ES2267096T3 - Proteinas bacterianas exportadas y vacunas acelulares basadas en las mismas. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA IDENTIFICACION DE PROTEINAS EXPORTADAS BACTERIANAS GRAM POSITIVAS, Y LOS GENES QUE LAS CODIFICAN. EN PARTICULAR, LA INVENCION SE REFIERE A LAS PROTEINAS EXPORTADAS DE ADHESION ASOCIADA, Y A ANTIGENOS COMUNES A MUCHAS O TODAS LAS CEPAS DE UNA ESPECIE DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A VACUNAS ACELULARES PARA PROPORCIONAR UNA PROTECCION FRENTE A LA INFECCION BACTERIAS GRAM POSITIVAS UTILIZANDO DICHOS GENES O PROTEINAS, Y A ANTICUERPOS CONTRA DICHAS PROTEINAS PARA SU USO EN EL DIAGNOSTICO Y TERAPIA INMUNE PASIVA. EN UNA REALIZACION PREFERIDA, SE DESCRIBEN FRAGMENTOS DE DIEZ GENES QUE CODIFICAN PROTEINAS EXPORTADAS DE S. PNEUMONIAE, Y SE DEMUESTRA LA ACTIVIDAD FUNCIONAL DE ALGUNAS DE ESTAS PROTEINAS EN LA ADHERENCIA.
Description
Proteínas bacterianas exportadas y vacunas
acelulares basadas en las mismas.
La presente invención se refiere a la
identificación de proteínas bacterianas exportadas y de los genes
que codifican estas proteínas. La invención también se refiere a
vacunas acelulares para proporcionar protección frente a una
infección bacteriana usando estas proteínas y a anticuerpos frente a
estas proteínas para su uso en diagnóstico y en inmunoterapia
pasiva.
Las proteínas exportadas en bacterias participan
en muchas funciones celulares diversas y esenciales, tales como
movilidad, transducción de señales, transporte y ensamblaje
macromolecular, y en la adquisición de nutrientes esenciales. Para
bacterias patogénicas, muchas proteínas exportadas son determinantes
de virulencia que funcionan como adhesinas para colonizar y, de este
modo, infectar al hospedador, o como toxinas para proteger a la
bacteria frente al sistema inmune del hospedador (para una revisión,
véase Hoepelman y Tuomanen, 1992, Infect. Immun.
60:1729-33).
Desde que Jenner desarrolló la vacuna frente a
la viruela en el siglo XVIII, la vacunación ha sido un importante
armamento en el arsenal frente a los microorganismos infecciosos.
Antes de la introducción de los antibióticos, la vacunación era la
principal esperanza para proteger a las poblaciones frente a la
infección vírico o bacteriana. Con la llegada de los antibióticos a
principio del siglo XX, la vacunación frente a infecciones
bacterianas se volvió mucho menos importante. Sin embargo, la
reciente aparición de cepas de bacterias infecciosas resistentes a
antibióticos ha dado lugar al reestablecimiento de la importancia de
las vacunas antibacterianas.
Una posibilidad para una vacuna antibacteriana
es el uso de bacterias muertas o atenuadas. Sin embargo, las vacunas
bacterianas completas tienen varias desventajas, incluyendo la
posibilidad de una reversión de la bacteria muerta o atenuada a
virulenta debido a una muerte o atenuación incompleta y a la
inclusión de componentes tóxicos como contaminantes.
Otra vacuna alternativa es inmunizar con la
cápsula bacteriana de hidratos de carbono. Actualmente, las vacunas
frente a Streptococcus pneumoniae emplean conjugados
compuestos de las cápsulas de los 23 serotipos más comunes de esta
bacteria. Estas vacunas no son eficaces en los individuos más
susceptibles a la infección patológica (jóvenes, ancianos e
inmunodeprimidos) debido a su incapacidad para provocar una
respuesta inmune de células T. Un estudio reciente ha mostrado que
esta vacuna sólo protege al 50% de estos individuos (Shapiro y col.,
1991, N. Engl. J. Med. 325:1453-60).
Una alternativa a las vacunas bacterianas
completas son las vacunas acelulares o las vacunas de subunidades en
las que el antígeno incluye una proteína de la superficie
bacteriana. Estas vacunas potencialmente podrían superar las
deficiencias de las vacunas bacterianas completas o basadas en
cápsulas. Además, dada la importancia de las proteínas exportadas en
la virulencia bacteriana, estas proteínas son un objetivo importante
para la intervención terapéutica. De especial importancia son las
proteínas que representan un antígeno común en todas las cepas de
una especie de bacteria en particular para su uso en una vacuna que
protegería frente a todas las cepas de la bacteria. Sin embargo,
hasta la fecha sólo se ha identificado un pequeño número de
proteínas exportadas de bacterias Gram positivas y ninguna de estas
representa un antígeno común para una especie en particular de
bacterias.
Se ha sugerido una estrategia para el análisis
genético de proteínas exportadas en E. coli tras la
descripción de fusiones traduccionales a un gen truncado de una
fosfatasa alcalina (phoA) que carecía de secuencia señal
funcional (Hoffman y Wright, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
82:5107-5111). En este estudio, la actividad
enzimática se detectaba fácilmente en cepas que tenían fusiones
génicas entre las regiones codificadoras de secuencias de señales
heterólogas y phoA lo que indicaba que la actividad
enzimática requería la translocación a través de la membrana
citoplásmica. Posteriormente, se construyó un transposón modificado,
TnphoA, para facilitar la detección sistemática rápida de las
fusiones génicas traduccionales (Manoil y Beckwith, 1985, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:8129-8133). Esta poderosa
herramienta se ha modificado y usado en muchos patógenos Gram
negativos, tales como Escherichia coli (Guitierrez y col.,
1987, J. Mol. Biol. 195:289-297), Vibrio
cholera (Taylor y col., 1989, J. Bacteriol.
171:1870-1878), Bordetella pertussis (Finn y
col., 1991, Infect. Immun. 59:3273-9; Knapp y
Mekalanos, 1988, J. Bacteriol. 170:5059-5066) y
Legionella pneumophila (Albano y col., 1992, Mol. Microbiol.
6:1829-39) para producir una gran cantidad de
información para la identificación y caracterización de proteínas
exportadas. Se ha usado con el mismo fin una estrategia similar
basada en fusiones génicas a una forma truncada del gen de la
\beta-lactamasa (Broome-Smith y
col., 1990, Mol. Microbiol. 4:1637-1644). También se
ha desarrollado una estrategia directa para mapear la topología de
proteínas exportadas, basada en fusiones de tipo "sándwich" de
genes a phoA (Ehrmann y col., 1990,
87:7574-7578).
Por diversas razones, el uso de fusiones génicas
como selección genética para proteínas exportadas en organismos Gram
positivos ha encontrado un éxito limitado. Se han diseñado vectores
plasmídicos que crearán fusiones traduccionales en dos o tres partes
con los genes de la fosfatasa alcalina,
\beta-lactamasa y a-amilasa de
Bacillus subtilis y Lactococcus lacti (Payne y
Jackson, 1991, J. Bacteriol. 173:2278-82; Perez y
col., 1992, Mol. Gen. Genet. 234:401-11; Smith y
col., 1987, J. Bacteriol. 169:3321-3328; Smith y
col., 1988, Gene 70:351-361). Se han usado fusiones
génicas entre phoA y el gen de la proteína A (spa) de
Staphylococcus aureus para determinar la localización celular
de esta proteína (Schneewind y col., 1992, Cell.
70:267-81). En este estudio, sin embargo, no se
recoge la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina.
Las estrategias de mutagénesis en diversas
especies de estreptococos también se han visto limitadas por
diversas razones. No se han desarrollado transposones eficaces para
estreptococos similares a aquellos que son las herramientas
principales para el estudio de bacterias Gram negativas. La
mutagénesis por inserción de duplicación con vectores plasmídicos
que no se replican ha sido una alternativa eficaz en
Streptococcus pneumoniae (Chen y Morrison, 1988, Gene.
64:155-164; Morrison y col., 1984, J. Bacteriol.
159:870). Esta estrategia ha llevado a la mutagénesis, aislamiento y
clonación de diversos genes de neumococos (Alloing y col., 1989,
Gene. 76:363-8; Berry y col., 1992, Microb. Pathog.
12:87-93; Hui y Morrison, 1991, J. Bacteriol.
173:372-81; Lacks y Greenberg, 1991, Gene.104:
11-7; Laible y col., 1989, Mol. Microbiol.
3:1337-48; Martin y col., 1992, J. Bacteriol.
174:4517-23; McDaniel y col., 1987, J. Exp. Med.
165:381-94; Prudhomme y col., 1989, J. Bacteriol.
171:5332-8; Prudhomme y col., 1991, J. Bacteriol.
173:7196-203; Puyet y col., 1989, J. Bacteriol.
171:2278-2286; Puyet y col., 1990, J. Mol. Biol.
213:727-38; Radnis y col., 1990, J. Bacteriol.
172:3669-74; Sicard y col., 1992, J. Bacteriol.
174:2412-5; Stassi y col., 1981, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 78:7028-7032; Tomasz y col., 1988, J.
Bacteriol. 170:5931-5934; Yother y col., 1992, J.
Bacteriol. 174:610-8).
La proteína A de la superficie del neumococo
(PspA) destaca en la búsqueda de proteínas exportadas de neumococos
que podrían ser objetivos atractivos para una vacuna (véase
Yother y col., 1992, anterior). Se ha descrito que PspA es una
candidata para una vacuna frente a S. pneumoniae ya que hasta
la fecha se ha encontrado en todos los neumococos; la proteína
purificada puede usarse para provocar una respuesta inmune
protectora en ratones y los anticuerpos frente a la proteína
confieren inmunidad pasiva en ratones (Talkington y col., 1992,
Microb. Pathog. 13:343-355). Sin embargo, PspA
muestra variabilidad antigénica entre las cepas en la mitad del
extremo N-terminal de la proteína, que contiene los
epítopos inmunogénicos y que inducen protección (Yother y col.,
1992, anterior). Esta proteína no representa un antígeno común para
todas las cepas de S. pneumoniae y, por tanto, no es un
candidato óptimo para vacuna.
Recientemente, en especies de bacterias Gram
positivas y Gram negativas se han exportado proteínas de fusión
aparente que contenían PhoA a (Pearce y Masure, 1992, Abstr. Gen.
Meet. Am. Soc. Microbiol. 92:127, resumen D-188).
Este resumen describe la inserción de ADN de neumococo antes del
extremo 5' del gen phoA de E. coli que carece de sus
secuencias señal y promotora en un vector conductor capaz de la
expresión tanto en E. coli como en S. pneumoniae, y
sugiere que deben encontrarse rutas similares para la translocación
de proteínas exportadas a través de las membranas plasmáticas para
ambas especies de bacterias.
Estudios recientes han demostrado que la
transferencia genética en diversas especies bacterianas depende de
un mecanismo de respuesta a señales entre células individuales. La
transferencia por conjugación de plásmidos está mediada por
homoserina lactonas en Agrobacterium tumefaciens (Zhang y
col., 1993, Science 362:446-448) y mediante
polipéptidos secretados en Enterococcus faecalis (para
revisión, véase Clewell, 1993, Cell 73:9-12). Se han
descrito activadores peptídicos de bajo peso molecular que inducen
la transformación en S. pneumoniae (Tomasz, 1965, Nature
208:155-159; Tomasz, 1966, J. Bacteriol.
91:1050-61; Tomasz y Mosser, 1966, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 55:58-66) y en Streptococcus sanguis
(Leonard y Cole, 1972, J. Bacteriol. 110:273-280;
Pakula y col., 1962, Acta Microbiol. Pol.
11:205-222; Pakula y Walczak, 1963, J. Gen.
Microbiol. 31:125-133). Se ha descrito un activador
peptídico que regula tanto la esporulación como la transformación en
B. subtilis (Grossman y Losick, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:4369-73). Además, las evidencias genéticas
sugieren que las permeasas peptídicas pueden mediar en estos
procesos tanto en E. faecalis (Ruhfel y col., 1993, J.
Bacteriol. 175:5253-59; Tanimoto y col., 1993, J.
Bacteriol. 175:5260-64) como en B. subtilis
(Rudner y col., 1991, J. Bacteriol.
173:1388-98).
En S. pneumoniae, la transformación tiene
lugar como un suceso programado durante un estado fisiológicamente
definido como "competente". Inducido por una señal desconocida
de manera dependiente de densidad, las células muestran un único
ciclo de competencia entre 5 x 10^{6} y 1-2 x
10^{7} ufc/ml que es el principio del crecimiento logarítmico
(Tomasz, 1966, anterior). Con la inducción, se expresa un conjunto
único de proteínas asociadas con la competencia (Morrison y Baker,
1979, Nature 282:215-217) lo que sugiere una
regulación global de los genes asociados con la transformación. Las
bacterias competentes unen y transportan el ADN exógeno, que si es
homólogo se incorpora mediante recombinación al genoma de la célula
receptora. Al cabo de una o dos divisiones celulares, las bacterias
ya no siguen siendo competentes. Como con la inducción, la
inactivación de la competencia tiene lugar mediante un mecanismo
desconocido.
Las referencias citadas en este documento no se
interpretará como una admisión de que ésta es una técnica previa a
la presente invención.
La presente invención se refiere a genes que
codifican proteínas exportadas en una bacteria Gram positiva y las
proteínas codificadas por estos genes. En especial, la presente
invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que
comprende un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos
de la ID SEC Nº 2 y el polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos de la ID SEC Nº 2.
La invención además se refiere a una vacuna para
la protección de un sujeto animal frente a la infección con una
bacteria Gram positiva que comprende un vector que contiene un gen
que codifica una proteína exportada de una bacteria Gram positiva
unida de forma operativa con un promotor capaz de expresar
directamente el gen en el sujeto, en la que la proteína exportada es
una permeasa, en la que dicho gen contiene una secuencia de
nucleótidos de la ID SEC Nº 1.
En otro aspecto, la invención se dirige a una
vacuna para la protección de un sujeto animal frente a una infección
con una bacteria Gram positiva que comprende una cantidad
inmunogénica de una proteína exportada de una bacteria Gram positiva
y un adyuvante, en la que la proteína exportada es una permeasa, en
la que dicha proteína exportada contiene una secuencia de
aminoácidos de la ID SEC Nº 2. Preferiblemente, estas vacunas
contienen la proteína conjugada covalentemente con una cápsula o
cápsulas bacterianas de una o más cepas de bacterias. Más
preferiblemente, en la vacuna se incluyen las cápsulas de todas las
cepas comunes de una especie de bacterias.
Alternativamente, la proteína puede usarse para
inmunizar un animal apropiado para generar anticuerpos policlonales
o monoclonales, como se describe en detalle a continuación. De este
modo, la invención además se refiere a anticuerpos que reaccionan
con proteínas exportadas de bacterias Gram positivas. Estos
anticuerpos pueden usarse en inmunoensayos para diagnosticar una
infección con una cepa o especie de bacteria en particular. En un
aspecto específico, la especie de bacteria es S. pneumoniae.
Los anticuerpos también pueden usarse para la inmunización pasiva
para tratar una infección con bacterias Gram positivas.
De este modo, es objeto de la presente invención
proporcionar genes que codifican proteínas exportadas de bacterias
Gram positivas.
Es un objeto adicional de la invención
proporcionar una vacuna acelular frente a una bacteria Gram
positiva, superando, de este modo, las deficiencias de las vacunas
de bacterias completas muertas o atenuadas y vacunas capsulares.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar una vacuna capsular que provoque una respuesta inmune
de células T colaboradoras.
Aún un objeto adicional de la invención es
proporcionan el diagnóstico de una infección con una bacteria Gram
positiva.
Otro objeto de la invención es proporcionar
terapia inmune pasiva para una infección bacteriana Gram positiva,
especialmente una infección por una bacteria resistente a un
antibiótico.
Figura 1. Construcción de vectores de fusión de
PhoA diseñados para la mutación e identificación genética de
proteínas exportadas en S. pneumoniae. (A) El fragmento de
2,6 kb de pPHO7 que contenía una forma truncada de phoA se insertó
en los sitios SmaI o BamHI de pJDC9 para generar
pHRM100 y pHRM104, respectivamente. T1T2 son terminadores de
transcripción y las flechas indican la orientación del gen. (B)
Mecanismos de mutagénesis por inserción de duplicación conjugado con
la fusión génica. La actividad de PhoA depende de la clonación de un
fragmento génico interno que está en fase y después del extremo 3'
del gen que codifica una proteína exportada. La transformación en
S. pneumoniae da lugar a la duplicación del fragmento diana y
a la consecuente alteración del gen.
Figura 2. Detección y susceptibilidad a la
tripsina de las fusiones de PhoA en S. pneumoniae. Los
lisados celulares completos (50 \mug de proteína) de R6x (carril
1; cepa parental); SPRU98 (carril 2); SPRU97 (carril 3) y SPRU96
(carril 4) se aplicaron en un gel de poliacrilamida al 8%-25% en
presencia de SDS. Las proteínas se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa y se incubaron con un anticuerpo
anti-PhoA. Los complejos
antígeno-anticuerpo se detectaron mediante
quimioluminiscencia potenciada con un anticuerpo secundario
apropiado conjugado con peroxidasa. SRPU96 y 97 contienen los
plásmidos pHRM100 y pHRM104 integrados de forma aleatoria en el
cromosoma. A la izquierda se indican los patrones de peso molecular.
Las bacterias completas de la cepa SPRU98 se trataron con (carril 5)
y sin (carril 6) 50 \mug/ml de tripsina durante 10 min a 37ºC.
Ambas muestras se trataron con un exceso molar de 40 veces de
inhibidor de tripsina de soja. En los lisados celulares completos
(50 \mug de proteína) se ensayó la presencia de material
inmunoreactivo con PhoA, como se describe a continuación. A la
izquierda se indican los patrones de peso molecular.
Figura 3. Los productos de fusión de PhoA son
más estables cuando las bacterias se cultivan en presencia de
oxidantes de disulfuro. Los cultivos de SPRU98 se cultivaron en
presencia de 2-hidroxietil disulfuro 600 \muM
(carril 1), DsbA 10 \muM (carril 2) o sin ningún añadido (carril
3). Los lisados celulares completos (50 \mug de proteína) se
aplicaron en un gel de poliacrilamida en presencia de SDS al
8-25%. A continuación, se ensayó la presencia de
material inmunoreactivo en las proteínas con un anticuerpo
anti-PhoA como se describe en la Figura 2.
Figura 4. Secuencias de aminoácidos derivados de
los loci genéticos recuperados de los mutantes PhoA^{+} de
neumococos. Cada uno de los plásmidos recuperados de las nueve cepas
PhoA^{+} de S. pneumoniae (véase la Tabla 1) se transformó
en E. coli y tenía inserciones de 400 a 700 pares de bases.
Cada plásmido se secuenció usando un cebador para el extremo 5' de
phoA, de aproximadamente 200 a 500 pares de bases del ADN del
neumococo inmediatamente antes del extremo 5' de phoA y se
estableció una región codificadora en fase con PhoA. Las secuencias
de aminoácidos derivadas de las fusiones se representan como Exp1
[ID SEC Nº 2], Exp2 [ID SEC Nº 24], Exp3 [ID SEC Nº 6], Exp4 [ID SEC
Nº 8], Exp5 [ID SEC Nº 10], Exp6 [ID SEC Nº 12], Exp7 [ID SEC Nº
14], Exp8 [ID SEC Nº 16] y Exp9a [ID SEC Nº 18]. La secuencia
derivada del extremo 5' de la inserción de Exp9 también está
representada en Exp9b [ID SEC Nº 20].
Figura 5. Alineamientos de secuencia de las
secuencias de aminoácidos derivadas de los loci Exp recuperados de
los mutantes PhoA^{+}. Se representan los valores de coincidencia
mayores para cada inserción. A la derecha se representa el
porcentaje de identidad (%ID) y el porcentaje de similitud (%SIM)
para cada alineamiento. (A) Exp1 [ID SEC Nº 2] y AmiA de S.
pneumoniae [ID SEC Nº 23] (Alloing y col., 1990, Mol. Microbiol.
4:633-44). B) Exp2 [ID SEC Nº 24] y PonA de S.
pneumoniae [ID SEC Nº 24] (Martin y col., 1992, J. Bacteriol.
174:4517-23). C) Exp3 [ID SEC Nº 25] y PilB de N.
gonorrhoeae [ID SEC Nº 26] (Taha y col., 1988, EMBO J.
7:4367-4378). La histidina (H_{408}) conservada en
PilB no está presente en Exp3 pero se sustituye por asparragina
(N_{124}). D) Exp4 [ID SEC Nº 27] y CD4B del tomate [ID SEC Nº 28]
(Gottesman y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
87:3513-7). E) Exp5 [ID SEC Nº 29] y PtsG de B.
subtilis [ID SEC Nº 30] (Gonzy-Tréboul y col.,
1991, Mol. Microbiol. 5:1241-1294). F) Exp6 [ID SEC
Nº 31] y GlpD de B. subtilis [ID SEC Nº 32] (Holmberg y col.,
1990, J. Gen. Microbiol. 136:2367-2375). G) Exp7 [ID
SEC Nº 33] y MgtB de S. thyphimurium [ID SEC Nº 34] (Snavely
y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:815-823). El ácido
aspártico conservado (D_{554}) necesario para la
autofosforilación también está presente en Exp7 (D_{37}). H) Exp8
[ID SEC Nº 35] y CyaB de B. pertussis [ID SEC Nº 36] (Glaser
y col., 1988, Mol. Microbiol. 2:1930; Glaser y col., 1988, EMBO J.
7:3997-4004). I) Exp9 y DeaD de E. coli
(Toone y col., 1991, J. Bacteriol. 173:3291-3302).
La secuencia superior de Exp9 [ID SEC Nº 37] deriva del extremo 5'
de la inserción plasmídica recuperada y es comparable a DeaD
135-220 [ID SEC Nº 38]. La secuencia inferior de
Exp9 [ID SEC Nº 20] deriva del extremo 3' de la inserción plasmídica
recuperada justo en dirección 5' y es comparable a DeaD
265-342 [ID SEC Nº 39]. Se subraya la secuencia DEAD
conservada.
Figura 6. Localización subcelular de la fusión
Exp9-PhoA. Las fracciones de membrana (carril 1) y
citoplásmica (carril 2) (50 \mug de proteína de cada muestra) de
SPRU17 se aplicaron en un gel de poliacrilamida al
10-15% en presencia de SDS. Las proteínas se
transfirieron a nitrocelulosa y se incubaron con un anticuerpo
anti-PhoA. A la izquierda se indican los patrones de
peso molecular.
Figura 7. Adherencia de neumococos de tipo 2AII
(\blacksquare) o no encapsulado R6 (\medcirc) a células
alveolares de tipo II de conejo. El ensayo de adherencia se realizó
como se describe en el Ejemplo 2, a continuación.
Figura 8. Valoración de la adherencia de
mutantes de neumococos a células endoteliales de vena umbilical
humana (HUVEC). Las cepas mutantes ensayadas se enumeran en la Tabla
1. Las mutaciones de exp1, cepa SPRU98 (\medbullet);
exp2, cepa SPRU64 (\medcirc); exp3, cepa SPRU40
(\blacksquare); exp10, cepa SPRU25
1000 y amiA, cepa SPRU121
(\blacklozenge) dan lugar a un descenso en la capacidad de la cepa
mutante para adherirse. La cepa R6 (\blacksquare) es S.
pneumoniae natural.
