TW494103B - Vaccine against Streptococcus suis infection - Google Patents
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Description
494103 A7 · B7 五、發明説明（1 ) 本發明是討論有關鏈球菌的多胜肽，一種用來保获豬 而拮抗鏈球菌感染而致病的疫苗，與鏈球菌多胜肽反應的 各種抗體，及製備此種疫苗的方法。 由關節炎、敗血病、腦膜炎、心包炎、心內膜炎、多 漿膜炎和/或肺炎的特徵（Clifton-Hadley，F.A.; Br. Vet. Journ. 139： 1-5 (1983), Vecht et al; Vet. Qu arterly 7： 315-321 (1985), Windsor, R.S.; Vet rec. 101： 378-379 (1977), Higgins et al; Can. J. Vet.
Res. 54: 170-173 (1990), Devriese et al; Vet. Rec. 127: 68 (1990))，鏈球菌已被證實是導致豬接觸性傳染 病的主因。 出生3 — 1 2週的小豬其罹病率特別高（Windsor, R.S. and Elliot, S.D.; J. Hyg. Camb., 75： 69-78 ( 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1975), Guise et al; Vet. Rec. 117: 43-44 (1985), Hoffman, L . J . and Henderson; L.M. Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28th Ann. Proc. 201-210 (1985) )。雖然可有年齡的豬對這種細菌引起的物質都是易感的 ’但大於1 4週的豬其死亡率較低（Gu i se e匕a 1 ; Ve t . Rec. 117: 43~44 (1985), Hoffman, L. J. and Henderson; L.M. Am. Assoc. Vet. Lab. Digηosticians 28th Ann . Proc . : 2 0 1 - 2 1 0 ( 1 985 ) ) 〇 有時，此種物質也會與其他動物及人的疾病一起出現 (Devriese et al; Vet. Rec. 127: 68 (1990), Hommez et al； Vet. Rec. 123： 6 2 6 - 6 27 ( 1 9 88 ) , Arends et a- 83.3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 494103 A7 B7 五、發明説明（2 ) 1； Rev. Infect. Dis 10： 131-137 (1988), Gottschal- k et al; J. Clinic. Microbiol. 27. 2633^2636 (1989 ),Arends, J.P. and Zanen. H.C.； Rev. Infect. Dis 10: 13卜137 (1988))，這些受感染的案例，通常都是穿 過受傷的皮膚而造成的。 鏈球菌可引起的疾病，1 9 6 3年已首次在荷蘭被 DeMoor ( DeMoor, C.E.; Antonie van Leeuwenhoek. 29： 2 7 2 - 2 8 0 ( 1 9 6 3 ))提出。從那時候起，歐洲其它國家和加 拿大、美國、澳洲的硏究者亦相繼的提出報告（s a n f q r d， E. and Tilker, M.E.; J. Am. Vet. iMed. Assoc. 23: 5 - 9 7 ( 1 9 8 2 )，P e r c h e t a 1 ; J . C 1 i n，M i c r o b i ο 1 . 1 7 : 993-996 (1983), Larson, D.J. and Kott, B.; Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28th Ann. P r o c . ： 121 -130 (1985), Guise et al; Vet. Rec. 117:43-44 ( 1985), Cl ifton-Hadley, F.A.; Br. Vet. Journ. 139： 卜5 ( 1 983 ) ) 〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
Streptococcus s u i s品系已被再分成許多不同的血清 類型。血清類型的決定乃根據其莢膜多醣抗原（Koehne et al; Am. J. Vet. Res. 40： 1640-1641 (1979), Per ch et al; J. Clin. Microbiol. 17: 993-996 (1983)) ，到目前爲止，全世界共發現2 9種不同的血清型，而在 不同的國家，對幾種血清類型有特定的流行。在北歐國家 ，血清型7最爲流行；而在奧地利，血清型9最常被發現 ，全世界最流行的是血清型2 (Gogolewski et al; Aust 83.3.10,000 (請先閱讀背面之注意事崎再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 494103 A7 B7 五、發明説明（3 ) .Vet. J. 67: 202-204 (1987), Boetner et al; Acta Path. Microbiol . Immunol . Scand. Sect. B 95: 233 -239(1987))。 已知的鏈球菌之發病原理，毒性因子或保茯的抗原並 不多，這表示沒有提示那一個因子是必需的，與能否有效 的接種疫苗，以對抗病原是有關聯。 在製造拮抗細菌引起的疾病之疫苗方面，有一個共同 遵循的法則，那就是完整細胞疫苗製備的生產和試驗。這 個法則也被用於鏈球菌，而也顯示，完整的細胞疫苗對豬 拮抗類似的挑戰，確實可產生明顯的保護作用（Η ο 1 t e t al; Res. Ver Sci. 48: 23-27 (1990))。然而，這似乎 顯示（Kebede et al; Vet. Microbiol. 22: 249-257 ( 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1 9 9 0 ))以完整細胞製備而得的保茯作用具血清型專一性。 完整細胞疫苗的其他廣爲人知的缺點有a )在注射位置及 其周圍不必要的反應，和b )與眞正能誘導產生保茯作用 的物質的量比起來，可給予的非專一性蛋白質較大。由目 前已知的2 9個以多醣莢膜爲基礎之鏈球菌血清型的事實 顯示，完整的彳，跑爲基礎之疫苗應含有許多血清型而得到 廣泛的保茯作用。這種疫苗事實上已製造來保茯人類而拮 肺炎球菌所致的肺炎（8〇111110丨2,6.].;」01]「11.6611.%-i crob i ο 1 . 138 ： 2 4 9 - 2 5 9 ( 1 9 9 2 ) ) 〇 這種疫苗含2 3個可得自最常遇到的血清型之多醣， 除其複雜性之外，由於莢膜多醣低度的免疫性，這種疫苗 有明顯的缺點，因此，做了許多嘗試，以決定各種不同的 83. 3.10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 494103 A7 B7_ 五、發明説明（4 ) 可能因子在鏈球菌的病原性上所扮演的角色。 血凝集素和纖毛已被認爲是潛在的毒性因子，但其在 病原性上眞正的角色或功能並不知道，且其個別的分子或 蛋白質尙未被確認（Jacques et: al; J. Bacteriol. 172 • 2833-2838 (1990), Gottschalk et al; J. Clin. Microbiol .28： 2156-2158 (1990)) 0 到目前爲止，有四種蛋白質已被提出認爲是潛在的毒 性因子： ^ a ) 4 4 k D 的蛋白質（Gol:tschalk et al; Vet.
