En un procedimiento alternativo, el gen deseado puede identificarse y aislarse tras la inserción en un vector de clonación adecuado con una estrategia de "secuenciación aleatoria forzada". El enriquecimiento en el gen deseado, por ejemplo, mediante fraccionamiento de tamaño, puede hacerse tras la inserción en el vector de clonación.

La transformación de células hospedadoras con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen exp aislado o la secuencia de ADN sintetizada permite la generación de copias múltiples del gen. De este modo, el gen puede obtenerse en mayores cantidades cultivando transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinante a partir de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen insertado del ADN recombinante aislado.

La solicitud presente también describe vectores que contienen genes que codifican análogos y derivados de Exp que tienen la misma actividad funcional que una Exp. Se contempla la producción y uso de derivados y análogos relacionados con una Exp. Por ejemplo, el derivado o análogo puede ser funcionalmente activo, es decir, capaz de exhibir una o más actividades funcionales asociadas con una Exp natural de longitud completa. Como un ejemplo, estos derivados o análogos demuestran actividad adhesina.

En particular, pueden obtenerse derivados de Exp alterando secuencias de ácido nucleico codificadoras mediante sustituciones, adiciones o deleciones que proporcionan moléculas funcionalmente equivalentes. Debido a la degeneración de las secuencias nucleotídicas codificadoras, pueden usarse otras secuencias de ADN que codifica sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que un gen exp. Estas incluyen, pero sin limitaciones, secuencias de nucleótidos que comprenden todos o porciones de los genes exp que están alterados mediante la sustitución de codónes diferentes que codifican el mismo resto de aminoácidos en la secuencia, produciendo de este modo, un cambio sinónimo. Asimismo, los derivados de Exp incluyen, pero sin limitaciones, aquellos que contienen, como secuencia de aminoácidos primarios, toda o parte de la secuencia de aminoácidos de una Exp incluyendo secuencias alteradas en las que restos de aminoácidos funcionalmente equivalentes se sustituyen por restos de la secuencia, dando lugar a sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, pueden sustituirse en la secuencia uno o más restos de aminoácidos de polaridad similar, que actúa como equivalente funcional, dando lugar a una alteración silenciosa. Los sustitutos para un aminoácido de la secuencia pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase de aminoácidos a la que pertenece. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido
glutámico.

Pueden producirse genes que codifican derivados y análogos de Exp mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que dan lugar a su producción pueden tener lugar a nivel génico o proteico. Por ejemplo, una secuencia génica de exp clonada puede modificarse mediante cualquiera de las numerosas estrategias conocidas en la técnica (Sambrook y col., 1989, anterior). La secuencia puede escindirse en sitios apropiados con endonucleasa o endonucleasas de restricción, seguido de modificación enzimática adicional si se desea, aislamiento y ligamiento in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de Exp, debería tenerse cuidado para asegurarse de que el gen modificado mantiene la misma fase de lectura de traducción que el gen exp, sin interrupciones por señales de traducción, en la región del gen donde se codifica la actividad deseada.

Adicionalmente, la secuencia del ácido nucleico de exp puede mutarse in vitro o in vivo, para crear y/o destruir secuencias de traducción, iniciación y/o terminación, o para crear variaciones en regiones codificadoras y/o formar nuevos sitios para endonucleasas de restricción o destruir los preexistentes, para facilitar una modificación adicional in vitro. Puede usarse cualquier técnica de mutagénesis conocida en la técnica incluyendo, pero sin limitaciones, mutagénesis dirigida a sitio in vitro (Hutchinson, C., y col., 1978, J. Biol. Chem., 253:6551; Zoller y Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant y col., 1986, Gene 44:177; Hutchinson y col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710), uso de enlazadores TAB® (Pharmacia), etc. Las técnicas de PCR son las preferidas para mutagénesis dirigida a sitio (véase Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, editor, Stockton Press, Capítulo 6, pág. 61-70).

Expresión de una proteína exportada

El gen que codifica una Exp, o un fragmento funcionalmente activo u otro derivado del mismo, pueden insertarse en un vector, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificadora de proteína insertada. Un vector de expresión también incluye preferiblemente un origen de replicación. Las señales transcripcionales y traduccionales necesarias también pueden suministrarse mediante el gen exp nativo y/o sus regiones flanqueantes. Pueden utilizarse diversos sistemas vectores hospedadores para expresar la secuencia codificadora de proteína. Preferiblemente, sin embargo, se usa un sistema de expresión bacteriana para proporcionar alto nivel de expresión de la proteína con una probabilidad mayor de la conformación nativa. Los sistemas hospedador-vector potenciales incluyen, pero sin limitaciones, sistemas de células de mamíferos infectadas con virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insectos infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levaduras o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, plásmido de ADN o cósmido de ADN. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus potencias y especificidades. Dependiendo del sistema hospedador-vector utilizado, puede usarse cualquiera de los varios elementos de transcripción y traducción adecuados.

Preferiblemente, la forma periplásmica de la Exp (que contiene una secuencia señal) se produce para exportar la proteína al periplasma de Escherichia coli o en un sistema de expresión basado en Bacillus subtilis. La exportación al periplasma puede promover el plegamiento apropiado de la proteína expresada.

Cualquiera de los procedimientos previamente descritos para la inserción de fragmentos de ADN en un vector, puede usarse para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico compuesto por señales de control de transcripción/traducción y las secuencias que codifican la proteína. Estos procedimientos pueden incluir técnicas de recombinación de ADN in vitro y sintéticas y de recombinación in vivo (recombinación genética).

La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína exportada o un fragmento peptídico puede estar regulada mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de manera que la proteína o péptido exportado se expresa en un hospedador transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de una proteína exportada puede controlarse mediante cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica, pero estos elementos reguladores serán funcionales para la expresión en el hospedador seleccionado. Para la expresión en bacterias se requieren promotores bacterianos. Cuando un vector que contiene un gen exp se inyecta directamente en un sujeto para la expresión transitoria, se prefieren promotores eucarióticos o víricos eucarióticos, incluyendo promotores específicos de tejidos, dando lugar a la protección heteróloga frente a la infección bacteriana, como se describe en detalle a continuación. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión del gen exp incluyen, pero sin limitaciones, la región promotora temprana de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, y col., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de la timidina quinasa del herpes (Wagner y col., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneina (Brinster y col., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión procariótica tal como el promotor de \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff, y col., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) o el promotor tac (DeBoer, y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94 y las siguientes regiones de control de la transcripción animal, que muestran especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa 1 que está activo en células acinares pancreáticas (Swift y col., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz y col., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515), región de control del gen de la insulina que está activo en células pancreáticas de tipo beta (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); región de control del gen de la inmunoglobulina que está activo en células linfoides (Grosschedl y col., 1984, Cell 38:647-658; Adames y col., 1985, Nature 318:533-538; Alexander y col., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control del virus del tumor mamario de ratón que está activo en células de testículo, de mama, linfoides y mastocitos (Leder y col., 1986, Cell 45:485-495), región de control del gen de la albúmina que está activo en el hígado (Pinkert y col., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), región de control del gen de la alfa-fetoproteína que está activo en el hígado (Krumlauf y col., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer y col., 1987, Science 235:53-58); región de control del gen de la alfa1-antitripsina que está activo en el hígado (Kelsey y col., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), región de control del gen de la beta-globina que está activo en células mieloides (Mogram y col., 1985, Nature 315:338-340; Kollias y col., 1986, Cell 46:89-94), región de control del gen de la proteína básica de mielina que está activo en células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead y col., 1987, Cell 48:703-712); región de control del gen de la cadena ligera de la miosina de tipo 2 que está activo en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286) y región control del gen de la hormona de liberación gonadotrófica que está activo en el hipotálamo (Mason y col., 1985, Science 234:1372-1378).

Los vectores de expresión que contienen inserciones del gen exp pueden identificarse mediante cuatro aproximaciones generales: (a) amplificación por PCR del ADN plasmídico o el ARNm específico deseado, (b) hibridación del ácido nucleico, (c) presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras" y (d) expresión de secuencias insertadas. En la primera aproximación, los ácidos nucleicos pueden amplificarse mediante PCR con la incorporación de radionucleótidos o tinción con bromuro de etidio para realizar la detección del producto amplificado. En la segunda aproximación, puede detectarse la presencia de un gen extraño insertado en un vector de expresión mediante la hibridación del ácido nucleico usando sondas que comprenden secuencias que son homólogas con un gen exp insertado. En la tercera aproximación, el sistema vector recombinante/hospedador puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones génicas "marcadoras" (por ejemplo, actividad \beta-galactosidasa, actividad PhoA, actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) causados por la inserción de genes extraños en el vector. Si el gen exp se inserta en la secuencia del gen marcador del vector, los recombinantes que contienen la inserción exp pueden identificarse mediante la ausencia de la función génica marcadora. En la cuarta aproximación, los vectores de expresión recombinantes pueden identificarse ensayando la actividad del producto gen exp expresado por el recombinante. Estos ensayos pueden estar basados, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales del producto génico exp en sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, adherencia a una célula diana o unión con un anticuerpo frente a la proteína exportada.

Una vez que se han establecido un sistema hospedador y unas condiciones de crecimiento adecuados, pueden propagarse los vectores de expresión recombinantes y prepararse en cantidad. Como se ha explicado previamente, los vectores de expresión que pueden usarse incluyen, pero sin limitaciones, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales, tales como el virus vaccinia o adenovirus, virus de insectos tales como baculovirus, vectores de levaduras, vectores bacteriófagos (por ejemplo, lambda) y vectores de ADN plasmídico y cósmido, por nombrar algunos. La elección del vector dependerá del uso deseado del vector, por ejemplo, para la expresión de la proteína en células procarióticas o eucarióticas, o como una vacuna basada en ácidos nucleicos.

Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas o modificadas y procese el producto génico en la manera específica deseada. La expresión a partir de ciertos promotores puede elevarse en presencia de ciertos inductores; de este modo, puede controlarse la expresión de la proteína exportada manipulada genéticamente. Además, las diferentes células hospedadoras tienen características y mecanismos específicos para la traducción y procesamiento y modificación postraduccional (por ejemplo, escisión de la secuencia señal) de proteínas. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación deseada y el procesamiento de la proteína extraña expresada. Sistemas de expresión vector/hospedador diferentes pueden llevar a cabo reacciones de procesamiento, tales como escisiones proteolíticas, a un grado diferente.

Preparación de anticuerpos frente a proteínas exportadas

Las Exp recombinantes y fragmentos u otros derivados o análogos de las mismas, o células que expresan los anteriores pueden usarse como inmunógenos para generar anticuerpos que reconocen la Exp. Estos anticuerpos incluyen, pero sin limitaciones, policlonales, monoclonales, quiméricos, cadena sencilla, fragmentos Fab y una biblioteca de expresión de Fab.

Pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales frente a una Exp recombinante o derivados o análogos de la misma. Para la producción de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos animales hospedadores mediante inyección con la Exp recombinante o un derivado (por ejemplo, fragmento) de la misma incluyendo, pero sin limitaciones, conejos, ratones, ratas, etc. Por ejemplo, la Exp recombinante o fragmento de la misma puede conjugarse con un vehículo inmunogénico, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH). Para aumentar la respuesta inmunológica pueden usarse diversos adyuvantes, dependiendo de las especies hospedadoras, incluyendo pero sin limitaciones, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones oleicas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes potencialmente útiles en humanos tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a una Exp o a un análogo de la misma, puede usarse cualquier técnica que permita la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares en cultivos continuos. Estos incluyen, pero sin limitaciones, la técnica de hibridomas originalmente desarrollada por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica de trioma, la técnica de hibridomas de células B humanas (Kozbor y col., 1983, Immunology Today 4:72) y la técnica de hibridoma del EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96). Los anticuerpos monoclonales también pueden producirse en animales sin patógenos utilizando tecnología reciente (PCT/US90/02545). Pueden usarse anticuerpos humanos y pueden obtenerse usando hibridomas humanos (Cole y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) o mediante la transformación de células B humanas con el virus EBV in vitro (Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77-96). De hecho, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y col., 1984, J. Bacteriol. 159-870; Neuberger y col., 1984, Nature 312:604-608; Takeda y col., 1985, Nature 314:452-454) mediante el empalme de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón específica para una Exp junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada; estos anticuerpos están dentro del alcance de este invención. En terapia inmune pasiva (descrita a continuación), se prefiere usar estos anticuerpos humanos o quiméricos humanizados, ya que es menos probable que los anticuerpos humanos o humanizados induzcan por sí mismos una respuesta inmune, en particular una respuesta alérgica, en comparación con los anticuerpos xenogénicos.

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de EE.UU. 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos de Exp. Por ejemplo, pueden utilizarse las técnicas descritas para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Huse y col., 1989, Science 246:1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para una Exp, sus derivados o análogos.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que contengan el idiotipo de la molécula de anticuerpo mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero sin limitaciones: el fragmento F(ab')_{2} que puede producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2} y los fragmentos Fab que pueden generarse tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.

En la producción de anticuerpos, la selección del anticuerpo deseado puede conseguirse mediante técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayo inmunorradiométrico, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando marcadores de oro coloidal, enzima o radioisótopo, por ejemplo), inmunotransferencias, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, la unión del anticuerpo se detecta mediante la detección de un marcador en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta mediante la detección de la unión de un anticuerpo secundario o un reactivo al anticuerpo primario. En una realización adicional, el anticuerpo secundario está marcado. En la técnica se conocen muchos medios para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un epítopo específico de una Exp, pueden ensayarse hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de Exp que contiene este epítopo. Para la selección de un anticuerpo específico de una Exp de una cepa de bacteria en particular, puede seleccionarse basándose en la unión positiva a esta cepa de bacteria en particular y a la carencia de unión de Exp a otra cepa. Para la selección de un anticuerpo específico de una Exp que es un antígeno común a todos o a muchas cepas de una bacteria en particular, o a especies de bacterias muy relacionadas, puede seleccionarse basándose en la unión a esta cepa en particular y a todas o muchas otras cepas de esta especie o a especies muy relacionadas.

Los anticuerpos anteriores pueden usarse en procedimientos conocidos en la técnica con respecto a la localización y actividad de la Exp, por ejemplo, para inmunotransferencia, captación de imágenes de Exp, medida de los niveles de la misma en muestras fisiológicas apropiadas, etc.

Vacunación y terapia pasiva inmune

La inmunidad activa frente a bacterias Gram positivas puede inducirse mediante inmunización (vacunación) con una cantidad inmunogénica de una proteína exportada o un derivado o fragmento antigénico de la misma, y un adyuvante, en el que la proteína exportada, o derivado o fragmento antigénico de la misma, es el componente antigénico de la vacuna. Preferiblemente, la proteína se conjuga con la cápsula o cápsulas de hidratos de carbono de una o más especies de bacterias Gram positivas. La conjugación covalente de una proteína a un hidrato de carbono es bien conocida en la técnica. Generalmente, la conjugación puede desarrollarse a través de una reacción de condensación por carbodiimida.