Figura 9. Adherencia de mutantes de neumococos a
células de pulmón de Tipo II. La mutación del gen exportado y las
denominaciones de la cepa se describen en la Figura 8.
Figura 10. Secuencias de nucleótidos y deducida
de aminoácidos para el locus genético recuperado del mutante SPRU25,
exp10. La secuencia de nucleótidos se obtuvo como se describe
en la Figura 4 y en el Ejemplo 1, a continuación.
Figura 11. Secuencias de nucleótidos (ID SEC Nº
46) y de la proteína derivada (ID SEC Nº 47) de pIpA. La secuencia
consenso de modificación de la lipoproteína se señala con un
asterisco sobre el resto de cisteína donde podría tener lugar la
escisión. Después del extremo 3' de la región codificadora se
subraya un posible terminador de transcripción independiente de rho.
Se indican las posiciones de las fusiones de PhoA en Leu_{197} de
SPRU58 y en Asp_{492} de SPRU98. (Número de acceso a Genbank:
PENDIENTE DE ASIGNACIÓN).
Figura 12. Análisis de secuencia de proteínas de
unión a péptidos. A; alineamiento de secuencia de PIpA (ID SEC Nº
47) y AmiA (ID SEC Nº 48). Se han enmarcado los restos idénticos. B;
alineamientos de secuencia de las proteínas de unión al sustrato de
las permeasas de diferentes especies bacterianas: PIpA, S.
pneumoniae (este estudio); AmiA, S. pneumoniae. La
secuencia descrita para amiA (Alloing y col., 1990, Mol. Microbiol.
4:633-6454) se ha cambiado ahora debido a un error
de secuenciación y la secuencia corregida está ahora en Genbank);
Spo0KA, B. subtilis (Perego y col., 1991, Mol. Microbiol.
5:173-185; Rudner y col., 1991, J. Bacteriol.
173:1388-98); HbpA, H. influenzae (Hanson y
col., 1992, Infect. Immun. 60:2257-66); DciAE, B.
subtilis (Mathiopoulos y col., 1991, Mol. Microbiol.
5:1903-13); OppA (Ec), E. coli (Kashiwagi y
col., 1990, J. Biol. Chem. 265:8387-91); TraC, E.
faecalis (Tanimoto y col., 1993, J. Bacteriol.
175:5260-64); DppA, E. coli (Abouhamad y
col., 1991, Mol. Microbiol. 5:1035-47); PrgZ, E.
faecalis (Ruhfel y col., 1993, J. Bacteriol.
175:5253-59); OppA (St) S. typhimurium (Hiles
y col., 1987, J. Mol. Biol. 195:125-142) y SarA,
S. gordonii. Las secuencias de aminoácidos derivadas se
alinearon con el grupo de programas de software MACAW (Schuler y
col., 1993, Proteins Struct. Funct. Genet.
9:180-190). Los recuadros negros y los recuadros
rayados indican las regiones de mayor similitud de secuencia con
valores de probabilidad menores o iguales a 1,3 x 10^{-7}, con el
tamaño eficaz de la búsqueda de espacio derivada de las longitudes
de todas las secuencias en la base de datos.
Figura 13. Localización subcelular y marcaje de
PIpA-PhoA. Panel superior: Las fracciones
subcelulares (50 \mug de proteína total) de SPRU98 (PhoA^{+},
pHRM104::pIpA) se aplicaron en un gel de poliacrilamida al
8-25% en presencia de SDS, se transfirieron a una
membrana de nitrocelulosa y se incubaron con antisueros
anti-PhoA. Los anticuerpos unidos se detectaron con
un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa y se visualizaron
con quimioluminiscencia potenciada. Los carriles son A, sobrenadante
del cultivo; B, membranas; C, citoplasma y D, pared celular. Panel
inferior: Los inmunoprecipitados con anti-PhoA de
lisados celulares completos del cultivo de bacterias en un medio
químicamente definido con [^{3}H]-ácido palmítico se aplicaron en
un gel de poliacrilamida al 8-25% en presencia de
SDS, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se
sometieron a autorradiografía. Los carriles son E, cepa parental
R6x; F, SPRU100 (PhoA^{+}, pHRM104::zzz) y G, SPRU98 (PhoA^{+},
pHRM104::pIpA). La flecha marca la banda de 93 kDa que
corresponde con la proteína de fusión PIpA-PhoA
inmunoprecipitada.
Figura 14. Análisis por inmunotransferencia del
ARN total de permeasas de péptidos de neumococos. Los preparados de
ARN (10 \mug) de SPRU107 (pJDC9::pIpA) (carriles A y C) y
de R6x (carriles B y D) se hibridaron con sondas de ADN de
pIpA (carriles A y B) o amiA (carriles C y D). Se
indican los pesos moleculares.
Figura 15. Eficacia de transformación de
mutantes de permeasas de neumococos. En diversas cepas que contienen
las construcciones génicas cromosómicas mostradas con lesiones en
pIpA o en ami se ensayó la incorporación de un
marcador cromosómico de resistencia a la estreptomicina como medida
de la eficacia de transformación. La eficacia de transformación de
cada cepa se representa como porcentaje de la cepa parental, R6x,
que produce de forma rutinaria el 0,3% de transformantes Str^{r}
en la población total de células susceptibles de transformación. Los
valores representados son la media de al menos tres valores con el
error típico de la media. Los resultados son representativos de
ensayos realizados en tres ocasiones independientes. E es
resistencia a eritromicina codificada por el vector.
Figura 16. Perfiles de competencia de mutantes
de permeasas de neumococos. El porcentaje de células susceptibles de
transformación se determinó a DO específicas durante el crecimiento
logarítmico temprano de R6x n, SPRU107 I (pJDC9::pIpA) y
SPRU114 s (pJDC9::amiA). Los resultados son representativos
de tres experimentos independientes.
Figura 17. Efecto de una mutación de pIpA
en la expresión del locus rec que regula la competencia. La
actividad fosfatasa alcalina se midió en SPRU100, n (PhoA^{+},
pHRM104::exp10) y SPRU156, s (PhoA^{+},
pHRM104::exp10; pWG5::pIpA) durante el crecimiento
logarítmico de neumococos que producen un ciclo de competencia
normal. Cada valor es la media de dos valores con un error típico de
la media que no excedía del 10% de éste punto. Estos resultados son
representativos de tres experimentos independientes.
Figura 18. Mapa físico de pIpA y de
plásmidos recombinantes generados a partir de diversos
procedimientos de clonación. Plásmidos con las inserciones que
contiene el inicio de pH en el vector de PhoA, pHRM104 mientras que
los plásmidos con las inserciones que contiene en el inicio de pJ en
el vector pJDC9. La mayoría de los plásmidos se crearon por
"desplazamiento sobre el cromosoma" con el plásmido integrado
pJpIp1. El plásmido pJpIp9 se creó mediante "clonación por
homología" con los oligonucleótidos lipo1 y P1. Véanse los
procedimientos experimentales para los detalles. Se muestran los
sitios para endonucleasas de restricción: H (HindIII), Hc
(HincII), E (EcoRI), K (KpnI), P (PstI),
R (EcoRV), Sau (SauIIIa), S (SphI).
Figura 19. Adherencia de R6 natural
(\boxempty) y mutante Pad1(\blacksquare) de neumococos a
las células pulmonares de tipo II. Este ensayo se realizó como se
describe en el Ejemplo 2.
Figura 20. (A) Localización subcelular de la
fusión Pad1-PhoA detectada mediante análisis por
inmunotransferencia con un antisuero anti-PhoA. Las
células se separaron en los componentes de membrana (Carriles
A-C) y componentes citoplásmicos (Carriles
D-F). Carriles A,D: células naturals (parentales)
R6; B,E: células mutantes Pad1; C,F: células mutantes Pad1b. (B)
Sonda de lisado bacteriano con el anticuerpo frente a la bacteria
completa mediante análisis por inmunotransferencia. Los carriles A,
B y C se corresponden con (A). Los mutantes Pad1 carecen de la
proteína inmunogénica de 17 kDa asociada a membrana encontrada en la
bacteria R6.
Figura 21. Adherencia de la bacteria R6 y de
los mutantes Pad1 cultivados en presencia o ausencia de acetato. El
cultivo en acetato corrige el defecto de la adherencia de Pad1.
Figura 22. Cultivo del mutante Pad1 y de la
bacteria R6 en presencia o ausencia de acetato. El mutante Pad1 se
cultivó en un medio de cultivo químicamente definido para S.
pneumoniae en presencia del 0% (\medcirc), 0,1% (\Diamond) y
0,5% (\boxempty) de acetato. R6 se cultivó en presencia de 0%
(cuadrados con aspa) y 0,5% (\Delta).
Figura 23. Secuencias de nucleótidos (ID SEC Nº
55) y de aminoácidos deducida de Pad1 (ID SEC Nº 56), también
denominado poxB. Están subrayados el posible sitio de unión a
ribosomas, los sitios -10 y -35 y se marca el codón de inicio.
De acuerdo con la presente invención pueden
emplearse técnicas convencionales de biología molecular,
microbiología y de recombinación de ADN dentro de la experiencia en
la materia. Estas técnicas se explican en detalle en la
bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis,
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edición
(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
Nueva York (en este documento "Sambrook y col., 1989"); "DNA
Cloning: A Practical Approach", volúmenes I y II (D.N. Glover
editor, 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait editor
1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames y S.J. Higgins
editores (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames y
S.J. Higgins, editores (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I.
Freshney, editores (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes"
[IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular
Cloning" (1984).
Por lo tanto, cuando aparezcan en este
documento, las expresiones siguientes tendrán las definiciones
establecidas a continuación.
Un "replicón" es cualquier elemento
genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como
una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir,
capaz de replicarse bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón, tal como un
plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN
que lleva, de ese modo, a la replicación del segmento unido.
La expresión "vector vírico" se refiere a
un virus que contiene un ácido nucleico recombinante, a través del
cual el virus puede introducir el ácido nucleico recombinante en una
célula, es decir, el virus puede transformar la célula. Según la
presente invención, estos vectores pueden usarse para la
administración de una vacuna basada en ácido nucleico, como se
describe en este documento.
Una célula se ha "transformado" mediante un
ADN exógeno o heterólogo cuando este ADN se ha introducido dentro de
la célula. El ADN transformante puede o no integrarse (unido
covalentemente) en el ADN cromosómico para formar parte del genoma
celular. En células procarióticas, de levaduras y de mamíferos por
ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento
episomal tal como un plásmido. Un "clon" es una población de
células derivadas por mitosis de una única célula o de un predecesor
común.
Una "molécula de ácido nucleico" se refiere
a la forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleósidos
(adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN")
o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina,
desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN") en forma
de hebra sencilla o de una hélice de hebra doble. Son posibles las
hélices de hebra doble de ADN-ADN,
ADN-ARN y ARN-ARN. La expresión
molécula de ácido nucleico y, en particular molécula de ADN o ARN,
se refiere sólo a la estructura primaria y secundaria de la
molécula, y no se limita a ninguna forma terciaria en particular. De
este modo, esta expresión incluye ADN de hebra doble encontrado,
entre otros, en moléculas de ADN lineal o circular (por ejemplo,
fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Para la
descripción de la estructura de las moléculas de ADN de doble hebra
en particular, en este documento las secuencias pueden describirse
según la convención normal de dar sólo la secuencia en la dirección
5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de ADN (es decir, la
hebra que tiene una secuencia homóloga al ARNm). Una "molécula de
ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha experimentado una
manipulación por biología molecular.
Una molécula de ácido nucleico es
"hibridable" con otra molécula de ácido nucleico, tal como un
ADNc, ADN genómico o ARN, cuando una forma de hebra sencilla de la
molécula de ácido nucleico puede condensar con la otra molécula de
ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza
iónica de la solución (véase Sambrook y col., 1989, anterior). Las
condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la
"rigurosidad" de la hibridación. La hibridación requiere que
los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias,
aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles
errores de apareamiento entre bases. La rigurosidad apropiada para
la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los
ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien
conocidas en la técnica. Preferiblemente, una longitud mínima para
un ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 10
nucleótidos, más preferiblemente de al menos aproximadamente 15
nucleótidos.
Una "secuencia codificadora" de ADN es una
secuencia de ADN de doble hebra que se transcribe y traduce in
vivo en un polipéptido cuando se sitúa bajo el control de
secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia
codificadora se determinan mediante un codón de inicio en el extremo
5' (amino) terminal y un codón de parada de la traducción en el
extremo 3' (carboxilo) terminal. Una secuencia codificadora puede
incluir, pero sin limitaciones, secuencias procarióticas, ADNc de
ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por
ejemplo, de mamífero) e incluso secuencias de ADN sintético. Si la
secuencia codificadora está destinada a su expresión en una célula
eucariótica, normalmente se localizará 3' de la secuencia
codificadora, una señal de poliadelinación y una secuencia de
terminación de la transcripción.
Las secuencias de control de transcripción y de
traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores,
potenciadores, terminadores y similares, que proporcionan la
expresión de una secuencia codificadora en una célula hospedadora.
En células eucarióticas, las señales de poliadenilación son
secuencias control.
Una "secuencia promotora" es una región
reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula
e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora después del
extremo 3' (dirección 3'). Con el propósito de definir la presente
invención, la secuencia promotora se une a su extremo 3' terminal
mediante el sitio de iniciación de transcripción y se extiende antes
del extremo 5' (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases
o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles
detectables por encima del fondo.
Dentro de la secuencia promotora se encontrará
un sitio de iniciación de la transcripción (convenientemente
definido mediante el mapeo con la nucleasa S1), así como dominios de
unión a proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de
la ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos contendrán a menudo,
pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT".
Una secuencia codificadora está "bajo el
control" de las secuencias de control de transcripción y
traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la
secuencia codificadora a ARNm, que a continuación se traduce a la
proteína codificada a partir de la secuencia codificadora.
Puede incluirse una "secuencia señal" antes
de la secuencia codificadora. Esta secuencia codifica un péptido
señal, en el extremo N-terminal del polipéptido, que
dirige a la célula hospedadora para que el polipéptido se transloque
a la superficie celular o secrete el polipéptido al medio, y la
célula degrada selectivamente este péptido señal tras la
exportación. Las secuencias señal puede encontrarse asociadas con
diversas proteínas nativas de procariotas o eucariotas.
Como se usa en este documento, la expresión
"proteína exportada" se refiera a una proteína que contiene una
secuencia señal y, de este modo, se encuentra asociada a o fuera de
la membrana celular. De este modo, las proteínas secretadas,
proteínas integrales de membrana, proteínas de superficie y
similares están incluidas en la clase de proteínas exportadas. La
expresión "proteína de superficie" como se usa en este
documento pretende especialmente referirse a una proteína que está
accesible en la superficie celular, por ejemplo, para unirse con un
anticuerpo.
Una "proteína asociada a la adhesión" es
una proteína que está implicada directa o indirectamente en la
adherencia de bacterias a las células diana, tales como células
endoteliales o células de pulmón. La expresión "proteína asociada
a la adhesión" incluye proteínas que pueden tener otras
actividades funcionales, tales como movilidad, traducción de señal,
ensamblaje de la pared celular o transporte macromolecular. Una
"adhesina" es una proteína asociada a la adhesión encontrada en
la superficie de una célula, tal como una bacteria, que esta
implicada directamente en la adherencia y, de este modo, causa
cierto grado de adherencia o adhesión a otra célula. De particular
importancia para la presente invención son las adhesinas de
bacterias Gram positivas que promueven la adhesión a células
eucarióticas, es decir, que están implicadas en la virulencia de
bacterias. Las adhesinas, para ser eficaces en la estimulación de la
adherencia, deberían ser proteínas de superficie, es decir, estar
accesibles en la superficie de la célula. La accesibilidad también
es importante para determinar la antigenicidad. Una vacuna que
provoca anticuerpos frente a una adhesina puede proporcionar
anticuerpos que se unen a un determinante antigénico accesible e
interferir directamente con la adherencia, previniendo, de este
modo, la infección. Una adhesina de la invención no necesita ser la
única adhesina o mediador de adhesión de una bacteria Gram positiva,
y la expresión contempla a cualquier proteína para la que se
demuestra cierto grado de actividad de adhesión, ya sea
relativamente fuerte o relativamente débil.
Un "determinante de virulencia" es
cualquier producto bacteriano requerido para la supervivencia
bacteriana dentro de un hospedador infectado. De este modo, los
determinantes de virulencia también son atractivos candidatos para
vacuna puesto que la neutralización de un determinante de virulencia
puede reducir la virulencia de la bacteria.
Una "toxina" es cualquier producto
bacteriano que daña activamente a un hospedador infectado. De este
modo, las toxinas bacterianas son dianas importantes para una
respuesta inmune que neutralice su toxicidad.
Una molécula es "antigénica" cuando es
capaz de interaccionar específicamente con una molécula de
reconocimiento del antígeno del sistema inmune, tal como una
inmunoglobulina (anticuerpo) o el receptor de antígeno de célula T.
Un polipéptido antigénico contiene al menos aproximadamente 5, y
preferiblemente al menos aproximadamente 10 aminoácidos. Una porción
antigénica de una molécula puede ser aquella porción que es
inmunodominante para el anticuerpo o para el reconocimiento del
receptor de la célula T, o puede ser una porción usada para generar
un anticuerpo frente a la molécula conjugando la porción antigénica
con una molécula portadora para la inmunización. Una molécula que es
antigénica no necesita ser en sí misma inmunogénica, es decir, capaz
de provocar una respuesta inmune sin un portador.
Una composición que comprende "A" (donde
"A" es una proteína, molécula de ADN, vector, etc., único) está
sustancialmente libre de "B" (donde "B" comprende una o
más proteínas, moléculas de ADN, vectores, etc., contaminantes)
cuando al menos aproximadamente el 75% en peso de las proteínas,
ADN, vectores (dependiendo de la categoría de la especie a la que
pertenecen A y B) de la composición es "A". Preferiblemente,
"A" comprende al menos aproximadamente el 90% en peso de las
especies A+B de la composición, mas preferiblemente al menos
aproximadamente el 99% en peso. También se prefiere que una
composición, que está sustancialmente libre de contaminación,
contenga sólo una especie de peso molecular único que tiene la
actividad o característica de la especie de interés.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se
refiere a entidades moleculares y composiciones que son
fisiológicamente tolerables y típicamente no producen una reacción
alérgica adversa o similar, tal como molestias gástricas, mareos y
similar, cuando se administra a un humano. Preferiblemente, como se
usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente
aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del
gobierno Federal o Estatal o incluido en la Farmacopea de los EE.UU.
o en otra farmacopea generalmente reconocida, para su uso en
animales y, más en particular, en humanos. El término
"portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o
vehículo con el cual se administra el compuesto. Estos portadores
farmacéuticos puede ser líquidos estériles, tales como agua y
aceites, incluyendo los de petróleo, de origen animal, vegetal o
sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite
mineral, aceite de sésamo y similares. Preferiblemente se emplean
como portadores, especialmente para soluciones inyectables, agua o
soluciones salinas acuosas y soluciones acuosas de dextrosa y
glicerol.
El término "adyuvante" se refiere a un
compuesto o mezcla que potencia la respuesta inmune a un antígeno.
Un adyuvante puede servir como un depósito tisular que libera
lentamente el antígeno y también como un activador del sistema
linfoide que potencia de forma inespecífica la respuesta inmune
(Hood y col., Immunology, Segunda Edición, 1984,
Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, pág. 384). A menudo, una
inmunización primaria con un antígeno sólo, en ausencia de un
adyuvante, no conseguirá provocar una respuesta inmune humoral o
celular. Los adyuvantes incluyen, pero sin limitaciones, adyuvante
completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles
minerales, tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas
superficiales, tales como lisolecitina, polioles pluronic,
polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o de hidratos de
carbono, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y
adyuvantes potencialmente útiles para humanos, tales como BCG
(bacilo de Calmette-Guerin) y
Corynebacterium parvum. Preferiblemente, el adyuvante es
farmacéuticamente aceptable.
En este primer aspecto, la presente solicitud
describe la identificación y aislamiento de un gen que codifica una
proteína exportada en una bacteria Gram positiva. La proteína
exportada puede ser una proteína de función conocida o desconocida.
En este documento, todas las proteínas exportadas, de función
conocida o desconocida, se denominan como "Exp" (del inglés
exported protein, proteína exportada) y los genes que
codifican estas proteínas se denominan como genes "exp".
En particular, la solicitud describe el aislamiento de genes que
codifican proteínas asociadas con la adhesión de bacterias Gram
positivas, preferiblemente adhesinas, determinantes de virulencia,
toxinas y antígenos inmunodominantes.
En particular, la solicitud describe diversas
proteínas exportadas de S. pneumoniae (véase la Tabla 1, a
continuación), algunas de las cuales tienen actividad demostrada
como adhesinas. Por ejemplo, la solicitud describe fragmentos
génicos de las siguientes proteínas exportadas: también se describen
Exp1 [ID SEC Nº 2], cuya secuencia de longitud completa, denominada
Plp1 [ID SEC Nº 47], codificada por exp1 [ID SEC Nº 1] y
plp1 [ID SEC Nº 46], respectivamente, una proteína que parece
estar relacionada con la familia de proteínas permeasas y que está,
por tanto, sorprendentemente asociada con la adhesión; Exp2 [ID SEC
Nº 3], codificado por exp2 [ID SEC Nº 4], cuya secuencia de
ácido nucleico es idéntica a ponA, que codifica la proteína
de unión a penicilina 1A (Martin y col., 1992, J. Bacteriol.
174:4517-4523) y que inesperadamente está asociada
con la adhesión; Exp3 [ID SEC Nº 6], codificada por exp3 [ID
SEC Nº 5], que está asociada con la adhesión; Exp4 [ID SEC Nº 8],
codificada por exp4 [ID SEC Nº 7], que se asocia con la
adhesión; Exp5 [ID SEC Nº 10], codificada por exp5 [ID SEC Nº
9]; Exp6 [ID SEC Nº 12], codificado por exp6 [ID SEC Nº 11];
Exp7 [ID SEC Nº 14], codificada por exp7 [ID SEC Nº 13]; Exp8
[ID SEC Nº 16], codificado por exp8 [ID SEC Nº 15]; Exp9 [ID
SEC Nº 18 y 20], codificada por exp9 [ID SEC Nº 17 y 19,
respectivamente]; Exp10 [ID SEC Nº 22], codificada por exp10
[ID SEC Nº 21] y Pad1 [ID SEC Nº 56], codificada por pad1 [ID
SEC Nº 55], que es un homólogo de la piruvato oxidasa. Las
denominaciones de las cepas de bacterias mutantes en las que se han
identificado las proteínas Exp1-9, se describen en
la Tabla 1. La denominación de la cepa del mutante en el que se ha
identificado Exp10 es SPRU25. Los solicitantes también han aislado
un mutante de S. pneumoniae (SPRU121) en el que se ha mutado
el gen amiA que codifica la proteína AmiA y por primera vez
se ha demostrado que ésta es una proteína asociada con la adhesión
y, de este modo, esta proteína puede usarse en una vacuna para
provocar una respuesta inmune frente a una proteína asociada a la
adhesión.
Una vez que se aíslan los genes que codifican
las proteínas exportadas, pueden usarse directamente como una vacuna
in vivo basada en ácidos nucleicos. Alternativamente, la
secuencia de nucleótidos de los genes puede usarse para preparar
sondas oligonucleotídicas o cebadores para la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) para diagnosticar la infección con una cepa en
particular o con especies de bacterias Gram positivas.