Microb. 30： 59-71 (1992)) b ) 9 4 kD 的蛋白質（}1〇116131;』.〇〇111口.？&-th . 1 0 0 3 ： 8 5 - 9 4 ( 1 9 9 0 )) c ) 1 1 0 kD 的蛋白質（EF(ext：ΓacellulaΓfac- tor)(Vecht et al; Infect. Immun. 60： 550-556 (1992 );Smith and Vecht; PCT - AppI i catiοn W0 9 2/ 1 6 63 0 )
O d ) 1 3 6 k D的蛋白質（即 MRP (Muraminidase R- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 e 1 e a s e d Protein)) ( V e c h t e t a 1 ; Infect. Immun. 5 9 ： 3156-3162 (1991), Vecht et al; Infect. Immun. 60: 5 5 0 - 5 5 6 ( 1 9 9 2 ), Smith and Vecht; PCT - App I icatiοn WO 9 2 / 1 6 6 3 0 ) 〇 4 4 k D的蛋白質乃自鏈球菌血清型2的病原性品系 發現，而在非病原性的變種中並未出現。提出來用以拮抗 缺乏4 4 k D蛋白質變種之抗血清，並不足以得到對母種 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 494103 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5 ) · 完全的保茯作用，因此，我們認爲其參與了毒性作用。 自兔子提出之拮抗鏈球菌血清型2的9 4 k D蛋白質 抗血清已顯示其在老鼠中拮抗類似挑戰具誘導保茯的作用 〇 而1 1 0 kD和1 3 6 kD的蛋白質則顯示是存在於 高度病原性的品系中，而不存在於非病原性的品系。而 1 1 0 k D的蛋白質顯示不存在於低病原性的品系中，這 顯示，1 1 0 kD和1 3 6 kD的蛋白質參與了致病過程 。換句話說，到目前爲止，尙未有以這些蛋白質的分離物 爲基礎的保茯作用實驗被發表。 結論：到目前爲止，已知的所有潛在毒性因子，僅 4 4 kD和9 4 kD的蛋白質顯示其在拮抗血清型2的保 茯作用上扮演了角色，這個保茯作用僅以類似的挑戰驗證 於老鼠中。另外，到目前爲止，上述的四種蛋白質僅存在 於鏈球菌血清型2中。·如上所提，所給予的大量不同的血 清型，以疫苗而言，很明顯地，非血清型依賴性和血清學 上交叉反應性的保茯性抗原，較能令人接受，以鏈球菌而 言，這種抗原尙未被描述。 令人驚訝地，目前已發現、里球菌的某些品系可分泌 出分子量約5 4 k D的多胜肽，其可藉硫醇（T h i q 1 )予 以活化，亦可藉膽固醇予以抑制而產生溶血反應。溶血性 毒素共同藉分裂細胞膜的完整性和/或功能，而破壞哺乳 動物的細胞，這種破壞可能是當其結合入細胞膜時，藉寡 聚型毒素而形成孔洞。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
494103 A7 B7 五、發明説明（6 ) 這顯示，本發明的溶血性多胜肽是一種硫醇活化的毒 素，硫醇活化的毒素僅於還原態時具有活性，相反的，在 氧化態則無活性（S m y t h，C . J · a n d D u n c a η，J · L . ; B a ** c t e r i a 1 Toxins and Cell Membranes Jel jaszewicz, J , and Wadstrom, T (eds.) London, Academic Press ： 129 -183(1978))。 雖然，硫醇基所扮演的角色還不很清楚，但我們認爲 它是細胞膜傷害產生的必要條件。 溶血素的某一基因在細胞溶解作用之後的機轉，意味 著在哺乳動物細胞膜內，溶血性多胜肽鍵結於膽固醇。一 旦該蛋白質附上細胞，即進入脂雙層，然後，寡聚溶血素 複合物形成，這被認爲是形成穿膜孔。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明中，多胜肽之溶血活性已被證明是屬於可被膽 固醇抑制的溶血素基因，膽固醇在溶血素與易感性細胞的 結合中，似乎扮演著關鍵的角色。有些模型已被提出，其 中，膽固醇乃作爲毒素與細胞之主要結合位。游離態的膽 固醇是細胞溶解的有效抑制劑，這可由當毒素之固醇結合 位被（游離態）膽固醇佔據時，其即不再與膽固醇（膜結 合的）結合的事實說明（B 〇 u 1 η ο 1 s e C a 1 ; Μ ο 1 . M i c r 〇 b -ι〇1· 5: 261 卜2616 (1991))0 本發明的溶血性多胜肽，其分子量已被估計約爲5 4 k D，這分子量乃用實施例II中所述的已標化過之凝膠一 電泳法測定的，圖1中C帶顯示，純化的多胜肽在標誌物 分子（A帶和D帶）之兩側。 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 494103 A7 _ B7 五、發明説明（7 ) 鏈球菌的一個品系之溶血性多胜肽一品系p 1 /. 7 ， 更可藉決定其氮爲終端的胺基酸序列也了解其特徵。 s E Q 1 D N 0 : 1 :代表多胜肽的氮爲終端之序列 ，溶血性多胜肽可自某些鏈球菌品系（但非全部）中分離 出來，而爲產生鏈球菌品系之個別溶血性多胜肽編碼的基 因，其核酸可能有些許的改變。如果只是改變相同胺基酸 的新三聯基密碼（Triplet: Codes)，這些改變對多胜肽 的胺基酸序列可能沒有影響，例如，當作爲白胺酸密碼的 三聯體密碼CTG中的G，由C取代時，同樣是白胺酸的 密碼，然而，假如其中的T由C取代，則新形成的三聯體 密碼則是D比卩客胺酸（P r ο 1 1 n e )而非白胺酸（L e u c i n e )， 這將導致溶血性多胜肽胺基酸序列的變異。 胺基酸序列的變異可能是由於以功能等價物取代一個 或多個胺基酸，或偶而導入阻礙密碼子，刪除/插入核酸 序列，插入或刪除一個或多個胺基酸序列所造成的結果， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以功能等價物取代則是常見的。由N e u r a t h等（T h e P r 〇匕-e i n s, Academic Press, New York ( 1 9 7 9 )，page 14， f l g u r e 6 )可提出的例子，即是以S e r i n e取代a 1 a n i n e ; A1 a/Ser 或 Val/I 1 e，Asp/Gl u 等。 除上述以功能等價的胺基酸取代所致的變異外，一種胺基 酸以非功能等價物的其它胺基酸取代，亦可能造成變異， 這種僅因不同功能等價物取代所造成變異，可能造成蛋白 質在空間折疊方面有些許的改變。自不待言，由於做爲溶 血性多胜肽密碼的核酸序列之變異，致溶血性多胜肽的胺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3.1〇!〇〇〇 494103 A7 B7 五、發明説明（8 ) 基酸序列之變異，而多胜肽的免疫活性被保留，這些變異 都包含在本發明的範圍內。 本發明亦與一種可保茯豬而拮抗鏈球菌感染的疫苗有 關。包括上述的溶血性多胜肽，或由其而來可誘導免疫反 應以拮抗鏈球菌溶血性多胜肽的部分。這種疫苗可被製造 ，例如用一種合成的多胜肽，仿效本發明中的多胜肽或由 其而來可誘導免疫反應以拮抗鏈球菌溶血性多胜肽的部分 0 製造這種疫苗另外的方法是細菌培養中，溶血性多胜 肽之生化純化。