CZ289302B6 - Polypeptid Streptococcus suis, vakcína proti infekci Streptococcus suis a protilátky, reagující s polypeptidem Streptococcus suis - Google Patents
Polypeptid Streptococcus suis, vakcína proti infekci Streptococcus suis a protilátky, reagující s polypeptidem Streptococcus suis Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289302B6 CZ289302B6 CZ19941175A CZ117594A CZ289302B6 CZ 289302 B6 CZ289302 B6 CZ 289302B6 CZ 19941175 A CZ19941175 A CZ 19941175A CZ 117594 A CZ117594 A CZ 117594A CZ 289302 B6 CZ289302 B6 CZ 289302B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polypeptide
- vaccine
- streptococcus suis
- hemolysin
- vac
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 75
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 63
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 62
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 title claims abstract description 49
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title description 10
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 44
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 7
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 claims abstract description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 28
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 14
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 8
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 6
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 4
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 claims description 2
- 241000186810 Erysipelothrix rhusiopathiae Species 0.000 claims description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 claims description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 claims description 2
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 claims description 2
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 11
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 56
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 26
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 23
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 16
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 11
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 6
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 6
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 4
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 Bayol * or Markol * Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N Asp-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 206010036141 Polyserositis Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N Ser-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 108010068249 mitochondrial RNA-processing endoribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 208000008494 pericarditis Diseases 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- IBUIVNCCBFLEJL-UHFFFAOYSA-M sodium;phosphoric acid;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].OP(O)(O)=O IBUIVNCCBFLEJL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000457 tarsus Anatomy 0.000 description 1
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/825—Bacterial vaccine for porcine species, e.g. swine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Podstatu °e en tvo° polypeptid Streptococcus suis s N-termin ln sekvenc aminokyselin Asp-Ser-Lys-Gln-Asp-Ile-Asn-Gln-Tyr-Phe-Gln-Ser-Leu-Thr-Tyr-Glu, s molekulovou hmotnost 54 000 .+-. 3000, aktivovateln² thiolem, inhibovateln² cholesterolem, maj c hemolytickou · innost v nativn form , nebo st polypeptidu, schopn vyvolat imunitn odpov proti tomuto polypeptidu. Sou st °e en je tak vakc na, kter obsahuje svrchu uveden² polypeptid a protil tky, reaguj c s uveden²m polypeptidem.\
Description
Polypeptid Streptococcus suis, vakcína proti infekci Streptococcus suis a protilátky, reagující s polypeptidem Streptococcus suis
Oblast techniky
Vynález se týká polypeptidu Streptococcus suis, vakcíny k ochraně proti infekci Streptococcus suis u vepřů a protilátek, které reagují s polypeptidem Streptococcus suis.
Dosavadní stav techniky
Streptococcus suis byl identifikován jako hlavní příčina infekčního onemocnění vepřů, které je charakterizováno artritidou, septikemií, meningitidou, perikarditidou, endokarditidou, polyserositidou a/nebo pneumonií (Clifton-Hadley, F. A., Br. Vet. Joum. 139:1-5 1983), Vecht a další, Vet. Quarterly 7: 315-321 (1985), Windsor R.S.: Vet. Rec. 101:378-379 (1977), Higgins a další: Can. J. Vet. Res. 54: 170-173 (1990), Devriese a další: Vet. Rec. 127: 68(1990).
Nemocnost je zvláště vysoká u selat mezi 3-12 týdny věku (Windsor R. S. a Elliot S:D:: J. Hyg. Camb. 75: 69-78 (1975), Guise a další: Vet. Rec. 117:43-44 (1985), Hoffinan L. J. a Henderson L. M.: Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28*11 Ann. Proč. 201-210 (1985). Přestože se onemocněním mohou nakazit vepři jakéhokoliv stáří, mortalita vepřů starších než 14 týdnů je nízká (Guise a další: Vet. Rec. 117: 43-44 (1985), Hoffman L. J. a Henderson L. M.: L. M. Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28* Ann. Proč.: 201-210 (1985).
Čas od času se vyskytují také přípravy, při nichž uvedený mikroorganismus vyvolá onemocnění i u jiných živočišných druhů nebo u člověka (Devriese a další: Vet. Rec. 127:68 (1990), Hommez a další: Vet. Rec. 123: 626-627 (1988), Arends a další: Rev. Infect. Dis. 10: 131-137 (1988), Gottschalk a další: J. Clinic. Microbiol. 27: 2633-2636 (1989), Arends J. P. a Zanen H. C.: Rev. Infect. Dis. 10: 131-137 (1988)). K infekci v těchto případech obvykle dochází poraněním kůže.
Onemocnění S. suis bylo poprvé popsáno v Nizozemí (DeMoor C. E.: Antonie van Leeuwenhoek 29: 272-280 (1963)). Od té doby podala řada výzkumných pracovníků zprávu o výskytu této choroby v dalších evropských zemích a také v Kanadě, v USA a v Austrálii (Sanford E. a Tilker Μ. E.: J. Am. Vet. Med. Assoc. 23: 5-97 (1982), Perch a další: J. Clin. Microbiol. 17:993-996 (1983), Larson D. J. a Kott B.: Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28* Ann. Proč.: 121-130 (1985), Guise a další: Vet. Rec. 117: 43^14 (1985), Clifton-Hadley F. A.: Br. Vet. Joum. 139: Ιό (1983)).
Kmeny Streptococcus suis byly rozděleny na velké množství odlišných serotypů.
Stanovení serotypů je založeno na kapsulámím polysacharidovém antigenů (Koehne a další, Am. J. Vet. Res. 40: 1640-1641 (1979), Perch a další, J. Clin. Microbiol. 17: 993-996 (1983)).
Až dosud bylo na celém světě prokázáno 29 různých serotypů.
Určité serotypy však v některých zemích převažují. Ve skandinávských zemích převažuje serotyp 7, kdežto v Rakousku se nejčastěji vyskytuje serotyp 9. Nejrozšířenějším serotypem po celém světě je serotyp 2 (Gogolewski a další, Aust. Vet. J. 67: 202-204 (1987), Boetner a další, Acta Path. Microbial. Immunol. Scand. Séct. B 95: 233-239 (1987).