La proteína exportada sola o conjugada con una cápsula o cápsulas no puede causar infección bacteriana, y la inmunidad activa provocada por la vacunación con la proteína según la presente invención, puede dar lugar tanto a una respuesta inmune inmediata como a memoria inmunológica y, de este modo, proporcionar protección a largo plazo frente a la infección por la bacteria. Las proteínas exportadas de la presente invención, o fragmentos antigénicos de las mismas, pueden prepararse en una mezcla con un adyuvante para preparar una vacuna.

La selección de un adyuvante depende del sujeto que se va a vacunar. Preferiblemente, se usa un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, en una vacuna para un humano deberían evitarse los adyuvantes de emulsión de aceite o de hidratos de carbono, incluyendo adyuvante completo e incompleto de Freund. Un ejemplo de un adyuvante adecuado para su uso en humanos es el alumbre (gel de alúmina). Una vacuna para un animal, sin embargo, puede contener adyuvantes no apropiados para su uso en humanos.

Una alternativa a una vacuna tradicional que comprende un antígeno y un adyuvante implica la introducción directa in vivo en los tejidos de un sujeto de ADN que codifica el antígeno para la expresión de éste en las células del tejido del sujeto. Estas vacunas se denominan en este documento "vacunas basadas en ácido nucleico". Puesto que el gen exp contiene, por definición, una secuencia señal, la expresión del gen en las células del tejido da lugar a la secreción de la proteína expresada en asociación con la membrana. Alternativamente, el vector de expresión puede manipularse genéticamente para que contenga una secuencia señal autóloga en lugar de la secuencia señal de exp. Por ejemplo, puede inyectarse en el tejido un vector de ADN desnudo (véase, por ejemplo, Ulmer y col., 1993, Science 259:1745-1749), un vector transportador de ADN (por ejemplo, Wu y col., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu y Wu, 1998, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut y col., solicitud de patente canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990) o un vector vírico que contiene el gen exp deseado. Se prefieren los vectores víricos adecuados incluyendo retrovirus que están empaquetados en células con un intervalo de hospedadores anfotróficos (véase Millar, 1990, Human Gene Ther. 1:5-14; Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Nº 9) y virus de ADN atenuados o defectuosos, tales como, pero sin limitaciones, virus del herpes simple (VHS) (véase, por ejemplo, Kaplitt y col., 1991, Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330), papilomavirus, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus (véase, por ejemplo, Stratford Perricaudet y col., 1992, J. Clin. Invest. 90:626-630), virus adenoasociados (VAA) (véase, por ejemplo, Samulski y col., 1987, J. Virol. 61:3096-3101; Samulski y col., 1989, J. Virol. 63:3822-3828), y similares. Se prefieren los virus defectuosos que carecen por completo o casi por completo de genes víricos. Los virus defectuosos no infectan a la célula tras su introducción.

Los vectores que contienen la vacuna basada en ácido nucleico de la invención pueden introducirse en el hospedador deseado mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola de ADN, o un vector transportador de ADN (véase, por ejemplo, Wu y col., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut y col., solicitud de patente canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990).

Cualquier vacuna de la invención, es decir, unas vacunas que comprenden un antígeno Exp, derivado antigénico o fragmento del mismo, o una vacuna de ácido nucleico de exp, pueden administrarse a través de cualquier vía parenteral incluyendo, pero sin limitaciones, la vía intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y similares. Preferiblemente, puesto que el resultado deseado de la vacunación es provocar una respuesta inmune frente al antígeno y, de este modo, frente al organismo patogénico, puede administrarse directamente, mediante un vector dirigido o mediante la elección de un vector vírico, indirectamente, a tejidos linfoides, por ejemplo, ganglios linfáticos o bazo. Puesto que las células inmunes se replican de forma continuada, son una diana ideal para las vacunas de ácidos nucleicos basadas en vectores retrovíricoes, ya que los retrovirus requieren que las células se repliquen.

Puede conferirse inmunidad pasiva a un sujeto animal sospechoso de sufrir una infección con una bacteria Gram negativa administrando un antisuero, anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal neutralizador frente a la bacteria Gram positiva del paciente. Aunque la inmunidad pasiva no confiere protección a largo plazo, puede ser una herramienta valiosa para el tratamiento de una infección bacteriana en un sujeto que no ha sido vacunado. La inmunidad pasiva es particularmente importante para el tratamiento de cepas de bacterias Gram positivas resistentes a antibióticos, ya que no se dispone de otra terapia. Preferiblemente, los anticuerpos administrados para terapia pasiva inmune son anticuerpos autólogos. Por ejemplo, si el sujeto es un humano, preferiblemente los anticuerpos son de origen humano o se han "humanizado" para minimizar la posibilidad de una respuesta inmune frente a los anticuerpos.

Las vacunas activas o pasivas de la invención pueden usarse para proteger a un sujeto animal de una infección de una bacteria Gram positiva. De este modo, puede usarse una vacuna de la invención en aves, tales como pollos y pavos, y en mascotas; en mamíferos, preferiblemente un humano, aunque se contempla el uso de las vacunas de la invención en otras especies de mamíferos, que incluyen, pero sin limitaciones, animales domésticos (caninos y felinos); animales de granja (bovino, ovino, equino, caprino, porcino y similares); roedores y animales no domésticos.

Diagnóstico de una infección bacteriana Gram positiva

Los anticuerpos de la presente invención que pueden generarse frente a las proteínas exportadas de bacterias Gram positivas son reactivos valiosos para el diagnóstico de una infección con un microorganismo Gram positivo. Actualmente, es difícil el diagnóstico de la infección con una bacteria Gram positiva. Según la invención, puede detectarse la presencia de bacterias Gram positivas en una muestra de un sujeto sospechoso de tener una infección con una bacteria Gram positiva detectando la unión de un anticuerpo frente a una proteína exportada de una bacteria en una muestra o a partir de ella.

El diagnóstico de la infección con una bacteria Gram positiva puede usar, según se desee, cualquier formato de inmunoensayo conocido en la técnica. En la sección titulada "Preparación de anticuerpos frente a proteínas exportadas" se describen muchos posibles formatos de inmunoensayo. Los anticuerpos pueden estar marcados para su detección in vitro, por ejemplo, con marcadores tales como enzimas, fluoróforos, cromóforos, radioisótopos, colorantes, oro coloidal, partículas de látex y agentes quimioluminiscentes. Alternativamente, los anticuerpos pueden marcarse para su detección in vivo, por ejemplo, con radioisótopos (preferiblemente tecnecio o yodo); reactivos de desplazamiento para resonancia magnética (tales como gadolinio y manganeso) o reactivos radioopacos.

Alternativamente, los ácidos nucleicos y secuencias de los mismos de la invención pueden usarse en el diagnóstico de infección con una bacteria Gram positiva. Por ejemplo, los genes exp o fragmentos susceptibles de hibridar de los mismos pueden usarse para la hibridación in situ con una muestra de un sujeto sospechoso de portar una infección con una bacteria Gram positiva. En otra realización, pueden identificarse segmentos génicos específicos de una bacteria Gram positiva usando amplificación por PCR con sondas basadas en los genes exp de la invención. En un aspecto de la invención, la hibridación con una sonda o con los cebadores de PCR puede realizarse en condiciones rigurosas, o con una secuencia específica para una única cepa o para un número limitado de cepas de la bacteria, o ambas, permitiendo, de este modo, el diagnóstico de la infección con esta cepa (o cepas) en particular. Alternativamente, la hibridación puede realizarse en condiciones menos rigurosas, o la secuencia puede ser homóloga en cualquiera o en todas las cepas de una bacteria, permitiendo, de este modo, el diagnóstico de la infección con esta especie.

La presente invención se entenderá mejor a partir de una revisión de la siguiente descripción ilustrativa que presenta los detalles de las construcciones y procedimientos que se han seguido en su desarrollo y validación.

Ejemplo 1 Identificación genética de proteínas exportadas en Streptococcus pneumoniae

Se ha desarrollado una estrategia para mutar e identificar genéticamente proteínas exportadas en Streptococcus pneumoniae. Conjugando la técnica de mutagénesis con las fusiones de genes a phoA, se ha desarrollado una herramienta para la mutación e identificación genética de proteínas exportadas de S. pneumoniae. Se crearon vectores y se usaron para analizar fusiones génicas traduccionales de la fosfatasa alcalina (PhoA) en el ADN de neumococos en Escherichia coli y S. pneumoniae. En este estudio se describe la identificación de diversos loci genéticos que codifican proteínas exportadas. Por similitud con las secuencias derivadas de otros genes de organismos procarióticos, estos loci probablemente codifican proteínas que juegan un papel en la transducción de señales, transporte y ensamblaje de macromoléculas, mantenimiento de un equilibrio quimiosmótico intracelular y adquisición de nutrientes.

Se aislaron veinticinco mutantes de neumococos PhoA^{+} y los loci de ocho de estos mutantes mostraron similitud con proteínas exportadas o asociadas a membrana conocidas. Se encontraron homólogos a: 1] permeasas de péptidos dependiente de proteína, 2] proteínas de unión a penicilina, 3] proteasas Clp, 4] dos componentes reguladores sensores, 5] las permeasas de fosfoenolpiruvato:hidrato de carbono fosfotransferasa, 6] deshidrogenasas asociadas a membranas, 7] ATPasas de transporte de cationes de tipo P (tipo E_{1}E_{2}), 8] transportadores ABC para la translocación de la clase RTX de toxinas bacterianas. De forma inesperada, un mutante PhoA^{+} contenía una fusión de un miembro de la familia de proteínas D-E-A-D de helicasas de ARN dependientes de ATP que sugiere la exportación de estas proteínas.

Materiales y procedimientos Cepas y medios

La cepa parental de S. pneumoniae usada en estos estudios fue R6x, que es un derivado de la cepa no encapsulada R36A de la Universidad Rockefeller (Tiraby y Fox, 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70:3541-3545). Las cepas de E. coli usadas fueron DH5\alpha, que es F^{-} f80dlacZ \Delta(lacZYA\DeltaM15) lacU169 recA1 endA1 hsdR17 (r_{K}-m_{K+}) supE44 l^{-} thy-1 gyrA relA1 (Bethesda Research Laboratories); CC118, que es \Delta(ara leu)7697 \DeltalacX74 araD139 phoA20 galE galK thi rpsE rpoB argE recA1 (Manoil y Beckwith, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:8129-8133), S1179, que es F^{-} \DeltalacU169 dam3 rpsL (Brown, 1987, Cell 49:825-33) y JCB607, que contiene un vector de expresión para la producción de DsbA (rna met pBJ41 pMS421) (Bardwell y col., 1991, Cell. 67:581-589). Las cepas de S. pneumoniae generadas en este estudio y sus características relevantes se enumeran en la Tabla 1.

TABLA 1 Cepas bacterianas de Streptococcus pneumoniae creadas en este estudio

Cepa	Características relevantes	Familia génica u homólogo^{a}	Fuente
R6x	Hex^{-}, cepa parental		(Tiraby y Fox, 1973)
SPRU2	fusión de PhoA a la secuencia		Estudio en curso
	señal 1
SPRU37	fusión de PhoA a la secuencia		Estudio en curso
	señal 2
SPRU96	pHRM100::zzz		Estudio en curso
SPRU97	pHRM104::zzz		Estudio en curso
SPRU121	fusión de PhoA a AmiA	permeasas de péptidos	Estudio en curso
SPRU98	fusión de PhoA a Exp1	permeasas de péptidos	Estudio en curso
SPRU42	fusión de PhoA a Exp2 (PonA)	proteína de unión a penicilina 1a	Estudio en curso
SPRU40	fusión de PhoA a Exp3	familia de dos componentes de	Estudio en curso
		reguladores sensores
SPRU39	fusión de PhoA a Exp4	proteasas Clp	Estudio en curso
SPRU87	fusión de PhoA a Exp5	familia PTS de permeasas	Estudio en curso
SPRU24	fusión de PhoA a Exp6	glicerol-3-fosfato deshidrogenasa;	Estudio en curso
		GlpD; B. subtilis
SPRU75	fusión de PhoA a Exp7	ATPasas del transporte catiónico de	Estudio en curso
		tipo P
SPRU81	fusión de PhoA a Exp8	ATPasas de tráfico de tipo RTX	Estudio en curso
SPRU17	fusión de PhoA a Exp9	helicasas de ARN dependientes de ATP	Estudio en curso

Las secuencias de aminoácidos derivadas se determinaron a partir de plásmidos recuperados de los mutantes PhoA^{+}. Los homólogos se identificaron buscando en una base de datos de proteínas con el algoritmo BLAST. Véanse los alineamientos en la Figura 5.

Las S. pneumoniae se sembraron de forma rutinaria en placas sobre agar tríptico de soja suplementado con sangre de carnero (TSAB) a una concentración final del 3% (vol/vol). Los cultivos también se cultivaron en un medio líquido semisintético de caseína hidrolizada suplementado con extracto de levadura (medio C+Y) (Lacks y Hotchkiss, 1960, Biochem. Biophys. Acta. 39:508-517). En algunos casos, S. pneumoniae se cultivó en medio de cultivo de Todd Hewitt (THBY) suplementado con levadura a una concentración final del 5% (p/v). Cuando se indica, S. pneumoniae se cultivó en C+Y en presencia del oxidante de disulfuro 2-hidroxietil disulfuro a una concentración de 600 \muM, que es 5 veces menor que la concentración mínima inhibitoria requerida para el crecimiento de E. coli cuando se cultiva en medio líquido o sólido de Luria-Bertani (LB). La selección de E. coli con vectores plasmídicos se obtuvo con eritromicina (erm) a una concentración de 500 \mug/ml. Para la selección y mantenimiento de S. pneumoniae que contiene plásmidos integrados en el cromosoma, las bacterias se cultivaron en presencia de 0,5 a 1 \mug/ml de erm.

La transformación de S. pneumoniae se realizó como sigue: las bacterias se cultivaronen medio C+Y a 37ºC y las muestras se retiraron a intervalos de 10 min entre una D.O._{620} de 0,07 a 0,15 y se conservaron a -70ºC en glicerol al 10%. Las muestras se congelaron en hielo y se añadió ADN (concentración final, 1 \mug/ml) antes de la incubación a 37ºC durante 90 min. Los transformantes se identificaron mediante selección en TSAB que contenía el antibiótico apropiado.

Técnicas de recombinación de ADN

Los plásmidos pHRM100 y pHRM104 (Figura 1) se construyeron mediante inserción de los fragmentos SmaI o BamHI de pPHO7 de 2,6 kb, que contienen el gen para phoA truncado (Guitierrez y Devedjian, 1989, Nucleic Acid Res. 17:3999), en los sitios correspondientes en pJCD9 (Chen y Morrison, 1988, Gene, 64:155-164). Se generaron un único sitio de clonación SmaI para pHRM100 y un único sitio de clonación BamHI para pHRM104 antes del extremo 5' del gen phoA mediante deleción selectiva de sitios duplicados.