例如，可將細菌作離心處理，然後，用凝 膠過濾管柱將溶血性多胜肽與其他成分分離，再於硫酸銨 中作選擇性沈澱處理，接著離心，然後，將該小團物質溶 於合適的緩衝液中。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 這種疫苗也可被製造，例如用分子無性繁殖的技術。 以這些技術，作爲本發明的多胜肽或由其而來可誘導免疫 反應拮抗鏈球菌的多胜肽之密碼的核酸序列，可在表現媒 介物中無性繁殖，接著表現於合適的表現系統，這時候， 表現的產物可用於疫苗中，而可能的表現系統是細菌、酵 母菌、黴菌、昆蟲和哺乳動物細胞的表現系統。 製造多胜肽的另一個方法是將多胜肽置於合適的病毒 媒介物中，作基因訊息的無性繁殖，然後用病毒的宿主細 胞作蛋白質的表現。這種系統是例如將牛痘病毒的媒介物 與易感的哺乳動物細胞結合，或巴氏病毒媒介物（bacul-〇 virus vector)與 Spodoptera frugiperda細胞結合， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 8^3.3.10,000 -11 - 494103 A7 B7 五、發明説明（9 ) 這時，粗抽物或已純化細胞的溶解產物（含表現的多胜肽 )可作爲疫苗的主要成分。 而另一個方法是用以豬爲宿主動物的病毒，作爲所謂 'Live Recombinant Carrier Virus〃（活重組體載體病 毒）。這種活重組體載體（LRC)是一種病毒，其中， 附加的基因訊息已被無性繁殖，被這種重組體病毒感染的 動物將產生免疫反應，不僅拮抗媒介病毒的免疫原，也拮 抗多胜肽免疫性的部分，因爲其基因密碼已被另外無性繁 殖而進入重組體病毒內。 一種疫苗，尤其是作爲L R C病毒以自外來的豬病原 體攜帶基因訊息時特別有用的是狂犬病病毒，這種病毒在 成功地作爲如狂犬病/霍亂病毒之前就已被使用，以較令 人滿意的型式，根據本發明，這種疫苗也包含其它鏈球菌 免疫原。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 我們也發現，可提出來拮抗鏈球菌血清型2的溶血性 多胜肽之抗血清，與所有其它製造溶血素的鏈球菌品系所 製造的溶血素具反應性，而與其血清型無關。但這尙未被 上述 44kD、94kD、1 1 OkD、136kD 的鏈 球菌多胜肽證明。 然而，根據本發明及另外包含這些鏈球菌免疫原其中 之一或其它鏈球菌的免疫原所得之疫苗，具有很好的效率 。這種較高的效率，可能有如是協同作用的結果，這可能 導致以更低的抗原負荷產生更有效的疫苗。 以較令人滿意的型式，根據本發明，疫苗由一種偶合 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -12 - 494103 A7 B7 五、發明説明（10 ) 於本發明的多胜肽之載體組成，其他的分子，如K e y h〇 1 e Limpet Haemocyanine, Bovine Serum Albumin及複雜的 糖分子均可作爲載體。 以較令人滿意的型式，根據本發明，疫苗由偶合於本 發明的多胜肽之莢膜多醣組成。 多胜肽與碳水化合物共價聯結的方法，已由Dick, E.和 Beiirt, M.; Contrib. Microbiol. Immunol. 10: 48 -1 1 4 ( 1 9 89 )提出。 很清楚地，其它載體的型式或多胜肽聯結於碳水化合 物的方法也在本發明的範圍內。 更具體的表現是，根據本發明所得之疫苗也包含由其 它豬病原性的有機體和病毒而來之抗原，這些有機體和病 毒’如放線桿菌屬牛胸膜肺炎菌（Actinobaci 1 lus p 1 e u -ropneumoniae )，狂犬病病毒(Pseudorabies virus )， 藉的流行感冒病毒（Porcine Influenza virus)，藉的 小去氧核糖核酸病毒（Porcine Parvovirus)，可傳染性 的胃腸炎病毒（Transmissible Gastroent:erit:isvirus) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ，Rotavirus，大腸桿菌（L_ C ο 1 i )豬丹毒桿菌（Ervsi-d e 1 o t h r i x rhusiopathiae )，雞霍 HL· 桿菌（Pasteurella multocida)和支氣管敗血球桿菌（Bordetel la bronchi-s e p t i c a ) 0 根據本發明，以一種較令人滿意的表示，疫苗也可含 有一種佐藥（AcUuvant)，一般，佐藥包含一些物質，這 些物質以一種非專一性的方式引起寄主的免疫反應，在技 83. 3.10,000 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -13 - 494103 A7 ___ B7 五、發明説明（11) 術方面，已知有許多不同的佐藥，例如Freunds完全和不 完全佐藥，維它命E，非離子性的阻斷聚脂，胞壁酸的雙 胜肽（Muramyldipeptides)，Quill A(R〉，礦物油，Ba-yol(R)或 Markol(R)，蔬菜油和 Carbopol(R)(—種同類聚 脂）或Diluvac(R) Forte。疫苗可能也包含一種所謂的、 媒介物（V e h i c 1 e ) 〃 ，媒介物是多胜肽所吸附的化合物 ，但並非共價鍵結，常用的媒介物如氫氧化鋁、磷酸鋁或 氧化銘、二氧化ϊ夕、白陶土和g 土。 這種媒介物的特殊型式是抗原部分嵌入媒介物中，此 即所謂 I S C 0 M ( E P 1 0 9.9 4 2， ΕΡ 180.564，ΕΡ 242.380)。 另外，疫苗可能包含一種或多種合適的表面活性化合 物或乳化劑，例如Span或Tween。 往往以安定劑與疫苗混合，以預防有變質傾向的多胜 肽變質，延長疫苗的架貯期，或改善冷凍乾燥的效率。有 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 logy 59: 509 (1950))，碳水化合物，例如山梨醇、木蜜 醇、繭蜜糖、澱粉、蔗糖·、菌葡萄聚糖或葡萄糖；蛋白質 ，如白蛋白或酪蛋白或其變質的產物和緩衝劑，如碱金屬 的磷酸鹽。另外，疫苗可懸浮於生理上合適的稀釋劑內。 自不待言地，其他輔助的方法，如加入媒介物或稀釋 劑、乳化或安定一種多胜肽也都包含於本發明中。 在其它被具體表現的部分中，與本發明的多胜肽或由 其而來的抗原部分單一專一性反應的抗體，被用來給予被 83. 3.10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 14 494103 Α7 Β7 五、發明説明（12) 動免疫。 單一專一性的抗體是一種專門能與本發明中5 4 k D 之多胜肽，或由其他而來的部分反應的抗體，與其他鏈球 菌抗原無特殊的反應性。 拮抗病原的抗體可成功地用於被動免疫，這種治療的 好處是當受到感染時，抗體可用以對抗。因此不需浪費時 間等待免疫系統的活化，而產生足夠的抵禦能力，尤其， 當感染已經發生及病情正在惡化中，抗體的使用可即時治 療動物由病原和其產生的毒素所致的疾病。因此，基於抗 體拮抗鏈球菌的溶血性多胜肽，可保茯豬而拮抗受鏈球菌 感染所致的疾病之疫苗也包含於本發明中。 本發明也提供一種以製劑上合適的媒介物、佐藥或稀 釋劑製備疫苗的方法而用來製備疫苗，以保茯晡乳動物而 拮抗由鏈球菌及根據本發明混合的多胜肽所造成的感染。