Málo je až dosud známo o patogenezi, faktorech virulence nebo protektivních antigenech Streptococcus suis.
Neexistuje proto žádné vodítko, jakých faktorů je zapotřebí pro účinnou vakcinaci proti patogenu.
Jednou zběžných cest pro výrobu vakcíny proti bakteriálnímu onemocnění je produkce a zkoušky s vakcínou, připravenou z celých buněk.
Tento postup byl použit také v případě Streptococcus suis a ukázalo se, že vakcína z celých buněk může zajistit účinnou ochranu vepřů proti napadení homologním organismem (Holt a další, Res. Vet. Sci. 48:23 - 27 (1990)).
Zdá se však pravděpodobné (Kebede a další, Vet. Microbiol 22: 249-257 (1990)), že ochrana, získaná při použití přípravků z celých buněk je specifická pro použití serotyp. Dalšími obecnými a dobře známými nevýhodami vakcín z celých buněk jsou a) nežádoucí reakce v místě a v blízkosti místa injekce a b) velké množství nespecifické bílkoviny, která je podána, ve srovnání s množstvím materiálu, který skutečně vyvolává ochranu.
Vzhledem ke skutečnosti, že v současné době je na bázi polysacharidového obalu známo již 29 odlišných serotypů Streptococcus suis, je zřejmé, že by vakcíny s použitím celých buněk měly obsahovat řadu serotypů k dosažení širokého spektra ochrany.
Taková vakcína byla připravena k ochraně lidí proti pneumonii, vyvolané streptokoky (Boulnois G. J.: Joum. Gen. Microbiol. 138:249-259 (1992)).
Tato vakcína obsahuje 23 polysacharidů z nejčastěji se vyskytujících serotypů. Vakcína však má kromě své složitosti ještě další podstatné nevýhody vzhledem k nízkému stupni imunogenity kapsulámích polysacharidů.
Z tohoto důvodu byly vyvíjeny snahy stanovit určující faktory, které pravděpodobně hrají úlohu v patogenezi onemocnění Streptococcus suis.
Byly popsány hemaglutininy a fimbrie jako potenciální virulence, avšak jejich přesná úloha nebo funkce, pokud jde o patogenezi, není známa a odpovídající molekuly nebo bílkoviny nebyly identifikovány (Jacques a další, J. Bacteriol. 172: 2833-2838 (1990), Gottschalk a další, J. Clin. Microbiol. 28: 2156-2158 (1990)).
Až dosud byly považovány za potenciální faktory virulence čtyři bílkoviny:
a) bílkovina s molekulovou hmotností 44 000 (Gottschalk a další, Vet. Microb. 30: 59-71 (1992)),
b) bílkovina s molekulovou hmotností 94 000 (Holt a další, J. Comp. Path. 1003: 85-94 (1990)),
c) bílkovina s molekulovou hmotností 110 000 (extracelulámí faktor), (Vecht a další, Infect. Immun. 59: 3156-3162 (1991), Vecht a další, Infect. Immun. 60: 550-556 (1992), Smith a Vecht, PCT-patentová přihláška WO 92/16630),
d) bílkovina s molekulovou hmotností 136 000 (Muraminidase Released Protein), Vecht adalší, Infect. Immun. 59: 3156-3162 (1991), Vecht a další, Infect. Immun. 60: 550-556 (1992), Smith a Vecht: PCT-patentová přihláška WO 92/16630).
Bílkovina s molekulovou hmotností 44 000 byla nalezena v patogenním kmenu S. Suis, serotyp 2 a bylo prokázáno, že není přítomna v nepatogenní mutantě tohoto kmene. Antiséra, produkovaná proti mutantě, neobsahující tuto bílkovinu s molekulovou hmotností 44 000 nebyla dostatečná pro dosažení úplné ochrany proti původnímu kmeni. Bílkovina se tudíž účastní vzniku virulence.
-2CZ 289302 B6
Antisérum, produkované králíkem proti bílkovině s molekulovou hmotností 94 000 ze S. suis, serotyp 2 zajišťuje u myší ochranu proti infekci homologním kmenem.
Bílkoviny s molekulovou hmotností 110 000 a 136 000 jsou přítomny ve vysoce patogenních kmenech a nelze je prokázat v nepatogenních kmenech, přičemž bílkovina s molekulovou hmotností 110 000 není přítomna u kmenů s nízkou patogenitou.
To by mohlo ukazovat na skutečnost, že bílkoviny s molekulovou hmotností 110 000 a 136 000 se účastní patogeneze. Na druhé straně nebyly prozatím uveřejněny žádné zprávy o výsledcích pokusů na izolátech těchto bílkovin v uvedeném smyslu.
Je tedy možno uzavřít, že prozatím pokud jde o potenciální faktory virulence, pouze bílkoviny s molekulovou hmotností 44 000 a 94 000 prokazatelně hrají úlohu v ochraně proti serotypů 2. Tuto ochranu bylo možno prokázat pouze u myší a při infekci homologním kmenem.
Mimoto byla prozatím přítomnost čtyř svrchu uvedených bílkovin prokázána pouze u kmenů
S. suis, serotyp 2.
Jak již bylo svrchu uvedeno, je vzhledem k velkému počtu různých serotypů zřejmé, že by antigen, nezávislý na serotypů a poskytující serologicky zkříženou ochranu byl nejvýhodnějším základem pro vakcínu. Takový antigen však dosud nebyl pro Streptococcus suis popsán.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří polypeptid Streptococcus suis s N-terminální sekvencí aminokyselin Asp-Ser-Lys-Gln-Asp-Ile-Asn-Gln-Tyr-Phe-Gln-Ser-Leu-Thr-Tyr-Glu, s molekulovou hmotností 54 000 ±3000, aktivovatelný thiolem, inhibovatelný cholesterolem, mající hemolytickou účinnost v nativní formě, nebo část polypeptidu, schopná vyvolat imunitní odpověď proti tomuto polypeptidu.
