CN113957057B - 一种杂交瘤细胞、能中和猪溶素的单克隆抗体及检测试剂盒 - Google Patents

一种杂交瘤细胞、能中和猪溶素的单克隆抗体及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞、能中和猪溶素的单克隆抗体及检测试剂盒，涉及单克隆抗体制备技术领域。本发明提供了由杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，经过检测单克隆抗体的Fab端和Fc端均已实现人源化，为IgG3亚型。该全人单克隆抗体对高致病猪链球菌产生的猪溶素(suilysin，SLY)具有中和作用。

Description

一种杂交瘤细胞、能中和猪溶素的单克隆抗体及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，具体而言，涉及一种杂交瘤细胞、能中和猪溶素的单克隆抗体及检测试剂盒。
背景技术
猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)在猪咽部以共生状态存在，有时可引起猪脑膜炎，偶尔引起人间感染。以序列7型S.suis的毒力最强。患者表现出链球菌中毒休克综合征(STSLS)，而国外早期报道病例主要表现为脑膜炎。郑翰等研究未发现S.suis存在超抗原(Bietal.,2015)，杜华茂等构建的猪溶素(Suilysin,SLY)的无毒突变体SLY(P353L)，发现其刺激小鼠的炎症反应显著下降，经主动免疫和被动免疫都表现出保护性抗原的特性(Duetal.，2009，2013；Xuetal.,2010)。林岚等(2019)和宋丽琼等(2020)相继发现SLY(P353L)突变体和缺失猪溶素基因的ST7型S.suis均不能激活NLRP3炎性小体；NLRP3炎性小体抑制物能显著降低ST7S.suis刺激巨噬细胞产生IL-1β的水平，也能显著提高攻击ST7S.suis的存活率(Linetal.，2019；Songetal.，2020)。
有报道指出，SLY作用于Occudin和ZonulaOccludens-1两种蛋白，从而损伤呼吸道上皮完整性，有利于S.suis侵袭入血液或淋巴系统(Bercieretal.,2020)。由于猪溶素能破坏呼吸道上皮的完整性、引发细胞因子风暴且损伤血脑屏障，因此，猪溶素是导致人感染S.suis，引发脑膜炎、STSLS，甚至死亡的重要致病因子。
猪溶素属于胆固醇依赖性细胞毒素家族(Cholesterol-dependent cytolysin,CDC)，具有CDC分子的典型结构特征，由四个结构域组成，其中第四结构域与细胞膜表面的胆固醇结合(ILY，VLY除外，结合CD59)，之后毒素分子在细胞膜表面寡聚化形成穹体或园环状结构，第三结构域发生构象改变，3个α螺旋结构转变为2个THM，第二结构域发生坍塌使THM插入细胞膜内，导致细胞裂解死亡。
据报道，多种天然化合物对猪溶素有抑制作用(GenLi,Shen,etal.,2019)(GenLi,Wang,etal.,2019)(G.Li,Wang,etal.,2019)。多种小分子、含胆固醇的脂质体对PLY有抑制作用(Andersonetal.,2018)。
目前还没有中和SLY的全人源化抗体。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杂交瘤细胞、能中和猪溶素的单克隆抗体及检测试剂盒以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种杂交瘤细胞，杂交瘤细胞于2021年8月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏物为：杂交瘤细胞株Anti-CDC 1-10F。保藏编号为CCTCC NO：C2021176。
上述杂交瘤细胞的制备包括：猪溶素无毒突变体rSLY(P353L)(Du et al.，2009，2013；Xu et al.,2010)与免疫佐剂(Sigma，USA)混合后接种转基因鼠CAMouse-HG4(免疫系统人源化，能产生人源免疫球蛋白，重庆金迈博科技有限公司)，4次免疫后血清抗体中和效价达1:6400以上。取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经HAT培养基筛选杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞分泌的抗体对于Suilysin(SLY)具有中和作用，命名为Anti-CDC 1-10F。该抗体可以阻断猪溶素的溶血作用。经过中和试验，结果表明本发明提供的抗体可以阻断有核细胞的裂解，抑制炎性细胞因子的产生。