實施例 I 細菌的品系 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 鏈球菌型2品系P 1 / 7和6 8 8 / 9由D r . T . A 1 -exander , University of Cambridge, U . K .)提供，型 2 品系 4005 ’D282 ，3921 ，3977 ， 3 8 8 9 ，和 ΤΙ 5 得自 Dr*. U. Vecht, CD hDL0,Lely-stad， the Netherlands.;型7 品系1 〇 6 8 1 ， 1 0 7 2 7和1 4 3 9 1由Dr· Β· Nielsen, Intervet Scandinavia, Copenhagen, Denmark提供；參考品系 1 一 83. 3.10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） -15 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494103 A7 B7 五、發明説明（13 ) 2 2 得自 Dr. J. Henrichsen, Statens Serum Institute ,Copenhagen , Denmark ° 品系B 1 0血清型1是一種最近的領域之分離物，得 白 ^ Gezondheidsdient voor dieren, Oost-Nederland^ ,a t Deventer, The Netherlands ° 品系NV 9 2 1 0 9血清型8 ，2 2 0 8 9 KM血清 型9和2 2 0 8 9 1GV血清型1 4是得自病豬之最近的 領域之分離物。 細菌的培養 細菌的品系是以線條加以區分地置於羊血瓊脂上，於 3 7 °C下培養2 4小時。爲確定每批培養基內溶血素的製 造，有些菌落接種於1 0 Omj?的Todd Hewitt培養液（ D i f c 〇 )，於3 7 °C下培養至對數生長相結束（通常爲5 一 6小時），接著以離心法於1 0 〇 〇 〇 X g下i 〇分鐘 而除去細胞，上清液保存於一 2 0°C，使用時取出。 溶血素抑制試驗 爲滴定血清溶血素的抑制效價，在深凹效價板（d e e -piell titer plates)上用 1 OmM Tr i s 緩衝生 理鹽水（pH7 · 4)作爲稀釋液，製備一連串兩倍稀釋 (7 5 " V )的試驗血清，接著，含25溶血單位的7 5 "又溶血素溶液加至每塊凹板，於2 0 °C下培養1 0分鐘 ，加入1 5 0 " $的2 % (洗過的）馬紅血球懸浮液，如 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3. 1〇,〇00 -16 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 494103 A7 B7 五、發明説明（Η) 上述溶血活性滴定完成後，試驗即完成。效價定義是最高 的稀釋對溶血至少5 0 %的抑制。專一性的豬血清 P 3 9 9對已純化的溶血素（得自鏈球菌型2 )抑制由不 同（血清型）品系所產生的溶血活性之容量，乃用於7 5 μ义 1 : 128預先稀釋的血清Ρ399和75"又未 稀釋的各種不同品系之培養基上清液於單一凹板中試驗。 假若血清Ρ 3 9 9比預免疫血清（pre-iminune serum)抑 制溶血超過5 0 %，則交叉中和作用非常明顯。溶血素效 價小於2 4的樣品由於最大溶血（預免疫血清）未達到背 景狀況（血清P 3 9 9 )的兩倍，所以在這試驗中沒有結 果。
實施例 II 溶血素的純化 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 5 Omj的品系P 1/7之隔夜培養基在1 2又 T 〇 d d H e w i 11培養液中3 7 °C無氧的狀況下生長6小時， 然後，細胞以連續流動離心法（C ο n t丨n u 〇 u s f 1 〇 w c e η I: r -i f u g a t i ο η )除去。培養基的上清液冷卻至4 °C通過 〇 · 8"Π1的濾器，然後在PTCG 1 0 0 0 0 N M W L濾器上濃縮至1 5 0 m j?。在通過〇 · 2 " m的 濾器後，每份1 m β塗敷於S u p e r 〇 s e — 1 2凝膠過濾管（ FPLC，Pharmacia)，然後在含 0.5M NaC 艾 之4 0 m M磷酸鹽緩衝的p Η 7 . 2生理鹽水下沖提，每 〇 · 收集一份，然後以SDS—PAGE，免疫塗 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3.10,000 -17 - 494103 A7 B7 五、發明説明（15) 墨及溶血素試驗分析。溶血的頂峰活性沖提於分段3 5 -4 5 (圖2)。由不同管路分段在SDS — PAGE和免 疫塗墨（immuno-blotting)方面的分析顯示，溶血活性 與約5 4 kD的單一抗原共同移動。溶血分段3 5 — 4 5 被共同使用，次要的污染物以選擇性沈澱法（5 0 %硫酸 銨4 °C下3小時）除去，離心後的小團物質再以2 0 m又 4 0 m Μ磷酸鹽緩衝的p Η 7 · 2生理鹽水重新使其懸浮 。在以 Coomassie Brilliant: blue (圖 1 )染色後，這最 後的製備物在SDS — PAGE約5 4 kD處顯示有如單 一多胜肽品種。在以/?—氣硫基乙醇（/? -mercaptoetha-nol)還原後，有約0 · 7 X 1 〇6溶血單位/毫克的專一 性活性。 蛋白質的決定 蛋白質濃度的測定是用Lowry等（Lowry et al; J. B i ο 1 . C h e m . 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 ( 1 9 5 1 ))提出的方法，以牛 的血清蛋白爲標準測定的。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 SDS — PAGE 和 Western 塗墨 · 在9 %的凝膠板上的S D S - PAGE及樣品的製備 ，基本上是以 Laemmli ( Laemmli, U.K.; Nature 227:680 -6 8 5 ( 1 9 7 0 ))所述的方法做的。在電泳後，多胜肽用（：〇〇-massie Brilliant blue R250 染色或在 Immobilon PVDF 膜 上作電塗墨（e 1 e c t r丨c - b 1 〇 t t e d )，塗墨點以多細胞的兔 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇 X 297公釐） 18 - 494103 A7 _____B7___ — 五、發明説明（ie) 子血清R2 0 8 9或多細胞系老鼠血清Ml 8 9 (看抗血 清部分），洗過後，以雙胺基聯苯胺爲基質，使用蘀菜（ 抗氧化酶-羊-抗-兔子）或羊抗老鼠結合物，則所結合 的抗體分別可見。 經不同處理後之溶血活性 所有的處理使用在4 OmM磷酸鹽緩衝的PH7 · 2 生理鹽水中，效價2 7 ，每份0 . 5 m j?的純化溶血素。 溶血素分別在—2 0 °C，4 °C，2 0 °C，3 7 °C和 1 Ο 0 °C經培養後，以溶血素分析測定溫度的作用。蛋白 酶一 K處理的作用之測定是取5 " β的濃縮蛋白溶液於 2 0 °C下培養1 0分鐘，接著於溶血素分析中測定殘餘的 溶血活性。 /?—氫硫基乙醇還原作用的試驗，是取5" j?