Všem hemolytickým toxinům je společný fenomen poškozování buněk savců rozrušením integrity membrány a/nebo její funkce. Toto rozrušení je patrně důsledkem tvorby pórovité struktury oligomemími formami toxinu, jakmile pronikne do buněčné membrány.
Bylo prokázáno, že hemolytický polypeptid podle vynálezu je toxin, aktivovaný thiolem. Toxiny, aktivované thioly jsou účinné pouze v redukovaném stavu a oxidací přechodně ztrácejí účinnost (Smyth C. J. a Duncan J. L.: Bacterial Toxins and Cell Membranes Jeljaszewicz J. and Wadstrom
T. (eds.) Londýn, Academie Press: 129-183 (1978)).
Přestože úloha thiolové skupiny prozatím není zřejmá, předpokládá se, že běží o důležitou část motivu sekvence, která je podstatná pro vznik poškození membrán.
Mechanismus cytolytického účinku některých skupin hemolyzinů předpokládá vazbu hemolytického polypeptidu na cholesterol v membráně savčí buňky. Jakmile je bílkovina navázána na buňku, vstupuje do dvojité vrstvy lipidů. Pak se vytvoří oligomemí hemolyziované komplex, o nichž se předpokládá, že jsou příčinou vzniku transmembránových pórů.
Bylo prokázáno, že hemolytická účinnost polypeptidu podle vynálezu náleží do skupiny hemolyzinů, kterou je možno inhibovat působením cholesterolu. Cholesterol patrně hraje klíčovou úlohu při vazbě hemolyzinů na cílové buňky. Byla navržena řada modelů, v nichž je cholesterol primárním místem vazby toxinu v buňce. Volný cholesterol je účinným inhibitorem cytolytické účinnosti, což může být vysvětleno tak, že v případě, že je místo vazby sterolu na
-3CZ 289302 B6 toxin obsazeno (volným) cholesterolem, nemůže se již dále vázat na cholesterol, vázaný na membránu (Boulnois a další, Mol. Microbiol. 5: 2611-2616 (1991)).
Pro hemolytický peptid podle vynálezu byla stanovena molekulová hmotnost 54 000. Tato molekulová hmotnost byla stanovena běžnými postupy při použití elektroforézy na polyakiylamidovém gelu, jak je popsáno v příkladu Π. Dráha C na obr. 1 znázorňuje čištěný polypeptid, ohraničený značícími molekulami (dráhy A a D).
Hemolytický polypeptid z jednoho kmene Streptococcus suis, kmen Pl/7, byl dále charakterizován stanovením svého N-terminálního řetězce aminokyselin. Řetězec č. 1 je uvedeným N-terminálním řetězcem tohoto polypeptidu. Hemolytické polypeptidy je možno izolovat z některých, avšak nikoliv ze všech kmenů Streptococcus suis. Mohou se rovněž vyskytovat určité modifikace vnukleových kyselinách genů pro hemolytické polypeptidy z různých kmenů Streptococcus suis. Tyto modifikace nemusí mít žádný vliv na řetězec aminokyselin odpovídajícího polypeptidu v případě, že modifikace je taková, že vzniká nový triplet, který je kódem pro tutéž aminokyselinu. K tomu dochází například v případě, že je G v tripletu CTG pro leucin nahrazeno C, takže vzniká jiný triplet, který je rovněž kódem pro leucin. Avšak v případě, že by došlo k náhradě T při použití C, byl by nový triplet kódem pro prolin místo pro leucin. To by již vedlo k variaci v řetězci aminokyselin hemolytického polypeptidu.
Variace v řetězci aminokyselin mohou být důsledkem náhrady jedné nebo většího počtu aminokyselin jejich funkčními ekvivalenty nebo vzácněji zavedením STOP-kodonu nebo v případě delecí/inzercí do nukleového řetězce může dojít k vypuštění nebo k zařazení některé aminokyseliny navíc do řetězce aminokyselin. Často je možno pozorovat náhradu určité aminokyseliny jejím funkčním ekvivalentem. Příklady byly popsány vNeurath a další, The Proteins, Academie Press, New York (1979), str, 14, obr. 6, jde mimo jiné o náhradu alaninu šermem, Ala/Ser nebo VAI/IIe, Asp/Glu a podobně. Kromě těchto variací, při nichž dochází k zařazení funkčního ekvivalentu původní aminokyseliny může docházet také k variacím, v nichž je aminokyselina nahrazena jinou aminokyselinou, která však není jejím funkčním ekvivalentem. Tato modifikace se však od předchozí liší pouze tím, že může vzniknout bílkovina s mírnou modifikací ve svém prostorovém rozložení.
Je samozřejmé, že variace řetězce nukleových kyselin v kódovém řetězci pro hemolytický polypeptid, při nichž dochází k takovým variacím v řetězci aminokyselin, při nichž je imunogenní účinnost polypeptidu zachována, spadají rovněž do rozsahu podstaty vynálezu.
Podstatu vynálezu tvoří rovněž vakcína, schopná zajistit ochranu vepřů proti infekci Streptococcus suis, která obsahuje svrchu uvedený hemolytický polypeptid nebo jeho část, schopnou vyvolat imunologickou odpověď na podání hemolytického polypeptidu S. suis. Takovou vakcínu je možno získat například při použití syntetického polypeptidu, napodobujícího polypeptid podle vynálezu nebo jeho část, schopnou vyvolat imunologickou odpověď proti hemolytickému polypeptidu S. suis.
Dalším možným způsobem získání takové vakcíny je biochemické čištění hemolytického polypeptidu z bakteriální kultury. Toho je možno dosáhnout například odstředěním bakterií, a použitím filtrace na sloupci gelu k oddělení hemolytického polypeptidu od zbývajících složek. Další čištění je možno uskutečnit například selektivním srážením při použití síranu amonného s následným odstředěním a rozpuštěním usazeniny ve vhodném pufru.