Alternativamente, pueden expresarse las
proteínas codificadas por los genes aislados y usarse para preparar
vacunas para la protección frente a la cepa de bacterias de la que
se ha obtenido la proteína exportada. Si la proteína exportada es
una proteína asociada con la adhesión, tal como una adhesina, es una
candidata especialmente atractiva para vacunas ya que la inmunidad
puede interferir con la capacidad bacteriana para adherirse a las
células hospedadoras e infectar, de este modo, es decir,
colonizar y sobrevivir dentro del organismo hospedador. Si la
proteína exportada es un determinante de virulencia, la inmunidad
puede interferir con la virulencia. Si la proteína exportada es una
toxina, la inmunidad puede interferir con la toxicidad. Si la
proteína exportada es un antígeno común a todas o a la mayoría de
las cepas de una especie de bacteria en particular, es una candidata
ideal para una vacuna frente a todas o la mayoría de las cepas de
esta especie, por ejemplo, S. pneumoniae.
Alternativamente, la proteína puede usarse para
inmunizar un animal apropiado para generar anticuerpos policlonales
o monoclonales, como se describe en detalle a continuación. Estos
anticuerpos pueden usarse en inmunoensayos para diagnosticar una
infección con una cepa o especie de bacteria en particular. De este
modo, pueden usarse proteínas exportadas específicas de cepa para
generar anticuerpos específicos de cepa para el diagnóstico de la
infección con esta cepa. Alternativamente, pueden usarse antígenos
comunes para preparar anticuerpos para el diagnóstico de la
infección con esta especie de bacteria, por ejemplo, S.
pneumoniae.
Si la Exp es una adhesina, la proteína soluble
puede administrarse a un sujeto sospechoso de sufrir una infección
para inhibir la adherencia de la bacteria.
La presente solicitud describe varios fragmentos
génicos que pueden usarse para obtener el gen de longitud completa
que codifica antígenos exportados de bacterias Gram positivas, en
especial, adhesinas exportadas.
La solicitud además describe un procedimiento,
usando un vector que codifica una proteína indicadora que es
funcional sólo cuando una bacteria la exporta, tal como el vector
phoA descrito en este documento, para seleccionar genes que
codifican proteínas exportadas de neumococos. Por ejemplo, puede
colocarse una forma truncada de phoA en un vector conductor
de neumococos, tal como el vector pJDC9 (Chen y Morrison, 1988, Gene
64:155-164). Puede localizarse un sitio de clonación
que contiene un sitio de restricción único, por ejemplo, SmaI
o BamHI, inmediatamente 5' de phoA, para permitir la
inserción de ADN que puede codificar una proteína exportada.
Preferiblemente, los sitios de clonación en el vector están
flanqueados por dos sitios de restricción para facilitar la
identificación fácil de una inserción. En una realización
específica, el sitio de restricción es un sitio KpnI, aunque
puede usarse cualquier endonucleasa de restricción. Los fragmentos
génicos que codifican las Exp se seleccionan basándose en la tinción
azul alrededor de la bacteria, lo que indica la exportación de la
enzima PhoA. Los genes de fusión exp-phoA
pueden expresarse en E. coli, aunque puede requerirse la
fusión de un promotor en este caso. Cuando el gen de fusión
exp-phoA se integra en el genoma de un
organismo Gram positivo, es una fusión traduccional implicada en
mutagénesis por duplicación y se expresa en una bacteria Gram
positiva. En una realización específica, se identifican proteínas
exportables de neumococos con esta técnica, que requiere la
clonación de un fragmento génico interno en el vector previo a la
integración.
La solicitud también describe la selección de
genes que codifican proteínas exportadas asociadas con la adhesión,
realizada en transformantes PhoA-positivos, probando
la perdida de adherencia de una bacteria Gram positiva a una célula
primaria o a una línea celular a la que normalmente se adhiere.
Estos ensayos de adhesión pueden realizarse en cualquier línea
celular eucariótica. Preferiblemente, si la infección en humanos es
importante, la célula o línea celular deriva de una fuente humana o
se ha demostrado que se comporta como células humanas en un ensayo
in vitro en particular. Las células y líneas celulares
adecuadas incluyen, pero sin limitaciones, células endoteliales,
células de pulmón, leucocitos, células bucales, células adenoides,
células de la piel, células conjuntivas, células ciliadas y otras
células representativas de los órganos infectados. Como se demuestra
en un ejemplo, a continuación, puede usarse una línea de células
endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que está disponible
en Clonetics (San Diego, CA). En otro ejemplo, a continuación, se
usan células alveolares de pulmón de Tipo II, que pueden prepararse
como se describe en el Ejemplo 2 o pueden obtenerse como una línea
celular disponible en la American Type Culture Collection (ATCC)
con el número de acceso ATCC A549. Alternativamente, puede probarse
la adherencia a macrófagos derivados de monocitos humanos, obtenidos
de la sangre. Otras células diana, especialmente para S.
pneumoniae, son las células orofaríngeas, tales como las células
epiteliales bucales (Andersson y col. 1988, Microb. Pathogen.
4:267-278; 1983, J. Exp. Med.
158:559-570; 1981, Infect. Immun.
32:311-317).
Generalmente, puede usarse cualquier ensayo de
adherencia conocido en la técnica para demostrar la pérdida de
adhesión debida a la mutagénesis de Exp. Uno de estos ensayos es el
siguiente: las células en las que se va a ensayar la adherencia se
cultivan durante 4-8 días (Wright y Silverstein,
1982, J. Exp. Med. 156:1149-1164) y, a continuación,
se transfieren a placas de Terasaki 24 horas antes del ensayo de
adherencia para permitir la formación de una monocapa confluente
(Geelen y col., 1993, Infect. Immun. 61:1538-1543).
Las bacterias se marcan con fluoresceína (Geelen y col., anterior),
se ajustan a una concentración de 5 x 10^{7} ufc/ml y se añaden
en un volumen de 5 \mul a al menos 6 pocillos. Tras la incubación
a 37ºC durante 30 min, las placas se lavan y se fijan con
PBS/glutaraldehído al 2,5%. Las bacterias unidas se cuentan
visualmente usando un microscopio de fluorescencia, tal como un
Microscopio Diaphot Invertido de Nikon equipado con
epifluorescencia.
Puesto que la adherencia de una bacteria Gram
positiva, en particular S. pneumoniae, a una célula diana
está determinada por dos mecanismos, las proteínas de la pared
celular y las adhesinas, puede ser importante distinguir si la
mutación en la proteína exportada que inhibe la adherencia es una
mutación de una proteína implicada en la síntesis de la pared
celular o de una adhesina. La mutación de la primera tendría un
efecto indirecto en la adherencia, mientras que la mutación en la
segunda afectaría directamente a la adherencia. Pueden usarse los
siguientes ensayos para distinguir si la proteína mutada es una
adhesina o no: (1) puesto que la adherencia a macrófagos está
mediada principalmente por proteínas exportadas, los ensayos de
adherencia a macrófagos indicarán inmediatamente si la mutación es
en una adhesina; (2) la adición independiente de la pared celular
bacteriana tendrá un efecto mínimo en la adherencia si la mutación
fuese en una proteína implicada directamente en la adherencia y una
inhibición adicional de la adherencia si se añade un mutante mutado
en una adhesina; (3) el tratamiento previo de la bacteria con una
proteasa, tal como tripsina, dará lugar a una inhibición adicional
de la adherencia si la mutación es en una proteína implicada
indirectamente en la adherencia, pero no tendrá efecto si la
proteína mutada es una adhesina; (4) una vez que se aísla el gen
exp de longitud completa, la posible adhesina puede
expresarse en E. coli o en otro tipo celular, o la posible
adhesina puede asociarse covalentemente con diferentes soportes
tales como una bacteria, un eritrocito o una perla de agarosa, y
puede evaluarse la capacidad de la posible adhesina para mediar en
la adherencia; (5) puede evaluarse la estructura de la pared celular
de los mutantes usando técnicas convencionales, en particular,
trazado del perfil de HPLC, para determinar si la mutación da lugar
a cambios en la estructura de la pared celular, que es indicativo de
una mutación en una proteína implicada indirectamente con la
adherencia.
La presente solicitud también describe genes
identificados que codifican determinantes de virulencia exportados.
Generalmente, los determinantes de virulencia pueden identificarse
probando la virulencia la cepa mutante en un modelo animal, por
ejemplo, evaluando la DL_{50} del animal infectado con la cepa.
Un aumento en la DL_{50} es indicativo de una pérdida de
virulencia y, por tanto, de la mutación ocurrida en un locus
requerido para la virulencia.
La solicitud también describe la identificación
de una Exp que es un antígeno común a todas o muchas de las cepas de
una especie de bacterias, o en especies de bacterias muy
relacionadas. Esto se consigue fácilmente usando un anticuerpo
específico de una Exp (cuya preparación se describe en detalle a
continuación). La capacidad del anticuerpo para esta cepa en
particular y para todas o muchas otras cepas de esta especie, o para
especies muy relacionadas, demuestra que la Exp es un antígeno
común. Este ensayo de anticuerpo es especialmente preferido ya que
es más relevante inmunológicamente, puesto que la Exp, que es un
antígeno común, es un candidato atractivo para vacuna.
Generalmente, la solicitud también describe la
identificación de una propiedad funcional de una proteína producida
por un gen exp comparando la homología de la secuencia de
aminoácidos deducida o de nucleótidos con la secuencia de
aminoácidos de una proteína conocida, o la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica la proteína.
Cualquier célula bacteriana Gram positiva
potencialmente puede servir como la fuente de ácido nucleico para la
clonación molecular de un gen exp. Las secuencias de ácidos
nucleicos pueden aislarse a partir de Streptococcus,
Bacillus, Mycobacterium, Staphylococcus,
Enterococcus y otras fuentes de bacterias Gram positivas,
etc. El ADN puede obtenerse mediante procedimientos convencionales
conocidos en la técnica de clonación de ADN (por ejemplo, una
"biblioteca" de ADN), mediante síntesis química, mediante
clonación de ADNc o mediante la clonación de ADN genómico, o
fragmentos de los mismos, purificados a partir de la célula deseada
(véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, anterior, Glover, D. M.
(editor), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd.,
Oxford, Reino Unido Vol. I, II). Cualquiera que sea la fuente, el
gen se clonará molecularmente en un vector adecuado para la
propagación del gen.
En la clonación molecular del gen a partir de
ADN genómico, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales
codificarán el gen deseado. El ADN puede escindirse en sitios
específicos usando diversas enzimas de restricción.
Alternativamente, puede usarse una ADNasa en presencia de manganeso
para fragmentar el ADN, o el ADN puede romperse físicamente, por
ejemplo, mediante sonicación. A continuación, los fragmentos de ADN
lineal pueden separarse según el tamaño mediante técnicas
convencionales que incluyen, pero sin limitaciones, electroforesis
en geles de agarosa y poliacrilamida y cromatografía en columna.
Una vez que se generan los fragmentos de ADN, la
identificación del fragmento de ADN específico que contiene el gen
exp deseado puede llevarse a cabo de varias formas. Por
ejemplo, si se dispone de una cantidad de una porción de un gen
exp o de un fragmento del mismo y puede purificarse y
marcarse, los fragmentos de ADN generados pueden seleccionarse
mediante hibridación de ácidos nucleicos con la sonda marcada
(Benton y Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein y Hogness, 1975,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). Aquellos fragmentos de ADN
con homología sustancial con la sonda hibridarán. La presente
invención proporciona ejemplos específicos de fragmentos de ADN que
pueden usarse como sondas de hibridación para las proteínas
exportadas de neumococos. Estas sondas de ADN pueden basarse, por
ejemplo, en las ID SEC Nº 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ó 21.
Alternativamente, la técnica de detección sistemática de la
invención puede usarse para aislar fragmentos de genes exp
adicionales para su uso como sondas.
También es posible identificar el fragmento
apropiado mediante digestión o digestiones con enzimas de
restricción y comparando los tamaños de los fragmentos con los
esperados según un mapa de restricción conocido si se dispone de
éste. Puede realizarse una selección adicional basándose en las
propiedades del gen.
Como se describe anteriormente, la presencia del
gen puede detectarse mediante ensayos basados en las propiedades
físicas, químicas o inmunológicas de su producto de expresión. Por
ejemplo, los clones de ADN que producen una proteína que, por
ejemplo, tiene migración electroforética, comportamiento en
electroenfoque, mapas de digestión proteolítica, actividad
proteolítica, propiedades antigénicas o propiedades funcionales,
especialmente actividad de adhesión, como se conoce (o en el caso de
una proteína asociada a la adhesión, se desconoce) similares o
idénticos para una Exp en particular. En un ejemplo específico, a
continuación la capacidad de una proteína Exp de neumococos para
mediar en la adhesión se demuestra mediante la inhibición de la
adhesión cuando la proteína está mutada. La expresión de Exp en
otras especies, tales como E. coli, puede demostrar
directamente si el exp codifica una
adhesina.
adhesina.
Las alternativas al aislamiento del ADN genómico
de exp incluyen, pero sin limitaciones, sintetizar
químicamente la secuencia misma del gen a partir de una secuencia
conocida que codifica una Exp. Por ejemplo, clonando el ADN de un
gen exp puede aislarse a partir de una bacteria Gram positiva
mediante PCR usando oligonucleótidos degenerados. Son posibles otros
procedimientos.
A continuación, el gen identificado y aislado
puede insertarse en un vector de clonación apropiado. Pueden usarse
un gran número de sistemas vector-hospedador
conocidos en la técnica. Los posibles vectores incluyen, pero sin
limitaciones, plásmidos o virus modificados, pero el sistema vector
debería ser compatible con la célula hospedadora usada. Por ejemplo,
la secuencia codificadora de exp puede insertarse en un
vector de clonación de E. coli. Otros ejemplos de vectores
incluyen, pero sin limitaciones, bacteriófagos tales como derivados
de lambda o plásmidos tales como derivados de pBR322 o derivados del
plásmido pUC, por ejemplo, vectores pGEX, pma1-c,
pFLAG, etc., La inserción en un vector de clonación puede, por
ejemplo, obtenerse ligando el fragmento de ADN en un vector de
clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. Sin embargo,
los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el
ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de
las moléculas de ADN puede modificarse enzimáticamente.
Alternativamente, puede producirse cualquier sitio deseado ligando
secuencias de nucleótidos (enlazadores) en los extremos del ADN;
estos enlazadores ligados pueden comprender oligonucleótidos
específicos sintetizados químicamente que codifican secuencias de
reconocimiento de endonucleasas de restricción. Pueden introducirse
moléculas recombinantes en células hospedadoras mediante
transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de
modo que se generan muchas copias de la secuencia génica.
En un procedimiento alternativo, el gen deseado
puede identificarse y aislarse tras la inserción en un vector de
clonación adecuado con una estrategia de "secuenciación aleatoria
forzada". El enriquecimiento en el gen deseado, por ejemplo,
mediante fraccionamiento de tamaño, puede hacerse tras la inserción
en el vector de clonación.
La transformación de células hospedadoras con
moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen exp
aislado o la secuencia de ADN sintetizada permite la generación de
copias múltiples del gen. De este modo, el gen puede obtenerse en
mayores cantidades cultivando transformantes, aislando las moléculas
de ADN recombinante a partir de los transformantes y, cuando sea
necesario, recuperando el gen insertado del ADN recombinante
aislado.
La solicitud presente también describe vectores
que contienen genes que codifican análogos y derivados de Exp que
tienen la misma actividad funcional que una Exp. Se contempla la
producción y uso de derivados y análogos relacionados con una Exp.
Por ejemplo, el derivado o análogo puede ser funcionalmente activo,
es decir, capaz de exhibir una o más actividades funcionales
asociadas con una Exp natural de longitud completa. Como un ejemplo,
estos derivados o análogos demuestran actividad adhesina.
En particular, pueden obtenerse derivados de Exp
alterando secuencias de ácido nucleico codificadoras mediante
sustituciones, adiciones o deleciones que proporcionan moléculas
funcionalmente equivalentes. Debido a la degeneración de las
secuencias nucleotídicas codificadoras, pueden usarse otras
secuencias de ADN que codifica sustancialmente la misma secuencia de
aminoácidos que un gen exp. Estas incluyen, pero sin
limitaciones, secuencias de nucleótidos que comprenden todos o
porciones de los genes exp que están alterados mediante la
sustitución de codónes diferentes que codifican el mismo resto de
aminoácidos en la secuencia, produciendo de este modo, un cambio
sinónimo. Asimismo, los derivados de Exp incluyen, pero sin
limitaciones, aquellos que contienen, como secuencia de aminoácidos
primarios, toda o parte de la secuencia de aminoácidos de una Exp
incluyendo secuencias alteradas en las que restos de aminoácidos
funcionalmente equivalentes se sustituyen por restos de la
secuencia, dando lugar a sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Por ejemplo, pueden sustituirse en la secuencia uno o más restos de
aminoácidos de polaridad similar, que actúa como equivalente
funcional, dando lugar a una alteración silenciosa. Los sustitutos
para un aminoácido de la secuencia pueden seleccionarse entre otros
miembros de la clase de aminoácidos a la que pertenece. Por ejemplo,
los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina,
isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina.
Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina,
cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Los aminoácidos
cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e
histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen
ácido aspártico y ácido
glutámico.
glutámico.
Pueden producirse genes que codifican derivados
y análogos de Exp mediante diversos procedimientos conocidos en la
técnica. Las manipulaciones que dan lugar a su producción pueden
tener lugar a nivel génico o proteico. Por ejemplo, una secuencia
génica de exp clonada puede modificarse mediante cualquiera
de las numerosas estrategias conocidas en la técnica (Sambrook y
col., 1989, anterior). La secuencia puede escindirse en sitios
apropiados con endonucleasa o endonucleasas de restricción, seguido
de modificación enzimática adicional si se desea, aislamiento y
ligamiento in vitro. En la producción del gen que codifica un
derivado o análogo de Exp, debería tenerse cuidado para asegurarse
de que el gen modificado mantiene la misma fase de lectura de
traducción que el gen exp, sin interrupciones por señales de
traducción, en la región del gen donde se codifica la actividad
deseada.
Adicionalmente, la secuencia del ácido nucleico
de exp puede mutarse in vitro o in vivo, para
crear y/o destruir secuencias de traducción, iniciación y/o
terminación, o para crear variaciones en regiones codificadoras y/o
formar nuevos sitios para endonucleasas de restricción o destruir
los preexistentes, para facilitar una modificación adicional in
vitro. Puede usarse cualquier técnica de mutagénesis conocida en
la técnica incluyendo, pero sin limitaciones, mutagénesis dirigida a
sitio in vitro (Hutchinson, C., y col., 1978, J. Biol. Chem.,
253:6551; Zoller y Smith, 1984, DNA 3:479-488;
Oliphant y col., 1986, Gene 44:177; Hutchinson y col., 1986, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710), uso de enlazadores TAB®
(Pharmacia), etc. Las técnicas de PCR son las preferidas para
mutagénesis dirigida a sitio (véase Higuchi, 1989, "Using PCR to
Engineer DNA", en PCR Technology: Principles and
Applications for DNA Amplification, H. Erlich, editor, Stockton
Press, Capítulo 6, pág. 61-70).
El gen que codifica una Exp, o un fragmento
funcionalmente activo u otro derivado del mismo, pueden insertarse
en un vector, es decir, un vector que contiene los elementos
necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia
codificadora de proteína insertada. Un vector de expresión también
incluye preferiblemente un origen de replicación. Las señales
transcripcionales y traduccionales necesarias también pueden
suministrarse mediante el gen exp nativo y/o sus regiones
flanqueantes. Pueden utilizarse diversos sistemas vectores
hospedadores para expresar la secuencia codificadora de proteína.
Preferiblemente, sin embargo, se usa un sistema de expresión
bacteriana para proporcionar alto nivel de expresión de la proteína
con una probabilidad mayor de la conformación nativa. Los sistemas
hospedador-vector potenciales incluyen, pero sin
limitaciones, sistemas de células de mamíferos infectadas con virus
(por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células
de insectos infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus);
microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de
levaduras o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, plásmido
de ADN o cósmido de ADN. Los elementos de expresión de los vectores
varían en sus potencias y especificidades. Dependiendo del sistema
hospedador-vector utilizado, puede usarse cualquiera
de los varios elementos de transcripción y traducción adecuados.
Preferiblemente, la forma periplásmica de la Exp
(que contiene una secuencia señal) se produce para exportar la
proteína al periplasma de Escherichia coli o en un sistema de
expresión basado en Bacillus subtilis. La exportación al
periplasma puede promover el plegamiento apropiado de la proteína
expresada.
Cualquiera de los procedimientos previamente
descritos para la inserción de fragmentos de ADN en un vector, puede
usarse para construir vectores de expresión que contienen un gen
quimérico compuesto por señales de control de
transcripción/traducción y las secuencias que codifican la proteína.
Estos procedimientos pueden incluir técnicas de recombinación de ADN
in vitro y sintéticas y de recombinación in vivo
(recombinación genética).
La expresión de la secuencia de ácido nucleico
que codifica una proteína exportada o un fragmento peptídico puede
estar regulada mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de
manera que la proteína o péptido exportado se expresa en un
hospedador transformado con la molécula de ADN recombinante. Por
ejemplo, la expresión de una proteína exportada puede controlarse
mediante cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la
técnica, pero estos elementos reguladores serán funcionales para la
expresión en el hospedador seleccionado. Para la expresión en
bacterias se requieren promotores bacterianos. Cuando un vector que
contiene un gen exp se inyecta directamente en un sujeto para
la expresión transitoria, se prefieren promotores eucarióticos o
víricos eucarióticos, incluyendo promotores específicos de tejidos,
dando lugar a la protección heteróloga frente a la infección
bacteriana, como se describe en detalle a continuación. Los
promotores que pueden usarse para controlar la expresión del gen
exp incluyen, pero sin limitaciones, la región promotora
temprana de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature
290:304-310), el promotor contenido en la repetición
terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, y col.,
1980, Cell 22:787-797), el promotor de la timidina
quinasa del herpes (Wagner y col., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del
gen de la metalotioneina (Brinster y col., 1982, Nature
296:39-42); vectores de expresión procariótica tal
como el promotor de \beta-lactamasa
(Villa-Kamaroff, y col., 1978, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 75:3727-3731) o el promotor tac
(DeBoer, y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80:21-25); véase también "Useful proteins from
recombinant bacteria" en Scientific American, 1980,
242:74-94 y las siguientes regiones de control de la
transcripción animal, que muestran especificidad de tejido y se han
utilizado en animales transgénicos: región de control del gen de la
elastasa 1 que está activo en células acinares pancreáticas (Swift y
col., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz y col., 1986,
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409;
MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515), región de
control del gen de la insulina que está activo en células
pancreáticas de tipo beta (Hanahan, 1985, Nature
315:115-122); región de control del gen de la
inmunoglobulina que está activo en células linfoides (Grosschedl y
col., 1984, Cell 38:647-658; Adames y col., 1985,
Nature 318:533-538; Alexander y col., 1987, Mol.
Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control del
virus del tumor mamario de ratón que está activo en células de
testículo, de mama, linfoides y mastocitos (Leder y col., 1986, Cell
45:485-495), región de control del gen de la
albúmina que está activo en el hígado (Pinkert y col., 1987, Genes
and Devel. 1:268-276), región de control del gen de
la alfa-fetoproteína que está activo en el hígado
(Krumlauf y col., 1985, Mol. Cell. Biol.