本发明还提供了一种能中和猪溶素的单克隆抗体，其由上述的杂交瘤细胞产生。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗体与猪溶素抗原以KD≤1×10-12mol/L的亲和力结合。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗体还包括恒定区；
优选地，恒定区选自IgG3的恒定区；
优选地，恒定区的来源为大鼠、小鼠或人；
优选地，恒定区的来源为人。
本发明还提供了一种检测猪溶素的试剂或试剂盒，其包括上述能中和猪溶素的单克隆抗体。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测试剂包括与抗原结合的酶标二抗以及与标记的酶产生颜色反应的底物。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述能中和猪溶素的单克隆抗体预先包被于酶标板上。
上述的检测试剂盒用于定性或定量检测猪溶素致病因子。
可选的，酶标二抗为酶标羊抗鼠二抗。可选的，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗或碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗。
本发明还提供了一种载体，其含有编码上述抗体的核酸分子。
本发明还提供了一种重组细胞，其含有上述的载体。
本发明还提供了一种能中和猪溶素的单克隆抗体在制备治疗猪链球菌感染的药物中的应用。
该药物可以用于治疗感染猪链球菌的人群，例如用于治疗脑膜炎或链球菌中毒休克综合征。此外，上述的药物可以用于抑制溶血或用于抑制细胞因子风暴。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述的药物还包括药学上可接受的载体。
上述药学上可接受的载体选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。
上述的药物剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾和针剂中的任意一种。
本发明还提供了一种能中和猪溶素的单克隆抗体在制备抑制溶血药物或抑制细胞因子风暴药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株分泌全人IgG的杂交瘤细胞，它分泌的抗体对高致病猪链球菌产生的猪溶素(suilysin，SLY)具有中和作用。经过鉴定这抗体为IgG3亚型。本发明提供的抗体可以阻断毒素裂解细胞；本发明提供的抗体可以阻断毒素作用于免疫细胞，防止细胞因子风暴，可以开发为辅助治疗药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例2中Anti-CDC 1-10F细胞培养上清阻断rSLY溶血的结果图；
图2为单抗1-10F定量阻断rSLY的溶血作用的统计图；
图3为猪溶素单克隆抗体的类型鉴定结果图；
图4单抗1-10F与rSLY的结合曲线图(ELISA法)；
图5为单抗1-10F的亲和力曲线图(生物膜干涉技术)；
图6微量培养条件下Anti-CDC 1-10F细胞产生抗体的动力学图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了猪溶素单克隆抗体的筛选方法，其包括将重组猪溶素无毒突变体rSLY(P353L)(Duetal.，2009，2013；Xu et al.,2010)与免疫佐剂(Sigma，USA)混合后接种转基因鼠CAMouse-HG4(免疫系统人源化，产生人源免疫球蛋白，重庆金迈博科技有限公司)，4次免疫后血清抗体中和效价达1:6400以上。
将免疫后血清效价合格的小鼠用乙醚麻醉后处死，用75％乙醇浸泡30秒，在操净工作台无菌解剖，取脾脏置于无菌安瓶中，剪碎，加25％胰蛋白酶消化分钟，加含10％FBSDMEM分散细胞，并用DMEM洗2次，并计数。将制备的脾细胞与骨髓瘤细胞SP20按1:5混合，采用电融合法，实验条件为：纳秒融合参数为10KV/cm、200ns、8次，微妙融合参数为2.50KV/cm、20μs、1次。将电融合处理的细胞铺于半固体培养基中，37℃5％CO2条件下培养，7-10天后，挑取单克隆至HAT培养基。筛选得到一株分泌全人IgG的杂交瘤细胞，它所分泌的抗体对rSLY有中和作用，命名为Anti-CDC 1-10F。