Vakcínu uvedeného typu je možno získat také molekulárním klonováním. Při použití tohoto postupu je možno klonovat řetězec nukleové kyseliny, která je kódem pro polypeptid podle vynálezu, nebo část tohoto řetězce, schopnou vyvolat imunologickou odpověď proti hemolytickému polypeptidu S. suis ve vektoru pro expresi a pak dosáhnout exprese ve vhodném
-4CZ 289302 B6 systému pro expresi. Produkt exprese je pak možno použít jako vakcínu. Možnými systémy pro expresi jsou bakterie, kvasinky, houby a další systémy na bázi buněk hmyzu a savců.
Dalším způsobem získání polypeptidů je klonování genetické informace pro polypeptid ve vhodném virovém vektoru a využití hostitelské buňky viru pro expresi bílkoviny. Takovým systémem může být například virus planých neštovic v kombinaci s buňkou savce, citlivou na polypeptid nebo baculovirus a buňky Spodoptera frugiperda. Čištěné nebo surové lyzáty buněk, obsahující polypeptid, produkovaný expresí je pak možno užít jako výchozí materiál pro vakcínu.
Další možnost spočívá ve využití virů, jejichž hostitelem je vepř, například viru Live Recombinant Carrier. LRC je virus, v němž byla klonována přídatná genetická informace. Živočichové, infikovaní tímto rekombinantním virem, budou produkovat imunogenní odpověď nejen proti imunogenům ve vektorovém viru, nýbrž také proti imunogenní části nebo částem polypeptidů nebo polypeptidů, pro něž byl navíc klonován v rekombinantním viru genetický kód.
Virus, který je zvláště vhodným materiálem je virus LRC, z organismů odlišných od vepře jde zejména o virus Pseudorabies. Tento virus byl již s úspěchem použit jako LRC na příklad pro kombinovanou vakcinaci proti pseudorabies a proti choleře vepřů.
Ve výhodném provedení obsahuje vakcína podle vynálezu ještě další imunogeny Streptococcus suis.
Bylo zjištěno, že antiséra proti S. suis, serotyp 2 - hemolytickému polypeptidů jsou reaktivní s hemolyziny všech kmenů S. suis, které hemolyziny vytvářejí, bez ohledu na jejich serotypy.
Tuto reaktivitu nebylo možno prokázat pro svrchu uvedené polypeptidy S. suis s molekulovými hmotnostmi 44 000,94 000,110 000 a 136 000.
Bez ohledu na tuto skutečnost má vakcína podle vynálezu, která navíc obsahuje ještě jeden z těchto polypeptidů nebo jakýkoliv jiný imunogen Streptococcus suis ještě lepší účinnost. Tato vyšší účinnost může být například důsledkem synergního účinku. Mohlo by tedy být dosaženo ještě účinnější vakcíny při použití nižšího množství antigenů.
V ještě výhodnějším provedení obsahuje vakcína podle vynálezu také nosič, vázaný na polypeptid podle vynálezu. Jako nosiče je možno užít různé molekuly, například haemocyaniny (Keyhole Limpet Haemocyanin), sérový albumin skotu nebo také složitější molekuly cukrů.
V ještě výhodnějším provedení obsahuje vakcína podle vynálezu kapsulámí polysacharid, vázaný na polypeptid podle vynálezu.
Postupy pro kovalentní vazbu polypeptidů na uhlohydráty byly popsány například v Dick W. E. a Beurt M. Contrib. Microbiol. Immunol. 10: 48-114 (1989).
Je zřejmé, že použití dalších typů nosičů nebo dalších způsobů vazby polypeptidů na uhlohydrát rovněž spadá do rozsahu vynálezu.
Podle dalšího možného provedení může vakcína podle vynálezu obsahovat antigeny dalších, pro vepře patogenních organismů a virů. Takovými organismy a viry jsou například Actinobacillus pleuropneumoniae, virus pseudorabies, virus chřipky vepřů, parvovirus vepřů, virus přenosné gastroenteritidy, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida a Bordetella brochiseptica.
Vakcína podle vynálezu může ve výhodném provedení rovněž obsahovat pomocný prostředek. Pomocné prostředky jsou obecně látky, které zvyšují imunologickou odpověď hostitele nespecifickým způsobem. V oboru je známa celá řada různých prostředků tohoto typu. Příkladem
-5CZ 289302 B6 může být Freundův kompletní a nekompletní pomocný prostředek, vitamin E, neiontové blokové polymery, muramyldipeptidy, Quill A , minerální oleje, jako Bayol* nebo Markol*, rostlinné oleje a některé z homopolymerů, jako Carbopol* nebo Diluvac* Forte.
Vakcína může také obsahovat tak zvaný „nosič“. Jde o látku, ke které polypeptid lne, aniž by byl na ni kovalentně vázán. Často užívanými nosiči jsou například hydroxid hlinitý, fosfát nebo oxid hlinitý, oxid křemičitý, kaolin a bentonit.
Specifickým nosičem, v němž je antigen částečně zapouzdřen, je prostředek ISCOM podle EP 109 942, EP 180 564 a EP 242 380.
Mimoto může vakcína obsahovat ještě jedno nebo větší počet smáčedel nebo emulgátorů, jako jsou například Spán nebo Tween.
Vakcína se ještě často mísí se stabilizátory, například pro ochranu citlivých polypeptidů, které by mohly podlehnout degradaci, k prodloužení skladovatelnosti vakcíny nebo pro snadnější lyofilizaci. Vhodnými stabilizátory jsou například SPGA (Bovamik a další, J. Bacteriology 59: 509 (1950)), uhlohydráty, jako sorbitol, mannitol, trehalóza, škrob, sacharóza, dextran nebo glukóza, dále bílkoviny, jako albumin nebo kasem nebo degradační produkty těchto látek a také pufry, například fosforečnany alkalických kovů. Mimoto může být vakcína uvedena do suspenze ve fyziologicky přijatelném ředidle.
Je samozřejmé, že je možno přidávat ještě jiné pomocné látky, nosná prostředí, ředidla, emulgátory nebo stabilizátory pro polypeptidy bez odchýlení se od smyslu vynálezu.