5:1639-1648; Hammer y col., 1987, Science
235:53-58); región de control del gen de la
alfa1-antitripsina que está activo en el hígado
(Kelsey y col., 1987, Genes and Devel. 1:161-171),
región de control del gen de la beta-globina que
está activo en células mieloides (Mogram y col., 1985, Nature
315:338-340; Kollias y col., 1986, Cell
46:89-94), región de control del gen de la proteína
básica de mielina que está activo en células oligodendrocíticas del
cerebro (Readhead y col., 1987, Cell 48:703-712);
región de control del gen de la cadena ligera de la miosina de tipo
2 que está activo en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature
314:283-286) y región control del gen de la hormona
de liberación gonadotrófica que está activo en el hipotálamo (Mason
y col., 1985, Science 234:1372-1378).
Los vectores de expresión que contienen
inserciones del gen exp pueden identificarse mediante cuatro
aproximaciones generales: (a) amplificación por PCR del ADN
plasmídico o el ARNm específico deseado, (b) hibridación del ácido
nucleico, (c) presencia o ausencia de funciones génicas
"marcadoras" y (d) expresión de secuencias insertadas. En la
primera aproximación, los ácidos nucleicos pueden amplificarse
mediante PCR con la incorporación de radionucleótidos o tinción con
bromuro de etidio para realizar la detección del producto
amplificado. En la segunda aproximación, puede detectarse la
presencia de un gen extraño insertado en un vector de expresión
mediante la hibridación del ácido nucleico usando sondas que
comprenden secuencias que son homólogas con un gen exp
insertado. En la tercera aproximación, el sistema vector
recombinante/hospedador puede identificarse y seleccionarse
basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones génicas
"marcadoras" (por ejemplo, actividad
\beta-galactosidasa, actividad PhoA, actividad
timidina quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de
transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus,
etc.) causados por la inserción de genes extraños en el vector. Si
el gen exp se inserta en la secuencia del gen marcador del
vector, los recombinantes que contienen la inserción exp
pueden identificarse mediante la ausencia de la función génica
marcadora. En la cuarta aproximación, los vectores de expresión
recombinantes pueden identificarse ensayando la actividad del
producto gen exp expresado por el recombinante. Estos ensayos
pueden estar basados, por ejemplo, en las propiedades físicas o
funcionales del producto génico exp en sistemas de ensayo
in vitro, por ejemplo, adherencia a una célula diana o unión
con un anticuerpo frente a la proteína exportada.
Una vez que se han establecido un sistema
hospedador y unas condiciones de crecimiento adecuados, pueden
propagarse los vectores de expresión recombinantes y prepararse en
cantidad. Como se ha explicado previamente, los vectores de
expresión que pueden usarse incluyen, pero sin limitaciones, los
siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales, tales
como el virus vaccinia o adenovirus, virus de insectos tales como
baculovirus, vectores de levaduras, vectores bacteriófagos (por
ejemplo, lambda) y vectores de ADN plasmídico y cósmido, por nombrar
algunos. La elección del vector dependerá del uso deseado del
vector, por ejemplo, para la expresión de la proteína en células
procarióticas o eucarióticas, o como una vacuna basada en ácidos
nucleicos.
Además, puede elegirse una cepa de célula
hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas o
modificadas y procese el producto génico en la manera específica
deseada. La expresión a partir de ciertos promotores puede elevarse
en presencia de ciertos inductores; de este modo, puede controlarse
la expresión de la proteína exportada manipulada genéticamente.
Además, las diferentes células hospedadoras tienen características y
mecanismos específicos para la traducción y procesamiento y
modificación postraduccional (por ejemplo, escisión de la secuencia
señal) de proteínas. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas
hospedadores apropiados para asegurar la modificación deseada y el
procesamiento de la proteína extraña expresada. Sistemas de
expresión vector/hospedador diferentes pueden llevar a cabo
reacciones de procesamiento, tales como escisiones proteolíticas, a
un grado diferente.
Las Exp recombinantes y fragmentos u otros
derivados o análogos de las mismas, o células que expresan los
anteriores pueden usarse como inmunógenos para generar anticuerpos
que reconocen la Exp. Estos anticuerpos incluyen, pero sin
limitaciones, policlonales, monoclonales, quiméricos, cadena
sencilla, fragmentos Fab y una biblioteca de expresión de Fab.
Pueden usarse diversos procedimientos conocidos
en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales frente
a una Exp recombinante o derivados o análogos de la misma. Para la
producción de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos animales
hospedadores mediante inyección con la Exp recombinante o un
derivado (por ejemplo, fragmento) de la misma incluyendo, pero sin
limitaciones, conejos, ratones, ratas, etc. Por ejemplo, la Exp
recombinante o fragmento de la misma puede conjugarse con un
vehículo inmunogénico, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) o
hemocianina de lapa californiana (KLH). Para aumentar la respuesta
inmunológica pueden usarse diversos adyuvantes, dependiendo de las
especies hospedadoras, incluyendo pero sin limitaciones, adyuvante
de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como
hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como
lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones
oleicas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y
adyuvantes potencialmente útiles en humanos tales como BCG
(bacilo de Calmette-Guerin) y
Corynebacterium parvum.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales
dirigidos frente a una Exp o a un análogo de la misma, puede usarse
cualquier técnica que permita la producción de moléculas de
anticuerpo por líneas celulares en cultivos continuos. Estos
incluyen, pero sin limitaciones, la técnica de hibridomas
originalmente desarrollada por Kohler y Milstein (1975, Nature
256:495-497), así como la técnica de trioma, la
técnica de hibridomas de células B humanas (Kozbor y col., 1983,
Immunology Today 4:72) y la técnica de hibridoma del EBV para
producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985, en
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.,
pág. 77-96). Los anticuerpos monoclonales también
pueden producirse en animales sin patógenos utilizando tecnología
reciente (PCT/US90/02545). Pueden usarse anticuerpos humanos y
pueden obtenerse usando hibridomas humanos (Cole y col., 1983, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) o mediante la
transformación de células B humanas con el virus EBV in vitro
(Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Alan R. Liss, pág. 77-96). De hecho,
pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de
"anticuerpos quiméricos" (Morrison y col., 1984, J. Bacteriol.
159-870; Neuberger y col., 1984, Nature
312:604-608; Takeda y col., 1985, Nature
314:452-454) mediante el empalme de los genes de una
molécula de anticuerpo de ratón específica para una Exp junto con
genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica
apropiada; estos anticuerpos están dentro del alcance de este
invención. En terapia inmune pasiva (descrita a continuación), se
prefiere usar estos anticuerpos humanos o quiméricos humanizados, ya
que es menos probable que los anticuerpos humanos o humanizados
induzcan por sí mismos una respuesta inmune, en particular una
respuesta alérgica, en comparación con los anticuerpos
xenogénicos.
Las técnicas descritas para la producción de
anticuerpos de cadena sencilla (Patente de EE.UU. 4.946.778) pueden
adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos
de Exp. Por ejemplo, pueden utilizarse las técnicas descritas para
la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Huse y col.,
1989, Science 246:1275-1281) para permitir una
identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la
especificidad deseada para una Exp, sus derivados o análogos.
Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que
contengan el idiotipo de la molécula de anticuerpo mediante técnicas
conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero sin
limitaciones: el fragmento F(ab')_{2} que puede producirse
por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los
fragmentos Fab' que pueden generarse reduciendo los puentes
disulfuro del fragmento F(ab')_{2} y los fragmentos Fab que
pueden generarse tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un
agente reductor.
En la producción de anticuerpos, la selección
del anticuerpo deseado puede conseguirse mediante técnicas conocidas
en la materia, por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo de
inmunoabsorción ligado a enzima), inmunoensayos de tipo
"sándwich", ensayo inmunorradiométrico, reacciones de
precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión,
inmunoensayos in situ (usando marcadores de oro coloidal,
enzima o radioisótopo, por ejemplo), inmunotransferencias,
reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo,
ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos
de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos
de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una
realización, la unión del anticuerpo se detecta mediante la
detección de un marcador en el anticuerpo primario. En otra
realización, el anticuerpo primario se detecta mediante la detección
de la unión de un anticuerpo secundario o un reactivo al anticuerpo
primario. En una realización adicional, el anticuerpo secundario
está marcado. En la técnica se conocen muchos medios para detectar
la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la
presente invención. Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que
reconocen un epítopo específico de una Exp, pueden ensayarse
hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de
Exp que contiene este epítopo. Para la selección de un anticuerpo
específico de una Exp de una cepa de bacteria en particular, puede
seleccionarse basándose en la unión positiva a esta cepa de bacteria
en particular y a la carencia de unión de Exp a otra cepa. Para la
selección de un anticuerpo específico de una Exp que es un antígeno
común a todos o a muchas cepas de una bacteria en particular, o a
especies de bacterias muy relacionadas, puede seleccionarse
basándose en la unión a esta cepa en particular y a todas o muchas
otras cepas de esta especie o a especies muy relacionadas.
Los anticuerpos anteriores pueden usarse en
procedimientos conocidos en la técnica con respecto a la
localización y actividad de la Exp, por ejemplo, para
inmunotransferencia, captación de imágenes de Exp, medida de los
niveles de la misma en muestras fisiológicas apropiadas, etc.
La inmunidad activa frente a bacterias Gram
positivas puede inducirse mediante inmunización (vacunación) con una
cantidad inmunogénica de una proteína exportada o un derivado o
fragmento antigénico de la misma, y un adyuvante, en el que la
proteína exportada, o derivado o fragmento antigénico de la misma,
es el componente antigénico de la vacuna. Preferiblemente, la
proteína se conjuga con la cápsula o cápsulas de hidratos de carbono
de una o más especies de bacterias Gram positivas. La conjugación
covalente de una proteína a un hidrato de carbono es bien conocida
en la técnica. Generalmente, la conjugación puede desarrollarse a
través de una reacción de condensación por carbodiimida.
La proteína exportada sola o conjugada con una
cápsula o cápsulas no puede causar infección bacteriana, y la
inmunidad activa provocada por la vacunación con la proteína según
la presente invención, puede dar lugar tanto a una respuesta inmune
inmediata como a memoria inmunológica y, de este modo, proporcionar
protección a largo plazo frente a la infección por la bacteria. Las
proteínas exportadas de la presente invención, o fragmentos
antigénicos de las mismas, pueden prepararse en una mezcla con un
adyuvante para preparar una vacuna.
La selección de un adyuvante depende del sujeto
que se va a vacunar. Preferiblemente, se usa un adyuvante
farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, en una vacuna para un
humano deberían evitarse los adyuvantes de emulsión de aceite o de
hidratos de carbono, incluyendo adyuvante completo e incompleto de
Freund. Un ejemplo de un adyuvante adecuado para su uso en humanos
es el alumbre (gel de alúmina). Una vacuna para un animal, sin
embargo, puede contener adyuvantes no apropiados para su uso en
humanos.
Una alternativa a una vacuna tradicional que
comprende un antígeno y un adyuvante implica la introducción directa
in vivo en los tejidos de un sujeto de ADN que codifica el
antígeno para la expresión de éste en las células del tejido del
sujeto. Estas vacunas se denominan en este documento "vacunas
basadas en ácido nucleico". Puesto que el gen exp
contiene, por definición, una secuencia señal, la expresión del gen
en las células del tejido da lugar a la secreción de la proteína
expresada en asociación con la membrana. Alternativamente, el
vector de expresión puede manipularse genéticamente para que
contenga una secuencia señal autóloga en lugar de la secuencia
señal de exp. Por ejemplo, puede inyectarse en el tejido un
vector de ADN desnudo (véase, por ejemplo, Ulmer y col., 1993,
Science 259:1745-1749), un vector transportador de
ADN (por ejemplo, Wu y col., 1992, J. Biol. Chem.
267:963-967; Wu y Wu, 1998, J. Biol. Chem.
263:14621-14624; Hartmut y col., solicitud de
patente canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990)
o un vector vírico que contiene el gen exp deseado. Se
prefieren los vectores víricos adecuados incluyendo retrovirus que
están empaquetados en células con un intervalo de hospedadores
anfotróficos (véase Millar, 1990, Human Gene Ther.
1:5-14; Ausubel y col., Current Protocols in
Molecular Biology, Nº 9) y virus de ADN atenuados o defectuosos,
tales como, pero sin limitaciones, virus del herpes simple (VHS)
(véase, por ejemplo, Kaplitt y col., 1991, Molec. Cell. Neurosci.
2:320-330), papilomavirus, virus de Epstein Barr
(EBV), adenovirus (véase, por ejemplo, Stratford Perricaudet y col.,
1992, J. Clin. Invest. 90:626-630), virus
adenoasociados (VAA) (véase, por ejemplo, Samulski y col., 1987, J.
Virol. 61:3096-3101; Samulski y col., 1989, J.
Virol. 63:3822-3828), y similares. Se prefieren los
virus defectuosos que carecen por completo o casi por completo de
genes víricos. Los virus defectuosos no infectan a la célula tras su
introducción.
Los vectores que contienen la vacuna basada en
ácido nucleico de la invención pueden introducirse en el hospedador
deseado mediante procedimientos conocidos en la técnica, por
ejemplo, transfección, electroporación, microinyección,
transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con
fosfato cálcico, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una
pistola de ADN, o un vector transportador de ADN (véase, por
ejemplo, Wu y col., 1992, J. Biol. Chem.
267:963-967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem.
263:14621-14624; Hartmut y col., solicitud de
patente canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de
1990).
Cualquier vacuna de la invención, es decir, unas
vacunas que comprenden un antígeno Exp, derivado antigénico o
fragmento del mismo, o una vacuna de ácido nucleico de exp,
pueden administrarse a través de cualquier vía parenteral
incluyendo, pero sin limitaciones, la vía intramuscular,
intraperitoneal, intravenosa y similares. Preferiblemente, puesto
que el resultado deseado de la vacunación es provocar una respuesta
inmune frente al antígeno y, de este modo, frente al organismo
patogénico, puede administrarse directamente, mediante un vector
dirigido o mediante la elección de un vector vírico, indirectamente,
a tejidos linfoides, por ejemplo, ganglios linfáticos o bazo. Puesto
que las células inmunes se replican de forma continuada, son una
diana ideal para las vacunas de ácidos nucleicos basadas en vectores
retrovíricoes, ya que los retrovirus requieren que las células se
repliquen.
Puede conferirse inmunidad pasiva a un sujeto
animal sospechoso de sufrir una infección con una bacteria Gram
negativa administrando un antisuero, anticuerpo policlonal o un
anticuerpo monoclonal neutralizador frente a la bacteria Gram
positiva del paciente. Aunque la inmunidad pasiva no confiere
protección a largo plazo, puede ser una herramienta valiosa para el
tratamiento de una infección bacteriana en un sujeto que no ha sido
vacunado. La inmunidad pasiva es particularmente importante para el
tratamiento de cepas de bacterias Gram positivas resistentes a
antibióticos, ya que no se dispone de otra terapia. Preferiblemente,
los anticuerpos administrados para terapia pasiva inmune son
anticuerpos autólogos. Por ejemplo, si el sujeto es un humano,
preferiblemente los anticuerpos son de origen humano o se han
"humanizado" para minimizar la posibilidad de una respuesta
inmune frente a los anticuerpos.
Las vacunas activas o pasivas de la invención
pueden usarse para proteger a un sujeto animal de una infección de
una bacteria Gram positiva. De este modo, puede usarse una vacuna de
la invención en aves, tales como pollos y pavos, y en mascotas; en
mamíferos, preferiblemente un humano, aunque se contempla el uso de
las vacunas de la invención en otras especies de mamíferos, que
incluyen, pero sin limitaciones, animales domésticos (caninos y
felinos); animales de granja (bovino, ovino, equino, caprino,
porcino y similares); roedores y animales no domésticos.
Los anticuerpos de la presente invención que
pueden generarse frente a las proteínas exportadas de bacterias Gram
positivas son reactivos valiosos para el diagnóstico de una
infección con un microorganismo Gram positivo. Actualmente, es
difícil el diagnóstico de la infección con una bacteria Gram
positiva. Según la invención, puede detectarse la presencia de
bacterias Gram positivas en una muestra de un sujeto sospechoso de
tener una infección con una bacteria Gram positiva detectando la
unión de un anticuerpo frente a una proteína exportada de una
bacteria en una muestra o a partir de ella.
El diagnóstico de la infección con una bacteria
Gram positiva puede usar, según se desee, cualquier formato de
inmunoensayo conocido en la técnica. En la sección titulada
"Preparación de anticuerpos frente a proteínas exportadas" se
describen muchos posibles formatos de inmunoensayo. Los anticuerpos
pueden estar marcados para su detección in vitro, por
ejemplo, con marcadores tales como enzimas, fluoróforos, cromóforos,
radioisótopos, colorantes, oro coloidal, partículas de látex y
agentes quimioluminiscentes. Alternativamente, los anticuerpos
pueden marcarse para su detección in vivo, por ejemplo, con
radioisótopos (preferiblemente tecnecio o yodo); reactivos de
desplazamiento para resonancia magnética (tales como gadolinio y
manganeso) o reactivos radioopacos.
Alternativamente, los ácidos nucleicos y
secuencias de los mismos de la invención pueden usarse en el
diagnóstico de infección con una bacteria Gram positiva. Por
ejemplo, los genes exp o fragmentos susceptibles de hibridar
de los mismos pueden usarse para la hibridación in situ con
una muestra de un sujeto sospechoso de portar una infección con una
bacteria Gram positiva. En otra realización, pueden identificarse
segmentos génicos específicos de una bacteria Gram positiva usando
amplificación por PCR con sondas basadas en los genes exp de
la invención. En un aspecto de la invención, la hibridación con una
sonda o con los cebadores de PCR puede realizarse en condiciones
rigurosas, o con una secuencia específica para una única cepa o para
un número limitado de cepas de la bacteria, o ambas, permitiendo, de
este modo, el diagnóstico de la infección con esta cepa (o cepas) en
particular. Alternativamente, la hibridación puede realizarse en
condiciones menos rigurosas, o la secuencia puede ser homóloga en
cualquiera o en todas las cepas de una bacteria, permitiendo, de
este modo, el diagnóstico de la infección con esta especie.
La presente invención se entenderá mejor a
partir de una revisión de la siguiente descripción ilustrativa que
presenta los detalles de las construcciones y procedimientos que se
han seguido en su desarrollo y validación.
Se ha desarrollado una estrategia para mutar e
identificar genéticamente proteínas exportadas en Streptococcus
pneumoniae. Conjugando la técnica de mutagénesis con las
fusiones de genes a phoA, se ha desarrollado una herramienta
para la mutación e identificación genética de proteínas exportadas
de S. pneumoniae. Se crearon vectores y se usaron para
analizar fusiones génicas traduccionales de la fosfatasa alcalina
(PhoA) en el ADN de neumococos en Escherichia coli y S.
pneumoniae. En este estudio se describe la identificación de
diversos loci genéticos que codifican proteínas exportadas. Por
similitud con las secuencias derivadas de otros genes de organismos
procarióticos, estos loci probablemente codifican proteínas que
juegan un papel en la transducción de señales, transporte y
ensamblaje de macromoléculas, mantenimiento de un equilibrio
quimiosmótico intracelular y adquisición de nutrientes.
Se aislaron veinticinco mutantes de neumococos
PhoA^{+} y los loci de ocho de estos mutantes mostraron similitud
con proteínas exportadas o asociadas a membrana conocidas. Se
encontraron homólogos a: 1] permeasas de péptidos dependiente de
proteína, 2] proteínas de unión a penicilina, 3] proteasas Clp, 4]
dos componentes reguladores sensores, 5] las permeasas de
fosfoenolpiruvato:hidrato de carbono fosfotransferasa, 6]
deshidrogenasas asociadas a membranas, 7] ATPasas de transporte de
cationes de tipo P (tipo E_{1}E_{2}), 8] transportadores
ABC para la translocación de la clase RTX de toxinas bacterianas. De
forma inesperada, un mutante PhoA^{+} contenía una fusión de un
miembro de la familia de proteínas
D-E-A-D de helicasas
de ARN dependientes de ATP que sugiere la exportación de estas
proteínas.
La cepa parental de S. pneumoniae usada
en estos estudios fue R6x, que es un derivado de la cepa no
encapsulada R36A de la Universidad Rockefeller (Tiraby y Fox, 1973,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70:3541-3545). Las
cepas de E. coli usadas fueron DH5\alpha, que es F^{-}
f80dlacZ \Delta(lacZYA\DeltaM15)
lacU169 recA1 endA1 hsdR17
(r_{K}-m_{K+}) supE44 l^{-}
thy-1 gyrA relA1 (Bethesda Research
Laboratories); CC118, que es \Delta(ara leu)7697
\DeltalacX74 araD139 phoA20 galE
galK thi rpsE rpoB argE recA1 (Manoil y
Beckwith, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
82:8129-8133), S1179, que es F^{-}
\DeltalacU169 dam3 rpsL (Brown, 1987, Cell
49:825-33) y JCB607, que contiene un vector de
expresión para la producción de DsbA (rna met pBJ41 pMS421)
(Bardwell y col., 1991, Cell. 67:581-589). Las cepas
de S. pneumoniae generadas en este estudio y sus
características relevantes se enumeran en la Tabla 1.
Cepa | Características relevantes | Familia génica u homólogo^{a} | Fuente |
R6x | Hex^{-}, cepa parental | (Tiraby y Fox, 1973) | |
SPRU2 | fusión de PhoA a la secuencia | Estudio en curso | |
señal 1 | |||
SPRU37 | fusión de PhoA a la secuencia | Estudio en curso | |
señal 2 | |||
SPRU96 | pHRM100::zzz | Estudio en curso | |
SPRU97 | pHRM104::zzz | Estudio en curso | |
SPRU121 | fusión de PhoA a AmiA | permeasas de péptidos | Estudio en curso |
SPRU98 | fusión de PhoA a Exp1 | permeasas de péptidos | Estudio en curso |
SPRU42 | fusión de PhoA a Exp2 (PonA) | proteína de unión a penicilina 1a | Estudio en curso |
SPRU40 | fusión de PhoA a Exp3 | familia de dos componentes de | Estudio en curso |
reguladores sensores | |||
SPRU39 | fusión de PhoA a Exp4 | proteasas Clp | Estudio en curso |
SPRU87 | fusión de PhoA a Exp5 | familia PTS de permeasas | Estudio en curso |
SPRU24 | fusión de PhoA a Exp6 | glicerol-3-fosfato deshidrogenasa; | Estudio en curso |
GlpD; B. subtilis | |||
SPRU75 | fusión de PhoA a Exp7 | ATPasas del transporte catiónico de | Estudio en curso |
tipo P | |||
SPRU81 | fusión de PhoA a Exp8 | ATPasas de tráfico de tipo RTX | Estudio en curso |
SPRU17 | fusión de PhoA a Exp9 | helicasas de ARN dependientes de ATP | Estudio en curso |
Las secuencias de aminoácidos derivadas se
determinaron a partir de plásmidos recuperados de los mutantes
PhoA^{+}. Los homólogos se identificaron buscando en una base de
datos de proteínas con el algoritmo BLAST. Véanse los alineamientos
en la Figura 5.