El ADN cromosómico de S. pneumoniae se preparó mediante el siguiente procedimiento: las células se cultivaron de THBY o de C+Y con erm a 0,5 \mug/ml hasta una D.O._{620} de 0,7. Las células se aislaron mediante centrifugación y se lavaron una vez en 500 \mul de TES (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,1 M). Se eliminaron los sobrenadantes y los sedimentos se resuspendieron en 500 \mul de TES recién preparado. Las bacterias se lisaron con la adición de 50 \mul de desoxicolato al 1% (vol/vol). El lisado se incubó secuencialmente con ARNasa (2 \mug) y pronasa (400 ng) durante 10 min a 37ºC. Esta solución se extrajo tres veces con un volumen igual de fenol:cloroformo:ácido isoamílico (25:24:1), seguido de una extracción con un volumen igual de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). El ADN se precipitó con la adición de dos volúmenes de etanol frío, se lavó una vez con etanol al 70% y se resuspendió en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM. En algunos casos, este protocolo se ajustó para acomodar 400 ml de bacterias.

Las bibliotecas plasmídicas que contenían el ADN de neumococo se crearon con pHRM100 y pHRM104 en E. coli para mutagénesis por inserción de duplicación en S. pneumoniae. El ADN cromosómico de S. pneumoniae se digirió durante 18 h con AluI o RsaI, o durante 1,5 h con SauIIIa. Este ADN se fraccionó por tamaño en un gel de agarosa al 0,7%, se extrajeron los fragmentos de 400-600 pares de bases y se purificaron con perlas de vidrio (BIO 101 Inc., La Jolla, CA) según las instrucciones del fabricante. El ADN se ligó durante 18 h a 4ºC en los sitios SmaI o BamHI de pHRM100 o pHRM104, respectivamente, a una proporción entre inserción y vector de 6:1. La mezcla de ligamiento se transformó en la cepa S1179 de E. coli o en la cepa PhoA^{-} CC118. El ADN plasmídico se obtuvo de estas bibliotecas usando el sistema de preparación de plásmidos Qiagen midi (Qiagen Inc., Charsworth, CA) según las instrucciones del fabricante.

La estrategia de mutagénesis en S. pneumoniae implicaba duplicación de la inserción tras la integración del plásmido (Figura 1b). Debido a esta duplicación hubo una baja frecuencia de escisión del plásmido integrado con esta inserción que contaminaba las preparaciones cromosómicas con ADN del neumococo. Por tanto, los plásmidos integrados que contenían una inserción de neumococo se recuperaban fácilmente de S. pneumoniae mediante transformación de estos plásmidos escindidos directamente en E. coli competente.

Para crear una fusión génica entre el phoA y amiA, se obtuvo un fragmento de 600 pares de bases de amiA del ADN cromosómico de S. pneumoniae mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando los cebadores sentido y complementario:

5'AAAGGATCCATGAARAARAAYMGHGTNTTY3' (ID SEC Nº 40),

y

5'TTTGGATCCGTTGGTTTAGCAAAATCGCTT3' (ID SEC Nº 41)

respectivamente, donde R=A/G, Y=T/C, M=C/A, H=T/C/A y N=G/A/T/C. La amplificación del ADN se realizó con 50 ng de ADN cromosómico, 2 mM del cebador sentido, 1 mM del cebador complementario y 2,5 U de ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer, Norwalk, CT), dNTP y tampón proporcionado por el fabricante. La amplificación (30 ciclos) se realizó usando el siguiente procedimiento: 1 min a 94ºC para la desnaturalización, 2 min a 72ºC para la extensión y 1 min a 45ºC para la recondensación. Se obtuvo un fragmento de 600 pares de bases, se dirigió con BamHI y se ligó en el correspondiente sitio de pHRM104. Esta mezcla se transformó en E. coli y se identificó un único clon recombinante que contenía el vector con la inserción. Mediante análisis de secuencia se confirmó una secuencia codificadora en fase a lo largo de la unión de fusión. El ADN plasmídico de este clon se transformó en S. pneumoniae y se analizó la actividad PhoA de los transformantes mediante el ensayo de transferencia de colonias para confirmar la producción y exportación de la proteína de fusión.

Secuenciación de ADN

Los oligonucleótidos para la secuenciación (5'AATATCGCCCTGAGC3', ID SEC Nº 42 y 5'ATCACGCAGAGC
GGCAG3', ID SEC Nº 43) se diseñaron a lo largo de las uniones de fusión de las inserciones del neumococo en pHRM100 y en pHRM104. El análisis de la secuencia de doble cadena se realizó en el ADN plasmídico mediante el método didesoxi de terminación de la cadena (Sanger y col., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467) usando el kit de secuenciación de ADN Sequenase Versión 2.0 (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) según las instrucciones del fabricante. Se añadió dimetilsulfóxido (1% vol/vol) a las etapas de condensación y extensión.

Actividad fosfatasa alcalina

Aunque la fosfatasa alcalina se ha caracterizado en algunos organismos Gram positivos tales como Enterococcus faecalis (Rothschild y col., 1991, En "Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci", Dunny, y col., Washington D.C. Sociedad Americana de Microbiología, pág. 45-48) y B. subtilis (Chesnut y col., 1991, Mol. Microbiol. 5:2181-90; Hulett y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:1077-84; Sugahara y col., 1991, J. Bacteriol. 173-1824-6), no se sabe nada acerca de esta enzima en S. pneumoniae. La actividad PhoA asociada con la cepa parental de S. pneumoniae se midió con sustratos cromogénicos en los ensayos descritos a continuación y se les dieron resultados nominales. Por tanto, la detección de la actividad PhoA debida a la expresión de las proteínas de fusión en S. pneumoniae se realizó con un fondo bajo o negativo.

Para seleccionar fusiones de PhoA derivadas de neumococos en E. coli, se analizaron bibliotecas de plásmidos en la cepa PhoA^{-} CC118. Los transformantes se dispusieron en placas en medio LB suplementado con 40 a 80 \mug/ml del sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (XP). En 15 a 24 h se desarrollaron colonias azules que indicaban la actividad PhoA. Se purificaron colonias individuales por siembra en estrías sobre placas de LP/XP recién preparadas para verificar el fenotipo azul.

Para seleccionar los mutantes PhoA^{+} de S. pneumoniae, se analizaron colonias individuales en un ensayo de transferencia de colonias con XP adaptado de un procedimiento previamente descrito (Knapp y Mekalanos, 1988, J. Bacteriol. 170:5059-5066). Se transfirieron colonias individuales de dos días a filtros de nitrocelulosa (HAHY, Millipore, Bedford, MA) y se secaron al aire de dos a cinco min. Los filtros se colocaron con las colonias hacia arriba sobre papeles de filtro del Nº 3 (Whatman, Inc. Clifton, N.J.) empapados previamente en NaCl 0,14 M y se incubaron durante 10 min a 37ºC. Esto se repitió una vez más y, a continuación, las membranas se transfirieron a papeles de filtro nuevos previamente empapados en Tris-HCl 1 M, pH 8,0 y se incubaron durante 10 min a 37ºC. Finalmente, las membranas se transfirieron a otro papel de filtro nuevo empapado en Tris-HCl 1 M, pH 8,0 con 200 \mug/ml de XP y se incubó a 37ºC. Las colonias azules indicaban mutantes PhoA^{+} y se detectaban desde los 10 min a 18 h. Las colonias se picaban directamente de los filtros o de las placas originales. Después de purificar por siembre en estrías sobre placas de TSAB, se volvió a confirmar el fenotipo azul en un ensayo posterior de transferencia de colonias.

La actividad PhoA se determinó en las cepas de S. pneumoniae a partir de cultivos en crecimiento exponencial. Se aislaron las bacterias de 10 ml de cultivo mediante centrifugación, se lavaron una vez en solución salina y se resuspendieron en 1 ml de Tris-HCl 1M, pH 8,0. La actividad se determinó mediante hidrólisis de p-nitrofenol fosfato en un ensayo descrito previamente (Brickman y Beckwith, 1975, Mol. Biol. 96:307-316; Guitierrez y col., 1987, J. Mol. Biol. 195:289-297). La proteína total se determinó sobre bacterias lisadas con colorante azul de Coomassie (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72:248-254).

Purificación de DsbA

DsbA se purificó casi hasta homogeneidad a partir de una cepa de E. coli (JCB607) que contenía un vector de expresión con el gen correspondiente (Bardwell y col., 1991, Cell. 67:581-589). Brevemente, se añadieron 2 ml de cultivo reciente de una noche a 400 ml de medio LB y se cultivó durante 2 h a 37ºC. La concentración de isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) se ajustó a 3 mM y se cultivó durante 2 h más. Las bacterias se aislaron mediante centrifugación y se resuspendieron en 6 ml de Tris-HCl 100 nM, pH 7,6, EDTA 5 mM y sacarosa 0,5 M. Esta suspensión se incubó durante 10 min en hielo y las células se aislaron mediante centrifugación. Las bacterias se resuspendieron en 6 ml de MgCl_{2} 5 mM y se incubaron durante 10 min en hielo. El sobrenadante se aisló tras la centrifugación. En un gel de poliacrilamida en presencia de SDS, este material contenía una banda predominante teñida con azul de Coomassie con una M_{r} aparente de 21 kDa, la cual es idéntica a la de DsbA y se juzgó que estaba aproximadamente al 95% de pureza (datos no mostrados).

Fraccionamiento subcelular

Los neumococos se separaron en fracciones subcelulares mediante una modificación de una técnica descrita previamente (Hakenbeck y col., 1986, Antimicrobial agents and chemotherapy. 30:553-558). Brevemente, las bacterias se cultivaron en 10 ml de medio C+Y hasta una D.O._{620} de 0,6 y se aislaron mediante centrifugación a 17.000xg durante 10 min. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 250 \mul de TEP (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, fenilmetilsulfonil fluoruro 1 mM). La suspensión se sonicó en periodos de 15 s durante un total de 4 min. Más del 99% de las bacterias se rompían según reveló la inspección visual. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación (17.000xg durante 10 min). Las membranas bacterianas y el contenido citoplásmico se separaron mediante centrifugación a 98.000xg durante 4 h en una ultracentrífuga Airfuge de Beckman. El sobrenadante de esta etapa final contenía la fracción citoplásmica mientras que el sedimento contenía las membranas bacterianas. Se evaluó el contenido proteico de muestras de cada fracción y se solubilizaron en tampón de muestra SDS para la posterior electroforesis en gel.

Detección inmunológica de proteínas de fusión

Los lisados bacterianos completos y las fracciones subcelulares se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS y las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Immobilon, Millipore, Bedford, MA) usando el PhastSystem (Pharmacia LKB, Uppsala, Suecia) según las instrucciones del fabricante. Las membranas se incubaron con anticuerpos policlonales anti-PhoA (5 Prime-3 Prime, Boulder, CO) a una dilución de 1:1.000 con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa a una dilución de 1:1.000. Las bandas inmunorreactivas se detectaron con peróxido de hidrógeno y diaminobencidina o mediante quimioluminiscencia potenciada con productos químicos obtenidos en Amersham (Arlington Heights, IL).

Resultados y discusión Construcción de plásmidos indicadores y bibliotecas de neumococos

Con el fin de analizar genéticamente las proteínas exportadas en S. pneumoniae mediante mutagénesis por inserción de duplicación, se colocó una forma truncada de phoA (Guitierrez y Devedjian, 1989, Nucleic Acid Res. 17:3999) en el vector neumocócico conductor pJDC9 (Figura 1a) (Chen y Morrison, 1988, Gene. 64:155-164). Se crearon dos vectores con un único sitio de clonación 5' SmaI (pHRM100) o un único sitio BamHI (pHRM104) para phoA. Los sitios de clonación en cada vector están flanqueados por dos sitios KpnI para facilitar la identificación sencilla de una inserción.

Una mutagénesis por inserción de duplicación eficaz requiere la clonación de un fragmento génico interno en el vector antes de la integración (Figura 1b). Por tanto, las bibliotecas de plásmidos se crearon en E. coli con inserciones de 400 a 600 pares de bases de ADN de neumococo. Se analizaron las fusiones traduccionales de phoA en E. coli o S. pneumoniae de varias bibliotecas que representaban aproximadamente 2.600 clones individuales.

Identificación de fusiones de PhoA de neumococos en E. coli

Cuando se detectaron sistemáticamente las bibliotecas de neumococos que representaban 1.100 clones independientes en la cepa de E. coli PhoA^{-} CC118, cincuenta y cinco colonias mostraron el fenotipo azul cuando se sembraron sobre placas en medios que contenían 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (XP). Puesto que los vectores de clonación pHRM100 y pHRM104 no contenían un promotor intrínseco antes del extremo 5' de phoA, las proteínas de fusión derivadas de estos plásmidos se deberían haber generado a partir del ADN de neumococos que contenían un promotor, un sitio de inicio de traducción y una secuencia señal funcional. El análisis de secuencias de ADN de las inserciones de dos de estos plásmidos mostró un posible promotor, sitios de unión a ribosoma y secuencias codificadoras para los aminoácidos 48 y 52 que estaban en fase con la secuencia codificadora para phoA. Estas secuencias codificadoras tienen aspectos característicos de secuencias señal procarióticas, tales como una región N-terminal básica, un núcleo hidrófobo central y una región C-terminal polar (von Heijne, 1990, J. Memb. Biol. 115:195-201) (Tabla 2).

TABLA 2 Regiones codificadoras predichas de dos loci genéticos que producían proteínas de fusión PhoA tanto en S. pneumoniae como en E. coli

Cepa	Secuencia señal^{a}
SPRU2	MKHLLSYFKPYIKESILAPLFKLLEAVFELLVPMVIA\uparrowGIVDQSLPQGDPRVP	(ID SEC Nº 44)
SPRU37	MAKNNKVAVVTTVPSVAEGLKNVNG\uparrowVNFDYKDEASAKEAIKEEKLKGYLTIDPRVP	(ID SEC Nº 45)
^{a} \begin{minipage}[t]{157mm} Las regiones codificadoras se identificaron a partir de las secuencias de ADN que están 5' de phoA de los plásmidos recuperados a partir de estas cepas. Las flechas indican el sitio de escisión predicho del péptido señal basado en la "regla -3, -1" (von Heijne, 1986, Nucleic Acid Res. 14:4683-4690) y los aminoácidos en negrita son de la región codificadora de phoA.\end{minipage}

Se identificó un posible sitio de escisión en ambas secuencias con un algoritmo diseñado para identificar estos sitios basándose en la "regla -3, -1" (von Heijne, 1986, Nucleic Acid Res. 14:4683-4690). La transformación e integración de estos plásmidos en S. pneumoniae daba transformantes que producían colonias azules en el ensayo de transferencia de colonias y cada uno producía proteínas de fusión inmunorreactivas anti-PhoA con una M_{r} aparente de 55 kDa en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (datos no mostrados). Estos resultados muestran claramente que las secuencias señal heterólogas de S. pneumoniae fusionadas con PhoA eran funcionales tanto en E. coli como en S. pneumoniae y probablemente usan una ruta de secreción similar.