Podle dalšího možného provedení se užívají protilátky, monospecificky reaktivní s polypeptidem podle vynálezu nebo jeho antigenní části k dosažení pasivní imunity.
Monospecifícké protilátky jsou protilátky, které jsou specificky schopné reagovat s polypeptidem podle vynálezu s molekulovou hmotností 54 000 nebo sjeho antigenní částí, aniž by přitom reagovaly s ostatními antigeny Streptococcus suis.
Protilátky proti patogenům je možno s úspěchem použít k dosažení pasivní imunizace. Výhoda tohoto způsobu léčení spočívá v tom, že protilátky jsou k dispozici v okamžiku vzniku infekce. To znamená, že nedochází ke ztrátě času čekáním na aktivaci imunologického systému hostitele tak, aby došlo ke tvorbě dostatečného množství protilátky pro obranu organismu. Zvláště v případě, kdy k infekci již došlo a onemocnění postupuje, dochází podáním protilátek okamžitě k vyléčení živočicha a k odstranění toxinů i patogenních organismů. Vakcína, schopná chránit vepře proti onemocnění po infekci Streptococcus suis a obsahující protilátky proti hemolytickému polypeptidů tedy rovněž tvoří součást podstaty vynálezu.
Podle vynálezu je rovněž možno vyrobit vakcínu, schopnou chránit savce proti infekci Streptococcus suis. Postup spočívá vtom, že se polypeptid podle vynálezu zpracuje spolu s farmaceutickým nosičem, pomocnými látkami nebo ředidlem.
Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady.
-6CZ 289302 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad I
Bakteriální kmeny
S. suis, typ 2, kmeny P 1/7 a 688/9 byly dodány Dr. T. Alexanderem, University of Cambridge, UK. Typ 2, kmeny 4005, D282, 3921, 3977, 3889 a TI5 byly získány od Dr. U. Vechta, CDI-DLO, Lelystad, Nizozemí. Typ 7, kmeny 10 681, 10 727 a 14 391 byly získány od Dr. B. Nielsena, Intervet Scandinavia, Kodaň, Dánsko. Referenční kmeny 1 až 22 byly získány od Dr. J. Henrichsena, Statens Sérum Institute, Kodaň, Dánsko.
Kmen BIO, serotyp 1, je izolát ze současné doby, získaný od „Gezondheidsdient voor dieren, Oost-Nederland“, Deventer, Nizozemí.
Kmeny NV92109, serotyp 8, 22089, serotyp 9 a 220891, serotyp 14 jsou izoláty ze současné doby a byly získány od nemocných vepřů.
Bakteriální kultury
Bakteriální kmeny byly naočkovány na agar s ovčí krví a pěstovány 24 hodin při teplotě 37 °C. Pro stanovení produkce hemolyzinu bylo několik kolonií naočkováno do 100 ml bujónu Todd Hewitt (Difco) a pěstováno při teplotě 37 °C až do ukončení exponenciální fáze růstu (obvykle 5 až 6 hodin). Pak byly buňky odděleny odstředěním při 10 000 g po dobu 10 minut a supematant byl uložen až do použití při teplotě -20 °C.
Zkouška na inhibici hemolyzinu
Pro titraci séra na schopnosti způsobit inhibici hemolyzinu bylo připraveno sériové ředění séra (vždy dvojnásobné ředění, 75 mikrolitrů) ve vyhloubeních titračních ploten při použití fyziologického roztoku chloridu sodného s 10 mM tris pufru o pH 7,4 jako ředidla. Pak bylo do každého vyhloubení přidáno 75 μΐ roztoku hemolyzinu, který obsahoval vždy 25 hemolyzinových jednotek. Po inkubaci vzorků při teplotě 20 °C po dobu 10 minut bylo do každého vyhloubení přidáno ještě 150 μΐ 2% suspenze koňských erytrocytů a zkouška byla ukončena tak, jak bylo svrchu uvedeno pro titraci hemolytické účinnosti. Titr byl definován jako největší zředění, při jehož užití je ještě možno dosáhnout 50% inhibice hemolýzy. Schopnost specifického séra vepřů P399 proti čištěnému hemolyzinu (odvozenému od S. suis, typ 2) způsobit inhibici hemolytického účinku u kmenů různých serotypů byla zkoušena vždy v jediném vyhloubení při použití 75 mikrolitrů séra P399, předem zředěného 1 : 128 a 75 mikrolitrů nezředěného supematantu kultur různých kmenů. Zkouška pak byla ukončena svrchu uvedeným způsobem. Preimunní sérum, rovněž předem zředěné 1 : 128 bylo užito jako kontrola (maximální hemolýza). Zkříženou neutralizaci bylo možno pozorovat v případech, kdy sérum P399 způsobilo inhibici hemolýzy na více než 50 % ve srovnání s preimunním sérem. Vzorky s titrem pro hemolyzin nižším než je hodnota 2' neposkytovaly při této zkoušce žádné výsledky vzhledem k tomu, že maximální hemolýza (preimunní sérum) nedosahovala dvojnásobku hodnoty pozadí (sérum P399).
Příklad Π
Čištění hemolyzinu
250 ml kultury kmene Pl/7, pěstované přes noc bylo dále pěstováno za anaerobních podmínek 6 hodin ve 12 litrech Todd Hewittova roztoku při teplotě 37 °C a pak byly buňky tohoto kmene odděleny kontinuálním odstředěním. Supematant kultury byl zchlazen na teplotu 4 °C a pak se nechal projít filtrem 0,8 pm a byl zahuštěn na 150 ml na filtrech PTGG 10 000 NMWL. Po průchodu filtrem s průměrem otvorů 0,2 pm byly podíly roztoku po 1,0 ml naneseny na gel Superose-12 ve filtračním sloupci (FPL, Pharmacia) a sloupec byl vymýván roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem o pH 7,2 s obsahem 0,5 M NaCl. Byly odebírány frakce po 0,5 ml a analyzovány na SDS-PAGE a byl proveden imunoblot a test na hemolyzin. Nejvyšší hemolytickou účinnost bylo možno prokázat ve frakcích 35 až 45, jak je zřejmé z obr. 2. Analýzou různých frakcí ze sloupce SDS-PAGE a imunoblotovou reakcí bylo možno prokázat, že hemolytická účinnost putuje společně s antigenem s molekulovou hmotností přibližně 54 000, jak je zřejmé z obr. 3. Hemolytické frakce 35 až 45 byly spojeny a malé množství přítomných nečistot bylo odstraněno selektivním srážením při použití 50% síranu amonného v průběhu tří hodin při teplotě 4 °C. Po odstředění byla usazenina znovu uvedena do suspenze ve 20 ml chloridu sodného se 40 mM fosfátového pufru o pH7,2. Jako výsledná látka byl získán polypeptid, který měl po průchodu sloupcem SDS PAGE molekulovou hmotnost přibližně 54 000 při barvení modří Coomassie brilliant, jak je zřejmé z obr. 1, specifická účinnost byla po redukci beta-merkaptoethanolem v hemolytických jednotkách přibližně 0,7 x 106/mg.