Las S. pneumoniae se sembraron de forma
rutinaria en placas sobre agar tríptico de soja suplementado con
sangre de carnero (TSAB) a una concentración final del 3% (vol/vol).
Los cultivos también se cultivaron en un medio líquido semisintético
de caseína hidrolizada suplementado con extracto de levadura (medio
C+Y) (Lacks y Hotchkiss, 1960, Biochem. Biophys. Acta.
39:508-517). En algunos casos, S. pneumoniae
se cultivó en medio de cultivo de Todd Hewitt (THBY) suplementado
con levadura a una concentración final del 5% (p/v). Cuando se
indica, S. pneumoniae se cultivó en C+Y en presencia del
oxidante de disulfuro 2-hidroxietil disulfuro a una
concentración de 600 \muM, que es 5 veces menor que la
concentración mínima inhibitoria requerida para el crecimiento de
E. coli cuando se cultiva en medio líquido o sólido de
Luria-Bertani (LB). La selección de E. coli
con vectores plasmídicos se obtuvo con eritromicina (erm) a una
concentración de 500 \mug/ml. Para la selección y mantenimiento de
S. pneumoniae que contiene plásmidos integrados en el
cromosoma, las bacterias se cultivaron en presencia de 0,5 a 1
\mug/ml de erm.
La transformación de S. pneumoniae se
realizó como sigue: las bacterias se cultivaronen medio C+Y a 37ºC y
las muestras se retiraron a intervalos de 10 min entre una
D.O._{620} de 0,07 a 0,15 y se conservaron a -70ºC en glicerol al
10%. Las muestras se congelaron en hielo y se añadió ADN
(concentración final, 1 \mug/ml) antes de la incubación a 37ºC
durante 90 min. Los transformantes se identificaron mediante
selección en TSAB que contenía el antibiótico apropiado.
Los plásmidos pHRM100 y pHRM104 (Figura 1) se
construyeron mediante inserción de los fragmentos SmaI o
BamHI de pPHO7 de 2,6 kb, que contienen el gen para
phoA truncado (Guitierrez y Devedjian, 1989, Nucleic Acid
Res. 17:3999), en los sitios correspondientes en pJCD9 (Chen y
Morrison, 1988, Gene, 64:155-164). Se generaron un
único sitio de clonación SmaI para pHRM100 y un único sitio
de clonación BamHI para pHRM104 antes del extremo 5' del gen
phoA mediante deleción selectiva de sitios duplicados.
El ADN cromosómico de S. pneumoniae se
preparó mediante el siguiente procedimiento: las células se
cultivaron de THBY o de C+Y con erm a 0,5 \mug/ml hasta una
D.O._{620} de 0,7. Las células se aislaron mediante centrifugación
y se lavaron una vez en 500 \mul de TES (Tris-HCl
0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
0,1 M). Se eliminaron los sobrenadantes y los sedimentos se
resuspendieron en 500 \mul de TES recién preparado. Las bacterias
se lisaron con la adición de 50 \mul de desoxicolato al 1%
(vol/vol). El lisado se incubó secuencialmente con ARNasa (2
\mug) y pronasa (400 ng) durante 10 min a 37ºC. Esta solución se
extrajo tres veces con un volumen igual de fenol:cloroformo:ácido
isoamílico (25:24:1), seguido de una extracción con un volumen igual
de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). El ADN se precipitó con la
adición de dos volúmenes de etanol frío, se lavó una vez con etanol
al 70% y se resuspendió en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0,
EDTA 1 mM. En algunos casos, este protocolo se ajustó para acomodar
400 ml de bacterias.
Las bibliotecas plasmídicas que contenían el ADN
de neumococo se crearon con pHRM100 y pHRM104 en E. coli para
mutagénesis por inserción de duplicación en S. pneumoniae. El
ADN cromosómico de S. pneumoniae se digirió durante 18 h con
AluI o RsaI, o durante 1,5 h con SauIIIa. Este
ADN se fraccionó por tamaño en un gel de agarosa al 0,7%, se
extrajeron los fragmentos de 400-600 pares de bases
y se purificaron con perlas de vidrio (BIO 101 Inc., La Jolla, CA)
según las instrucciones del fabricante. El ADN se ligó durante 18 h
a 4ºC en los sitios SmaI o BamHI de pHRM100 o pHRM104,
respectivamente, a una proporción entre inserción y vector de 6:1.
La mezcla de ligamiento se transformó en la cepa S1179 de E.
coli o en la cepa PhoA^{-} CC118. El ADN plasmídico se obtuvo
de estas bibliotecas usando el sistema de preparación de plásmidos
Qiagen midi (Qiagen Inc., Charsworth, CA) según las instrucciones
del fabricante.
La estrategia de mutagénesis en S.
pneumoniae implicaba duplicación de la inserción tras la
integración del plásmido (Figura 1b). Debido a esta duplicación hubo
una baja frecuencia de escisión del plásmido integrado con esta
inserción que contaminaba las preparaciones cromosómicas con ADN del
neumococo. Por tanto, los plásmidos integrados que contenían una
inserción de neumococo se recuperaban fácilmente de S.
pneumoniae mediante transformación de estos plásmidos escindidos
directamente en E. coli competente.
Para crear una fusión génica entre el
phoA y amiA, se obtuvo un fragmento de 600 pares de
bases de amiA del ADN cromosómico de S. pneumoniae
mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando los cebadores
sentido y complementario:
5'AAAGGATCCATGAARAARAAYMGHGTNTTY3' (ID SEC Nº
40),
y
5'TTTGGATCCGTTGGTTTAGCAAAATCGCTT3' (ID SEC Nº
41)
respectivamente, donde R=A/G,
Y=T/C, M=C/A, H=T/C/A y N=G/A/T/C. La amplificación del ADN se
realizó con 50 ng de ADN cromosómico, 2 mM del cebador sentido, 1 mM
del cebador complementario y 2,5 U de ADN polimerasa AmpliTaq
(Perkin Elmer, Norwalk, CT), dNTP y tampón proporcionado por el
fabricante. La amplificación (30 ciclos) se realizó usando el
siguiente procedimiento: 1 min a 94ºC para la desnaturalización, 2
min a 72ºC para la extensión y 1 min a 45ºC para la recondensación.
Se obtuvo un fragmento de 600 pares de bases, se dirigió con
BamHI y se ligó en el correspondiente sitio de pHRM104. Esta
mezcla se transformó en E. coli y se identificó un único
clon recombinante que contenía el vector con la inserción. Mediante
análisis de secuencia se confirmó una secuencia codificadora en fase
a lo largo de la unión de fusión. El ADN plasmídico de este clon se
transformó en S. pneumoniae y se analizó la actividad PhoA de
los transformantes mediante el ensayo de transferencia de colonias
para confirmar la producción y exportación de la proteína de
fusión.
Los oligonucleótidos para la secuenciación
(5'AATATCGCCCTGAGC3', ID SEC Nº 42 y 5'ATCACGCAGAGC
GGCAG3', ID SEC Nº 43) se diseñaron a lo largo de las uniones de fusión de las inserciones del neumococo en pHRM100 y en pHRM104. El análisis de la secuencia de doble cadena se realizó en el ADN plasmídico mediante el método didesoxi de terminación de la cadena (Sanger y col., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467) usando el kit de secuenciación de ADN Sequenase Versión 2.0 (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) según las instrucciones del fabricante. Se añadió dimetilsulfóxido (1% vol/vol) a las etapas de condensación y extensión.
GGCAG3', ID SEC Nº 43) se diseñaron a lo largo de las uniones de fusión de las inserciones del neumococo en pHRM100 y en pHRM104. El análisis de la secuencia de doble cadena se realizó en el ADN plasmídico mediante el método didesoxi de terminación de la cadena (Sanger y col., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467) usando el kit de secuenciación de ADN Sequenase Versión 2.0 (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) según las instrucciones del fabricante. Se añadió dimetilsulfóxido (1% vol/vol) a las etapas de condensación y extensión.
Aunque la fosfatasa alcalina se ha caracterizado
en algunos organismos Gram positivos tales como Enterococcus
faecalis (Rothschild y col., 1991, En "Genetics and Molecular
Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci", Dunny, y
col., Washington D.C. Sociedad Americana de Microbiología, pág.
45-48) y B. subtilis (Chesnut y col., 1991,
Mol. Microbiol. 5:2181-90; Hulett y col., 1991, J.
Biol. Chem. 266:1077-84; Sugahara y col., 1991, J.
Bacteriol. 173-1824-6), no se sabe
nada acerca de esta enzima en S. pneumoniae. La actividad
PhoA asociada con la cepa parental de S. pneumoniae se midió
con sustratos cromogénicos en los ensayos descritos a continuación y
se les dieron resultados nominales. Por tanto, la detección de la
actividad PhoA debida a la expresión de las proteínas de fusión en
S. pneumoniae se realizó con un fondo bajo o negativo.
Para seleccionar fusiones de PhoA derivadas de
neumococos en E. coli, se analizaron bibliotecas de plásmidos
en la cepa PhoA^{-} CC118. Los transformantes se dispusieron en
placas en medio LB suplementado con 40 a 80 \mug/ml del sustrato
cromogénico
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
(XP). En 15 a 24 h se desarrollaron colonias azules que indicaban la
actividad PhoA. Se purificaron colonias individuales por siembra en
estrías sobre placas de LP/XP recién preparadas para verificar el
fenotipo azul.
Para seleccionar los mutantes PhoA^{+} de
S. pneumoniae, se analizaron colonias individuales en un
ensayo de transferencia de colonias con XP adaptado de un
procedimiento previamente descrito (Knapp y Mekalanos, 1988, J.
Bacteriol. 170:5059-5066). Se transfirieron colonias
individuales de dos días a filtros de nitrocelulosa (HAHY,
Millipore, Bedford, MA) y se secaron al aire de dos a cinco min. Los
filtros se colocaron con las colonias hacia arriba sobre papeles de
filtro del Nº 3 (Whatman, Inc. Clifton, N.J.) empapados previamente
en NaCl 0,14 M y se incubaron durante 10 min a 37ºC. Esto se repitió
una vez más y, a continuación, las membranas se transfirieron a
papeles de filtro nuevos previamente empapados en
Tris-HCl 1 M, pH 8,0 y se incubaron durante 10 min
a 37ºC. Finalmente, las membranas se transfirieron a otro papel de
filtro nuevo empapado en Tris-HCl 1 M, pH 8,0 con
200 \mug/ml de XP y se incubó a 37ºC. Las colonias azules
indicaban mutantes PhoA^{+} y se detectaban desde los 10 min a 18
h. Las colonias se picaban directamente de los filtros o de las
placas originales. Después de purificar por siembre en estrías sobre
placas de TSAB, se volvió a confirmar el fenotipo azul en un ensayo
posterior de transferencia de colonias.
La actividad PhoA se determinó en las cepas de
S. pneumoniae a partir de cultivos en crecimiento
exponencial. Se aislaron las bacterias de 10 ml de cultivo mediante
centrifugación, se lavaron una vez en solución salina y se
resuspendieron en 1 ml de Tris-HCl 1M, pH 8,0. La
actividad se determinó mediante hidrólisis de
p-nitrofenol fosfato en un ensayo descrito
previamente (Brickman y Beckwith, 1975, Mol. Biol.
96:307-316; Guitierrez y col., 1987, J. Mol. Biol.
195:289-297). La proteína total se determinó sobre
bacterias lisadas con colorante azul de Coomassie (Bradford, 1976,
Anal. Biochem. 72:248-254).
DsbA se purificó casi hasta homogeneidad a
partir de una cepa de E. coli (JCB607) que contenía un vector
de expresión con el gen correspondiente (Bardwell y col., 1991,
Cell. 67:581-589). Brevemente, se añadieron 2 ml de
cultivo reciente de una noche a 400 ml de medio LB y se cultivó
durante 2 h a 37ºC. La concentración de isopropil
\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) se ajustó a 3 mM y se cultivó durante 2 h más. Las bacterias
se aislaron mediante centrifugación y se resuspendieron en 6 ml de
Tris-HCl 100 nM, pH 7,6, EDTA 5 mM y sacarosa 0,5 M.
Esta suspensión se incubó durante 10 min en hielo y las células se
aislaron mediante centrifugación. Las bacterias se resuspendieron en
6 ml de MgCl_{2} 5 mM y se incubaron durante 10 min en hielo. El
sobrenadante se aisló tras la centrifugación. En un gel de
poliacrilamida en presencia de SDS, este material contenía una banda
predominante teñida con azul de Coomassie con una M_{r} aparente
de 21 kDa, la cual es idéntica a la de DsbA y se juzgó que estaba
aproximadamente al 95% de pureza (datos no mostrados).
Los neumococos se separaron en fracciones
subcelulares mediante una modificación de una técnica descrita
previamente (Hakenbeck y col., 1986, Antimicrobial agents and
chemotherapy. 30:553-558). Brevemente, las bacterias
se cultivaron en 10 ml de medio C+Y hasta una D.O._{620} de 0,6 y
se aislaron mediante centrifugación a 17.000xg durante 10 min. Los
sedimentos celulares se resuspendieron en 250 \mul de TEP
(Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM,
fenilmetilsulfonil fluoruro 1 mM). La suspensión se sonicó en
periodos de 15 s durante un total de 4 min. Más del 99% de las
bacterias se rompían según reveló la inspección visual. Los restos
celulares se eliminaron mediante centrifugación (17.000xg durante 10
min). Las membranas bacterianas y el contenido citoplásmico se
separaron mediante centrifugación a 98.000xg durante 4 h en una
ultracentrífuga Airfuge de Beckman. El sobrenadante de esta etapa
final contenía la fracción citoplásmica mientras que el sedimento
contenía las membranas bacterianas. Se evaluó el contenido proteico
de muestras de cada fracción y se solubilizaron en tampón de muestra
SDS para la posterior electroforesis en gel.
Los lisados bacterianos completos y las
fracciones subcelulares se sometieron a electroforesis en gel de
poliacrilamida en presencia de SDS y las proteínas se transfirieron
a membranas de nitrocelulosa (Immobilon, Millipore, Bedford, MA)
usando el PhastSystem (Pharmacia LKB, Uppsala, Suecia) según las
instrucciones del fabricante. Las membranas se incubaron con
anticuerpos policlonales anti-PhoA (5
Prime-3 Prime, Boulder, CO) a una dilución de
1:1.000 con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa a una
dilución de 1:1.000. Las bandas inmunorreactivas se detectaron con
peróxido de hidrógeno y diaminobencidina o mediante
quimioluminiscencia potenciada con productos químicos obtenidos en
Amersham (Arlington Heights, IL).
Con el fin de analizar genéticamente las
proteínas exportadas en S. pneumoniae mediante mutagénesis
por inserción de duplicación, se colocó una forma truncada de
phoA (Guitierrez y Devedjian, 1989, Nucleic Acid Res.
17:3999) en el vector neumocócico conductor pJDC9 (Figura 1a) (Chen
y Morrison, 1988, Gene. 64:155-164). Se crearon dos
vectores con un único sitio de clonación 5' SmaI (pHRM100) o
un único sitio BamHI (pHRM104) para phoA. Los sitios
de clonación en cada vector están flanqueados por dos sitios
KpnI para facilitar la identificación sencilla de una
inserción.
Una mutagénesis por inserción de duplicación
eficaz requiere la clonación de un fragmento génico interno en el
vector antes de la integración (Figura 1b). Por tanto, las
bibliotecas de plásmidos se crearon en E. coli con
inserciones de 400 a 600 pares de bases de ADN de neumococo. Se
analizaron las fusiones traduccionales de phoA en E.
coli o S. pneumoniae de varias bibliotecas que
representaban aproximadamente 2.600 clones individuales.
Cuando se detectaron sistemáticamente las
bibliotecas de neumococos que representaban 1.100 clones
independientes en la cepa de E. coli PhoA^{-} CC118,
cincuenta y cinco colonias mostraron el fenotipo azul cuando se
sembraron sobre placas en medios que contenían
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
(XP). Puesto que los vectores de clonación pHRM100 y pHRM104 no
contenían un promotor intrínseco antes del extremo 5' de
phoA, las proteínas de fusión derivadas de estos plásmidos se
deberían haber generado a partir del ADN de neumococos que contenían
un promotor, un sitio de inicio de traducción y una secuencia señal
funcional. El análisis de secuencias de ADN de las inserciones de
dos de estos plásmidos mostró un posible promotor, sitios de unión a
ribosoma y secuencias codificadoras para los aminoácidos 48 y 52 que
estaban en fase con la secuencia codificadora para phoA.
Estas secuencias codificadoras tienen aspectos característicos de
secuencias señal procarióticas, tales como una región
N-terminal básica, un núcleo hidrófobo central y una
región C-terminal polar (von Heijne, 1990, J. Memb.
Biol. 115:195-201) (Tabla 2).
Cepa | Secuencia señal^{a} | |
SPRU2 | MKHLLSYFKPYIKESILAPLFKLLEAVFELLVPMVIA\uparrowGIVDQSLPQGDPRVP | (ID SEC Nº 44) |
SPRU37 | MAKNNKVAVVTTVPSVAEGLKNVNG\uparrowVNFDYKDEASAKEAIKEEKLKGYLTIDPRVP | (ID SEC Nº 45) |
^{a} \begin{minipage}[t]{157mm} Las regiones codificadoras se identificaron a partir de las secuencias de ADN que están 5' de phoA de los plásmidos recuperados a partir de estas cepas. Las flechas indican el sitio de escisión predicho del péptido señal basado en la "regla -3, -1" (von Heijne, 1986, Nucleic Acid Res. 14:4683-4690) y los aminoácidos en negrita son de la región codificadora de phoA.\end{minipage} | ||
Se identificó un posible sitio de escisión en
ambas secuencias con un algoritmo diseñado para identificar estos
sitios basándose en la "regla -3, -1" (von Heijne, 1986,
Nucleic Acid Res. 14:4683-4690). La transformación e
integración de estos plásmidos en S. pneumoniae daba
transformantes que producían colonias azules en el ensayo de
transferencia de colonias y cada uno producía proteínas de fusión
inmunorreactivas anti-PhoA con una M_{r} aparente
de 55 kDa en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (datos no
mostrados). Estos resultados muestran claramente que las secuencias
señal heterólogas de S. pneumoniae fusionadas con PhoA eran
funcionales tanto en E. coli como en S. pneumoniae y
probablemente usan una ruta de secreción similar.
AmiA es un representante neumocócico de la
familia de permeasas bacterianas que son responsables del transporte
de péptidos pequeños (Alloing y col., 1989, Gene.
76:363-8; Alloing y col., 1990, Mol. Microbiol.
4:633-44; Gilson y col., 1988, EMBO J.
7:3971-3974). AmiA contiene una secuencia señal y
debe ser una lipoproteína exportada unida a la membrana bacteriana
mediante un resto lipídico unido covalentemente a la cisteína
N-terminal (Gilson y col., 1988, EMBO J.
7:3971-3974). Se modificó genéticamente un mutante
neumocócico (SPRU121) que contenía la región codificadora 5' de
amiA fusionada en fase en el codón 169 a phoA. Las
colonias de este mutante producía el fenotipo azul cuando se exponía
a XP, lo que sugería que la proteína híbrida se exportaba. Se
confirmó un polipéptido inmunorreactivo con la M_{r} predicha de
67 kDa mediante análisis por inmunotransferencia de un lisado
celular completo (datos no mostrados).
Animados por la detección de fusiones de PhoA
derivadas del ADN de neumococos tanto en E. coli como en
S. pneumoniae, se creó una biblioteca de transformantes
neumocócicos que contenían inserciones cromosómicas aleatorias de
los vectores de PhoA pHRM100 y pHRM104. A partir de un banco de
1.500 clones, se aislaron 75 mutantes que mostraban el fenotipo azul
con XP en el ensayo de transferencia de colonias. Puesto que S.
pneumoniae se lisa espontáneamente durante la fase estacionaria
de crecimiento debido a una amidasa endógena (LytA), resultaba
preocupante que el fenotipo azul de algunos mutantes fuera el
resultado de la lisis celular y no debido a la exportación de una
proteína de fusión desde las células viables. Se transformó el ADN
de 10 mutantes azules al azar que incluían SPRU22, 42, 75, 81 y 98
en un contexto genético lytA menos y todos seguían mostrando
el fenotipo azul (datos no mostrados).
Uno de los mutantes (SPRU98) mostraba el
fenotipo azul en XP y expresaba un polipéptido inmunorreactivo
anti-PhoA de 93 kDa (Figura 2, carril 2). Puesto que
la región codificadora de phoA produciría un polipéptido con
una masa molecular de 49 kDa, se puede concluir que la proteína de
fusión estaba siendo producida a partir de una región codificadora
correspondiente a un polipéptido con una masa molecular de 44 kDa.
Por el contrario, los mutantes SPRU96 y 97, que contenían vectores
insertados aleatoriamente y no eran azules cuando se exponían a XP,
no producían ningún material inmunorreactivo (Figura 2, carriles 3,
4). La proteína de fusión de SPRU98 se degradaba proteolíticamente
cuando las bacterias completas se exponían a concentraciones bajas
de tripsina, lo que sugería una localización extracelular (Figura 2,
carril 5). La medida directa de la actividad de fosfatasa alcalina
asociada con bacterias completas estaba de acuerdo con este
resultado. Comparado con la cepa parental y un mutante en PhoA^{-}
(SPRU97) con un plásmido integrado aleatoriamente, había una
actividad enzimática de tres a cuatro veces mayor para SPRU98 (Tabla
3). En conjunto, estos resultados sugieren que las fusiones de PhoA
a proteínas exportadas eran translocadas a través de la membrana
citoplásmica de S. pneumoniae.
Cepa | Vector phoA integrado ^{a} | Ensayo de transferencia de colonias ^{b} | Actividad fosfatasa ^{c} |
SPRU98 | + | azul | 44,7 \pm 6 |
SPRU97 | + | blanca | 18,4 \pm 5 |
R6x | 0 | blanca | 14,6 \pm 4 |
^{a} \begin{minipage}[t]{157mm}SPRU97 y SPRU98 contienen el vector de phoA, pHRM104 integrado aleatoriamente en el cromosoma como se describe en el texto.\end{minipage} | |||
^{b} \begin{minipage}[t]{157mm} El mutante PhoA^{+} se aisló basándose en la expresión de la actividad fosfatasa alcalina detectada mediante la exposición de colonias individuales a XP en el ensayo de transferencia de colonias.\end{minipage} | |||
^{c} \begin{minipage}[t]{157mm} Las unidades de actividad de fosfatasa alcalina se determinaron como se describe en Procedimientos experimentales. El ensayo se realizó en células lavadas de cultivos en crecimiento exponencial. Los resultados se presentan como las unidades de actividad enzimática/mg de proteína total.\end{minipage} | |||
En E. coli, la actividad PhoA requiere
la translocación de la proteína a través de la membrana
citoplásmica, la incorporación de Zn^{2+}, la formación de puentes
disulfuro y la dimerización. Después de este proceso de activación,
la enzima es muy resistente a proteasas (Roberts y Chlebowski,
1984). Recientemente dos grupos han identificado un único locus
genético, dsbA (Bardwell y col., 1991, Cell.
67:581-589) y ppfA (Kamitani y col., 1992,
EMBO J. 11:57-67), que codifica una disulfuro
oxidorreductasa que facilita la formación de puentes disulfuro en
PhoA. Se ha identificado un locus similar en V. cholera (Peek y
Taylor, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:6210-6214).