的1 0 % (v/v ) —氫硫基乙醇溶液加入0 · 5m$的溶血 素溶液中，2 0 °C下培養1 0分鐘後，於溶血素分析中測 定其活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 過氧化氫氧化作用的試驗，是取5 " β的1 〇 %過氧 化氣溶液加入〇 · 5 m β的溶血素溶液中後，在2 0 °〇下 培養1 0分鐘，接著於溶血素分析中測定殘餘活性。 TLCK (N — A -對一甲苯酸胺—L 一離胺基酸氯 甲基酮，S i gma )對任何硫醇基的甲基化作用之測定是加 入 5"义的 1 〇%(w/v) TLCK 溶液於 〇 · 5mj? 的溶血素溶液中後，於2 0 °C下培養1 0分鐘，接著於溶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 -19 - 494103 A7 B7 五、發明説明（17) 血素分析中測定其殘餘的活性。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) 膽固醇作用的試驗是將1 0 v 5的5%膽固醇（於 1 0 %乙醇中）加入溶血素溶液中，接著在2 0 °C下培養 1 0分鐘，然後於溶血素分析中測定其殘餘的活性。 一些處理藉還原逆轉的可能性之試驗是加入過量的 一氫硫基乙醇（2 %最後濃度）於反應混合物的部分，接 著於2 0 °C下培養1 0分鐘，然後滴定其溶血活性。 各種不同處理對溶血活性的作用示於表1 ，結果顯示 ，溶血素對熱不穩定，且易感於蛋白酶- K的消化作用（ d i g e s t i ο η )，以過氧化氫的氧化及用T L C K的甲基化 。而且溶血活性受膽固醇的抑制，以/3 -氫硫基乙醇培養 後活性增强；當加入過量的/? -氫硫基乙醇於過氧化氫氧 化的製備物後，造成其溶血活性的恢復；當加入過量的 一氫硫基乙醇於TLCK處理過的製備物後，造成溶血活 性的部分恢復，這種部分的恢復可被解釋爲未與T L C Κ 反應的氧化硫醇基之存在，而溫度和膽固醇的作用無法因 加入/? 一氫硫基乙醇而恢復。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 各個試藥被省略或未加入溶血素的複製樣品顯示，在 溶血活性方面，對各種方法沒有作用，或各試藥對紅血球 有各自的作用。 不同種類的紅血球對血紅素的易感性 不同種類的紅血球的易感性（即人類、牛、火雞、鴿 子、老鼠、雞、天竺鼠、兔子、貓、狗和藉）之試驗，是 83. 3.10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -20 - 494103 A7 B7 五、發明説明（18 ) 將效價28的已純化之溶血素角0 · 1%/? —氫硫基乙醇 還原。此試驗基本上是在a溶血活性的滴定'下進行，所 有的紅血球顯示大約相等的溶血素易感性，效價自27 ( 老鼠、貓和火雞）至21Q (人）變化。 氣爲終端的胺基酸序列 得自品系P 1/7之已純化溶血素的前1 6個胺基酸 殘餘物被以如列於S E Q ID N〇：1 :的自動化
Edman變質來測定。 在不同的鏈球菌品系中，溶血素分子的流行件 所有有用的品系，包括血清型品系1 一 2 2 ，被培養 於T 〇 d d H e w 1 11培養液中，直到對數生長相的終點（5 — 6小時），然後以離心法除去細胞。培養基上清液中溶血 素分子的存在以溶血素分析和免疫塗敷測定。很多但並非 全部的品系顯示，在培養基上清液中有不同量的溶血活性 產生（表2 )。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 所有的溶血樣品（含低活性的樣品顯示受到膽固醇和 過氧化氫的抑制。而且，當加入過量的y? -氫硫基乙醇於 過氧化氫氧化的製備物中，導致溶血活性的完全恢復。 總之，大部分受試驗的品系顯示，在培養基上清液中 會產生溶血活性，這在免疫學上和生化，學上與溶血素是有 聯的，但對不相關的溶血素並未有徵候被發現。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3· 1〇,〇〇〇 -21 - 494103 A7 B7 五、發明説明（19)
實施例 III 疫苗 以經純化的溶血素爲基礎的4種疫苗，濃縮的培養基 上清液或共同使用的Superose— 1 2管柱分段1 9 一 3 1 ，和安慰劑疫苗乃製備自品系P 1/7。 爲作比較，製備了以往純化的E F爲基礎的疫苗，也 自品系B 1 0製備了以濃縮的培養基上清液爲基礎的疫苗 0 疫苗的製備如下： 已純化的溶血素（每mj? 4 0 v g蛋白質）以1 : 1 與D i 1 u v a c F 〇 r t e ( R >佐藥混合，直到得到均質的微乳化 物，這種疫苗稱爲VAC - S LY。 含濃縮培養基上清液之疫苗的製備乃是將p T C G濃 縮物的一部分（每含1 · 9mg蛋白質）以1 : ι與 D i 1 u v a c F 〇 r t e ( R )佐藥混合，直到得到均質的懸浮液， 這種疫苗稱爲VAC - CCS。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第三種疫苗的製備是將共同使用和濃縮的Superose — 1 2管柱分段1 9 一 3 1 (每含2mg蛋白質）以ι : 1與D i 1 u v a c F 〇 r t e ( R〉佐藥混合，直到得到均質的懸浮液 。管柱分段1 9 — 3 1含大部分的鏈球菌品系ρ ι / 7細 胞外產生的蛋白質，但基本上並不含溶血素，這種疫苗稱 之爲 VAC — SCF。 第四種疫苗是將培養基上清液經〇 . 2 #減器過減， 接著用6 0 %飽和硫酸銨於0 °C下沈澱1 6小時，經離心 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -22 - 494103 A7 B7 五、發明説明（2〇) 後，小團物質重新懸浮於P B S，以製備培養基上清.液的 1 0 0倍濃縮物。 安慰劑疫苗的製備方面，除將抗原溶液用4 0 mM磷 酸鹽緩衝的p Η 7 · 2生理鹽水外，製備方法如上，。 品系Β 1 0被用來製備上述以6 0 %飽和硫酸銨於〇 °C沈澱1 6小時爲基礎的疫苗。 品系P 1 / 7培養基上清液以硫酸銨漸減梯度作厭水 性交互作用色層析（Phenyl Sepharose phast flow column, high substituted) 後 ，得到 E F 疫苗 ，最後的已 純化之EF製備物（在透析和稀釋後）每約含1 5 0 μ § EF，以 SDS — PAGE 和 Coomassie 染色法爲 依據，則製備物有9 5 %以上的純度。 抗血清 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 已純化的溶血素之專一性多細胞系豬血清（P 3 9 9 )以下列方法得到。出生四週的豬用2 in j的疫苗V A C 一 S L Y經頸部肌肉注射後免疫，初次劑量兩週後，該豬 U相同給藥途徑追加相同劑量的疫苗，追加劑量兩週後， 該豬被抽血，而血清於- 2 0°C下保存至使用。 老鼠保茯作用之試驗 出生四週Balb-C老鼠分成四組，皮下接種0 . 5m义 VAC — CCS 疫苗、VAC — SCF 疫苗、VAC — s L Y疫苗或安慰劑疫苗，初次劑量兩週後，相同給藥途 83. 