Fusiones de PhoA con una proteína de neumococos exportada

AmiA es un representante neumocócico de la familia de permeasas bacterianas que son responsables del transporte de péptidos pequeños (Alloing y col., 1989, Gene. 76:363-8; Alloing y col., 1990, Mol. Microbiol. 4:633-44; Gilson y col., 1988, EMBO J. 7:3971-3974). AmiA contiene una secuencia señal y debe ser una lipoproteína exportada unida a la membrana bacteriana mediante un resto lipídico unido covalentemente a la cisteína N-terminal (Gilson y col., 1988, EMBO J. 7:3971-3974). Se modificó genéticamente un mutante neumocócico (SPRU121) que contenía la región codificadora 5' de amiA fusionada en fase en el codón 169 a phoA. Las colonias de este mutante producía el fenotipo azul cuando se exponía a XP, lo que sugería que la proteína híbrida se exportaba. Se confirmó un polipéptido inmunorreactivo con la M_{r} predicha de 67 kDa mediante análisis por inmunotransferencia de un lisado celular completo (datos no mostrados).

Identificación de fusiones de PhoA en S. pneumoniae

Animados por la detección de fusiones de PhoA derivadas del ADN de neumococos tanto en E. coli como en S. pneumoniae, se creó una biblioteca de transformantes neumocócicos que contenían inserciones cromosómicas aleatorias de los vectores de PhoA pHRM100 y pHRM104. A partir de un banco de 1.500 clones, se aislaron 75 mutantes que mostraban el fenotipo azul con XP en el ensayo de transferencia de colonias. Puesto que S. pneumoniae se lisa espontáneamente durante la fase estacionaria de crecimiento debido a una amidasa endógena (LytA), resultaba preocupante que el fenotipo azul de algunos mutantes fuera el resultado de la lisis celular y no debido a la exportación de una proteína de fusión desde las células viables. Se transformó el ADN de 10 mutantes azules al azar que incluían SPRU22, 42, 75, 81 y 98 en un contexto genético lytA menos y todos seguían mostrando el fenotipo azul (datos no mostrados).

Uno de los mutantes (SPRU98) mostraba el fenotipo azul en XP y expresaba un polipéptido inmunorreactivo anti-PhoA de 93 kDa (Figura 2, carril 2). Puesto que la región codificadora de phoA produciría un polipéptido con una masa molecular de 49 kDa, se puede concluir que la proteína de fusión estaba siendo producida a partir de una región codificadora correspondiente a un polipéptido con una masa molecular de 44 kDa. Por el contrario, los mutantes SPRU96 y 97, que contenían vectores insertados aleatoriamente y no eran azules cuando se exponían a XP, no producían ningún material inmunorreactivo (Figura 2, carriles 3, 4). La proteína de fusión de SPRU98 se degradaba proteolíticamente cuando las bacterias completas se exponían a concentraciones bajas de tripsina, lo que sugería una localización extracelular (Figura 2, carril 5). La medida directa de la actividad de fosfatasa alcalina asociada con bacterias completas estaba de acuerdo con este resultado. Comparado con la cepa parental y un mutante en PhoA^{-} (SPRU97) con un plásmido integrado aleatoriamente, había una actividad enzimática de tres a cuatro veces mayor para SPRU98 (Tabla 3). En conjunto, estos resultados sugieren que las fusiones de PhoA a proteínas exportadas eran translocadas a través de la membrana citoplásmica de S. pneumoniae.

TABLA 3 Actividad fosfatasa alcalina para un mutante neumocócico con una fusión génica a phoA

Cepa	Vector phoA integrado ^{a}	Ensayo de transferencia de colonias ^{b}	Actividad fosfatasa ^{c}
SPRU98	+	azul	44,7 \pm 6
SPRU97	+	blanca	18,4 \pm 5
R6x	0	blanca	14,6 \pm 4
^{a} \begin{minipage}[t]{157mm}SPRU97 y SPRU98 contienen el vector de phoA, pHRM104 integrado aleatoriamente en el cromosoma como se describe en el texto.\end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{157mm} El mutante PhoA^{+} se aisló basándose en la expresión de la actividad fosfatasa alcalina detectada mediante la exposición de colonias individuales a XP en el ensayo de transferencia de colonias.\end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{157mm} Las unidades de actividad de fosfatasa alcalina se determinaron como se describe en Procedimientos experimentales. El ensayo se realizó en células lavadas de cultivos en crecimiento exponencial. Los resultados se presentan como las unidades de actividad enzimática/mg de proteína total.\end{minipage}

Los oxidantes disulfuro aumentan la actividad enzimática de las fusiones de PhoA en S. pneumoniae

En E. coli, la actividad PhoA requiere la translocación de la proteína a través de la membrana citoplásmica, la incorporación de Zn^{2+}, la formación de puentes disulfuro y la dimerización. Después de este proceso de activación, la enzima es muy resistente a proteasas (Roberts y Chlebowski, 1984). Recientemente dos grupos han identificado un único locus genético, dsbA (Bardwell y col., 1991, Cell. 67:581-589) y ppfA (Kamitani y col., 1992, EMBO J. 11:57-67), que codifica una disulfuro oxidorreductasa que facilita la formación de puentes disulfuro en PhoA. Se ha identificado un locus similar en V. cholera (Peek y Taylor, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:6210-6214). Las mutaciones en dsbA disminuyen considerablemente la actividad PhoA y vuelven a la proteína sensible a proteasas tanto in vitro como in vivo (Bardwell y col., 1991, Cell. 67:581-589; Kamitani y col., 1992, EMBO J. 11:57-67). Puesto que la actividad enzimática asociada con las funciones PhoA en S. pneumoniae era generalmente 10 veces inferior que los valores obtenidos con las fusiones en E. coli (datos no mostrados) y debido a la sensibilidad a proteasas de la fusión de PhoA mostrada en la Figura 2, se planteó la hipótesis de que la adición de DsbA o un oxidante disulfuro potente promovería la formación de puentes disulfuro, aumentara la actividad enzimática y retrasara la degradación proteolítica.

Se cultivó SPRU98, que producía una proteína de fusión de PhoA con una M_{r} de 93 kDa, en presencia de DsbA 10 \muM o 2-hidroxietil disulfuro 600 \muM, un potente oxidante de disulfuro. En ambas condiciones la actividad enzimática se incrementaba al menos dos veces (Tabla 4).

TABLA 4 Efecto de los oxidantes de disulfuro sobre la actividad fosfatasa alcalina

Agente
DsbA 10 \muM	138,4 \pm 7
2-hidroxietil disulfuro 600 \muM	107,5 \pm 8
Control	51,2 \pm 5
^{a} \begin{minipage}[t]{157mm} La cepa SPRU98 (10 ml) se cultivó en presencia de los agentes indicados hasta una fase semilogarítmica (DO_{620}\text{:} 0,4), se concentró y se analizó la actividad fosfatasa alcalina. La hidrólisis de \mathit{p}\text{-}nitrofenol fosfato se determinó con bacterias completas en presencia de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 durante una hora a 37^{o}C. Las unidades de actividad se expresan por mg de proteína total.\end{minipage}

Comparado con el control, había también un aumento de la cantidad de proteína inmunorreactiva detectada en presencia de estos dos compuestos (Figura 3). Esto sugería un aumento de la estabilidad de la proteína y de la resistencia a la proteolisis intrínseca. Puesto que sólo había un modesto aumento de la actividad enzimática asociado a estos compuestos, se propone que puede haber otros factores necesarios para el correcto plegamiento de PhoA que faltan en S. pneumoniae. Es destacable que las secuencias derivadas de otras isoenzimas de fosfatasa alcalina en los organismos Gram positivos B. subtilis (Chesnut y col., 1991, Mol. Microbiol. 5:2181-90; Hulett y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:1077-84; Sugahara y col., 1991, J. Bacteriol. 173:1824-6) y Enterococcus faecalis, contienen sólo uno o ningún resto de cisteína. Esto puede sugerir que la presencia de un sistema oxido-reductasa para el correcto plegamiento de estos puentes disulfuro intra o intermoleculares pueden ser una propiedad exclusiva de algunos organismos Gram negativos que contienen un periplasma bien definido.

Identificación de las proteínas exportadas mediante el análisis de secuencias de las fusiones de PhoA de S. pneumoniae

Los plásmidos que contienen inserciones de neumococos se recuperaron en E. coli de 48 mutantes neumocócicos que mostraron el fenotipo azul en XP. La digestión de estos plásmidos con KpnI corta las inserciones de neumococos del vector parental. Todas las inserciones tenían un tamaño de aproximadamente 400 a 900 pares de bases. El análisis preliminar de las secuencias de las 48 inserciones reveló 21 secuencias distintas demostrando, de este modo, una relación de semejanza entre algunos de los mutantes. Se establecieron regiones codificadoras largas correspondientes con 50 a 200 aminoácidos en fase con PhoA durante la mayoría de las inserciones, nueve de las cuales se presentan en la Figura 4. Usando el algoritmo BLAST (Altschul y col., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410) se analizó la similitud de las secuencias proteicas derivadas con las secuencias depositadas en la versión más actualizada de la base de datos proteica no redundante en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (Washington, D.C.). Las secuencias de estas nuevas inserciones (Figura 4) mostraron regiones codificadoras con similitud con las familias de ocho proteínas exportadas o asociadas a membrana conocidas. Esas proteínas codificadas por los genes que corresponden a las posibles fases de lectura sin una función conocida se designan con el prefijo exp (del inglés, exported protein, proteína exportada) para describir los diferentes loci genéticos.

No se detectó similitud entre las secuencias derivadas de las otras inserciones y las de la base de datos. Las secuencias de las nueve inserciones estarán disponibles en el Genbank (Números de acceso aún por asignar) después de la fecha de presentación de esta solicitud.

Exp1 mostró similitud con la familia de permeasas responsables del transporte de péptidos pequeños tanto en bacterias Gram negativas como Gram positivas (Figura 5A). La fase de lectura identificada mostró la mayor similitud con la proteína exportada, AimA, de S. pneumoniae (Alloing y col., 1990, Mol. Microbiol. 4:633-44). El locus ami se caracterizó por primera vez en un mutante espontáneo resistente a aminopterina (Sicard, 1964, Genetics. 50:31-44; Sicard y Ephrussi-Taylor, 1965). El alelo natural puede ser responsable del transporte intracelular de aminoácidos de cadena lateral corta (Sicard, 1964). Exp1 es claramente distinta de AmiA y representa un miembro relacionado de la familia de permeasas presentes en la misma bacteria. E. coli tiene al menor tres permeasas peptídicas, mientras que B. subtilis tiene al menos dos (para una revisión véase (Higgins y col., 1990, J. Bioengen. Biomembranes. 22:571-92)). Las mutaciones en un locus análogo, Spo0K de B. subtilis, inhiben la esporulación y disminuyen considerablemente la eficacia de la transformación en las células naturalmente competentes (Perego y col., 1991, Mol. Microbiol. 5:173-85; Rudner y col., 1991, J. Bacteriol). Resultados recientes han demostrado que las mutaciones en exp1 también disminuyen la eficacia de transformación en S. pneumoniae mientras que las mutaciones en amiA no. Por tanto, dos permeasas de péptidos distintas de dos bacterias Gram positivas diferentes afectan al proceso de transformación en estas bacterias naturalmente competentes.

Tanto el ADN como las secuencias proteicas derivadas de exp2 eran idénticos a ponA (pares de bases 1821-2055) que codifica la proteína de unión a penicilina 1A (PBP1a) (Martin y col., 1992a, J. Bacteriol. 174:4517-23) (Figura 5B). Esta proteína pertenece a la familia de peptidasas D, serina peptidasas D que interaccionan con penicilina, que catalizan las últimas etapas en la biosíntesis de mureína. PBP1a se aísla habitualmente de preparaciones de membranas de neumococos y se considera generalmente una proteína exportada (Hakenbeck y col., 1991, J. Infect. Dis. 164:313-9; Hakenbeck y col., 1986, Antimicorbial Agents and Chemotherapy. 30:553-558; Martin y col., 1992, Embo J. 11:3831-6). Deleciones en PBP1a y en PBP 1b de E. coli son letales para la célula, pero las bacterias son capaces de compensarlo si se deleciona el gen (Yousif y col., 1985, J. Gen. Microbiol. 131:2839-2845). Sería interesante comparar el perfil de peptidoglicanos de SPRU42 con la cepa parenteral para determinar si la fusión génica con PBP1a altera la función enzimática.

Exp3 mostró una similitud de secuencia significativa con PilB de N. gonorrhoeae (Figura 5C) (Taha y col., 1988, EMBO J. 7:4367-4378). Había dos regiones de similitud que corresponden al dominio C-terminal de PilB. Había un hueco corto de 25 aminoácidos en Exp3 y de 37 aminoácidos en PilB que no mostró similitud. Esto sugiere una relación estructura-función modular para estas dos proteínas. De acuerdo con este resultado, los híbridos PhoA-PilB se localizaban en la fracción de membrana de N. gonorrhoeae (Taha y col., 1991, Mol. Microbiol 5:137-48) indicando translocación a la membrana.

Se ha sugerido que PilA y PilB son miembros de la familia de dos componentes de reguladores sensores que controlan la expresión del gen de pilina y que PilB es un sensor transmembranal con la región transmisora conservada que contiene actividad quinasa en la región C-terminal de la proteína (Taha y col., 1991, Mol. Microbiol. 5:137-48; Taha y col., 1992, J. Bacteriol. 174:5978-81). El resto de histidina conservado (H_{408}) en PilB necesario para la autofosforilación que es característico de esta familia no está presente en Exp3. Puesto que no se ha identificado la pilina en S. pneumoniae podría asumirse un sitio diana diferente para la regulación génica por Exp3.

La región codificadora identificada con Exp4 sugiere que es similar a la familia ubicua de proteínas Clp encontrada tanto en eucariotas como procariotas (Figura 5D) (para revisión, véase Squires y Squires, 1992, J. Bacteriol. 174:1081-1085). Exp4 es la más semejante al homólogo CD4B de tomate (Gottesman y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3513-7), pero también se apreció una similitud significativa a ClpA y ClpB de E. coli. Se ha propuesto que estas proteínas funcionan como reguladores de proteolisis (Gottesman y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3513-7) o como caperones moleculares (Squires y Squires, 1992, J. Bacteriol. 174:1081-1085). Una característica universal de las proteínas Clp es una secuencia líder larga que implica la translocación a la membrana (Squires y Squires, 1992, anterior, J. Bacteriol. 174:1081-1085). De hecho, la ClpC vegetal se transloca a los cloroplastos (Moare, 1989, Tesis Doctoral, Universidad de Wisconsin, Madison). Incluso aunque se conoce poco sobre la localización subcelular de las otras proteínas Clp, sus resultados sugieren la translocación del homólogo de neumococo a través de la membrana bacteriana.