Stanovení bílkoviny
Koncentrace bílkoviny byla měřena způsobem podle publikace Lowry a další, J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951) při použití sérového albuminu skotu jako standardu.
SDS-PAGE a Western blot
SDS-PAGE na 9% gelech a příprava vzorků byly uskutečněny v podstatě podle publikace Laemmli U.K., Nátuře 227: 680-685 (1970). Po elektroforéze byly peptidy barveny modří Coomassie brilliant R250 nebo byl proveden elektroblot při použití membrány Immobilon PVDF. V případě blotu byly jako sondy použity polyklonální králičí sérum R2089 nebo polyklonální myší sérum Ml89 (popsané v odstavci Antiséra). Po promytí byly vázané protilátky vizualizovány při použití konjugátu peroxidázy a kozího antiséra proti králičím tkáním nebo konjugátu s kozími protilátkami proti myším tkáním, jako substrát byl použit v obou případech diaminobenzidin.
Hemolytická účinnost po různém zpracování
Pro každé zpracování bylo použito 0,5 ml čištěného hemolyzinu v roztoku chloridu sodného se 40 mM fosfátovým pufrem o pH 7,2 při titru 27.
Vliv teploty byl měřen po inkubaci hemolyzinu při různých teplotách v rozmezí -20, 4, 20, 37 a 100 °C.
Vliv proteinázy K byl měřen tak, že bylo 5 mikrolitrů koncentrovaného roztoku enzymu (2 mg/ml) přidáno k 0,5 ml roztoku hemolyzinu a směs byla inkubována 10 minut při teplotě 20 °C. Pak byla měřena zbývající hemolytická účinnost.
Vliv redukce beta-merkaptoethanolem byl měřen tak, že bylo přidáno 5 mikrolitrů roztoku beta-merkaptoethanolu s koncentrací 10% objemových k 0,5 ml roztoku hemolyzinu a směs byla inkubována 10 minut při teplotě 20 °C, načež byla měřena hemolytická účinnost.
-8CZ 289302 B6
Vliv oxidace peroxidem vodíku byl měřen tak, že bylo přidáno 5 mikrolitrů 10% roztoku peroxidu k 0,5 ml roztoku hemolyzinu a pak byla směs inkubována 10 minut při teplotě 20 °C, načež byla měřena jakákoliv zbývající hemolytická účinnost.
Vliv alkylace jakékoliv thiolové skupiny působením TLCK (N-a-p-tosyl-L-lyzinchlormethylketon, Sigma) byl stanoven přidáním 5 mikrolitrů 10% roztoku TLCK k 0,5 ml roztoku hemolyzinu s následnou inkubací 10 minut při teplotě 20 °C. Pak byla měřena jakákoliv zbývající účinnost zkouškou na hemolyzin.
Vliv cholesterolu byl zkoumán přidáním 10 mikrolitrů 5% cholesterolu (v 10% ethanolu) k0,5 ml rožtoku hemolyzinu, pak byla reakční směs inkubována celkem 10 minut při teplotě 20 °C načež byla měřena jakákoliv zbývající hemolytická účinnost.
Reverzibilní redukce po určitém zpracování byla měřena tak, že k části reakční směsi byl přidán přebytek beta-merkaptoethanolu v konečné koncentraci 2 %, načež byla směs inkubována 10 minut při teplotě 20 °C a pak byla měřena zbývající hemolytická účinnost.
Účinek různého zpracování na hemolytickou účinnost je shrnut v tabulce 1. Výsledky ukazují, že hemolyzin je tepelně labilní, štěpí se proteinázou K, oxiduje se peroxidem vodíku a je možno jej alkylovat působením TLCK. Mimoto dochází k inhibici jeho hemolytické účinnosti působením cholesterolu. Po inkubaci s beta-merkaptoethanolem bylo možno prokázat zvýšení účinnosti a po přidání beta-merkaptoethanolu k přípravku, oxidovanému peroxidem vodíku došlo k obnovení hemolytické účinnosti. Po přidání přebytku beta-merkaptoethanolu k přípravku po působení TLCK došlo k částečnému obnovení účinnosti. Toto částečně obnovení účinnosti by patrně bylo možno vysvětlit přítomností oxidovaných thiolových skupin, které nereagovaly s TLCK. Účinek teploty a cholesterolu nebylo možno přidáním beta-merkaptoethanolu zrušit.
V podvojných vzorcích, v nichž bylo vynecháno reakční činidlo nebo hemolyzin, nebylo možno při zkouškách vzorků prokázat žádný vliv na hemolytickou účinnost nebo žádný vliv reakčních činidel bez hemolyzinu na erytrocyty.
Vnímavost erytrocytů různých druhů na hemolyzin
Byla zkoumána vnímavost erytrocytů z různých živočišných druhů, jako je člověk skot, krocan, holub, myš, kuře, morče, králík, kočka, pes a vepř, použit byl redukovaný (0,1% betamerkaptoethanol) přípravek čištěného hemolyzinu s titrem 28. Zkoušky byly prováděny tak, jak bylo popsáno u titrace hemolytické účinnosti. Podle výsledků těchto zkoušek byly všechny druhy eiytrocytů stejně citlivé na působení hemolyzinu. Titr se měnil v rozmezí 27 (myš, kočka, krocan) až 210 (člověk).