3.10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（21〇><297公釐） -23 - 494103 A7 B7 五、發明説明（21 ) 徑追加相同的疫苗，追加劑量兩週後，老鼠用品系 P 1/7 在含 4 X 1 09CFU/mj?的 Todd Hewitt 培養 液培養6小時之培養基作腹腔內的挑戰性試驗（0 · 5 m又），記錄7天內的死亡率。 結果 挑戰性試驗後，接種安慰劑疫苗的老鼠3天內死亡， 而接種VAC — CC S和VAC — S LY者則有完全的保 茯作用（表3 ) 。VAC - SCF則僅誘導部分的保茯作 用，這種疫苗含大部分品系P 1 / 7細胞外製造的抗原， •但基本上並沒有溶血素。 結論 因此，我們下一個結論：根據本發明，含已純化溶血 素的疫苗，在老鼠體內具有保茯作用，這顯示，溶血素是 一個毒性因子，這種單一毒性因子的中和作用足以保获老 鼠拮抗鏈球菌型2感染造成的傷害。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 老鼠異屬保茯作用的實驗 實驗動物 使用得老鼠Iffa Credo的BALC/c (出生四週） 實驗的建古 分成幾組的3 0隻老鼠以一次〇 . 4 m i?的量經皮下 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 -24 - 494103 A7 B7 五、發明説明（22) 接種疫苗或不接種疫苗（30隻老鼠的一組），如表六所 示。接種後四週，每組一半的老鼠以〇 ·5mj品系 B 1 0 (型1 )的六小時培養液做腹腔內挑戰性試驗，另 一半則用品系P 1 / 7 (型2 )，記錄7天內的死亡率， 當與品系P 1 / 7 (死亡率1 0 0 % )做比較，品系 B 1 0對老鼠的致病性較少（死亡率約2 0%)。因此， 雖然有B 1 0的挑戰組，生病老鼠的數目也做記錄，在挑 戰性試驗之前，仍要採血液樣本，然後將血清共同分組， 做免疫塗敷試驗。 結果 在溶血素的試驗中，品系B 1 0 (血清型1 )的培養 基上清液有2 9 · 5的溶血活性，而品系P 1 / 7 (血清型 2 )的培養基上清液有2 7的溶血活性。因此品系B 1 0 所產生的溶血活性比品系P 1 / 7.高約5倍。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 根據S D S — P A G E和Comassie染色法’顯亦品系 B 1 0和P 1 / 7的濃縮培養基上清液均含有5 4 k D蛋 白質（S L Y )，而根據品系B 1 0活性較高的結果，所 以品系B 1 0含較多的5 4 k D蛋白質。 純化的E F不含5 4 k D的蛋白質。 挑戰性試驗的結果，培養基上清液所含的疫苗，在老 鼠體內誘導出同屬和異屬的保茯作用（如表6 ) ° 當共同分組的血清用品系P 1 / 7或B 1 0的培養基 上清液爲抗原，於免疫塗敷中試驗時，結果顯示，兩種疫 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 494103 A7 B7 五、發明説明（23 ) 苗均誘導產生抗S LY抗體（表6 )，而且發現抗B1 0 培養基上清液比抗P 1 / 7培養基上清液有較强的反應， 在免疫塗敷的異屬試驗中（抗B 1 0培養基上清液拮抗 P1/7培養基上清液，而抗P1/7培養基上清液拮抗 B 1 0培養基上清液），5 4 kD的抗原爲主要或僅有的 反應性抗原。 以純化的E F接種的老鼠，雖然給予高劑量，且誘導 產生抗體，但顯示其對同屬或異屬的挑戰並沒有保茯的作 用（如表6 )。 結論： 兩種培養基上清液疫苗在老鼠中均可誘導出同屬和異 屬的保作用。在免疫塗敷中，當做異屬的試驗時，由5 4 k D抗原爲唯一或主要的反應性抗原之事實可明白地顯示 ，在老鼠中，S LY是交叉保茯的因子。 藉保茯作用的實驗 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 VAC — SLY，VAC — SCF和安慰劑疫苗以上 述的方法製備。 VAC — SLY 於 Diluvac Forte(R〉K 藥中含 2 0 "g/mj?已純化的溶血素，VAC — SCF (每mi?含 2mg蛋白質）於DiluVacFoΓte(R)佐藥中含大部分：鏈球菌 細胞外產生的蛋白質，.但基本上並沒有溶血素。 9隻出生四週的豬被分成三組，每組三隻，然後以2 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 494103 A7 B7 ___ 五、發明説明（24 ) m芡的VAC — SLY，VAC — SCF或安慰劑疫苗接 種（頸部肌肉注射），初次劑量兩週後，以相同的疫苗和 給藥途徑追加劑量，追加劑量兩週後，用Todd Hewitt培 養液中含品系P 1/ 7 4 X 1 〇9的六小時培養液，以靜 脈注射給藥（Q . 5 m 5 )進行挑戰性試驗。在初次劑量 和挑戰性試驗之前，採取血液樣本，血清保存於一 2 0°C 直至使用。 細菌的重新分離 在屍體檢驗時，拭子乃採自腦、肺和跗，若可能的話 ，應採自大部分受影響的區域，若有細菌的生長，則以其 大小記錄爲0 ，1 ，2 ，3 ，4。 結果 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經挑戰性試驗後，安慰劑疫苗接種的豬出現嚴重的臨 床症狀，特點是跋行（包括很多的關節），愁苦的外表和 高溫。三隻安慰劑疫苗接種的豬有兩隻出現神經方面的症 狀，且受到嚴重的影響，以致必須施予安樂死。V A C — S C F接種的藉顯τκ與控制組有相同的臨床症狀，但程度 較低，這組的豬中有一隻出現神經方面的症狀而必須施予 安樂死。VAC - S LY接種的豬較不受影響，這組的豬 只出現輕微的症狀，與另兩組比起來，這些症狀減弱的較 快。臨床的結果摘要於表4 ，經過解剖，安慰劑疫苗接種 的豬顯示有嚴重的多數關節炎且很關節受到影響（表5 ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10 〇〇〇 494103 A7 _B7_ 五、發明説明（25 ) ，VAC — SCF接種的豬也有多數關節炎，但程度較小 ;而VAC — SLY接種的豬大部分的關節都正常（表5 )° 鏈球菌被以不同的量分離自安慰劑疫苗接種的三隻豬 中的兩隻及三隻VAC — S C F接種的豬之不同組織.，但 並不分離自VAC — SLY接種的豬（、重新分離的總數 '下的數字，代表重新分離自各組所有動物的細菌相對量 )(表 5 ) 〇 腦樣本組織學上的檢查（表5 )顯示，2隻VAC — S C F接種的豬和2隻安慰劑疫苗接種的豬有腦膜炎。 結論 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 雖然以VAC- S LY接種的豬在幾天內顯示臨床症 狀，但和VAC - S CF或安慰劑疫苗接種的豬比起來， 這些症狀很明顯地較不嚴重，且期間較短_。在解剖方面， VAC—SLY接種的豬和VAC—SCF或安慰劑疫苗 接種的豬比起來，纖維蛋白性的關節炎較不嚴重且較少發 現。另外，2隻S C F接種的和2隻安慰劑接種的豬有腦 膜炎，而VAC - S LY接種者則沒有，而且VAC — S LY接種的豬之肺、關節和腦顯示是無菌的，而自另兩 組的這些器官可重新分離出來鏈球菌型2。免疫塗敷試驗 中，VAC — S LY接種的豬之血清（於挑戰性試驗當天 摘取）與5 4 k D的單一抗原帶反應，在整個培養基上清 液中確認溶血素是免疫性的，而溶血素的製備乃高度純化 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -28 - 494103 A7 B7 五、發明説明（26 ) 的0 結果顯示，鏈球菌溶血素是一種重要的因子，而這種 傷 的 染 感 菌 球 鏈 抗 拮 ο 而菌 茯細 保的 顯織 月 且 以 \ 足 官 用器 作同 和不 中除 的清 子且 因而 1 > 單害 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