Exp5 muestra similitud con PtsG de B. subtilis (Gonzy-Treboul y col., 1991, Mol. Microbiol. 5:1241-1249) que es un miembro de la familia de permeasas fosfoenolpiruvato:hidrato de carbono fosfotransferasa que se han encontrado tanto en bacterias Gram positivas como en Gram negativas (para revisión, véase Saier y Reizer, 1992, J. Bacteriol. 174:1433-1448) (Figura 5E). Estas permeasas son proteínas politópicas de membrana con varios dominios translocados.

El análisis de la inserción recuperada de Exp6 reveló una región codificadora similar a las glicerol-3-fosfato deshidrogenasas de varias especies procarióticas (Figura 5F). Es más similar a la GlpD de B. subtilis (Hombert y col., 1990, J. Gen. Microbiol. 136:2367-2375). Esta enzima es una flavoproteína asociada a membrana que forma un complejo con citocromo oxidadas que son proteínas integrales de membrana. Además, cuando convierte el glicerol-3-fosfato en dihidroxiacetona fosfato y gliceraldehido-3-fosfato para su posterior entrada en la ruta glucolítica, esta enzima suministra electrones a las citocromo oxidasas para su posterior transporte. Se ha propuesto que estas deshidrogenasas se unen a la superficie interior de la membrana citoplásmica mediante interacciones hidrófobas no específicas (Halder y col., 1982, Biochemistry. 21:4590-4606; Koland y col., 1984, Biochemistry 23:445-453, Wood y col., 1984, Biochem. J. 222:519-534). Alternativamente, se ha propuesto que hay un número específico y saturable de sitios de unión entre las deshidrogenadas y los citocromos que sirven para anclar las deshidrogenasas a la membrana citoplásmica. Los datos recogidos aquí sugieren que en S. pneumoniae, un segmento de la deshidrogenasa se transloca a la superficie externa de la bacteria (Kung y Henning, 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69:925-929). Ciertamente, la translocación del dominio catalítico no alteraría la función de la enzima. En vesículas de membranas reconstituidas de forma invertida, tenía lugar la transferencia de los citocromos cuando se añadían en cualquier de los dos lados de las vesículas (Halder y col., 1982, Biochemistry. 21:4590-4606).

El análisis de la secuencia derivada de Exp7 mostraba similitud con la familia de ATPasas transportadoras de cationes de tipo P (tipo E_{1}-E_{2}) tanto de eucariotas como de procariotas, responsables del transporte de cationes tales como Ca^{2+}, Mg^{2+}, K^{+}, Na^{+} e H^{+} (Figura 5G). Estas ATPasas son proteínas de membrana intrínsecas con varios dominios translocados. Se han identificado ejemplos en E. faecalis (Solioz y col., 1987, J. Biol. Chem. 262:7358-7362), Salmonella typhimurium (Snavely y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:815-823), E. coli (Hesse y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:4746-4750), Neurospora crassa (Addison, 1986, J. Biol. Chem. 26:14896-14901; Hager y col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:7693-7697), Saccharomyces cerevisiae (Rudolph y col., 1989, Cell 58:133-145) y el retículo sarcoplásmico de músculo esquelético de conejo (Brandi y col., 1986, Cell 44:597-607; Serrano y col., 1986, Nature. 689-693). Exp7 es más similar a MgtB de S. typhimurium, que es uno de los tres loci genéticos responsables del transporte de Mg^{2+} (Snavely y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:815-823). La región identificada contiene el resto aspartilo altamente conservado, que es el sitio de autofosforilación dependiente de ATP. En función de la semejanza con MgtB, la fusión en Exp7 probablemente se producía en la región C-terminal de la proteína. Un modelo predicho para los lazos transmembranales de MgtB sugería que esta región estaría en la superficie citoplásmica (Snavely y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:815-823). Los datos con la fusión de PhoA a Exp7 sugieren que la localización de esta región en la superficie citoplásmica no es el caso en S. pneumoniae.

Exp8 muestra similitud con la familia de ATPasas de tráfico, denominada alternativamente superfamilia de casete de unión a ATP (ABC) de transportadores, que se encuentran tanto en procariotas como en eucariotas (revisado en Ames y Lecar, 1992, Faseb J. 6:2660-6) (Figura 5H). Exp8 es la más similar a las proteínas transmembranales responsables de la translocación de proteínas RTX bacterianas, tales como las \alpha-hemolisinas, que son citotoxinas eucarióticas que se encuentran en organismos Gram negativos y Gram positivos (revisado en Welch, 1991, Mol. Microbiol. 5:521-528). La proteína de fusión que contiene Exp8 es más semejante a CyaB, un componentes del operón cya en Bordetella pertussis (Glaser y col., 1988, Mol. Microbiol. 2:19-30; Glaser y col., 1988, EMBO J. 7:3997-4004). Este locus produce la toxina adenilato ciclasa que también es un miembro de la familia RTX de toxinas bacterianas. No se puede pasar por alto que el locus comA en S. pneumoniae también es un miembro de esta familia (Hui y Morrison, 1991, J. Bacteriol. 173:372-81).

La secuencia derivada para exp9 a partir de dos regiones de la inserción recuperada se presenta en la Figura 4. El análisis de esta secuencia reveló que Exp9 es un miembro de la familia de proteínas D-E-A-D de helicasas de ARN dependientes de ATP (para revisión, véase (Schmid y Linder, 1992, Mol. Microbiol. 6:282-292)). Es más similar a DEAD de E. coli (Figura 5I) (Toone y col., 1991, J. Bacteriol. 173:3291-3302). Se ha identificado un gran número de helicasas a partir de muchos organismos diferentes. Se han identificado al menos cinco homólogos diferentes en E. coli (Kalman y col., 1991, The New Biologist 3:886-895). La marca característica de estas proteínas es la secuencia DEAD conservada en el motivo B de un dominio de unión a ATP (Walker y col., 1982, EMBO J. 1:945-951). La secuencia DEAD se identificó en la secuencia derivada del extremo 5' de la inserción de exp9.

Dos estudios han sugerido que diferentes homólogos en E. coli pueden estar implicados en la traducción afectando al ensamblaje de ribosomas (Nishi y col., 1988, Nature. 336:496-498; Toone y col., 1991, J. Bacteriol. 173:3291-3302). Ninguno de los estudios publicados ha descrito la exportación o la asociación a membrana de estas proteínas. Por tanto, fue sorprendente identificar un mutante PhoA^{+} portador de esta fusión. El fraccionamiento subcelular mostró claramente la mayoría de la proteína de fusión asociada con la fracción de membrana de las bacterias (Figura 6), aunque esto podría ser una anomalía observada sólo con la proteína de fusión.

Recientemente, se ha demostrado que comF en B. subtilis contiene una helicasa ARN/ADN similar con una secuencia DEAD (Londonó-Vallejo y Dubnau, Mol. Microbiol.). Las mutaciones en este locus causan una deficiente transformación bacteriana. Estudios posteriores han demostrado que la helicasa es una proteína asociada a membrana y se ha sugerido que puede estar implicada en el transporte de ADN durante la transformación (D. Dubnau, comunicación personal). Experimentos preliminares no han mostrado una gran diferencia en la capacidad de transformación de un mutante que expresa la fusión Exp9-PhoA. Si hay una clase de helicasas asociadas con la membrana, es tentador especular que Exp9 puede estar implicada en la traducción de polipéptidos destinados a ser exportados.

En conclusión, este Ejemplo demuestra el desarrollo de una técnica que mutaba eficazmente e identificaba varios loci génicos en S. pneumoniae que codifican homólogos de proteínas exportadas conocidas. Resulta claro a partir de nuestros resultados que la mayoría de los loci que se han identificado codificaban proteínas exportadas que están implicadas en varios procesos diversos que ocurren en la membrana citoplásmica o fuera de la bacteria. Al igual que con el uso de la mutagénesis de PhoA en otros organismos, también es aconsejable precaución con esta técnica en S. pneumoniae. No todos los loci identificados pueden codificar proteínas exportadas. Ciertamente es posible que debido a varios factores, tales como la lisis celular, se puedan generar algunos falso positivos. Como se demuestra en el siguiente Ejemplo, pueden realizarse ensayos adicionales para demostrar la actividad funcional de la posible proteína exportada mutante.

Dados estos resultados, la mayoría de los loci identificados hasta la fecha codifican proteínas exportadas, algunas de las cuales están implicadas en la transducción de señales, translocación de proteínas, biosíntesis de la pared celular, adquisición de nutrientes o en el mantenimiento del equilibrio quimiosmótico.

Ejemplo 2 La mutación de algunas proteínas exportadas afecta a la adherencia

En este Ejemplo se determinó la capacidad de neumococos encapsulados y no encapsulados para adherirse a las células del pulmón. Los resultados indican que ambos tipos de neumococos se adhieren a células pulmonares mixtas y a células pulmonares de tipo II, aunque la preferencia era por las células de tipo II. Además, los resultados sugieren que la cepa encapsulada de tipo 2 tiene una capacidad ligeramente mayor para adherirse que la variante no encapsulada.

También se ensayó el efecto de las mutaciones en proteínas exportadas sobre la capacidad de las cepas de S. pneumoniae mutadas para adherirse a células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) y células pulmonares de tipo II. Los resultados demostraron que algunas de las proteínas exportadas tienen funciones directas o indirectas en la adhesión de S. pneumoniae a HUVEC o células de pulmón, o a ambas.

Materiales y procedimientos Preparación de células alveolares mixtas y de tipo II de conejo

Como se describe en Dobbs y Mason (1979, J. Clin. Invest. 63:378-387), se extrajeron los pulmones del conejo, se troceó y se digirió con colagenasa, elastasa y ADNasa durante 60 min a 37ºC. Los trozos grandes se retiraron con un filtro de gasa y se sedimentaron y lavaron las células dos veces. Las células pulmonares mixtas se resuspendieron en 20 ml de un tampón con calcio suplementado con albúmina al 0,5% a una densidad de 10^{4} por ml. Las células alveolares de tipo II se purificaron a partir de la suspensión de células pulmonares mixtas cargando la suspensión sobre un gradiente de albúmina de 10 ml a 16,5 g% sobre 10 ml a 35 g% y centrifugando a 1.200 rpm durante 20 min a 4ºC. Se desecharon los 26 ml superiores del gradiente y se recogieron las células de los siguientes 12 ml, se lavaron y se ajustaron a una concentración de 10^{4} células por ml. La viabilidad de las células era superior al 90%, según se valoró por exclusión de azul de Tripán, y más del 80% de las células contenían cuerpos lamelares osmiófílos típicos de las células de tipo II cuando se examinaron al microscopio electrónico.

Ensayo de adherencia con células alveolares mixtas y de tipo II

Se añadieron aproximadamente 10^{3} a 10^{9} neumococos de tipo II (encapsulados) o R6 (no encapsulados) a 10^{4} células de pulmón en un volumen de 1 ml durante 30 min a 37ºC. Las células de pulmón se separaron de las bacterias no adherentes mediante 6 rondas de lavado por centrifugación a 270xg durante 5 min. Las bacterias adherentes en el sedimento celular final se contaron sembrando sobre placas y mediante tinción Gram.

Ensayos de adherencia a HUVEC y a células pulmonares alveolares de tipo II

Se cultivaron HUVEC (Clonetics, San Diego, California) y células de la línea celular alveolar de tipo II (número de acceso de la ATCC A549) durante 4-8 días y luego se transfirieron a placas de Terasaki 24 horas antes de que se realizara el ensayo de adherencia para permitir la formación de una monocapa confluente (Geelen y col., 1993, Infect. Immun. 61:1538-1543). Las bacterias se marcaron con fluoresceína (Geelen y col., anterior), se ajustan a una concentración de 5 x 10^{7} o a concentraciones de 10^{5}, 10^{6} y 10^{7} ufc por ml y se añadieron en un volumen de 5 \mul a al menos 6 pocillos. Tras la incubación a 37ºC durante 30 min, las placas se lavaron y fijaron con PBS/glutaraldehído al 2,5%. Las bacterias unidas se contaron visualmente usando un microscopio Diaphot invertido de Nikon equipado con epifluorescencia.

Cepa mutante SPRU25

Se generó una cepa mutante adicional de R6, SPRU25, como se describe en el Ejemplo 1 anterior.

Resultados y discusión

La adherencia a las células pulmonares mixtas de los nemococos de tipo 2 encapsulados y R6 no encapsulados (datos no mostrados) era sistemáticamente de 1-2 logaritmos menor en cada inóculo que las células de tipo II purificadas. Esto indicaba que las células de tipo II eran la diana preferida para las bacterias. La curva de concentración para las células de tipo II se muestra en la Figura 7. Se apreció una diferencia constante, pero estadísticamente no significativa entre las cepas encapsulada y no encapsulada, lo que sugería que la cepa de tipo II podría tener una capacidad ligeramente superior para adherirse que la variante no encapsulada.

Se analizó la capacidad de adherirse a HUVEC y a células pulmonares de tipo II de las cepas mutantes (Tabla 1). Se encontró que las cepas SPRU98, SPRU42, SPRU40, SPRU25 y SPRU121 tenían la capacidad de adhesión reducida en comparación con la cepa natural R6. La adherencia de otras cepas no estaba afectada significativamente por la mutación de las proteínas exportadas (datos no mostrados).

Las bacterias se valoraron a 10^{5}, 10^{6} y 10^{7} ufc por ml y se analizó su capacidad para adherirse a HUVEC (Figura 8) y a células pulmonares de tipo II (Figura 9). A la concentración más baja, el número de bacterias adherentes era relativamente el mismo entre los mutantes deficientes en adherencia y R6. A 10^{6}, y más notablemente, a 10^{7} ufc por ml las diferencias entre la unión de los mutantes tanto a HUVEC como a células pulmonares de tipo II variaba de significativas a espectaculares.

Las homologías de las proteínas exportadas de las cepas SPRU98, SPRU42 y SPRU40 se discuten en el Ejemplo 1 anterior. SPRU121 representa una mutación del locus amiA. Los resultados de este experimento proporcionan inesperadas evidencias de que la proteína exportada AmiA está implicada en la adhesión. SPRU25 es una cepa generada como se describe en el Ejemplo 1, con una mutación en exp10. No se ha encontrado ningún gen o proteína con homología con las secuencias de ácido nucleico [ID SEC Nº 21] o de aminoácidos [ID SEC Nº 22] de esta proteína exportada. La porción identificada de la secuencia de nucleótidos de exp10 y de la de aminoácidos de Exp10 se muestra en la Figura 10.