Las mutaciones en dsbA disminuyen considerablemente la
actividad PhoA y vuelven a la proteína sensible a proteasas tanto
in vitro como in vivo (Bardwell y col., 1991, Cell.
67:581-589; Kamitani y col., 1992, EMBO J.
11:57-67). Puesto que la actividad enzimática
asociada con las funciones PhoA en S. pneumoniae era
generalmente 10 veces inferior que los valores obtenidos con las
fusiones en E. coli (datos no mostrados) y debido a la
sensibilidad a proteasas de la fusión de PhoA mostrada en la Figura
2, se planteó la hipótesis de que la adición de DsbA o un oxidante
disulfuro potente promovería la formación de puentes disulfuro,
aumentara la actividad enzimática y retrasara la degradación
proteolítica.
Se cultivó SPRU98, que producía una proteína de
fusión de PhoA con una M_{r} de 93 kDa, en presencia de DsbA 10
\muM o 2-hidroxietil disulfuro 600 \muM, un
potente oxidante de disulfuro. En ambas condiciones la actividad
enzimática se incrementaba al menos dos veces (Tabla 4).
Agente | |
DsbA 10 \muM | 138,4 \pm 7 |
2-hidroxietil disulfuro 600 \muM | 107,5 \pm 8 |
Control | 51,2 \pm 5 |
^{a} \begin{minipage}[t]{157mm} La cepa SPRU98 (10 ml) se cultivó en presencia de los agentes indicados hasta una fase semilogarítmica (DO_{620}\text{:} 0,4), se concentró y se analizó la actividad fosfatasa alcalina. La hidrólisis de \mathit{p}\text{-}nitrofenol fosfato se determinó con bacterias completas en presencia de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 durante una hora a 37^{o}C. Las unidades de actividad se expresan por mg de proteína total.\end{minipage} | |
Comparado con el control, había también un
aumento de la cantidad de proteína inmunorreactiva detectada en
presencia de estos dos compuestos (Figura 3). Esto sugería un
aumento de la estabilidad de la proteína y de la resistencia a la
proteolisis intrínseca. Puesto que sólo había un modesto aumento de
la actividad enzimática asociado a estos compuestos, se propone que
puede haber otros factores necesarios para el correcto plegamiento
de PhoA que faltan en S. pneumoniae. Es destacable que las
secuencias derivadas de otras isoenzimas de fosfatasa alcalina en
los organismos Gram positivos B. subtilis (Chesnut y col.,
1991, Mol. Microbiol. 5:2181-90; Hulett y col.,
1991, J. Biol. Chem. 266:1077-84; Sugahara y col.,
1991, J. Bacteriol. 173:1824-6) y Enterococcus
faecalis, contienen sólo uno o ningún resto de cisteína. Esto
puede sugerir que la presencia de un sistema
oxido-reductasa para el correcto plegamiento de
estos puentes disulfuro intra o intermoleculares pueden ser una
propiedad exclusiva de algunos organismos Gram negativos que
contienen un periplasma bien definido.
Los plásmidos que contienen inserciones de
neumococos se recuperaron en E. coli de 48 mutantes
neumocócicos que mostraron el fenotipo azul en XP. La digestión de
estos plásmidos con KpnI corta las inserciones de neumococos
del vector parental. Todas las inserciones tenían un tamaño de
aproximadamente 400 a 900 pares de bases. El análisis preliminar de
las secuencias de las 48 inserciones reveló 21 secuencias distintas
demostrando, de este modo, una relación de semejanza entre algunos
de los mutantes. Se establecieron regiones codificadoras largas
correspondientes con 50 a 200 aminoácidos en fase con PhoA durante
la mayoría de las inserciones, nueve de las cuales se presentan en
la Figura 4. Usando el algoritmo BLAST (Altschul y col., 1990, J.
Mol. Biol. 215:403-410) se analizó la similitud de
las secuencias proteicas derivadas con las secuencias depositadas en
la versión más actualizada de la base de datos proteica no
redundante en el Centro Nacional de Información Biotecnológica
(Washington, D.C.). Las secuencias de estas nuevas inserciones
(Figura 4) mostraron regiones codificadoras con similitud con las
familias de ocho proteínas exportadas o asociadas a membrana
conocidas. Esas proteínas codificadas por los genes que corresponden
a las posibles fases de lectura sin una función conocida se designan
con el prefijo exp (del inglés, exported
protein, proteína exportada) para describir los diferentes
loci genéticos.
No se detectó similitud entre las secuencias
derivadas de las otras inserciones y las de la base de datos. Las
secuencias de las nueve inserciones estarán disponibles en el
Genbank (Números de acceso aún por asignar) después de la fecha de
presentación de esta solicitud.
Exp1 mostró similitud con la familia de
permeasas responsables del transporte de péptidos pequeños tanto en
bacterias Gram negativas como Gram positivas (Figura 5A). La fase de
lectura identificada mostró la mayor similitud con la proteína
exportada, AimA, de S. pneumoniae (Alloing y col., 1990, Mol.
Microbiol. 4:633-44). El locus ami se
caracterizó por primera vez en un mutante espontáneo resistente a
aminopterina (Sicard, 1964, Genetics. 50:31-44;
Sicard y Ephrussi-Taylor, 1965). El alelo natural
puede ser responsable del transporte intracelular de aminoácidos de
cadena lateral corta (Sicard, 1964). Exp1 es claramente distinta de
AmiA y representa un miembro relacionado de la familia de permeasas
presentes en la misma bacteria. E. coli tiene al menor tres
permeasas peptídicas, mientras que B. subtilis tiene al menos
dos (para una revisión véase (Higgins y col., 1990, J. Bioengen.
Biomembranes. 22:571-92)). Las mutaciones en un
locus análogo, Spo0K de B. subtilis, inhiben la
esporulación y disminuyen considerablemente la eficacia de la
transformación en las células naturalmente competentes (Perego y
col., 1991, Mol. Microbiol. 5:173-85; Rudner y col.,
1991, J. Bacteriol). Resultados recientes han demostrado que las
mutaciones en exp1 también disminuyen la eficacia de
transformación en S. pneumoniae mientras que las mutaciones
en amiA no. Por tanto, dos permeasas de péptidos distintas de
dos bacterias Gram positivas diferentes afectan al proceso de
transformación en estas bacterias naturalmente competentes.
Tanto el ADN como las secuencias proteicas
derivadas de exp2 eran idénticos a ponA (pares de
bases 1821-2055) que codifica la proteína de unión a
penicilina 1A (PBP1a) (Martin y col., 1992a, J. Bacteriol.
174:4517-23) (Figura 5B). Esta proteína pertenece a
la familia de peptidasas D, serina peptidasas D que interaccionan
con penicilina, que catalizan las últimas etapas en la biosíntesis
de mureína. PBP1a se aísla habitualmente de preparaciones de
membranas de neumococos y se considera generalmente una proteína
exportada (Hakenbeck y col., 1991, J. Infect. Dis.
164:313-9; Hakenbeck y col., 1986, Antimicorbial
Agents and Chemotherapy. 30:553-558; Martin y col.,
1992, Embo J. 11:3831-6). Deleciones en PBP1a y en
PBP 1b de E. coli son letales para la célula, pero las
bacterias son capaces de compensarlo si se deleciona el gen (Yousif
y col., 1985, J. Gen. Microbiol. 131:2839-2845).
Sería interesante comparar el perfil de peptidoglicanos de SPRU42
con la cepa parenteral para determinar si la fusión génica con PBP1a
altera la función enzimática.
Exp3 mostró una similitud de secuencia
significativa con PilB de N. gonorrhoeae (Figura 5C) (Taha y
col., 1988, EMBO J. 7:4367-4378). Había dos regiones
de similitud que corresponden al dominio C-terminal
de PilB. Había un hueco corto de 25 aminoácidos en Exp3 y de 37
aminoácidos en PilB que no mostró similitud. Esto sugiere una
relación estructura-función modular para estas dos
proteínas. De acuerdo con este resultado, los híbridos
PhoA-PilB se localizaban en la fracción de membrana
de N. gonorrhoeae (Taha y col., 1991, Mol. Microbiol
5:137-48) indicando translocación a la
membrana.
Se ha sugerido que PilA y PilB son miembros de
la familia de dos componentes de reguladores sensores que controlan
la expresión del gen de pilina y que PilB es un sensor
transmembranal con la región transmisora conservada que contiene
actividad quinasa en la región C-terminal de la
proteína (Taha y col., 1991, Mol. Microbiol.
5:137-48; Taha y col., 1992, J. Bacteriol.
174:5978-81). El resto de histidina conservado
(H_{408}) en PilB necesario para la autofosforilación que es
característico de esta familia no está presente en Exp3. Puesto que
no se ha identificado la pilina en S. pneumoniae podría
asumirse un sitio diana diferente para la regulación génica por
Exp3.
La región codificadora identificada con Exp4
sugiere que es similar a la familia ubicua de proteínas Clp
encontrada tanto en eucariotas como procariotas (Figura 5D) (para
revisión, véase Squires y Squires, 1992, J. Bacteriol.
174:1081-1085). Exp4 es la más semejante al homólogo
CD4B de tomate (Gottesman y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 87:3513-7), pero también se apreció una
similitud significativa a ClpA y ClpB de E. coli. Se ha
propuesto que estas proteínas funcionan como reguladores de
proteolisis (Gottesman y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
87:3513-7) o como caperones moleculares (Squires y
Squires, 1992, J. Bacteriol. 174:1081-1085).
Una característica universal de las proteínas Clp es una secuencia
líder larga que implica la translocación a la membrana (Squires y
Squires, 1992, anterior, J. Bacteriol.
174:1081-1085). De hecho, la ClpC vegetal se
transloca a los cloroplastos (Moare, 1989, Tesis Doctoral,
Universidad de Wisconsin, Madison). Incluso aunque se conoce poco
sobre la localización subcelular de las otras proteínas Clp, sus
resultados sugieren la translocación del homólogo de neumococo a
través de la membrana bacteriana.
Exp5 muestra similitud con PtsG de B.
subtilis (Gonzy-Treboul y col., 1991, Mol.
Microbiol. 5:1241-1249) que es un miembro de la
familia de permeasas fosfoenolpiruvato:hidrato de carbono
fosfotransferasa que se han encontrado tanto en bacterias Gram
positivas como en Gram negativas (para revisión, véase Saier y
Reizer, 1992, J. Bacteriol. 174:1433-1448) (Figura
5E). Estas permeasas son proteínas politópicas de membrana con
varios dominios translocados.
El análisis de la inserción recuperada de Exp6
reveló una región codificadora similar a las
glicerol-3-fosfato deshidrogenasas
de varias especies procarióticas (Figura 5F). Es más similar a la
GlpD de B. subtilis (Hombert y col., 1990, J. Gen. Microbiol.
136:2367-2375). Esta enzima es una flavoproteína
asociada a membrana que forma un complejo con citocromo oxidadas que
son proteínas integrales de membrana. Además, cuando convierte el
glicerol-3-fosfato en
dihidroxiacetona fosfato y
gliceraldehido-3-fosfato para su
posterior entrada en la ruta glucolítica, esta enzima suministra
electrones a las citocromo oxidasas para su posterior transporte. Se
ha propuesto que estas deshidrogenasas se unen a la superficie
interior de la membrana citoplásmica mediante interacciones
hidrófobas no específicas (Halder y col., 1982, Biochemistry.
21:4590-4606; Koland y col., 1984, Biochemistry
23:445-453, Wood y col., 1984, Biochem. J.
222:519-534). Alternativamente, se ha propuesto que
hay un número específico y saturable de sitios de unión entre las
deshidrogenadas y los citocromos que sirven para anclar las
deshidrogenasas a la membrana citoplásmica. Los datos recogidos aquí
sugieren que en S. pneumoniae, un segmento de la
deshidrogenasa se transloca a la superficie externa de la bacteria
(Kung y Henning, 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
69:925-929). Ciertamente, la translocación del
dominio catalítico no alteraría la función de la enzima. En
vesículas de membranas reconstituidas de forma invertida, tenía
lugar la transferencia de los citocromos cuando se añadían en
cualquier de los dos lados de las vesículas (Halder y col., 1982,
Biochemistry. 21:4590-4606).
El análisis de la secuencia derivada de Exp7
mostraba similitud con la familia de ATPasas transportadoras de
cationes de tipo P (tipo E_{1}-E_{2})
tanto de eucariotas como de procariotas, responsables del transporte
de cationes tales como Ca^{2+}, Mg^{2+}, K^{+}, Na^{+} e
H^{+} (Figura 5G). Estas ATPasas son proteínas de membrana
intrínsecas con varios dominios translocados. Se han identificado
ejemplos en E. faecalis (Solioz y col., 1987, J. Biol. Chem.
262:7358-7362), Salmonella typhimurium
(Snavely y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:815-823),
E. coli (Hesse y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
81:4746-4750), Neurospora crassa (Addison,
1986, J. Biol. Chem. 26:14896-14901; Hager y col.,
1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:7693-7697),
Saccharomyces cerevisiae (Rudolph y col., 1989, Cell
58:133-145) y el retículo sarcoplásmico de músculo
esquelético de conejo (Brandi y col., 1986, Cell
44:597-607; Serrano y col., 1986, Nature.
689-693). Exp7 es más similar a MgtB de S.
typhimurium, que es uno de los tres loci genéticos responsables
del transporte de Mg^{2+} (Snavely y col., 1991, J. Biol. Chem.
266:815-823). La región identificada contiene el
resto aspartilo altamente conservado, que es el sitio de
autofosforilación dependiente de ATP. En función de la semejanza con
MgtB, la fusión en Exp7 probablemente se producía en la región
C-terminal de la proteína. Un modelo predicho para
los lazos transmembranales de MgtB sugería que esta región estaría
en la superficie citoplásmica (Snavely y col., 1991, J. Biol. Chem.
266:815-823). Los datos con la fusión de PhoA a Exp7
sugieren que la localización de esta región en la superficie
citoplásmica no es el caso en S. pneumoniae.
Exp8 muestra similitud con la familia de ATPasas
de tráfico, denominada alternativamente superfamilia de casete de
unión a ATP (ABC) de transportadores, que se encuentran tanto en
procariotas como en eucariotas (revisado en Ames y Lecar, 1992,
Faseb J. 6:2660-6) (Figura 5H). Exp8 es la más
similar a las proteínas transmembranales responsables de la
translocación de proteínas RTX bacterianas, tales como las
\alpha-hemolisinas, que son citotoxinas
eucarióticas que se encuentran en organismos Gram negativos y Gram
positivos (revisado en Welch, 1991, Mol. Microbiol.
5:521-528). La proteína de fusión que contiene Exp8
es más semejante a CyaB, un componentes del operón cya en
Bordetella pertussis (Glaser y col., 1988, Mol. Microbiol.
2:19-30; Glaser y col., 1988, EMBO J.
7:3997-4004). Este locus produce la toxina adenilato
ciclasa que también es un miembro de la familia RTX de toxinas
bacterianas. No se puede pasar por alto que el locus comA en
S. pneumoniae también es un miembro de esta familia (Hui y
Morrison, 1991, J. Bacteriol. 173:372-81).
La secuencia derivada para exp9 a partir
de dos regiones de la inserción recuperada se presenta en la Figura
4. El análisis de esta secuencia reveló que Exp9 es un miembro de la
familia de proteínas
D-E-A-D de helicasas
de ARN dependientes de ATP (para revisión, véase (Schmid y Linder,
1992, Mol. Microbiol. 6:282-292)). Es más similar a
DEAD de E. coli (Figura 5I) (Toone y col., 1991, J.
Bacteriol. 173:3291-3302). Se ha identificado un
gran número de helicasas a partir de muchos organismos diferentes.
Se han identificado al menos cinco homólogos diferentes en E.
coli (Kalman y col., 1991, The New Biologist
3:886-895). La marca característica de estas
proteínas es la secuencia DEAD conservada en el motivo B de un
dominio de unión a ATP (Walker y col., 1982, EMBO J.
1:945-951). La secuencia DEAD se identificó en la
secuencia derivada del extremo 5' de la inserción de
exp9.
Dos estudios han sugerido que diferentes
homólogos en E. coli pueden estar implicados en la traducción
afectando al ensamblaje de ribosomas (Nishi y col., 1988, Nature.
336:496-498; Toone y col., 1991, J. Bacteriol.
173:3291-3302). Ninguno de los estudios publicados
ha descrito la exportación o la asociación a membrana de estas
proteínas. Por tanto, fue sorprendente identificar un mutante
PhoA^{+} portador de esta fusión. El fraccionamiento subcelular
mostró claramente la mayoría de la proteína de fusión asociada con
la fracción de membrana de las bacterias (Figura 6), aunque esto
podría ser una anomalía observada sólo con la proteína de
fusión.
Recientemente, se ha demostrado que comF
en B. subtilis contiene una helicasa ARN/ADN similar con una
secuencia DEAD (Londonó-Vallejo y Dubnau, Mol. Microbiol.). Las
mutaciones en este locus causan una deficiente transformación
bacteriana. Estudios posteriores han demostrado que la helicasa es
una proteína asociada a membrana y se ha sugerido que puede estar
implicada en el transporte de ADN durante la transformación (D.
Dubnau, comunicación personal). Experimentos preliminares no han
mostrado una gran diferencia en la capacidad de transformación de un
mutante que expresa la fusión Exp9-PhoA. Si hay una
clase de helicasas asociadas con la membrana, es tentador especular
que Exp9 puede estar implicada en la traducción de polipéptidos
destinados a ser exportados.
En conclusión, este Ejemplo demuestra el
desarrollo de una técnica que mutaba eficazmente e identificaba
varios loci génicos en S. pneumoniae que codifican homólogos
de proteínas exportadas conocidas. Resulta claro a partir de
nuestros resultados que la mayoría de los loci que se han
identificado codificaban proteínas exportadas que están implicadas
en varios procesos diversos que ocurren en la membrana citoplásmica
o fuera de la bacteria. Al igual que con el uso de la mutagénesis de
PhoA en otros organismos, también es aconsejable precaución con esta
técnica en S. pneumoniae. No todos los loci identificados
pueden codificar proteínas exportadas. Ciertamente es posible que
debido a varios factores, tales como la lisis celular, se puedan
generar algunos falso positivos. Como se demuestra en el siguiente
Ejemplo, pueden realizarse ensayos adicionales para demostrar la
actividad funcional de la posible proteína exportada mutante.
Dados estos resultados, la mayoría de los loci
identificados hasta la fecha codifican proteínas exportadas, algunas
de las cuales están implicadas en la transducción de señales,
translocación de proteínas, biosíntesis de la pared celular,
adquisición de nutrientes o en el mantenimiento del equilibrio
quimiosmótico.
En este Ejemplo se determinó la capacidad de
neumococos encapsulados y no encapsulados para adherirse a las
células del pulmón. Los resultados indican que ambos tipos de
neumococos se adhieren a células pulmonares mixtas y a células
pulmonares de tipo II, aunque la preferencia era por las células de
tipo II. Además, los resultados sugieren que la cepa encapsulada de
tipo 2 tiene una capacidad ligeramente mayor para adherirse que la
variante no encapsulada.
También se ensayó el efecto de las mutaciones en
proteínas exportadas sobre la capacidad de las cepas de S.
pneumoniae mutadas para adherirse a células endoteliales de vena
umbilical humanas (HUVEC) y células pulmonares de tipo II. Los
resultados demostraron que algunas de las proteínas exportadas
tienen funciones directas o indirectas en la adhesión de S.
pneumoniae a HUVEC o células de pulmón, o a ambas.
Como se describe en Dobbs y Mason (1979, J.
Clin. Invest. 63:378-387), se extrajeron los
pulmones del conejo, se troceó y se digirió con colagenasa, elastasa
y ADNasa durante 60 min a 37ºC. Los trozos grandes se retiraron con
un filtro de gasa y se sedimentaron y lavaron las células dos veces.
Las células pulmonares mixtas se resuspendieron en 20 ml de un
tampón con calcio suplementado con albúmina al 0,5% a una densidad
de 10^{4} por ml. Las células alveolares de tipo II se purificaron
a partir de la suspensión de células pulmonares mixtas cargando la
suspensión sobre un gradiente de albúmina de 10 ml a 16,5 g% sobre
10 ml a 35 g% y centrifugando a 1.200 rpm durante 20 min a 4ºC. Se
desecharon los 26 ml superiores del gradiente y se recogieron las
células de los siguientes 12 ml, se lavaron y se ajustaron a una
concentración de 10^{4} células por ml. La viabilidad de las
células era superior al 90%, según se valoró por exclusión de azul
de Tripán, y más del 80% de las células contenían cuerpos lamelares
osmiófílos típicos de las células de tipo II cuando se examinaron al
microscopio electrónico.
Se añadieron aproximadamente 10^{3} a
10^{9} neumococos de tipo II (encapsulados) o R6 (no encapsulados)
a 10^{4} células de pulmón en un volumen de 1 ml durante 30 min a
37ºC. Las células de pulmón se separaron de las bacterias no
adherentes mediante 6 rondas de lavado por centrifugación a 270xg
durante 5 min. Las bacterias adherentes en el sedimento celular
final se contaron sembrando sobre placas y mediante tinción
Gram.
Se cultivaron HUVEC (Clonetics, San Diego,
California) y células de la línea celular alveolar de tipo II
(número de acceso de la ATCC A549) durante 4-8 días
y luego se transfirieron a placas de Terasaki 24 horas antes de que
se realizara el ensayo de adherencia para permitir la formación de
una monocapa confluente (Geelen y col., 1993, Infect. Immun.
61:1538-1543). Las bacterias se marcaron con
fluoresceína (Geelen y col., anterior), se ajustan a una
concentración de 5 x 10^{7} o a concentraciones de 10^{5},
10^{6} y 10^{7} ufc por ml y se añadieron en un volumen de 5
\mul a al menos 6 pocillos. Tras la incubación a 37ºC durante 30
min, las placas se lavaron y fijaron con PBS/glutaraldehído al 2,5%.
Las bacterias unidas se contaron visualmente usando un microscopio
Diaphot invertido de Nikon equipado con epifluorescencia.
Se generó una cepa mutante adicional de R6,
SPRU25, como se describe en el Ejemplo 1 anterior.
La adherencia a las células pulmonares mixtas de
los nemococos de tipo 2 encapsulados y R6 no encapsulados (datos no
mostrados) era sistemáticamente de 1-2 logaritmos
menor en cada inóculo que las células de tipo II purificadas. Esto
indicaba que las células de tipo II eran la diana preferida para las
bacterias. La curva de concentración para las células de tipo II se
muestra en la Figura 7. Se apreció una diferencia constante, pero
estadísticamente no significativa entre las cepas encapsulada y no
encapsulada, lo que sugería que la cepa de tipo II podría tener una
capacidad ligeramente superior para adherirse que la variante no
encapsulada.
Se analizó la capacidad de adherirse a HUVEC y a
células pulmonares de tipo II de las cepas mutantes (Tabla 1). Se
encontró que las cepas SPRU98, SPRU42, SPRU40, SPRU25 y SPRU121
tenían la capacidad de adhesión reducida en comparación con la cepa
natural R6. La adherencia de otras cepas no estaba afectada
significativamente por la mutación de las proteínas exportadas
(datos no mostrados).