杂交瘤细胞于2021年8月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏物为：杂交瘤细胞株Anti-CDC1-10F。保藏编号为CCTCC NO：C2021176。
通过间接ELISA与抑制rSLY(P353L)凝血试验进行双阳性筛选。将rSLY(P353L)按500ng/mL包被ELISA板，100μl/孔，按常规方法检测细胞培养液中的抗体，检测用酶标二抗为鼠抗人IgG Fab-HRP，按1:5000稀释,50μL/孔，37℃孵育2h，PBST洗涤3次；加入50μL TMB显色液，反应10min，加入2mmol/L硫酸50μL终止反应，立即测定OD450值。
在凝血板中加入25μL 1nmol/L的rSLY(P353L)，加入等体积的杂交瘤上清液，37℃孵育1h，每孔加入50μL 2％的红细胞悬液，37℃孵育30min。肉眼观察红细胞沉淀与凝集情况。
检测两者均为阳性的杂交瘤细胞进入下一环节鉴定。
实施例2
本实施例进行微量溶血阻断试验。
在凝血板中加入25μL浓度为16个溶血单位(HU)的rSLY，加入等体积的实施例1的杂交瘤上清液，37℃孵育1h，每孔加入50μL 2％的红细胞悬液，37℃静置孵育30min。以16HU为阳性对照，以生理盐水为阴性对照。结果表明杂交瘤细胞可以分泌对rSLY具有中和作用的抗体，见图1。
定量阻断溶血作用在两个毒素浓度下进行，分别为16HU、32HU，单抗1-10F浓度为500μg/mL。如上述方法作用后，于3000rpm/min离心10min，取上清测A595值，每孔3个重复。溶血率按公式计算：溶血率(％)＝(A595试验组-A595空白组)/(A595毒素组-A595空白组)，结果见图2A。图2A显示，在500μg/mL单抗1-10F对32HUrSLY的溶血阻断率为50％，对16HUrSLY溶血阻断率达78％。
有核细胞以THP-1株为例，将rSLY作系列稀释，加入THP-1中作用1小时，用LDH法测定rSLY的细胞毒性作用，并计算IC50值。将4 IC50，8IC50rSLY分别与100μg/mL单抗1-10F等体积混合均匀，37℃孵育1h，加入106THP-1悬液中，以Triton-100为阳性对照，PBS为阴性对照，均作三个重复孔，5％CO2，37℃作用1小时，实验重复三次。结果显示rSLY对THP-1的IC50值相当于400HU，用50μg/mL单抗1-10F处理2IC50rSLY后细胞毒性下降了50％，处理4IC50rSLY后细胞毒性下降了30％(见图2B)。
实施例3
本实施例进行抗体类型的鉴定。
采用抗体夹心法进行测定。将Mouse Anti-Human Kappa Light Chain；MouseAnti-Human IgG Fc；Mouse Anti-Human IgA；Mouse Anti-Human lambda light chain；Goat Anti-Mouse IgM；Goat Anti-Mouse IgG作100倍稀释，100μl/孔，4℃过夜。用0.5％BSA溶液于室温封闭2小时，加入100μL杂交瘤细胞培养液，以人血清和鼠血清为对照，均加入100μL，于37℃作用2h，充分洗涤后加入相应的酶标抗体，再于37℃作用1.5h,充分洗涤后加入50μL TMB显色液，反应10min，加入2mmol/L硫酸50μL终止反应，立即测定OD450值。结果表明该杂交瘤细胞分泌人IgG，轻链为Kappa。图3中，HK：Human Kappa chain,HL:Humanlight chain,HG:Human IgG,HA:Human IgA,MG:mouse IgG,MM:Mouse IgM。
结果如图3所示，Anti-CDC 1-10F细胞分泌的抗体为全人源化IgG型抗体。
酶标二抗的来源：