N-terminální řetězec aminokyselin
Prvních 16 zbytků aminokyselin čištěného hemolyzinu, získaného z kmene Pl/7 bylo stanoveno pomocí automatizované Edmanovy degradace, výsledky jsou dále uvedeny jako řetězec aminokyselin 1.
Prevalence molekul hemolyzinu u různých kmenů S. suis
Všechny dostupné kmeny včetně kmenů se serotypy 1 až 22 byly pěstovány v živném prostředí Todd Hewitt až do ukončení exponenciální růstové fáze (5 až 6 hodin). Pak byly buňky odděleny odstředěním. Přítomnost molekul hemolyzinu v supematantu kultury byla prokázána zkouškou na hemolyzin a pomocí imunoblotové reakce. Četné, avšak nikoliv všechny kmeny produkovaly různá množství hemolyzinu v supematantu svých kultur, jak je zřejmé z tabulky 2.
-9CZ 289302 B6
Všechny hemolytické vzorky včetně vzorků s nízkou účinností byly inhibovány působením cholesterolu a peroxidu vodíku. Mimoto vedle přidání přebytku beta-merkaptoethanolu ke vzorkům, oxidovaným peroxidem vodíku, k úplnému návratu hemolytické účinnosti.
Je tedy možno uzavřít, že většina kmenů produkovala hemolyzin v supematantu kultuiy, nebylo možno prokázat žádné známky produkce odlišných hemolyzinů.
Příkladní
Vakcíny
Z kmene PÍ/7 byly připraveny čtyři vakcíny na bázi Čištěného hemolyzinů, koncentrovaného supematantu kultury nebo na bázi spojených frakcí 19 až 31 ze sloupce Superose-12, mimoto byla vyrobena také vakcína jako placebo.
Pro srovnání byla připravena vakcína na bázi čištěného EF a další vakcína byla připravena z kmene BIO z koncentrovaného supematantu kultury.
Vakcína byla připravena následujícím způsobem:
Čištěný hemolyzin s obsahem 40 mikrogramů bílkoviny/ml byl v poměru 1: 1 smísen s pomocným prostředkem Diluvac ForteR za vzniku homogenní emulze. Tato vakcína byla označena VAC-SLY.
V případě vakcíny, obsahující koncentrovaný supematant kultury byla část koncentrátu PTCG s obsahem 1,9 mg bílkoviny/ml smísena v poměru 1 : 1 s pomocným prostředkem Diluvac Forte až do vzniku homogenní suspenze. Tato vakcína byla označena VAC-CCS.
Třetí vakcína byla připravena smísením spojených a koncentrovaných frakcí 19 až 31 ze sloupce Superose-12, obsahujících 2 mg bílkoviny/ml v poměru 1 : 1 s pomocným prostředkem Diluvac Forte za vzniku homogenní suspenze. Frakce 19 až 31 z uvedeného sloupce obsahovaly většinu extracelulámě produkovaných bílkovin kmene Pl/7 S. suis, byly však v podstatě prosté hemolyzinů. Tato vakcína byla označena VAC-SCF.
Čtvrtá vakcína byla připravena filtrací supematantu kultury přes filtr s průměrem otvorů 0,2 mikrometrů s následným srážením síranem amonným, nasyceným na 60 % po dobu 16 hodin při teplotě 0 °C. Po odstředění byla vytvořená usazenina znovu uvedena do suspenze v PBS za vzniku vzorku, který byl přibližně 100-krát koncentrovanější ve srovnání se supematantem kultury.
Vakcína, použitá jako placebo, byla připravena stejným způsobem jako svrchu s tím rozdílem, že roztok antigenu byl nahrazen fyziologickým roztokem chloridu sodného se 40 mM fosfátovým pufrem o pH 7,2.
Kmen BIO byl užit k přípravě vakcíny vysrážením síranem amonným, nasyceným na 60 % po dobu 16 hodin při teplotě 0 °C, jak bylo popsáno svrchu.
Vakcína EF byla získána po chromatografíi s hydrofobní interakcí (Phenyl Sepharose, vysoký stupeň substituce) při použití supematantu kultury kmene Pl/7 a klesajícího gradientu síranu amonného. Vzorek EF po konečném čištění (dialýza a ředění) obsahoval přibližně 150 mikrogramů EF/ml. Podle SDS-PAGE a barvení Coomassieovou modří měl vzorek čistotu vyšší než 95 %.
-10CZ 289302 B6
Antisérum
Specifické polyklonální sérum vepře (P399) proti čištěnému hemolyzinu bylo získáno následujícím způsobem: Vepř ve stáří 4 týdny byl imunizován nitrosvalově (šíje) při použití 2 ml vakcíny VAC-SLY. Po dvou týdnech bylo provedeno přeočkování stejným množstvím vakcíny, podané stejným způsobem. Po dalších dvou týdnech byla odebrána krev, která pak byla skladována až do použití při teplotě -20 °C.
Zkouška na očkování myší
Myši kmene Balb-c ve stáří 4 týdnů byly rozděleny do 4 skupin a očkovány podkožním podáním vakcíny, a to 0,5 ml vakcíny VAC-CCS, VAC-SCF, VAC-SLY nebo placebem. Po dvou týdnech byla zvířata přeočkována stejným způsobem. Po dalších dvou týdnech byla intraperitoneálně podáno 0,5 ml 6 hodin staré kultury kmene Pl/7 v Todd-Hewittově živném prostředí, obsahujícím 4 x 109 CFU/ml. Pak byla zaznamenávána po dobu 7 dnů mortalita myší.
Výsledky
Myši, jimž bylo podáno placebo, uhynuly do tří dnů, kdežto myši, očkované vakcínami VACCCS a VAC-SLY byly zcela chráněny, jak je zřejmé z tabulky 3. Vakcína VAC-SCF poskytovala pouze částečnou ochranu. Tato vakcína obsahovala většinu extracelulámě produkovaných antigenů kmene Pl/7, avšak byla v podstatě prostá hemolyzinu.