Las bacterias se valoraron a 10^{5}, 10^{6}
y 10^{7} ufc por ml y se analizó su capacidad para adherirse a
HUVEC (Figura 8) y a células pulmonares de tipo II (Figura 9). A la
concentración más baja, el número de bacterias adherentes era
relativamente el mismo entre los mutantes deficientes en adherencia
y R6. A 10^{6}, y más notablemente, a 10^{7} ufc por ml las
diferencias entre la unión de los mutantes tanto a HUVEC como a
células pulmonares de tipo II variaba de significativas a
espectaculares.
Las homologías de las proteínas exportadas de
las cepas SPRU98, SPRU42 y SPRU40 se discuten en el Ejemplo 1
anterior. SPRU121 representa una mutación del locus amiA. Los
resultados de este experimento proporcionan inesperadas evidencias
de que la proteína exportada AmiA está implicada en la adhesión.
SPRU25 es una cepa generada como se describe en el Ejemplo 1, con
una mutación en exp10. No se ha encontrado ningún gen o
proteína con homología con las secuencias de ácido nucleico [ID SEC
Nº 21] o de aminoácidos [ID SEC Nº 22] de esta proteína exportada.
La porción identificada de la secuencia de nucleótidos de
exp10 y de la de aminoácidos de Exp10 se muestra en la Figura
10.
Estos resultados indican claramente que se
pueden identificar las proteínas exportadas de S. pneumoniae
que están implicadas en la adhesión de la bacteria a las células
El presente ejemplo se refiere a la explicación
más detallada de la secuencia y función de Exp1, un mutante que
invariablemente se transformaba 10 veces menos que la cepa parental.
El análisis de la secuencia completa y la reconstitución del locus
alterado revelaron un gen, al que se puso el nuevo nombre de
plpA (del inglés, permease like protein,
proteína semejante a permeasa) que codifica una posible proteína de
unión a sustrato perteneciente a la familia de permeasas bacterianas
responsables del transporte de péptidos. La secuencia de aminoácidos
derivada para este gen era el 80% similar a AmiA, una proteína de
unión a péptido homóloga de neumococo, y el 50% similar sobre 230
aminoácidos a Spo0KA, que es un elemento regulador en el proceso de
transformación y esporulación en Bacillus subtilis. Se
demostró que las fusiones de PlpA a fosfatasa alcalina (PhoA)
estaban asociadas a membrana y marcadas con [^{3}H]-ácido
palmítico que sirve probablemente como anclaje a la membrana. Los
experimentos diseñados para definir las funciones de los
determinantes plpA y ami en el proceso de
transformación demostró que: 1] Los mutantes con defectos en
plpA eran >90% deficientes en transformación mientras que
los mutantes ami mostraban un aumento de la eficacia en la
transformación de hasta cuatro veces. 2] En comparación con la cepa
parenteral, el inicio de competencia en un mutante ami se
producía más temprano en crecimiento logarítmico, mientras que el
inicio se retrasaba en un mutante plpA. 3] La mutación de
plpA disminuye la expresión de un locus regulado por
competencia. Puesto que los mutantes de permeasas no podrían unir
ligandos específicos, parece probable que la interacción
sustrato-permeasa module el proceso de
transformación.
Este ejemplo demuestra, a través del análisis
mutacional que estas dos permeasas de péptidos tienen efectos
distintos sobre la inducción de competencia, así como sobre la
eficacia de la transformación. Por tanto, se propone que las
permeasas de péptidos median el proceso de transformación en
neumococos a través de la unión de sustrato y el posterior
transporte o señalización y que estos sustratos pueden estar
implicados en la regulación de competencia.
Cepas y medios. Las cepas de S.
pneumoniae usada en este Ejemplo se describen en el Ejemplo 1,
en particular en la Tabla 1. La Tabla 5 enumera otras cepas de
neumococos usadas en este estudio y resume sus características
relevantes. Las cepas de Escherichia coli usadas se describen
en el Ejemplo 1.
Cepa | Características relevantes | Plásmido integrado | Fuente |
R6x | hex^{-}, cepa parental | ninguno | (Tiraby y Fox, 1973) |
SPRU58 | fusión plpA-phoA | pHp1p10 | Estudio en curso |
SPRU98 | fusión plpA-phoA | pHp1p1 | (Ejemplo 1) |
SPRU107 | plpA^{-} | pJp1p1 | Estudio en curso |
SPRU114 | amiA^{-} | pJamiA1 | Estudio en curso |
SPRU121 | fusión amiA-phoA | pHamiA1 | (Ejemplo 1) |
SPRU122 | plpA^{-} | pJp1p9 | Estudio en curso |
SPRU148 | amiC^{-} | pJamiC1 | Estudio en curso |
SPRU100 | fusión exp10-phoA | Manuscrito en preparación | |
SPRU156 | plpA^{-}, fusión exp10-phoA | pWp1p9 | Manuscrito en preparación |
Las condiciones de siembra sobre placa y cultivo
de S. pneumoniae se describen en el Ejemplo 1. Para los
estudios de marcaje los cultivos se cultivaron en un medio
químicamente definido (C_{DEN}) preparado como se ha descrito
(Tomasz, 1964, Bacteriol. Proc. 64:29). E. coli se cultivó en
medio de Luria-Bertani líquido o en medio TSA sólido
suplementado con 500 \mug/ml de eritromicina o 100 \mug/ml de
ampicilina, cuando era apropiado. Para la selección y mantenimiento
de neumococos que contenían plásmidos integrados en el cromosoma,
las bacterias se cultivaron en presencia de 0,5 \mug/ml de
eritromicina.
Bibliotecas de PhoA^{+} y mutagénesis.
Se crearon bibliotecas de mutantes neumocócicos que expresaban
fusiones de PhoA mediante inactivación por inserción con los
vectores conductores de E. coli neumocócicos no replicativos,
pHRM100 o pHRM104. El vector conductor de E. coli
neumocócico, pJDC9, se usó para la inactivación génica sin la
generación de fusiones de phoA. Las construcciones de
plásmidos usadas para la mutagénesis se muestran en la Figura 7.
Los detalles de estos procedimientos se describen en el Ejemplo
1.
Transformación neumocócica. Para detectar
selectivamente grandes cantidades de mutantes por su disminución en
la eficacia de transformación, se transfirieron colonias
individuales a placas de microvaloración de 96 pocillos que
contenían 250 \mul de medio líquido y ADN cromosómico
(concentración final, 1 \mug/ml) de una cepa de neumococo
resistente a estreptomicina (ADN Str^{r}). Tras la incubación
durante 16 h a 37ºC, se sembraron en placa 5 \mul de muestra sobre
medio sólido con y sin antibiótico para determinar la eficacia de
transformación. Las cepas control producían aproximadamente 10^{5}
transformantes Str^{r}/ml, mientras que los candidatos deficientes
para la transformación producían menos de 10^{4} transformantes
Str^{r}/ml.
Los mutantes de permeasas se valoraron en un
ensayo de transformación más definido (Figura 15). Los cultivos
madre de bacterias se diluyeron a una densidad celular de
aproximadamente 10^{6} ufc/ml en medio C+Y con ADN Str^{r}. Esta
solución se distribuyó en alícuotas de 250 \mul en una placa de
microvaloración de 96 pocillos y las bacterias se cultivaron durante
5 horas a 37ºC hasta una DO_{620} de aproximadamente 0,6. Las
bacterias totales y los transformantes Str^{r} se determinaron
mediante dilución seriada de los cultivos sobre medio sólido con o
sin antibiótico. La eficacia de transformación se calculó como el
porcentaje de transformantes Str^{r}/número total de bacterias y
se comparó con la cepa parental, R6x.
Los perfiles de competencia que valoran la
transformación se generaron a partir de los cultivos en medio
líquido. El cultivo madre de bacterias se diluyó a una densidad
celular de aproximadamente 10^{6} ufc/ml en medio C+Y nuevo (10
ml) y se cultivó a 37ºC. Se retiraron muestras (500 \mul) a
intervalos programados, se congelaron y se conservaron en glicerol
al 10% a -70ºC. Estas muestras se descongelaron en hielo y a
continuación se incubaron con ADN Str^{r} durante 30 min a 30ºC.
Se añadió ADNasa a una concentración final de 10 \mug/ml para
detener la captación adicional de ADN y los cultivos se
transfirieron a 37ºC durante un periodo adicional de 1,5 h para
permitir la expresión de la resistencia al antibiótico. La eficacia
de transformación se calculó como se describe anteriormente.
Técnicas de recombinación de ADN. Las
técnicas de ADN convencionales que incluyen minipreparaciones de
plásmidos, digeridos con endonucleasas de restricción, ligamientos,
transformaciones en E. coli y electroforesis en gel se
hicieron según los procedimientos convencionales (Sambrook y col.,
1989, anterior). Los fragmentos de restricción usados en los
experimentos de clonación se aislaron a partir de geles de agarosa
usando perlas de vidrio (Bio 101) o extracciones con fenol. Las
preparaciones de plásmidos a gran escala se prepararon usando las
columnas de afinidad según las instrucciones del fabricante
(Qiagen).
La secuenciación del ADN de doble hebra se
realizó mediante el método de Sanger (Sanger y col., 1977, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-67) usando
[a-^{35}S]-dATP (New England
Nuclear) y el kit de Sequenase Versión 2.0 (United States
Biochemical Corp.), según las instrucciones del fabricante. Se
añadió dimetilsulfóxido (1 % v/v) a las etapas de hibridación y
extensión.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se
realizó usando el kit Gene Amp (Perkin Elmer Cetus). Los
oligonucleótidos fueron sintetizados por Oligos Etc. Inc. o en las
Instalaciones de Secuenciación de proteínas de la Universidad
Rockefeller.
Marcaje in vivo de
PlpA-PhoA. Los cultivos madre congelados de
neumococos se resuspendieron en 4 ml de medio C_{DEN} nuevo y se
cultivaron hasta una DO_{620} de 0,35 a 37ºC. Cada cultivo se
suplementó con 100 \muCi de [9,10-^{3}H]-ácido
palmítico (New England Nuclear) y se cultivaron durante un tiempo
adicional de 30 min. Las células se recogieron mediante
centrifugación y se lavaron tres veces en solución salina tamponada
con fosfato (PBS). El sedimento celular final se resuspendió en 50
\mul de tampón de lisis (PBS, 10 \mug/ml de ADNasa, 10
\mug/ml de ARNasa, desoxicolato al 5% [v/v]) y se incubó durante
10 min a 37ºC. Para inmunoprecipitar la proteína de fusión
PlpA-PhoA se incubó el lisado celular con 20 \mul
de anticuerpos anti-PhoA conjugados a Sepharosa
(5'3' Inc.) durante 1 h a 4ºC. La suspensión se lavó tres veces con
volúmenes iguales de PBS y una vez con 100 \mul de
Tris-HCl 50 mM, pH 7,8,
tetra-acetato de etilendiamina dipotásico (EDTA) 0,5
mM. El sobrenadante final se desechó y la resina se resuspendió en
30 \mul de tampón de muestra SDS, se hirvió durante 5 min y se
sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de
SDS y se autorradiografió.
Fraccionamiento subcelular. Los
neumococos se fraccionaron en los componentes subcelulares mediante
una técnica descrita previamente (Hakenbeck y col., 1986,
Antimicrob. Agents Chemother. 30:553-8). Brevemente,
se cultivaron las bacterias en 400 ml de medio C+Y hasta una
DO_{620} de 0,6 y se aislaron mediante centrifugación a 17.000
g durante 10 min. El sedimento celular se resuspendió en un
volumen total de 2 ml de TEPI (Tris-HCl 25 mM, pH
8,0, EDTA 1 mM, fenilmetilsulfonil fluoruro 1 mM, 20 \mug/ml de
leupeptina y 20 \mug/ml de aprotinina). Se añadió medio volumen de
perlas de vidrio lavadas y la mezcla se agitó durante 15 a 20 min a
4ºC hasta que las células se rompieron según se comprobó mediante
inspección microscópica. La suspensión se separó de las perlas de
vidrio mediante filtración en un embudo de vidrio sinterizado. Las
perlas se lavaron con 5 ml adicionales de TEPI. Las soluciones
combinadas se centrifugaron durante 5 min a 500 g para
separar los restos celulares del material de la pared celular, las
membranas bacterianas y el contenido citoplásmico. A continuación,
se centrifugó el sobrenadante durante 15 min a 29.000 g. El
sedimento contenía la fracción de pared celular, mientras que el
sobrenadante se sometió a otra centrifugación durante 2 h a 370.000
g. El sobrenadante de este procedimiento contenía la fracción
citoplásmica, mientras que el sedimento contenía las membranas
bacterianas. Se evaluó el contenido proteico de muestras de cada
fracción y se solubilizaron en tampón de muestra SDS para la
posterior electroforesis en gel. Las proteínas de fusión
PlpA-PhoA se detectaron con antisuero
anti-PhoA (5'3' Inc.) y se visualizaron
indirectamente mediante quimioluminiscencia potenciada como se
describe en el Ejemplo 1.
\newpage
Recuperación y secuenciación de plpA. La
Figura 18 muestra un mapa de endonucleasas de restricción de
plpA y fragmentos de diversos subclones. Los plásmidos con
fragmentos clonados en pHRM104 tienen el prefijo H, mientras que
aquellos clonados en pJDC9 tienen el prefijo J. Los plásmidos
integrados pHplp1 y pHplp10 se aislaron de SPRU98 y SPRU58,
respectivamente, mediante transformación en E. coli de
plásmidos escindidos espontáneamente que contaminan la preparaciones
cromosómicas de ADN. Se usó el "desplazamiento sobre cromosoma"
para aislar la mayoría de plpA y de la región después del
extremo 3'. Se clonó la inserción de 500 pb de pHplp1 a través de
KpnI en pJDC9 para producir pJplp1 que se transfirió de
vuelta en neumococos para producir SPRU107. Se digirió el ADN
cromosómico de SPRU107 con diversas enzimas de restricción que
cortaron el vector una vez, pero no en el fragmento original. El ADN
se ligó de nuevo y se transformó en E. coli con selección
para el vector. Usando este procedimiento, PstI producía
pJplp2 y HindIII producía pJplp3 que extendían ambos la
región 3' del fragmento original en pJplp1 en 190 pb, mientras que
SphI producía pJplp4 que contenía 3,8 kb adicionales. La
subclonación de un fragmento interno de 900 pb de pJplp4 en pJDC9
dio el plásmido pJplp5 que contenía 630 pb después del extremo 3' de
plpA. Se aislaron 450 pb adicionales antes del extreme 5' a
partir del fragmento original usando EcoRI (pJplp6). Se clonó
el fragmento interno de 730 pb de pJplp6 en pJDC9 dando pJplp7 y un
fragmento interno EcoRI/PstI de 200 pb de pJplp6 en
los sitios apropiados de pJDC9 para producir pJplp8.
La región antes del extremo 5' del fragmento
original de plpA se obtuvo mediante "clonación por
homología" usando oligonucleótidos degenerados y específicos con
ADN cromosómico en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El
oligonucleótido degenerado, lipo1, (GCC GGA TCC GGW GTW CTT GCW GCW
TGC donde W es A + T) (ID SEC Nº 49) se basó en el motivo consenso
del precursor de lipoproteína en AmiA (Alloing y col., 1990, Mol.
Microbiol. 4:633-44) y SarA, un homólogo de la
proteína de unión a permeasas de péptidos de S. gordonii
(Jenkinson, 1992, Infect. Immun. 60:1225-8). El
oligonucleótido específico, P1, (TAC AAG AGA CTA CTT GGA TCC) (ID
SEC Nº 50) era complementario al extremo 5' de la inserción pJplp6.
Para prevenir la amplificación del gen amiA altamente
homólogo, se uso ADN cromosómico de SPRU114 que tiene un amiA
alterado. El ADN cromosómico se digirió primero con XhoI para
producir moldes más cortos. Las condiciones de la PCR fueron 40
ciclos a 94ºC durante 30 segundos para la desnaturalización, 40ºC
durante 30 segundos para la hibridación y 72ºC durante 1 min para la
extensión. Se obtuvo un producto de 600 pb, se purificó en gel, se
digirió con BamHI y se clonó en Bluescript KS (Stratagene)
dando pBSplp9. A continuación se subclonó el fragmento digerido con
BamHI en pJDC9 para producir pJplp9. Este plásmido se
transformó en neumococos para dar SPRU122.
Generación de un mutante plpA que contiene un
gen regulado por competencia fusionado con fosfatasa alcalina.
El fragmento BamHI de 600 pb de pBSplp9 se ligó a pWG5
digerido con SauIIIa (Lacks y col., 1991, Gene
104:11-17) dando lugar a pWplp9. Este plásmido se
transformó en SPRU100, que contiene un gen, exp10, a partir
del locus rec regulado por competencia, fusionado con
phoA, dando SPRU156. La correcta integración del vector en el
cromosoma se confirmó mediante PCR. La actividad fosfatasa alcalina
se midió como se describe en el Ejemplo 1, pero con una
concentración final de sustrato (p-nitrofenil
fosfato, Sigma) de 2,5 mg/ml. Las unidades de actividad se
calcularon usando la siguiente fórmula:
\frac{DO_{420}
- 1,75 \ x \ DO_{550}}{tiempo(h) \ x \ DO_{600} \ (de \
cultivo \
resuspendido)}
Generación de mutantes ami. Los
fragmentos internos de ami obtenidos mediante PCR y digestión
con endonucleasas de restricción se ligaron en los vectores
conductores apropiados y se transformaron en neumococos para
producir los diversos mutantes ami. La construcción de la
fusión génica entre amiA y phoA se ha descrito
previamente en el Ejemplo 1 para dar SPRU121. Para obtener un
amiA truncado, se usaron los oligonucleótidos ami1 (ACC GGA
TCC TGC CAA CAA GCC TAA ATA TTC) (ID SEC Nº 51) y ami2 (TTT GGA TCC
GTT GGT TTA GCA AAA TCG CTT) (ID SEC Nº 52) para generar un producto
de 720 pb en el extremo 5' de amiA. Este fragmento se digirió
con HindIII y EcoRI, que están dentro de la región
codificadora de amiA, y el fragmento correspondiente de 500
pb se clonó en pJDC9. El plásmido pJamiA resultante se transformó en
neumococos para producir SPRU114. Para inactivar amiC se
usaron los oligonucleótidos amiC1 (CTA TAC CTT GGT TCC TCG) (ID SEC
Nº 53) y amiC2 (TTT GGA TTC GGA ATT TCA CGA GTA GC) (ID SEC Nº 54),
que son internos en amiC, para generar un producto de 300 pb
usando PCR. El fragmento resultante se digirió con BamHI y se
clonó en pJDC9, produciendo el plásmido pJamiC1, que se transformó
en neumococos para producir SPRU148.
Análisis por inmunotransferencia de ARN
total. Se preparó el ARN según los procedimientos adaptados de
Simpson y col. (1993, FEMS Microbiol. Lett.
108:93-98). Las bacterias se cultivaron hasta una
DO_{620} de 0,2 en medio C+Y, pH 8,0. Después de la centrifugación
(12.000 g, 15 min, 4ºC) el sedimento celular se resuspendió
en 1/40 volúmenes de tampón de lisis (desoxicolato al 0,1%, sacarosa
al 8%, ditiotreitol 70 mM). Se añadió SDS al 0,1% y la suspensión se
incubó a 37ºC durante 10 min. Los restos celulares se eliminaron y
se añadió un volumen igual de cloruro de litio 4 M frío al
sobrenadante. La suspensión mezclada se dejó en hielo durante una
noche y a continuación se centrifugó a 18.500 g durante 30
min a 4ºC. El sedimento que contenía el ARN se resuspendió en 1,2 ml
de acetato sódico frío (100 mM, pH 7,0) y SDS al 0,5%, se extrajo
tres veces con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico (25:24:1) y una vez con un volumen igual de
cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). El ARN se precipitó con etanol
y se resuspendió en agua estéril. El rendimiento y pureza se
determinaron mediante espectrofotometría con un rendimiento típico
de 300 \mug de ARN a partir de 800 ml de cultivo.
\newpage
Las muestras de ARN se separaron mediante
electroforesis en geles de agarosa al 1,2%/formaldehído al 6,6%
(Rosen y Villa-Komaroff, 1990, Focus
12:23-24). El gel se lavó en agua y el ARN se
transfirió a filtros de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell)
mediante transferencia por capilaridad (Sambrook y col., 1989,
anterior). La prehibridación se hizo durante 4 h en solución de
Denhardt al 0,2% (la solución de Denhardt 1x es Ficoll al 1%,
polivinilpirrolidona al 1%, albúmina sérica bovina al 1%), SDS al
0,1%, SSC 3x (SSC 1x es NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM), HEPES 10
mM, 18 \mug/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón y 10
\mug/ml de ARNt de levadura a 65ºC con agitación suave.
La sonda de ADN usada para detectar las
transcripciones de plpA fue un fragmento
HindIII-BamHI de 480 pb de pJplp9. Para la detección
de las transcripciones de amiA, la sonda de ADN fue un
producto de PCR de 720 pb generado con los oligonucleótidos ami1 y
ami2 (descritos anteriormente). Los fragmentos de ADN se marcaron
con [a-^{32}P]-dCTP usando el
sistema Nick Translation (New England Nuclear). La hibridación se
realizó a 65ºC durante una noche. Los lavados de hibridación fueron
SSC 2x, SDS al 0,5% durante 30 min a temperatura ambiente, seguido
por 3 lavados de 30 min a 65ºC en SSC 1x, SSC 0,5x y SSC 0,2x, todos
con SDS al 0,5%.
Identificación de un mutante deficiente en
transformación con un defecto en una permeasa de péptidos. Para
identificar proteínas exportadas en mutantes como se describe en el
Ejemplo 1 anterior, que participan en el proceso de transformación,
se analizó una disminución en la eficacia de transformación de 30
mutantes PhoA^{+}. En un ensayo diseñado para analizar un número
grande de mutantes, la transformación de una mutación cromosómica
para la resistencia a estreptomicina (Str^{r}) en la cepa parental
(R6x) producía aproximadamente 10^{5} ufc/ml de transformantes
Str^{r}. El mutante PhoA^{+}, SPRU98, mostraba sistemáticamente
el 90% de reducción en el número de transformantes Str^{r}
(10^{4} ufc/ml). La transformación de la mutación PhoA^{+} en
Rx6 parental producía cepas que eran tanto PhoA^{+} como
deficientes en transformación, demostrando que la mutación causada
por la fusión génica estaba ligada al defecto en la transformación.
La tasa de crecimiento de SPRU98 era idéntica al de la cepa
parental, lo que sugería que el fenotipo deficiente en
transformación no era debido a un efecto pleiotrópico relacionado
con el crecimiento del organismo (datos no mostrados). La
recuperación e identificación del locus mutado en SPRU98 puso de
manifiesto plpA (del inglés, permease like
protein, proteína semejante a permeasa) (Figura 11, ID SEC Nº
46), que corresponde a exp1. La secuencia de aminoácidos de
plpA derivada (ID SEC Nº 47) mostró considerable similitud
con las proteínas de unión a sustrato asociadas con las permeasas
bacterianas (para revisión, véase Tam y Saier, 1993, Microbiol. Rev.
57:320-346) con la similitud más grande con AmiA
(60% de identidad de secuencia) (Figura 12A; ID SEC Nº 48). El
alineamiento de PlpA con las proteínas de unión de la familia de
permeasas bacterianas de péptidos reveló varios bloques de similitud
de secuencia que sugieren motivos funcionales comunes a todos los
miembros de esta familia (Figura 12B).