Estos resultados indican claramente que se pueden identificar las proteínas exportadas de S. pneumoniae que están implicadas en la adhesión de la bacteria a las células

Ejemplo 3 Las permeasas de péptidos modulan la transformación

El presente ejemplo se refiere a la explicación más detallada de la secuencia y función de Exp1, un mutante que invariablemente se transformaba 10 veces menos que la cepa parental. El análisis de la secuencia completa y la reconstitución del locus alterado revelaron un gen, al que se puso el nuevo nombre de plpA (del inglés, permease like protein, proteína semejante a permeasa) que codifica una posible proteína de unión a sustrato perteneciente a la familia de permeasas bacterianas responsables del transporte de péptidos. La secuencia de aminoácidos derivada para este gen era el 80% similar a AmiA, una proteína de unión a péptido homóloga de neumococo, y el 50% similar sobre 230 aminoácidos a Spo0KA, que es un elemento regulador en el proceso de transformación y esporulación en Bacillus subtilis. Se demostró que las fusiones de PlpA a fosfatasa alcalina (PhoA) estaban asociadas a membrana y marcadas con [^{3}H]-ácido palmítico que sirve probablemente como anclaje a la membrana. Los experimentos diseñados para definir las funciones de los determinantes plpA y ami en el proceso de transformación demostró que: 1] Los mutantes con defectos en plpA eran >90% deficientes en transformación mientras que los mutantes ami mostraban un aumento de la eficacia en la transformación de hasta cuatro veces. 2] En comparación con la cepa parenteral, el inicio de competencia en un mutante ami se producía más temprano en crecimiento logarítmico, mientras que el inicio se retrasaba en un mutante plpA. 3] La mutación de plpA disminuye la expresión de un locus regulado por competencia. Puesto que los mutantes de permeasas no podrían unir ligandos específicos, parece probable que la interacción sustrato-permeasa module el proceso de transformación.

Este ejemplo demuestra, a través del análisis mutacional que estas dos permeasas de péptidos tienen efectos distintos sobre la inducción de competencia, así como sobre la eficacia de la transformación. Por tanto, se propone que las permeasas de péptidos median el proceso de transformación en neumococos a través de la unión de sustrato y el posterior transporte o señalización y que estos sustratos pueden estar implicados en la regulación de competencia.

Materiales y procedimientos

Cepas y medios. Las cepas de S. pneumoniae usada en este Ejemplo se describen en el Ejemplo 1, en particular en la Tabla 1. La Tabla 5 enumera otras cepas de neumococos usadas en este estudio y resume sus características relevantes. Las cepas de Escherichia coli usadas se describen en el Ejemplo 1.

TABLA 5 Cepas bacterianas de Streptococcus pneumoniae usadas en este estudio

Cepa	Características relevantes	Plásmido integrado	Fuente
R6x	hex^{-}, cepa parental	ninguno	(Tiraby y Fox, 1973)
SPRU58	fusión plpA-phoA	pHp1p10	Estudio en curso
SPRU98	fusión plpA-phoA	pHp1p1	(Ejemplo 1)
SPRU107	plpA^{-}	pJp1p1	Estudio en curso
SPRU114	amiA^{-}	pJamiA1	Estudio en curso
SPRU121	fusión amiA-phoA	pHamiA1	(Ejemplo 1)
SPRU122	plpA^{-}	pJp1p9	Estudio en curso
SPRU148	amiC^{-}	pJamiC1	Estudio en curso
SPRU100	fusión exp10-phoA		Manuscrito en preparación
SPRU156	plpA^{-}, fusión exp10-phoA	pWp1p9	Manuscrito en preparación

Las condiciones de siembra sobre placa y cultivo de S. pneumoniae se describen en el Ejemplo 1. Para los estudios de marcaje los cultivos se cultivaron en un medio químicamente definido (C_{DEN}) preparado como se ha descrito (Tomasz, 1964, Bacteriol. Proc. 64:29). E. coli se cultivó en medio de Luria-Bertani líquido o en medio TSA sólido suplementado con 500 \mug/ml de eritromicina o 100 \mug/ml de ampicilina, cuando era apropiado. Para la selección y mantenimiento de neumococos que contenían plásmidos integrados en el cromosoma, las bacterias se cultivaron en presencia de 0,5 \mug/ml de eritromicina.

Bibliotecas de PhoA^{+} y mutagénesis. Se crearon bibliotecas de mutantes neumocócicos que expresaban fusiones de PhoA mediante inactivación por inserción con los vectores conductores de E. coli neumocócicos no replicativos, pHRM100 o pHRM104. El vector conductor de E. coli neumocócico, pJDC9, se usó para la inactivación génica sin la generación de fusiones de phoA. Las construcciones de plásmidos usadas para la mutagénesis se muestran en la Figura 7. Los detalles de estos procedimientos se describen en el Ejemplo 1.

Transformación neumocócica. Para detectar selectivamente grandes cantidades de mutantes por su disminución en la eficacia de transformación, se transfirieron colonias individuales a placas de microvaloración de 96 pocillos que contenían 250 \mul de medio líquido y ADN cromosómico (concentración final, 1 \mug/ml) de una cepa de neumococo resistente a estreptomicina (ADN Str^{r}). Tras la incubación durante 16 h a 37ºC, se sembraron en placa 5 \mul de muestra sobre medio sólido con y sin antibiótico para determinar la eficacia de transformación. Las cepas control producían aproximadamente 10^{5} transformantes Str^{r}/ml, mientras que los candidatos deficientes para la transformación producían menos de 10^{4} transformantes Str^{r}/ml.

Los mutantes de permeasas se valoraron en un ensayo de transformación más definido (Figura 15). Los cultivos madre de bacterias se diluyeron a una densidad celular de aproximadamente 10^{6} ufc/ml en medio C+Y con ADN Str^{r}. Esta solución se distribuyó en alícuotas de 250 \mul en una placa de microvaloración de 96 pocillos y las bacterias se cultivaron durante 5 horas a 37ºC hasta una DO_{620} de aproximadamente 0,6. Las bacterias totales y los transformantes Str^{r} se determinaron mediante dilución seriada de los cultivos sobre medio sólido con o sin antibiótico. La eficacia de transformación se calculó como el porcentaje de transformantes Str^{r}/número total de bacterias y se comparó con la cepa parental, R6x.

Los perfiles de competencia que valoran la transformación se generaron a partir de los cultivos en medio líquido. El cultivo madre de bacterias se diluyó a una densidad celular de aproximadamente 10^{6} ufc/ml en medio C+Y nuevo (10 ml) y se cultivó a 37ºC. Se retiraron muestras (500 \mul) a intervalos programados, se congelaron y se conservaron en glicerol al 10% a -70ºC. Estas muestras se descongelaron en hielo y a continuación se incubaron con ADN Str^{r} durante 30 min a 30ºC. Se añadió ADNasa a una concentración final de 10 \mug/ml para detener la captación adicional de ADN y los cultivos se transfirieron a 37ºC durante un periodo adicional de 1,5 h para permitir la expresión de la resistencia al antibiótico. La eficacia de transformación se calculó como se describe anteriormente.

Técnicas de recombinación de ADN. Las técnicas de ADN convencionales que incluyen minipreparaciones de plásmidos, digeridos con endonucleasas de restricción, ligamientos, transformaciones en E. coli y electroforesis en gel se hicieron según los procedimientos convencionales (Sambrook y col., 1989, anterior). Los fragmentos de restricción usados en los experimentos de clonación se aislaron a partir de geles de agarosa usando perlas de vidrio (Bio 101) o extracciones con fenol. Las preparaciones de plásmidos a gran escala se prepararon usando las columnas de afinidad según las instrucciones del fabricante (Qiagen).

La secuenciación del ADN de doble hebra se realizó mediante el método de Sanger (Sanger y col., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-67) usando [a-^{35}S]-dATP (New England Nuclear) y el kit de Sequenase Versión 2.0 (United States Biochemical Corp.), según las instrucciones del fabricante. Se añadió dimetilsulfóxido (1 % v/v) a las etapas de hibridación y extensión.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó usando el kit Gene Amp (Perkin Elmer Cetus). Los oligonucleótidos fueron sintetizados por Oligos Etc. Inc. o en las Instalaciones de Secuenciación de proteínas de la Universidad Rockefeller.

Marcaje in vivo de PlpA-PhoA. Los cultivos madre congelados de neumococos se resuspendieron en 4 ml de medio C_{DEN} nuevo y se cultivaron hasta una DO_{620} de 0,35 a 37ºC. Cada cultivo se suplementó con 100 \muCi de [9,10-^{3}H]-ácido palmítico (New England Nuclear) y se cultivaron durante un tiempo adicional de 30 min. Las células se recogieron mediante centrifugación y se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El sedimento celular final se resuspendió en 50 \mul de tampón de lisis (PBS, 10 \mug/ml de ADNasa, 10 \mug/ml de ARNasa, desoxicolato al 5% [v/v]) y se incubó durante 10 min a 37ºC. Para inmunoprecipitar la proteína de fusión PlpA-PhoA se incubó el lisado celular con 20 \mul de anticuerpos anti-PhoA conjugados a Sepharosa (5'3' Inc.) durante 1 h a 4ºC. La suspensión se lavó tres veces con volúmenes iguales de PBS y una vez con 100 \mul de Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, tetra-acetato de etilendiamina dipotásico (EDTA) 0,5 mM. El sobrenadante final se desechó y la resina se resuspendió en 30 \mul de tampón de muestra SDS, se hirvió durante 5 min y se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS y se autorradiografió.

Fraccionamiento subcelular. Los neumococos se fraccionaron en los componentes subcelulares mediante una técnica descrita previamente (Hakenbeck y col., 1986, Antimicrob. Agents Chemother. 30:553-8). Brevemente, se cultivaron las bacterias en 400 ml de medio C+Y hasta una DO_{620} de 0,6 y se aislaron mediante centrifugación a 17.000 g durante 10 min. El sedimento celular se resuspendió en un volumen total de 2 ml de TEPI (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, fenilmetilsulfonil fluoruro 1 mM, 20 \mug/ml de leupeptina y 20 \mug/ml de aprotinina). Se añadió medio volumen de perlas de vidrio lavadas y la mezcla se agitó durante 15 a 20 min a 4ºC hasta que las células se rompieron según se comprobó mediante inspección microscópica. La suspensión se separó de las perlas de vidrio mediante filtración en un embudo de vidrio sinterizado. Las perlas se lavaron con 5 ml adicionales de TEPI. Las soluciones combinadas se centrifugaron durante 5 min a 500 g para separar los restos celulares del material de la pared celular, las membranas bacterianas y el contenido citoplásmico. A continuación, se centrifugó el sobrenadante durante 15 min a 29.000 g. El sedimento contenía la fracción de pared celular, mientras que el sobrenadante se sometió a otra centrifugación durante 2 h a 370.000 g. El sobrenadante de este procedimiento contenía la fracción citoplásmica, mientras que el sedimento contenía las membranas bacterianas. Se evaluó el contenido proteico de muestras de cada fracción y se solubilizaron en tampón de muestra SDS para la posterior electroforesis en gel. Las proteínas de fusión PlpA-PhoA se detectaron con antisuero anti-PhoA (5'3' Inc.) y se visualizaron indirectamente mediante quimioluminiscencia potenciada como se describe en el Ejemplo 1.

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Recuperación y secuenciación de plpA. La Figura 18 muestra un mapa de endonucleasas de restricción de plpA y fragmentos de diversos subclones. Los plásmidos con fragmentos clonados en pHRM104 tienen el prefijo H, mientras que aquellos clonados en pJDC9 tienen el prefijo J. Los plásmidos integrados pHplp1 y pHplp10 se aislaron de SPRU98 y SPRU58, respectivamente, mediante transformación en E. coli de plásmidos escindidos espontáneamente que contaminan la preparaciones cromosómicas de ADN. Se usó el "desplazamiento sobre cromosoma" para aislar la mayoría de plpA y de la región después del extremo 3'. Se clonó la inserción de 500 pb de pHplp1 a través de KpnI en pJDC9 para producir pJplp1 que se transfirió de vuelta en neumococos para producir SPRU107. Se digirió el ADN cromosómico de SPRU107 con diversas enzimas de restricción que cortaron el vector una vez, pero no en el fragmento original. El ADN se ligó de nuevo y se transformó en E. coli con selección para el vector. Usando este procedimiento, PstI producía pJplp2 y HindIII producía pJplp3 que extendían ambos la región 3' del fragmento original en pJplp1 en 190 pb, mientras que SphI producía pJplp4 que contenía 3,8 kb adicionales. La subclonación de un fragmento interno de 900 pb de pJplp4 en pJDC9 dio el plásmido pJplp5 que contenía 630 pb después del extremo 3' de plpA. Se aislaron 450 pb adicionales antes del extreme 5' a partir del fragmento original usando EcoRI (pJplp6). Se clonó el fragmento interno de 730 pb de pJplp6 en pJDC9 dando pJplp7 y un fragmento interno EcoRI/PstI de 200 pb de pJplp6 en los sitios apropiados de pJDC9 para producir pJplp8.

La región antes del extremo 5' del fragmento original de plpA se obtuvo mediante "clonación por homología" usando oligonucleótidos degenerados y específicos con ADN cromosómico en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El oligonucleótido degenerado, lipo1, (GCC GGA TCC GGW GTW CTT GCW GCW TGC donde W es A + T) (ID SEC Nº 49) se basó en el motivo consenso del precursor de lipoproteína en AmiA (Alloing y col., 1990, Mol. Microbiol. 4:633-44) y SarA, un homólogo de la proteína de unión a permeasas de péptidos de S. gordonii (Jenkinson, 1992, Infect. Immun. 60:1225-8). El oligonucleótido específico, P1, (TAC AAG AGA CTA CTT GGA TCC) (ID SEC Nº 50) era complementario al extremo 5' de la inserción pJplp6. Para prevenir la amplificación del gen amiA altamente homólogo, se uso ADN cromosómico de SPRU114 que tiene un amiA alterado. El ADN cromosómico se digirió primero con XhoI para producir moldes más cortos. Las condiciones de la PCR fueron 40 ciclos a 94ºC durante 30 segundos para la desnaturalización, 40ºC durante 30 segundos para la hibridación y 72ºC durante 1 min para la extensión. Se obtuvo un producto de 600 pb, se purificó en gel, se digirió con BamHI y se clonó en Bluescript KS (Stratagene) dando pBSplp9. A continuación se subclonó el fragmento digerido con BamHI en pJDC9 para producir pJplp9. Este plásmido se transformó en neumococos para dar SPRU122.