83. 3. 10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -29 494103 A7 B7 五、發明説明（27 ) 表1 經各種處理後，純化的溶血素之活性 處理方式 處理時間 2 1 〇 g 溶血素 效價 加入2 %—氬硫 基乙醇後2 1 〇 g 溶血素效價 -2 0 °C 7天 7 NDa 4°C 7天 6 ND 2 0°C 7天 3 ND 3 7°C 7天 0 0 1 0 0°C 5分鐘 0 0 2 0°C 1 0分鐘 7 ND 蛋白酶一K ( 2 0 " g/m j?) 1 0 分鐘，2 0 °C 0 ND y?—氫硫基乙醇（0 · 1 %) 1 0 分鐘，2 0 °C 12 ND 過氧化氫（0 · 1 %) 1 0 分鐘，2 0 °C 0 12 T L C K ( 0 ·. 1 % ) 1 0 分鐘，2 0 °C 2 6 膽固醇（0 · 1 %) 1 0 分鐘，2 0 °C 0 0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 aND=未定 TLCK=(N—A—對一甲苯醯胺一L—離胺基酸氯甲基酮） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494103 A7 _B7 五、發明説明（28 ) 表2在不同的鏈球菌品系之培養基上清液中的溶血素樣分子之流行 2】og 0.1¾膽固 氧化/還原血清P399免疫塗敷中 品系 血清型參考品系（R)表現型a溶血素醇對溶血 後的免疫對溶血素5 4kD的 效價b 素的抑制b 減活b 的抑制b 存在與否b S428 1 R 5 + + 十 十 RS 2651 1/2 R 6 + + 十 十 R735 2 R MRP中EF- 5 + + 十 + P1/7 一 2 MRPW 8 + + 十 + 688/9 2 MR「EF+ 6 + + + + 4005 2 MRP 十 ΕΓ. 5 + 十 十 + D282 2 MRP+ΕΓ 7 + + + + 3921 2 MRP^EF' 4 + 十 - 3977 2 MRP^EF~ 2 + + # - 3889 2 MRP^EF' 6 + + 十 + T-15 2 MRP 十 ΕΓ 6 + + + + 4961 3 R 0 NDd ND ND - 6407 4 R 4 + 十 十 _ 11538 5 R 4 + 十 # 2524 6 R 2 + 十 # _ 8074 7 R 0 ND ND ND - 10681 7 0 ND ND ND - 10727 7 0 ND ND ND - 14391 7 2 ND ND ND - 14636 8 R 5 十 十 十 - NV92109 8 3 + + # - 22083 9 R 0 ND ND ND - 22089101 9 3 十 十 # - V 4417 10 R 2 + 十 # 十 12814 11 R 2 十 十 # - 8830 12 R 0 ND ND ND - 10581 13 R 2 十 十 # 一 ' 13730 14 R 6 + + + 十 ' 220891GV 14 6 十 十 十 + T639 15 R 6 + + + + 2726 16 R 0 ND ND ND - 93A 17 R 4 十 十 + - ' NT77 18 R 6 + + + + 42A 19 R 3 十 十 十 + 865192 20 R 0 ND ND ND - 14A 21 R 0 ND ND ND - 88/1861 22 R 2 十 十 # - a 以型2品系面言，如Vecht等（2 6，2 7 )所述的表現型被呈現出來。 b 溶血活性的滴定、〇 · 1 %膽固醇對溶血活性的抑制、過氧化氣和/?—氫硫基乙醇培養的溶血活性之可逆 減活、專一性豬血清P 3 9 9對溶血活性的抑制和用專一性老鼠血清所做的免疫塗敷，以在物質和方法處 所述的方式來做。 1 =已操作但因溶血活性太低而致沒有結果的試驗（看下一個） dND二未定 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 83. 3. !0,〇〇〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -31 - 494103 Α7 Β7 五、發明説明（29 ) 表3 根據以鏈球菌品系P 1 / 7作腹腔內的挑戰 性試驗之老鼠的存活率不同疫苗的免疫作用 疫苗種類 存活率 V A C 一 c c S a V A c - s c F b V A c - s L Y c 安 慰 劑 9/9 6/10 10/10 0/10 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 的疫苗 & .含濃縮培養基上清液的疫苗 b •含Superose管柱分段1 9 — e .含純化的s u i 1 y s丨η的疫苗 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 83. 3. 10,000 32 494103 A7 B7 五、發明説明（30 ) 表4 表示挑戰試驗當天及挑戰試驗後第1- 7天全部數量的臨床記錄之摘要表 疫苗種類 挑戰性試驗後各日的臨床記錄 0 la 2a 3a 4 a 5 6 7 合計 VAC-SLY 0 3 . 7 3 1 . 7 0 . 8 0 . 3 0 . 3 0 . 3 10.2 YAC-SCF 0 4 . 7 4 . 2 5 . 5 5 . 5 5 . 5 5 4 . 7 3 4.3 PLACEBO 0 5 . 7 5 . 8 6 7 . 8 7 . 7 7 . 3 7 . 7 4 8 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) a )第1- 4天的記錄代表兩次檢査的平均値（上午和下午） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 張 紙 I本 準 標 家 國 國 中 用 l.it (CNS )八4胁（210X297公釐） 83. 3. 10,000 -33 494103 A7 B7 五、發明説明（3l ) 表5 表示解剖當天的臨床特徵，解剖上的巨觀觀察，重新分離 的數據，及腦膜炎案例數目的摘要表 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 疫苗種類 解剖日爲挑戰性 試驗後的天數 關節炎總數 重新分離的 總數 腦膜炎 VAC-SLY 7 3.5 0 0 VAC-SCF 7 8 7 2 PLACEBO 4 12 9 2 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 83. 3. 