La mayoría de los ejemplos de permeasas de
péptidos tienen una estructura génica que consiste en cinco genes
que codifican una proteína de unión a sustrato exportada, dos
proteínas integrales de membrana y dos proteínas asociadas a
membrana que son responsables del transporte del sustrato a través
de la membrana citoplásmica (para revisiones, véanse Higgins, 1992,
Annu. Rev. Cell. Biol. 8:67-113; Tam y Saier, 1993,
anterior). El análisis de la secuencia de 630 pb inmediatamente
después del extremo 3' y en la región de 3,3 kb después del extremo
3' de plpA, no reveló ninguna secuencia codificadora que
fuera homóloga a estos elementos de transporte (datos no mostrados).
Por tanto, si PlpA se acopla al transporte de sustrato, entonces
esto puede ocurrir a través de los productos de un alelo distinto.
Hay precedentes sobre esto. En Salmonella typhimurium, los
genes hisJ y argT codifican las proteínas de unión
periplásmicas muy similares, J y LAO. Estas dos proteínas
transportan sus sustratos a los mismos componentes asociados a
membrana (Higgins y Ames, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:6038-42). Asimismo, las proteínas de unión
periplásmicas LS-BP y LIV-BP de
Escherichia coli, que transportan leucina y aminoácidos de
cadenas ramificadas, también utilizan el mismo grupo de componentes
unidos a membrana (Landick y Oxender, 1985, J. Biol. Chem.
260:8257-61).
No se pudo recuperar el extremo 5' de
plpA debido quizás a la toxicidad de la proteína expresada en
E. coli. Se han encontrado dificultades similares en la
clonación de genes de otras permeasas de neumococos, tales como
amiA y malX (Alloing y col., 1989, anterior; Martin y
col., 1989, Gene 80:227-238). En función de la
similitud de secuencia entre las secuencias de plpA y
amiA derivadas, se clonó el extremo 5' completo del gen,
excepto 51 pb.
Localización en la membrana y modificación
covalente postraduccional de PlpA. Tanto PlpA como AmiA
contienen la secuencia consenso LYZCyz (Y = A, S, V, Q, T: Z = G, A:
y = S, T, G, A, N, Q, D, F: z = S, A, N, Q, G, W, E) en el extremo
N-terminal que es el motivo distintivo para la
modificación lipídica postraduccional de lipoproteínas en bacterias
(Gilson y col., 1988, EMBO J. 7:3971-74; Yamaguchi y
col., 1988, Cell 53:423-32). En organismos Gram
positivos, esta modificación sirve para anclar estos polipéptidos a
la membrana citoplásmica (Gilson y col., 1988, anterior). Los
ejemplos específicos de proteínas permeasas de unión a sustrato que
contienen esta secuencia consenso incluyen SarA de Streptococcus
gordonii (Jenkinson, 1992, Infect. Immun.
60:1225-8), Spo0KA de B. subtilis (Perego y
col., 1991, Mol. Microbiol. 5:173-185; Rudner y
col., 1991, J. Bacteriol. 173:1388-98), TraC y PrgZ
de E. faecalis (Ruhfel y col., 1993, J. Bacteriol.
175:5253-59; Tanimoto y col., 1993, J. Bacteriol
175:5260-64) y MalX de S. pneumoniae (Gilson
y col., 1988, anterior).
En apoyo de esta propuesta, la Figura 13
muestra que la proteína PlpA-PhoA se exporta y se
asocia principalmente con las membranas citoplásmicas. También se
detectaron pequeñas cantidades en la fracción de pared celular y en
el sobrenadantes del cultivo, lo que sugiere que algo de PlpA se
puede liberar desde la membrana. Esto también se observa para la
proteína de unión a péptido OppA (Spo0KA) de B. subtilis,
donde OppA se asocia inicialmente con la célula, pero durante el
crecimiento se liberan proporciones crecientes (Perego y col., 1991,
anterior). De este modo, PlpA y OppA pueden estar presentes en el
exterior de la célula en una forma susceptible de ser secretada como
se ha propuesto para otras lipoproteínas en bacterias Gram positivas
(Nielsen y Lampen, 1982, J. Bacteriol. 152:315-322).
Aunque no se puede excluir que la presencia de la proteína de fusión
en estas fracciones no refleje la localización de la molécula
nativa, sino más bien el procesamiento de una proteína extraña, esto
parece poco probable, puesto que otras fusiones de PhoA asociadas a
membrana se asocian firmemente con membranas citoplásmicas.
Finalmente, una proteína de 93 kDa marcada con
[^{3}H]-ácido palmítico que corresponde a la proteína de fusión
PlpA-PhoA se inmunoprecipitó a partir de SPRU98 que
contiene una construcción génica plpA-phoA
(Figura 13, panel inferior). Por el contrario, no se detectó la
proteína marcada de forma similar en el control parental o en
SPRU100 que contiene una fusión PhoA no definida. Esto demuestra la
modificación lipídica postraduccional in vivo de PlpA.
Análisis transcripcional de plpA y amiA.
Las transcripciones de 2,2 kb se detectaron con sondas específicas
para plpA y amiA en preparaciones de ARN de células
R6x (Figura 14). Esta es similar en tamaño a la región codificadora
de ambos genes. Para eliminar la posibilidad de hibridación cruzada
entre las sondas para plpA y para amiA, se hicieron
lavados con alta rigurosidad después de la hibridación (véanse los
procedimientos experimentales). La especificidad de las sondas se
demostró también cuando el ARN preparado a partir del mutante
SPRU107, que contiene una inserción plasmídica en plpA, se
incubó con sonda con amiA y plpA. La transcripción de
amiA se mantenía en 2,2 kb, mientras que la transcripción de
plpA cambió a 2,6 kb. En SPRU107, plpA se alteró en el
pb 1474 por pJDC9. La transcripción de plpA sería 520 pb más
pequeña que la transcripción de longitud completa (1,7 kb), con 800
pb adicionales de pJDC9 que dan una transcripción de aproximadamente
2,5 kb, que es similar a la transcripción de 2,6 kb detectada.
Una única transcripción que corresponde al
tamaño de plpA sugiere que plpA no es parte de un
operón. Esto se confirma mediante el análisis de la secuencia
después del extremo 3' de plpA que no reveló ningún homólogo
con los genes que codifican los elementos de transporte asociados
frecuentemente con las permeasas de péptidos (datos no mostrados).
Además, se identificó un posible terminador de la transcripción
independiente de rho de 21 pb después del codón de parada de la
traducción de plpA (Figura 11).
Las mutaciones en las permeasas PlpA y AmiA
tienen efectos distintos sobre el proceso de transformación.
Para determinar el efecto de las permeasas durante la competencia,
valoramos la eficacia de transformación de mutantes con defectos en
plpA o ami. En este ensayo, las cepas de bacterias se
transformaron con un marcador seleccionable a través de un ciclo de
competencia completo seguido por una posterior crecimiento y a
continuación se sembraron sobre placas para la selección de las
células que han incorporado el marcador antibiótico. Los resultados
son, de este modo, una medida del número total de células
transformadas durante la competencia. Los mutantes que producían
fusiones truncadas o de PhoA de PlpA mostraban una disminución de
dos a diez veces en la eficacia de transformación (Figura 15).
En los mutantes con una alteración en el
Asp_{492} de PlpA, la presencia (SPRU98) o ausencia (SPRU107) de
PhoA no afectaba la disminución del 90% en la eficacia de
transformación. Por otro lado, un mutante (SPRU122) que producía una
PlpA truncada en el Asp_{192} mostraba una disminución del 90% en
la eficacia de transformación, mientras que en SPRU58 la fusión a
PhoA en la Leu_{197} restablecía parcialmente el fenotipo
parental. En esta construcción es posible que PhoA confiera
funcionalidad contribuyendo a la estructura terciara de la quimera
afectando, de este modo, su capacidad para unirse a sus
sustratos.
Por el contrario, los mutantes con defectos en
ami eran capaces para la transformación. Los mutantes que
producían AmiA truncada en la Pro_{191} en presencia (SPRU121) o
ausencia (SPRU114) de PhoA mostraron un modesto aumento en la
eficacia de transformación (Figura 15). Además, el mutante SPRU148
con una alteración en AmiC (IIe_{126}) mostró un aumento de cuatro
veces en la eficacia de transformación. En este mutante suponemos
que se produce AmiA y, de este modo, es capaz de unirse a su
sustrato. Por tanto, el aumento observado con el mutante amiC
sugiere que el transporte de sustrato a través del complejo de
transporte codificado por ami puede regular la
transformación, además de la unión al sustrato por AmiA. Finalmente,
incluso aunque PlpA y AmiA son estructuras muy relacionadas (60% de
identidad de secuencia) los efectos dispares observados con
mutaciones en plpA y ami sobre la eficacia de
transformación sugieren que la especificidad de sustrato confiere
estas diferencias.
La transformación se produce durante un único
ciclo de competencia en crecimiento logarítmico temprano (Figura
16). Por tanto, la regulación de este proceso puede ocurrir mediante
la modificación del inicio de competencia (un cambio en la curva) o
mediante la alteración de la expresión de genes inducidos por
competencia que conducen a un cambio en el número de células
transformadas eficazmente. Para determinar si las permeasas regulan
el proceso de transformación comparamos los perfiles de competencia
de los mutantes de permeasas con la cepa parental. Este análisis
mide el número de células transformadas en la población de células
en diversos estados de crecimiento durante un ciclo de competencia.
La Figura 16 muestra un único ciclo de competencia para la cepa
parental (R6x) con una eficacia de transformación máxima de 0,26% a
una DO_{620} de 0,12. Esto corresponde a una densidad celular de
aproximadamente 10^{7} ufc/ml. Un mutante en plpA (SPRU107)
sufrió un ciclo de transformación similar con una eficacia de
transformación máxima de sólo el 0,06% a una densidad celular más
alta. Por el contrario, un mutante amiA (SPRU114) sufrió un
ciclo de transformación que persistía durante más de un tiempo de
multiplicación con una eficacia de transformación máxima del 0,75%.
El inicio del ciclo de competencia en SPRU114 se produjo a una
densidad celular más temprana comenzando por una DO_{620} de 0,03.
A partir de estos datos se concluye que mutaciones en cualquier de
las dos permeasas tienen un efecto doble sobre el proceso de
transformación, afectando ambas la inducción del ciclo de
competencia, así como modulando el número de transformantes
eficaces.
eficaces.
Una mutación en plpA causa un descenso en la
expresión de un locus regulado por competencia. El locus
rec en neumococos, que es necesario para la transformación
genética, contiene dos genes, exp10 y recA. Los
resultados con una fusión génica postraduccional
exp10-phoA han demostrado un incremento de 10
veces en la actividad enzimática, demostrando la inducción de
competencia que este es un locus regulado por competencia. Para
determinar si las permeasas de péptidos afectan directamente a la
expresión de este locus inducido por competencia, construimos un
mutante (SPRU156) con una mutación nula en plpA y la fusión
génica exp10-phoA. Midiendo la actividad
fosfatasa alcalina durante el crecimiento, demostramos que,
comparado con una cepa isogénica (SPRU100), el mutante que portaba
la mutación en plpA demostró un descenso de casi dos veces en
la expresión de la fusión exp10-phoA (Figura
17). Por tanto, estos resultados muestran que al menos plpA
afecta directamente a la cascada de señalización responsable de la
expresión de un gen regulado por competencia necesario para la
transformación.
La proteína exportada recién identificada Exp1
está codificada por el determinante genético, al que se ha puesto el
nuevo nombre en este documento de plpA. Este locus, junto con
el locus ami, modula el proceso de transformación en S.
pneumoniae. Ambos loci codifican proteínas de unión a péptidos
muy similares (PlpA y AmiA) que son miembros de una familia
creciente de permeasas bacterianas responsables del transporte de
péptidos pequeños (Figura 12B). Ejemplos de estas proteínas de unión
a péptidos se han asociado con el proceso de transferencia génica en
varias bacterias. En B. subtilis, la inactivación de
spo0KA, el primer gen de un operón con competentes homólogos
a las permeasa de péptidos, causaba una disminución en la eficacia
de transformación, así como la parada de la esporulación (Perego y
col., 1991, anterior; Rudner y col., 1991, anterior). El sustrato
para Spo0KA no se conoce. B. subtilis produce al menos un
factor de diferenciación extracelular que es necesario para la
esporulación (Grossman y Losick, 1988, anterior) y se ha propuesto
que este sistema de transporte podría estar implicado en la
detección de este factor peptídico extracelular que puede ser
necesario para la competencia y esporulación.
La transferencia por conjugación de varios
plásmidos en E. faecalis se controla mediante feromonas
peptídicas extracelulares. Recientes análisis genéticos han
identificado dos genes codificados por plásmidos, prgZ y
traC, cuyos productos derivados son homólogos a las proteínas
de unión a péptidos. Las evidencias experimentales sugieren que
estas proteínas pueden unir las feromonas peptídicas mediando, de
este modo, la señal que controla la conjugación (Ruhfel y col.,
1993, anterior; Tanimoto y col., 1993, anterior). La ausencia de
elementos del transporte de membrana es un aspecto común entre los
determinantes prgZ, traC y plpA que implica que
el transporte no es necesario para la transducción de la señal o que
es necesario un alelo distinto para el transporte.
Las mutaciones en plpA y en ami
causan una disminución o un aumento en la eficacia de
transformación, respectivamente. Además, las mutaciones en estos
loci afectan la inducción del estado de crecimiento específico del
estado competente. Comparado con la cepa parental, una mutación en
ami induce un inicio temprano de competencia, mientras que
una mutación en plpA retrasa esta inducción. Además, una
fusión traduccional a un locus regulado por competencia ha
demostrado que una mutación en plpA afecta directamente a la
expresión de un gen necesario para el proceso de transformación.
Dado que la inducción de competencia se produce en función de la
densidad celular (Tomasz, 1966, J. Bacteriol.
91:1050-61), es razonable proponer que estas
permeasas sirven como elementos reguladores que modulan la inducción
de competencia dependiente de la densidad celular mediante la unión
y/o transporte de moléculas señalizadoras. Los péptidos pequeños que
son los supuestos sustratos de estas permeasas en otras bacterias o
la proteína activadora neumocócica extracelular son probables
candidatos como ligandos para estas permeasas. Puesto que los
mutantes defectivos en permeasas de péptidos de Salmonella
typhimurium y Escherichia coli no pueden reciclar los
péptidos de la pared celular liberados al medio de cultivo, se ha
propuesto que estas permeasas unen y transportan péptidos de la
pared celular (Goodell y Higgins, 1987, J. Bacteriol.
169:3861-65; Park, 1993, J. Bacteriol.
175:7-11). De este modo, los péptidos de la pared
celular son probables candidatos. Recientes evidencias genéticas
sugieren que el transporte de cationes divalentes (Ni^{2+})
también está acoplado a la función de permeasas de péptidos en E.
coli (Navarro y col., 1993, Mol. Microbiol.
9:1181-91). También se ha demostrado que el
acoplamiento de Ca^{2+} extracelular al transporte intracelular
puede afectar la transformación (Trombe, 1993, J. Gen. Microbiol.
139:433439; Trombe y col., 1992, J. Gen. Microbiol.
138:77-84). Por tanto, el transporte de cationes
divalentes mediado por permeasas de péptidos también es un modelo
viable para la señalización intracelular y la posterior modulación
de la transformación.
El presente Ejemplo describe el aislamiento y
determinación de secuencia de un mutante Exp que codifica un
homólogo de la piruvato oxidasa. Esta nueva proteína regula la
adherencia bacteriana a células eucarióticas.
Se reconoce que la adhesión bacteriana a células
epiteliales de la nasofaringe es un requisito para la colonización
de la superficie mucosa y la infección. La pared celular neumocócica
y las proteínas de la superficie bacteriana median la unión a
células eucarióticas. Los determinantes moleculares que el neumococo
reconoce sobre la superficie de la célula eucariótica son azúcares
complejos, especialmente los restos de hidratos de carbono
GlcNAc\beta1-3Gal o
GalNAc\beta1-4Gal.
Se analizó la pérdida de unión de los mutantes,
como se describen en el Ejemplo 1, anterior, a células pulmonares de
tipo II (T2LC), a células endoteliales humanas (HUVEC) y a
receptores de azúcar GlcNAc\beta1-3Gal en un
ensayo de hemaglutinación que refleja la adherencia a células de la
nasofaringe.
Uno de los 92 mutantes independientes,
denominado Pad1 (del inglés, pneumococcal adherence 1,
adherencia neumocócica 1), mostraba incapacidad para hemaglutinar el
receptor de azúcar GlcNAc\beta1-3Gal sobre los
eritrocitos bovinos tratados con neuraminidasa como se describe
(Andersson y col., véase el Ejemplo 2). Posteriormente, a este
mutante se le ha puesto el nuevo nombre de PoxB. La hemaglutinación
de eritrocitos bovinos tratados con neuraminidasa refleja la
adherencia a células de la nasofaringe. La mutagénesis dirigida de
la cepa parental que inactiva pad1 volvía a confirmar que la
pérdida de hemaglutinación estaba ligada a este locus.
Este mutante también mostró una disminución
mayor del 70% en la adhesión a T2LC y HUVEC, como se muestra en la
Figura 19.
La recuperación y reconstitución del locus
mutado pad1 reveló una fase de lectura abierta de 1,8 kb con
similitud de secuencia con enzimas de la familia de ácido
acetohidroxisintetasa-piruvato oxidasa. En especial,
pad1 comparte el 51% de similitud de secuencia con pox
recombinante y el 32% de similitud con poxB. La alteración
génica dirigida del locus en la cepa parental mostró que la mutación
en este locus era responsable de la pérdida de adherencia en los
tres ensayos.
El fraccionamiento subcelular de un mutante que
expresaba una fusión Pad1-PhoA mostró que la
proteína se localizada en la membrana y el citoplasma (Figura 20A).
La comparación de los componentes antigénicos de la superficie en la
cepa parental y mutante mostró que la pérdida de un polipéptido de
17 kDa no correspondía a Pad1 (Figura 20B).
Estos resultados indican que Pad1 afecta a la
adherencia neumocócica a múltiples tipos celulares, posiblemente
regulando la expresión de adhesinas bacterianas.
El mutante en Pad1 necesitaba acetato para
crecer en un medio químicamente definido (Figuras 21 y 22). El
crecimiento en acetato restablecía las propiedades de adhesión de
las bacterias tanto a células de pulmón como endoteliales.
La información de la secuencia de nucleótidos
para la región promotora de pad1 muestra un posible sitio
-35, una secuencia taatat -10, un sitio de unión a ribosoma y un
sitio de inicio de la traducción (Figura 23) (ID SEC Nº 55). También
se proporciona la traducción de la proteína deducida de esta región
(Figura 23) (ID SEC Nº 56).
Esta invención puede realizarse en otras formas
o realizarse de otro modo sin alejarse de las características
esenciales de la misma. La presente descripción se debe considerar,
por tanto, a todos los respectos, como ilustrativa y no restrictiva,
estando el alcance de la invención indicado por las reivindicaciones
adjuntas y se pretende que ésta abarque todos los cambios que estén
dentro del sentido e intervalo de equivalencia.
También se debe entender que todos los tamaños
de pares de bases dados para los nucleótidos y la información de
todos los pesos moleculares para proteínas son aproximados y se usan
para el propósito de la descripción.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Universidad Rockefeller, The Masure Ph.D.,
\hskip3.9cmH. Robert Pearce, Barbara
\hskip3.9cmJ. Tuomanen, Elaine
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEINAS BACTERIANAS EXPORTADAS Y VACUNAS ACELULARES BASADAS EN LAS MISMAS.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 56
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Klauber y Jackson
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 411 Hackensack Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Hackensack
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva Jersey
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 07601
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: WO por asignar
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-SEP-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/245.511
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-MAYO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/116.541
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-SEP-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Jackson Esq., David A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 26,742
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 600-1-069 PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 201 487-5800
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 201 343-1684
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 133521
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 490 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU98
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..490
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 163 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 960 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU42
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..960
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 320 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 520 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU40
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..519
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 173 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 282 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU39
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..281
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 93 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 327 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU87
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..326
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 417 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU24
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..416
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 138 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 246 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU75
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..245
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 81 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 292 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU81
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..290
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 342 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU17
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..341
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 235 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU17
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..234
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 251 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU25
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (2..250)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 83 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 163 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU42
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 173 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU40
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 175 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- +(A)
- ORGANISMO: Neisseria gonorrheae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU39
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Lycopersicon esculentum (tomate)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 98 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU87
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Bacillus subtilis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU24
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Bacillus subtilis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU75
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus typhimurium
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU81
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Bordetella pertussis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 86 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU17
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 86 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Escherichia coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Escherichia coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAGGATCCA TGAARAARAA YMGHGTNTTY
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTGGATCCG TTGGTTTAGC AAAATCGCTT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATATCGCCC TGAGC
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCACGCAGA GCGGCAG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2019 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPRU98
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1932
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 643 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 642 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: amiA
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Alloing, y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Mol. Microbiol.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 633-644
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 1990
\vskip0.800000\baselineskip
- nota: La referencia contiene un error de secuencia; la secuencia correcta mostrada a continuación se obtiene de GENBANK.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1932
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGGATCCG GWGTWCTTGC WGCWTGC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1932
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACAAGAGAC TACTTGGATC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1932
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCGGATCCT GCCAACAAGC CTAAATATTC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1932
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTGGATCCG TTGGTTTAGC AAAATCGCTT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1932
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTATACCTTG GTTCCTCG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1932
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTGGATTCG GAATTTCACG AGTAGC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1929 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: R6
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pad1 (poxB)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 154..1929
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 591 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 56:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Una molécula de ADN recombinante que
comprende un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos
de la ID SEC Nº 2.
2. La molécula de ADN recombinante de la
reivindicación 1, en la que el ácido nucleico comprende la secuencia
de nucleótidos de la ID SEC Nº 1.
3. Un polipéptido aislado que tiene la secuencia
de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o un fragmento antigénico de dicho
polipéptido en el que dicho fragmento antigénico es capaz de
interaccionar específicamente con una molécula de reconocimiento
antigénico del sistema inmune, tal como una inmunoglobulina o el
receptor antigénico de la célula T, y contiene al menos 5
aminoácidos.
4. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se
une a un epítopo específico de una proteína que tiene una secuencia
de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.
5. Una vacuna para la protección de un sujeto
animal de la infección con una bacteria Gram positiva que
comprende:
a) un vector que contiene un gen que codifica
una proteína exportada de una bacteria Gram positiva asociada de
forma operativa con un promotor capaz de dirigir la expresión del
gen en el sujeto, en el que la proteína exportada es una permeasa;
y/o
b) una cantidad inmunogénica de una proteína
exportada de una bacteria Gram positiva y un adyuvante, en la que la
proteína exportada es una permeasa, en la que dicho gen contiene una
secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1; y/o dicha proteína
exportada contiene una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº
2.
6. La vacuna de la reivindicación 5 en la que el
sujeto animal es un ser humano.
7. La vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 6 en la que la bacteria Gram positiva es un
S. pneumoniae.
8. Un procedimiento para diagnosticar una
infección con una bacteria Gram positiva que comprende detectar la
presencia de una bacteria Gram positiva:
a) con un anticuerpo de la reivindicación 4 o un
fragmento del mismo;
b) en una muestra de un sujeto con una sonda de
ácido nucleico; o
c) mediante reacción en cadena de la polimerasa
usando un cebador;
en el que dicha sonda de ácido
nucleico o dicho cebador es la molécula de ADN de la reivindicación
1.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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