Generación de un mutante plpA que contiene un gen regulado por competencia fusionado con fosfatasa alcalina. El fragmento BamHI de 600 pb de pBSplp9 se ligó a pWG5 digerido con SauIIIa (Lacks y col., 1991, Gene 104:11-17) dando lugar a pWplp9. Este plásmido se transformó en SPRU100, que contiene un gen, exp10, a partir del locus rec regulado por competencia, fusionado con phoA, dando SPRU156. La correcta integración del vector en el cromosoma se confirmó mediante PCR. La actividad fosfatasa alcalina se midió como se describe en el Ejemplo 1, pero con una concentración final de sustrato (p-nitrofenil fosfato, Sigma) de 2,5 mg/ml. Las unidades de actividad se calcularon usando la siguiente fórmula:

\frac{DO_{420} - 1,75 \ x \ DO_{550}}{tiempo(h) \ x \ DO_{600} \ (de \ cultivo \ resuspendido)}

Generación de mutantes ami. Los fragmentos internos de ami obtenidos mediante PCR y digestión con endonucleasas de restricción se ligaron en los vectores conductores apropiados y se transformaron en neumococos para producir los diversos mutantes ami. La construcción de la fusión génica entre amiA y phoA se ha descrito previamente en el Ejemplo 1 para dar SPRU121. Para obtener un amiA truncado, se usaron los oligonucleótidos ami1 (ACC GGA TCC TGC CAA CAA GCC TAA ATA TTC) (ID SEC Nº 51) y ami2 (TTT GGA TCC GTT GGT TTA GCA AAA TCG CTT) (ID SEC Nº 52) para generar un producto de 720 pb en el extremo 5' de amiA. Este fragmento se digirió con HindIII y EcoRI, que están dentro de la región codificadora de amiA, y el fragmento correspondiente de 500 pb se clonó en pJDC9. El plásmido pJamiA resultante se transformó en neumococos para producir SPRU114. Para inactivar amiC se usaron los oligonucleótidos amiC1 (CTA TAC CTT GGT TCC TCG) (ID SEC Nº 53) y amiC2 (TTT GGA TTC GGA ATT TCA CGA GTA GC) (ID SEC Nº 54), que son internos en amiC, para generar un producto de 300 pb usando PCR. El fragmento resultante se digirió con BamHI y se clonó en pJDC9, produciendo el plásmido pJamiC1, que se transformó en neumococos para producir SPRU148.

Análisis por inmunotransferencia de ARN total. Se preparó el ARN según los procedimientos adaptados de Simpson y col. (1993, FEMS Microbiol. Lett. 108:93-98). Las bacterias se cultivaron hasta una DO_{620} de 0,2 en medio C+Y, pH 8,0. Después de la centrifugación (12.000 g, 15 min, 4ºC) el sedimento celular se resuspendió en 1/40 volúmenes de tampón de lisis (desoxicolato al 0,1%, sacarosa al 8%, ditiotreitol 70 mM). Se añadió SDS al 0,1% y la suspensión se incubó a 37ºC durante 10 min. Los restos celulares se eliminaron y se añadió un volumen igual de cloruro de litio 4 M frío al sobrenadante. La suspensión mezclada se dejó en hielo durante una noche y a continuación se centrifugó a 18.500 g durante 30 min a 4ºC. El sedimento que contenía el ARN se resuspendió en 1,2 ml de acetato sódico frío (100 mM, pH 7,0) y SDS al 0,5%, se extrajo tres veces con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y una vez con un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). El ARN se precipitó con etanol y se resuspendió en agua estéril. El rendimiento y pureza se determinaron mediante espectrofotometría con un rendimiento típico de 300 \mug de ARN a partir de 800 ml de cultivo.

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Las muestras de ARN se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,2%/formaldehído al 6,6% (Rosen y Villa-Komaroff, 1990, Focus 12:23-24). El gel se lavó en agua y el ARN se transfirió a filtros de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell) mediante transferencia por capilaridad (Sambrook y col., 1989, anterior). La prehibridación se hizo durante 4 h en solución de Denhardt al 0,2% (la solución de Denhardt 1x es Ficoll al 1%, polivinilpirrolidona al 1%, albúmina sérica bovina al 1%), SDS al 0,1%, SSC 3x (SSC 1x es NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM), HEPES 10 mM, 18 \mug/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón y 10 \mug/ml de ARNt de levadura a 65ºC con agitación suave.

La sonda de ADN usada para detectar las transcripciones de plpA fue un fragmento HindIII-BamHI de 480 pb de pJplp9. Para la detección de las transcripciones de amiA, la sonda de ADN fue un producto de PCR de 720 pb generado con los oligonucleótidos ami1 y ami2 (descritos anteriormente). Los fragmentos de ADN se marcaron con [a-^{32}P]-dCTP usando el sistema Nick Translation (New England Nuclear). La hibridación se realizó a 65ºC durante una noche. Los lavados de hibridación fueron SSC 2x, SDS al 0,5% durante 30 min a temperatura ambiente, seguido por 3 lavados de 30 min a 65ºC en SSC 1x, SSC 0,5x y SSC 0,2x, todos con SDS al 0,5%.

Resultados

Identificación de un mutante deficiente en transformación con un defecto en una permeasa de péptidos. Para identificar proteínas exportadas en mutantes como se describe en el Ejemplo 1 anterior, que participan en el proceso de transformación, se analizó una disminución en la eficacia de transformación de 30 mutantes PhoA^{+}. En un ensayo diseñado para analizar un número grande de mutantes, la transformación de una mutación cromosómica para la resistencia a estreptomicina (Str^{r}) en la cepa parental (R6x) producía aproximadamente 10^{5} ufc/ml de transformantes Str^{r}. El mutante PhoA^{+}, SPRU98, mostraba sistemáticamente el 90% de reducción en el número de transformantes Str^{r} (10^{4} ufc/ml). La transformación de la mutación PhoA^{+} en Rx6 parental producía cepas que eran tanto PhoA^{+} como deficientes en transformación, demostrando que la mutación causada por la fusión génica estaba ligada al defecto en la transformación. La tasa de crecimiento de SPRU98 era idéntica al de la cepa parental, lo que sugería que el fenotipo deficiente en transformación no era debido a un efecto pleiotrópico relacionado con el crecimiento del organismo (datos no mostrados). La recuperación e identificación del locus mutado en SPRU98 puso de manifiesto plpA (del inglés, permease like protein, proteína semejante a permeasa) (Figura 11, ID SEC Nº 46), que corresponde a exp1. La secuencia de aminoácidos de plpA derivada (ID SEC Nº 47) mostró considerable similitud con las proteínas de unión a sustrato asociadas con las permeasas bacterianas (para revisión, véase Tam y Saier, 1993, Microbiol. Rev. 57:320-346) con la similitud más grande con AmiA (60% de identidad de secuencia) (Figura 12A; ID SEC Nº 48). El alineamiento de PlpA con las proteínas de unión de la familia de permeasas bacterianas de péptidos reveló varios bloques de similitud de secuencia que sugieren motivos funcionales comunes a todos los miembros de esta familia (Figura 12B).

La mayoría de los ejemplos de permeasas de péptidos tienen una estructura génica que consiste en cinco genes que codifican una proteína de unión a sustrato exportada, dos proteínas integrales de membrana y dos proteínas asociadas a membrana que son responsables del transporte del sustrato a través de la membrana citoplásmica (para revisiones, véanse Higgins, 1992, Annu. Rev. Cell. Biol. 8:67-113; Tam y Saier, 1993, anterior). El análisis de la secuencia de 630 pb inmediatamente después del extremo 3' y en la región de 3,3 kb después del extremo 3' de plpA, no reveló ninguna secuencia codificadora que fuera homóloga a estos elementos de transporte (datos no mostrados). Por tanto, si PlpA se acopla al transporte de sustrato, entonces esto puede ocurrir a través de los productos de un alelo distinto. Hay precedentes sobre esto. En Salmonella typhimurium, los genes hisJ y argT codifican las proteínas de unión periplásmicas muy similares, J y LAO. Estas dos proteínas transportan sus sustratos a los mismos componentes asociados a membrana (Higgins y Ames, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6038-42). Asimismo, las proteínas de unión periplásmicas LS-BP y LIV-BP de Escherichia coli, que transportan leucina y aminoácidos de cadenas ramificadas, también utilizan el mismo grupo de componentes unidos a membrana (Landick y Oxender, 1985, J. Biol. Chem. 260:8257-61).

No se pudo recuperar el extremo 5' de plpA debido quizás a la toxicidad de la proteína expresada en E. coli. Se han encontrado dificultades similares en la clonación de genes de otras permeasas de neumococos, tales como amiA y malX (Alloing y col., 1989, anterior; Martin y col., 1989, Gene 80:227-238). En función de la similitud de secuencia entre las secuencias de plpA y amiA derivadas, se clonó el extremo 5' completo del gen, excepto 51 pb.

Localización en la membrana y modificación covalente postraduccional de PlpA. Tanto PlpA como AmiA contienen la secuencia consenso LYZCyz (Y = A, S, V, Q, T: Z = G, A: y = S, T, G, A, N, Q, D, F: z = S, A, N, Q, G, W, E) en el extremo N-terminal que es el motivo distintivo para la modificación lipídica postraduccional de lipoproteínas en bacterias (Gilson y col., 1988, EMBO J. 7:3971-74; Yamaguchi y col., 1988, Cell 53:423-32). En organismos Gram positivos, esta modificación sirve para anclar estos polipéptidos a la membrana citoplásmica (Gilson y col., 1988, anterior). Los ejemplos específicos de proteínas permeasas de unión a sustrato que contienen esta secuencia consenso incluyen SarA de Streptococcus gordonii (Jenkinson, 1992, Infect. Immun. 60:1225-8), Spo0KA de B. subtilis (Perego y col., 1991, Mol. Microbiol. 5:173-185; Rudner y col., 1991, J. Bacteriol. 173:1388-98), TraC y PrgZ de E. faecalis (Ruhfel y col., 1993, J. Bacteriol. 175:5253-59; Tanimoto y col., 1993, J. Bacteriol 175:5260-64) y MalX de S. pneumoniae (Gilson y col., 1988, anterior).

En apoyo de esta propuesta, la Figura 13 muestra que la proteína PlpA-PhoA se exporta y se asocia principalmente con las membranas citoplásmicas. También se detectaron pequeñas cantidades en la fracción de pared celular y en el sobrenadantes del cultivo, lo que sugiere que algo de PlpA se puede liberar desde la membrana. Esto también se observa para la proteína de unión a péptido OppA (Spo0KA) de B. subtilis, donde OppA se asocia inicialmente con la célula, pero durante el crecimiento se liberan proporciones crecientes (Perego y col., 1991, anterior). De este modo, PlpA y OppA pueden estar presentes en el exterior de la célula en una forma susceptible de ser secretada como se ha propuesto para otras lipoproteínas en bacterias Gram positivas (Nielsen y Lampen, 1982, J. Bacteriol. 152:315-322). Aunque no se puede excluir que la presencia de la proteína de fusión en estas fracciones no refleje la localización de la molécula nativa, sino más bien el procesamiento de una proteína extraña, esto parece poco probable, puesto que otras fusiones de PhoA asociadas a membrana se asocian firmemente con membranas citoplásmicas.

Finalmente, una proteína de 93 kDa marcada con [^{3}H]-ácido palmítico que corresponde a la proteína de fusión PlpA-PhoA se inmunoprecipitó a partir de SPRU98 que contiene una construcción génica plpA-phoA (Figura 13, panel inferior). Por el contrario, no se detectó la proteína marcada de forma similar en el control parental o en SPRU100 que contiene una fusión PhoA no definida. Esto demuestra la modificación lipídica postraduccional in vivo de PlpA.

Análisis transcripcional de plpA y amiA. Las transcripciones de 2,2 kb se detectaron con sondas específicas para plpA y amiA en preparaciones de ARN de células R6x (Figura 14). Esta es similar en tamaño a la región codificadora de ambos genes. Para eliminar la posibilidad de hibridación cruzada entre las sondas para plpA y para amiA, se hicieron lavados con alta rigurosidad después de la hibridación (véanse los procedimientos experimentales). La especificidad de las sondas se demostró también cuando el ARN preparado a partir del mutante SPRU107, que contiene una inserción plasmídica en plpA, se incubó con sonda con amiA y plpA. La transcripción de amiA se mantenía en 2,2 kb, mientras que la transcripción de plpA cambió a 2,6 kb. En SPRU107, plpA se alteró en el pb 1474 por pJDC9. La transcripción de plpA sería 520 pb más pequeña que la transcripción de longitud completa (1,7 kb), con 800 pb adicionales de pJDC9 que dan una transcripción de aproximadamente 2,5 kb, que es similar a la transcripción de 2,6 kb detectada.

Una única transcripción que corresponde al tamaño de plpA sugiere que plpA no es parte de un operón. Esto se confirma mediante el análisis de la secuencia después del extremo 3' de plpA que no reveló ningún homólogo con los genes que codifican los elementos de transporte asociados frecuentemente con las permeasas de péptidos (datos no mostrados). Además, se identificó un posible terminador de la transcripción independiente de rho de 21 pb después del codón de parada de la traducción de plpA (Figura 11).

Las mutaciones en las permeasas PlpA y AmiA tienen efectos distintos sobre el proceso de transformación. Para determinar el efecto de las permeasas durante la competencia, valoramos la eficacia de transformación de mutantes con defectos en plpA o ami. En este ensayo, las cepas de bacterias se transformaron con un marcador seleccionable a través de un ciclo de competencia completo seguido por una posterior crecimiento y a continuación se sembraron sobre placas para la selección de las células que han incorporado el marcador antibiótico. Los resultados son, de este modo, una medida del número total de células transformadas durante la competencia. Los mutantes que producían fusiones truncadas o de PhoA de PlpA mostraban una disminución de dos a diez veces en la eficacia de transformación (Figura 15).

En los mutantes con una alteración en el Asp_{492} de PlpA, la presencia (SPRU98) o ausencia (SPRU107) de PhoA no afectaba la disminución del 90% en la eficacia de transformación. Por otro lado, un mutante (SPRU122) que producía una PlpA truncada en el Asp_{192} mostraba una disminución del 90% en la eficacia de transformación, mientras que en SPRU58 la fusión a PhoA en la Leu_{197} restablecía parcialmente el fenotipo parental. En esta construcción es posible que PhoA confiera funcionalidad contribuyendo a la estructura terciara de la quimera afectando, de este modo, su capacidad para unirse a sus sustratos.

Por el contrario, los mutantes con defectos en ami eran capaces para la transformación. Los mutantes que producían AmiA truncada en la Pro_{191} en presencia (SPRU121) o ausencia (SPRU114) de PhoA mostraron un modesto aumento en la eficacia de transformación (Figura 15). Además, el mutante SPRU148 con una alteración en AmiC (IIe_{126}) mostró un aumento de cuatro veces en la eficacia de transformación. En este mutante suponemos que se produce AmiA y, de este modo, es capaz de unirse a su sustrato. Por tanto, el aumento observado con el mutante amiC sugiere que el transporte de sustrato a través del complejo de transporte codificado por ami puede regular la transformación, además de la unión al sustrato por AmiA. Finalmente, incluso aunque PlpA y AmiA son estructuras muy relacionadas (60% de identidad de secuencia) los efectos dispares observados con mutaciones en plpA y ami sobre la eficacia de transformación sugieren que la especificidad de sustrato confiere estas diferencias.