10,000 34 494103 A7 B7 五、發明説明（32 ) "(尧姙涨 n»x 3) + (aa^^«xl) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B1◦上清液 P1/7上清液 Pl/7 EF 控制組 所含疫苗 »—» h-» \ ζ〇 公 CJ1 ^ 品系P1/7 挑戰性試 驗後的結 果 死亡數 CO 1—1 〇 * 〇〇 — <〇〇〇 Κ-* *<1 尧菸卽 ΓΤ S勒 湘§ 澉hi溪 s >H g ft 燁萍谇 g ^ S 5¾ ή m m m Η~ -h + + H--1—h + + + + θ彩芑a ^ ^ 您 td十 一· iprj π 〇> 〇M廿 S go - Εφ hr勒贫掛油 菏：^ θ 31淘 ^ φ ® hr S〇勒穹g ί« ^ Ftt g i 裔 Ξ B g i S M丑雄 + + + -+ + + + — 3 ? a 萌雄旨笤 B fflt ίί· S 〇M ~fr 為 S S Sa 、 -hr勒漭掛油 il 2 1淋贫 菏> q画δΐ 3 Φ孬 ^ Πα哳餌冲 tC g ή+ 3 S S & m 3 丑雄 »6勺一 \ 7aB 1 0 6 /」/«葫灕® 0 · 5 m jMiiss 禁舞14¾。ili - iDnn^ ^ \ 3W - ^srY^^EF^lts^^。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 83. 3. 10,000 -35 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494103 A7 B7 五、發明説明（33 ) 圖的說明 圖1 :低分子量標誌物的SDs — PAGE (A帶） ，濃縮的培養基上清液（B帶）絢化的鏈球菌溶血素（C 帶），和高分子量的標誌物。凝膠用Coomass丨e Brilliant B 1 u e 染色， 左側和 右側的 數字指 示標誌 蛋白質 的分子 量。 圖2 :鏈球菌型2品系P 1 / 7濃縮培養基上清液 S u p e r 〇 s e - 1 2色層析的乳化側面圖。實線：2 8 0 n m處 的吸收，點線：溶血素效價。 圖3 :標誌蛋白質的Western塗敷（A帶），品系 P 1 / 7的濃縮培養基上清液（B帶）和Superose-12管 柱各段（C帶至N帶）C帶：1 5分段，D帶：1 8分段 ，£帶：20分段，F帶：23分段，G帶·· 26分段， Η帶：28分段，I帶：30分段，J帶：32分段，K 帶：34分段，L帶：36分段，Μ帶：38分段，Ν帶 :4 0分段。 標誌蛋白質（Α 帶）用 Coomassie Briliiant $iue& 色；鏈球菌抗原（B帶至N帶）以兔子血清試驗，然後用 goat-anti- rabbit結合物染色，並以雙胺基聯苯胺爲基質 。標誌蛋白質的分子量示於左側。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-36 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494103 A7 B7 五、發明説明（34 ) 序列列出 (1 ) 一般的訊息： (i )申請人： (A )姓名：AKZO N.V. (B)街道：Velperweg 7 6 (C )城市：Arnhem (E )國家：荷蘭. (F) 郵政號碼（ZIP) :6824 B Μ (G) 電話：04120- 66381 (Η)傳眞機：04120- 50592 (I)TELEX :37503 akphanl (ii )發明名稱：拮抗鏈球菌感染的疫苗 (iii )序列號碼：1 (iv )電腦可讀型式： (A )媒介型式：Floppy disk (B) 電腦：IBM PC可互容。· (C) 操作系統：PC — DOS/
MS-DOS (D )軟體：Patientln Release #1.0，
Version #1.2δ (EPO) (2 ) S E Q ID N 〇：1 之訊息·· (i )序列特徵： (A ) : 1 6個胺基酸 (B )型式：胺基酸 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） 83. 3. 10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T
-37 - 494103 A7 B7 五、發明説明（35 ) (D )解剖學：直線 (ii)分子型式：蛋白質 (iii )假說：沒有 (v )斷片型式：氮爲終端的 (vi )最初的來源： (A )微生物：鏈球菌 (B )品系：P 1 / 7 (C )個別的分離物：一 (vii )直接的來源： (B )同本生物：一 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 1:
Asp Ser Lys Gin Asp lie Asn Gin Tyr Phe Gin Ser Leu Thr Tyr Glu 1 5 10 15 ϋϋ.^ϋ —^ϋ mi mi ml —4— ϋ.— n (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 • λ__ 83.3. 10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -38 -
Claims (1)
103 103
附件（A ): /·与， 一 *一* /\\ t： A8 B8 C8 D8 A、申請專利範圍 第83104343號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國9 1年5月修正 1 · 一種豬鏈球菌（Streptococcus suis)之多胜肽 ，其特徵爲該多胜肽分子量爲5 4 k D，當呈天然型式時 具有溶血活性，對熱敏感，對烷基化作用敏感，對Η 2〇2 敏感’可被硫醇激活，經Η 2 0 2處理後可被硫醇再激活， 具有 Ν —終端胺基酸序列As p — Se r — Ly s — Gin— Asp— I le— Asn — Gin — Tyr — Phe— G 1 n — Se r— Leu — Thr— Ty r — G 1 u ，且可被膽固醇所抑制。 2 · —種保護豬拮抗會產生豬溶血素（suilysin)之 諸鏈球菌感染的疫苗，其特徵爲含有申請專利範圍第1項 的多胜肽。 3 ·如申請專利範圍第2項的疫苗，其特徵爲另外包 含其它豬鏈球菌免疫原性蛋白質或免疫原性碳水化合物。 4 ·如申請專利範圍第2項的疫苗，其特徵爲該多胜 肽偶合至載劑。 5 ·如申請專利範圍第3項的疫苗，其特徵爲該多胜 肽偶合至載劑。 6 ·如申請專利範圍第4或5項之疫苗，其特徵爲該 載劑是一種莢膜多胜肽。 7·如申請專利範圍第2至5項中任一項之疫苗，其 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21〇><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 494103 A8 B8 C8 D8 六、申請鲁利範圍 特徵:i該疫苗包含佐劑。 8 ·如申請專利範圍第2至5項中任一項之疫苗，其 特徵爲該疫苗包含源自豬病原性病毒或微生物的其它免疫 原性蛋白質或免疫原性碳水化合物。 9 · 一種抗體，其可專一地與申請專利範圍第1項的 多胜肽反應。 1 0 · —種製備可保護哺乳動物拮抗豬鏈球菌感染之 疫苗的方法，包含將申請專利範圍第1項的多胜肽與製劑 上可接受的載劑，佐劑或稀釋劑混合。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）
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