Mouse Anti-Human IgG Fab-HRP(No.A01855)购自南京金斯瑞生物科技有限公司，Mouse anti-Human Kappa Light Chain-HRP(NO.SA1-19155)、Mouse Anti-Human IgG1Fc-HRP(NO.A10648)，Mouse Anti-Human IgA(NO.SA1-72510)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Mouse Anti-Human lambda light chain-HRP(NO.ab99811)购自Abcam公司；Goat anti-Mouse IgM-HRP(NO.K0055G)购自北京索莱宝科技有限公司；Goat anti-MouseIgG-HRP(NO.ARG65350)购自上海帛龙生物科技有限公司。
实施例4
用ELISA方法进行鉴定抗体亚型。包被500ng/mL rSLY于4℃过夜，用BSA封闭后加入杂交瘤细胞培养液，于37℃作用2小时,充分洗涤后分别加入辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG1、anti-Human IgG2、anti-Human IgG3、anti-Human IgG4，按1:1000稀释。结果表明抗体1-10F为IgG3亚型。
实施例5
本实施例检测单抗1-10F与rSLY的半数有效结合浓度(EC50)。
先利用人IgG检测试剂盒测定杂交瘤上清液中抗体的含量，再包被500ng/mL rSLY于4℃过夜，用BSA封闭后加入系列梯度稀释后的杂交瘤细胞培养液，于37℃作用2h，充分洗涤后加入Mouse Anti-Human IgG Fc-HRP，于37℃作用1.5h，充分洗涤后加入50μL TMB显色液，反应10min，加入2mmol/L硫酸50μL终止反应，立即测定OD450值。结果曲线见图4，计算SLY的EC50值为60nmol/L。
实施例6
本实施例测定单克隆抗体1-10F与rSLY的亲和力。
用生物膜干涉技术测定抗原抗体的亲和力。配制平衡buffer(50mgBSA，0.4％吐温20，PBS 50mL)；用平衡buffer将抗原稀释至1000nM，按200ul/孔加入96黑色酶标板中；同时将杂交瘤上清按200μl/孔加入96孔板中；设置参数为：平衡120s；固化300s；再平衡120s；结合300s；解离500s。经计算，1-10F与rSLY亲和力值≤1×10-12M,曲线图见图5。
实施例7
本实施例研究了杂交瘤细胞1-10F产生抗体的动力学。
接种5×104个细胞(实施例1中的杂交瘤细胞1-10F)至24孔板，加入1mL的HT培养基，在5％CO2条件下，连续培养5天，每天采集50μL杂交瘤上清，用人IgG(ELISA)检测试剂盒测定杂交瘤细胞培养液中抗体的含量，绘制其产生抗体的动态。结果见图6。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，比如因为阻断细胞裂解而抑制炎症细胞因子的产生与防止炎症细胞因子风暴。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞于2021年8月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO： C2021176。
2.一种能中和猪溶素的单克隆抗体，其特征在于，其由权利要求1所述的杂交瘤细胞产生。
3.根据权利要求2所述的能中和猪溶素的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体与猪溶素抗原以KD≤1×10-12mol/L的亲和力结合。
4.根据权利要求2所述的能中和猪溶素的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体还包括恒定区。
5.根据权利要求4所述的能中和猪溶素的单克隆抗体，其特征在于，所述恒定区选自IgG3的恒定区。
6.根据权利要求5所述的能中和猪溶素的单克隆抗体，其特征在于，所述恒定区的来源为人。
7.一种检测猪溶素的试剂，其特征在于，其包括权利要求2-6任一项所述的能中和猪溶素的单克隆抗体。
8.一种检测猪溶素的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求2-6任一项所述的能中和猪溶素的单克隆抗体。
9.一种如权利要求2-6任一项所述的能中和猪溶素的单克隆抗体在制备治疗猪链球菌感染的药物中的应用。
10.一种如权利要求2-6任一项所述的能中和猪溶素的单克隆抗体在制备抑制猪溶素所致的溶血药物中的应用。
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