La transformación se produce durante un único ciclo de competencia en crecimiento logarítmico temprano (Figura 16). Por tanto, la regulación de este proceso puede ocurrir mediante la modificación del inicio de competencia (un cambio en la curva) o mediante la alteración de la expresión de genes inducidos por competencia que conducen a un cambio en el número de células transformadas eficazmente. Para determinar si las permeasas regulan el proceso de transformación comparamos los perfiles de competencia de los mutantes de permeasas con la cepa parental. Este análisis mide el número de células transformadas en la población de células en diversos estados de crecimiento durante un ciclo de competencia. La Figura 16 muestra un único ciclo de competencia para la cepa parental (R6x) con una eficacia de transformación máxima de 0,26% a una DO_{620} de 0,12. Esto corresponde a una densidad celular de aproximadamente 10^{7} ufc/ml. Un mutante en plpA (SPRU107) sufrió un ciclo de transformación similar con una eficacia de transformación máxima de sólo el 0,06% a una densidad celular más alta. Por el contrario, un mutante amiA (SPRU114) sufrió un ciclo de transformación que persistía durante más de un tiempo de multiplicación con una eficacia de transformación máxima del 0,75%. El inicio del ciclo de competencia en SPRU114 se produjo a una densidad celular más temprana comenzando por una DO_{620} de 0,03. A partir de estos datos se concluye que mutaciones en cualquier de las dos permeasas tienen un efecto doble sobre el proceso de transformación, afectando ambas la inducción del ciclo de competencia, así como modulando el número de transformantes
eficaces.

Una mutación en plpA causa un descenso en la expresión de un locus regulado por competencia. El locus rec en neumococos, que es necesario para la transformación genética, contiene dos genes, exp10 y recA. Los resultados con una fusión génica postraduccional exp10-phoA han demostrado un incremento de 10 veces en la actividad enzimática, demostrando la inducción de competencia que este es un locus regulado por competencia. Para determinar si las permeasas de péptidos afectan directamente a la expresión de este locus inducido por competencia, construimos un mutante (SPRU156) con una mutación nula en plpA y la fusión génica exp10-phoA. Midiendo la actividad fosfatasa alcalina durante el crecimiento, demostramos que, comparado con una cepa isogénica (SPRU100), el mutante que portaba la mutación en plpA demostró un descenso de casi dos veces en la expresión de la fusión exp10-phoA (Figura 17). Por tanto, estos resultados muestran que al menos plpA afecta directamente a la cascada de señalización responsable de la expresión de un gen regulado por competencia necesario para la transformación.

Discusión

La proteína exportada recién identificada Exp1 está codificada por el determinante genético, al que se ha puesto el nuevo nombre en este documento de plpA. Este locus, junto con el locus ami, modula el proceso de transformación en S. pneumoniae. Ambos loci codifican proteínas de unión a péptidos muy similares (PlpA y AmiA) que son miembros de una familia creciente de permeasas bacterianas responsables del transporte de péptidos pequeños (Figura 12B). Ejemplos de estas proteínas de unión a péptidos se han asociado con el proceso de transferencia génica en varias bacterias. En B. subtilis, la inactivación de spo0KA, el primer gen de un operón con competentes homólogos a las permeasa de péptidos, causaba una disminución en la eficacia de transformación, así como la parada de la esporulación (Perego y col., 1991, anterior; Rudner y col., 1991, anterior). El sustrato para Spo0KA no se conoce. B. subtilis produce al menos un factor de diferenciación extracelular que es necesario para la esporulación (Grossman y Losick, 1988, anterior) y se ha propuesto que este sistema de transporte podría estar implicado en la detección de este factor peptídico extracelular que puede ser necesario para la competencia y esporulación.

La transferencia por conjugación de varios plásmidos en E. faecalis se controla mediante feromonas peptídicas extracelulares. Recientes análisis genéticos han identificado dos genes codificados por plásmidos, prgZ y traC, cuyos productos derivados son homólogos a las proteínas de unión a péptidos. Las evidencias experimentales sugieren que estas proteínas pueden unir las feromonas peptídicas mediando, de este modo, la señal que controla la conjugación (Ruhfel y col., 1993, anterior; Tanimoto y col., 1993, anterior). La ausencia de elementos del transporte de membrana es un aspecto común entre los determinantes prgZ, traC y plpA que implica que el transporte no es necesario para la transducción de la señal o que es necesario un alelo distinto para el transporte.

Las mutaciones en plpA y en ami causan una disminución o un aumento en la eficacia de transformación, respectivamente. Además, las mutaciones en estos loci afectan la inducción del estado de crecimiento específico del estado competente. Comparado con la cepa parental, una mutación en ami induce un inicio temprano de competencia, mientras que una mutación en plpA retrasa esta inducción. Además, una fusión traduccional a un locus regulado por competencia ha demostrado que una mutación en plpA afecta directamente a la expresión de un gen necesario para el proceso de transformación. Dado que la inducción de competencia se produce en función de la densidad celular (Tomasz, 1966, J. Bacteriol. 91:1050-61), es razonable proponer que estas permeasas sirven como elementos reguladores que modulan la inducción de competencia dependiente de la densidad celular mediante la unión y/o transporte de moléculas señalizadoras. Los péptidos pequeños que son los supuestos sustratos de estas permeasas en otras bacterias o la proteína activadora neumocócica extracelular son probables candidatos como ligandos para estas permeasas. Puesto que los mutantes defectivos en permeasas de péptidos de Salmonella typhimurium y Escherichia coli no pueden reciclar los péptidos de la pared celular liberados al medio de cultivo, se ha propuesto que estas permeasas unen y transportan péptidos de la pared celular (Goodell y Higgins, 1987, J. Bacteriol. 169:3861-65; Park, 1993, J. Bacteriol. 175:7-11). De este modo, los péptidos de la pared celular son probables candidatos. Recientes evidencias genéticas sugieren que el transporte de cationes divalentes (Ni^{2+}) también está acoplado a la función de permeasas de péptidos en E. coli (Navarro y col., 1993, Mol. Microbiol. 9:1181-91). También se ha demostrado que el acoplamiento de Ca^{2+} extracelular al transporte intracelular puede afectar la transformación (Trombe, 1993, J. Gen. Microbiol. 139:433439; Trombe y col., 1992, J. Gen. Microbiol. 138:77-84). Por tanto, el transporte de cationes divalentes mediado por permeasas de péptidos también es un modelo viable para la señalización intracelular y la posterior modulación de la transformación.

Ejemplo 4 Un homólogo de la piruvato oxidasa regula la adherencia

El presente Ejemplo describe el aislamiento y determinación de secuencia de un mutante Exp que codifica un homólogo de la piruvato oxidasa. Esta nueva proteína regula la adherencia bacteriana a células eucarióticas.

Se reconoce que la adhesión bacteriana a células epiteliales de la nasofaringe es un requisito para la colonización de la superficie mucosa y la infección. La pared celular neumocócica y las proteínas de la superficie bacteriana median la unión a células eucarióticas. Los determinantes moleculares que el neumococo reconoce sobre la superficie de la célula eucariótica son azúcares complejos, especialmente los restos de hidratos de carbono GlcNAc\beta1-3Gal o GalNAc\beta1-4Gal.

Se analizó la pérdida de unión de los mutantes, como se describen en el Ejemplo 1, anterior, a células pulmonares de tipo II (T2LC), a células endoteliales humanas (HUVEC) y a receptores de azúcar GlcNAc\beta1-3Gal en un ensayo de hemaglutinación que refleja la adherencia a células de la nasofaringe.

Uno de los 92 mutantes independientes, denominado Pad1 (del inglés, pneumococcal adherence 1, adherencia neumocócica 1), mostraba incapacidad para hemaglutinar el receptor de azúcar GlcNAc\beta1-3Gal sobre los eritrocitos bovinos tratados con neuraminidasa como se describe (Andersson y col., véase el Ejemplo 2). Posteriormente, a este mutante se le ha puesto el nuevo nombre de PoxB. La hemaglutinación de eritrocitos bovinos tratados con neuraminidasa refleja la adherencia a células de la nasofaringe. La mutagénesis dirigida de la cepa parental que inactiva pad1 volvía a confirmar que la pérdida de hemaglutinación estaba ligada a este locus.

Este mutante también mostró una disminución mayor del 70% en la adhesión a T2LC y HUVEC, como se muestra en la Figura 19.

La recuperación y reconstitución del locus mutado pad1 reveló una fase de lectura abierta de 1,8 kb con similitud de secuencia con enzimas de la familia de ácido acetohidroxisintetasa-piruvato oxidasa. En especial, pad1 comparte el 51% de similitud de secuencia con pox recombinante y el 32% de similitud con poxB. La alteración génica dirigida del locus en la cepa parental mostró que la mutación en este locus era responsable de la pérdida de adherencia en los tres ensayos.

El fraccionamiento subcelular de un mutante que expresaba una fusión Pad1-PhoA mostró que la proteína se localizada en la membrana y el citoplasma (Figura 20A). La comparación de los componentes antigénicos de la superficie en la cepa parental y mutante mostró que la pérdida de un polipéptido de 17 kDa no correspondía a Pad1 (Figura 20B).

Estos resultados indican que Pad1 afecta a la adherencia neumocócica a múltiples tipos celulares, posiblemente regulando la expresión de adhesinas bacterianas.

El mutante en Pad1 necesitaba acetato para crecer en un medio químicamente definido (Figuras 21 y 22). El crecimiento en acetato restablecía las propiedades de adhesión de las bacterias tanto a células de pulmón como endoteliales.

La información de la secuencia de nucleótidos para la región promotora de pad1 muestra un posible sitio -35, una secuencia taatat -10, un sitio de unión a ribosoma y un sitio de inicio de la traducción (Figura 23) (ID SEC Nº 55). También se proporciona la traducción de la proteína deducida de esta región (Figura 23) (ID SEC Nº 56).

Esta invención puede realizarse en otras formas o realizarse de otro modo sin alejarse de las características esenciales de la misma. La presente descripción se debe considerar, por tanto, a todos los respectos, como ilustrativa y no restrictiva, estando el alcance de la invención indicado por las reivindicaciones adjuntas y se pretende que ésta abarque todos los cambios que estén dentro del sentido e intervalo de equivalencia.

También se debe entender que todos los tamaños de pares de bases dados para los nucleótidos y la información de todos los pesos moleculares para proteínas son aproximados y se usan para el propósito de la descripción.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Universidad Rockefeller, The Masure Ph.D.,

\hskip3.9cm

H. Robert Pearce, Barbara

\hskip3.9cm

J. Tuomanen, Elaine

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEINAS BACTERIANAS EXPORTADAS Y VACUNAS ACELULARES BASADAS EN LAS MISMAS.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 56

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(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Klauber y Jackson

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 411 Hackensack Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Hackensack

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(D): ESTADO: Nueva Jersey

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 07601

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM compatible con PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: WO por asignar

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-SEP-1994

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/245.511

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-MAYO-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/116.541

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-SEP-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Jackson Esq., David A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 26,742

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 600-1-069 PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 201 487-5800

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 201 343-1684

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX: 133521

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 490 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU98

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..490

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 163 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 960 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU42

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..960

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 320 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 520 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU40

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..519

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 173 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 282 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU39

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3..281

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 93 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 327 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU87

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3..326

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 417 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU24

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3..416

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 138 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12:

\newpage

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 246 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU75

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3..245

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 81 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 292 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU81

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3..290

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 342 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU17

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3..341

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 235 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU17

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..234

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 78 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 251 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU25

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (2..250)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 83 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 163 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 77 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU42

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 24:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 173 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU40

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 25:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 175 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

+(A): ORGANISMO: Neisseria gonorrheae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 26:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 69 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU39

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 27:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 69 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Lycopersicon esculentum (tomate)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 28:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 98 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU87

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 29:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Bacillus subtilis

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 30:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 69 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 31:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 69 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Bacillus subtilis

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 32:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU75

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 33:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus typhimurium

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 34:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 72 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU81

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 35:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 73 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Bordetella pertussis

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 36:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 86 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU17

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 37:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 86 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Escherichia coli

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 38:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 78 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Escherichia coli

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 39:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGATCCA TGAARAARAA YMGHGTNTTY

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCG TTGGTTTAGC AAAATCGCTT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATATCGCCC TGAGC

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCACGCAGA GCGGCAG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 44:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 56 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 45:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2019 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: SPRU98

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1932

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 46:

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 643 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 47:

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 642 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: amiA

\vskip0.800000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): AUTORES: Alloing, y col.

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REVISTA: Mol. Microbiol.

\vskip0.500000\baselineskip

(D): VOLUMEN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(F): PÁGINAS: 633-644

\vskip0.500000\baselineskip

(G): FECHA: 1990

\vskip0.800000\baselineskip

: nota: La referencia contiene un error de secuencia; la secuencia correcta mostrada a continuación se obtiene de GENBANK.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 48:

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1932

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGGATCCG GWGTWCTTGC WGCWTGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1932

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACAAGAGAC TACTTGGATC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1932

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCGGATCCT GCCAACAAGC CTAAATATTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1932

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCG TTGGTTTAGC AAAATCGCTT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1932

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATACCTTG GTTCCTCG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1932

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATTCG GAATTTCACG AGTAGC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1929 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: R6

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(vii): FUENTE INMEDIATA:

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(B): CLON: pad1 (poxB)

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 154..1929

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 55:

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54

55

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 56:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 591 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 56:

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Claims

1. Una molécula de ADN recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1.

3. Un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o un fragmento antigénico de dicho polipéptido en el que dicho fragmento antigénico es capaz de interaccionar específicamente con una molécula de reconocimiento antigénico del sistema inmune, tal como una inmunoglobulina o el receptor antigénico de la célula T, y contiene al menos 5 aminoácidos.

4. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un epítopo específico de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

5. Una vacuna para la protección de un sujeto animal de la infección con una bacteria Gram positiva que comprende:

a) un vector que contiene un gen que codifica una proteína exportada de una bacteria Gram positiva asociada de forma operativa con un promotor capaz de dirigir la expresión del gen en el sujeto, en el que la proteína exportada es una permeasa; y/o

b) una cantidad inmunogénica de una proteína exportada de una bacteria Gram positiva y un adyuvante, en la que la proteína exportada es una permeasa, en la que dicho gen contiene una secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1; y/o dicha proteína exportada contiene una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

6. La vacuna de la reivindicación 5 en la que el sujeto animal es un ser humano.

7. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6 en la que la bacteria Gram positiva es un S. pneumoniae.

8. Un procedimiento para diagnosticar una infección con una bacteria Gram positiva que comprende detectar la presencia de una bacteria Gram positiva:

a) con un anticuerpo de la reivindicación 4 o un fragmento del mismo;

b) en una muestra de un sujeto con una sonda de ácido nucleico; o

c) mediante reacción en cadena de la polimerasa usando un cebador;

en el que dicha sonda de ácido nucleico o dicho cebador es la molécula de ADN de la reivindicación 1.