Závěr
Z toho, co bylo uvedeno, je možno uzavřít, že vakcína, obsahující čištěný hemolyzin podle vynálezu chrání myši před infekcí. Z toho vyplývá, že hemolyzin je faktorem, určujícím virulenci a že neutralizace tohoto jediného faktoru virulence stačí k ochraně myší proti zhoubným účinkům infekce S. suis, typ 2.
Pokus s heterologní ochranou myší
K pokusu byly použity myši kmene Balb/c ve stáří čtyř týdnů (Iffa Credo).
Uspořádání pokusu
Skupiny 30 myší (2 x 15) byly očkovány jednou podkožní dávkou 0,4 ml vakcíny nebo nebyly vůbec očkovány (jedna skupina 30 myší), jak je zřejmé z tabulky 6. Čtyři týdny po očkování bylo polovině myší ve skupině intraperitoneálně podáno 0,5 ml 6 hodin staré kultury kmene BIO (typ 1), druhé polovině myší bylo podáno stejné množství kultury kmene Pl/7 (typ 2).
Mortalita myší byla zaznamenávána v průběhu 7 dnů. Kmen BIO je pro myši méně patogenní (mortalita přibližně 20 %) než kmen Pl/7 (mortalita 100 %). Z tohoto důvodu byl u skupiny, jíž byla podána kultura kmene BIO, zaznamenáván také počet myší, u nichž došlo k projevům onemocnění. Těsně před podáním kultur byly odebrány vzorky krve a směs sér byla podrobena imunoblotové zkoušce.
Výsledky
Při zkoušce na hemolyzin měl supematant kultury kmene BIO (sérotyp 1) hemolytickou účinnost 29,5, kdežto supematant z kultury kmene Pl/7 (sérotyp 2) měl tuto účinnost velikosti 27. To znamená, že kmen BIO produkoval přibližně 5x vyšší množství hemolytické účinnosti než kmen Pl/7.
-11CZ 289302 B6
Na základě SDS-PAGE a barvení Coomassieovou modří je zřejmé, že oba koncentrované supematanty kultur kmenů BIO a P1/7 obsahovaly bílkovinu s molekulovou hmotností 54 000 (SLY) a že koncentrovaný supematant kultury kmeny BIO obsahoval větší množství této bílkoviny, což je v souladu sjeho vyšší účinností. Čištěný EF neobsahoval žádnou bílkovinu s molekulovou hmotností 54 000.
Po podání kultury patogenních kmenů se ukázalo, že obě vakcíny, obsahující supematant kultury vyvolávaly homologní i heterologní ochranu myší, jak je zřejmé z tabulky 6. V případě, že byly vzorky sér ze skupin po jejich slití zkoušeny imunoblotovou technikou při použití supematantu kultury kmene Pl/7 nebo BIO jako antigenu, bylo možno prokázat, že obě vakcíny na bázi supematantu kultur vyvolávaly tvorbu protilátek proti SLY, jak je zřejmé z tabulky 6. V případě protilátek proti supematantu kultury BIO bylo možno prokázat silnější reakci než v případě kmene Pl/7. Při heterologních zkouškách imunoblotovou technikou (supematant proti BIO a supematant Pl/7 nebo supematant proti Pl/7 a supematant BIO) bylo zřejmé, že antigen s molekulovou hmotností 54 000 je hlavním nebo jediným reaktivním antigenem.
Myši, očkované čištěným EF nebyly ani po podání vysokých dávek chráněny proti heterologní nebo homologní infekci, přestože došlo ke tvorbě protilátek, jak je zřejmé z tabulky 6.
Závěr:
Obě vakcíny na bázi supematantu kultur poskytovaly homologní i heterologní ochranu očkovaným myším. Skutečnost, že antigen s molekulovou hmotností 54 000 je jediným nebo alespoň hlavním reaktivním antigenem při heterologní imunoblotové zkoušce jasně prokazuje, že SLY je faktorem, jímž je možno u myší dosáhnout zkřížené ochrany.
Očkování vepřů
Vakcíny VAC-SLY, VAC-SCF a placebo byly připraveny svrchu uvedených způsobem.
Vakcína VAC-SLY obsahovala 20 mikrogramů/ml čištěného hemolyzinu v pomocném prostředku Diluvac Forte. Vakcína VAC-SCF obsahovala 2 mg bílkoviny/ml, šlo o většinu extracelulámě produkované bílkoviny Streptococcus suis v pomocném prostředku Diluvac Forte, vakcína však byla v podstatě prostá hemolyzinu.
Devět vepřů ve stáří 4 týdnů bylo rozděleno do tří skupin po třech vepřích a skupiny pak byly očkovány nitrosvalově do šíje vždy 2 ml vakcíny VAC-SLY, VAC-SCF nebo placebem. Dva týdny po prvním očkování byla zvířata přeočkována stejným způsobem při použití téhož množství vakcín. Dva týdny po přeočkování bylo zvířatům podáno nitrožilně 0,5 ml 6 hodin staré kultury kmene Pl/7 vTodd Hewittově roztoku, materiál obsahoval 4x 109CFU/ml (4). Těsně před prvním očkováním a před nitrožilním podáním kultury byly odebrány vzorky krve, sérum bylo uloženo při teplotě -20 °C až do použití.
Opětná izolace bakterií
Z uhynulých zvířat byla odebrána tkáň mozku, plic a tarsu, pokud možno z nej postiženějších částí. Bakteriální růst byl hodnocen stupnicí 0,1,2,3 a 4 podle intenzity růstu.
Výsledky
Po podání kultury patogenního mikroorganismu se u vepřů, očkovaných placebem objevily závažné klinické příznaky, a to záněty kloubů, vysoká teplota a chorobný vzhled. U dvou ze tří vepřů, očkovaných placebem došlo k rozvoji neurologických příznaků, které byly tak závažné, že zvířata bylo nutno usmrtit. U zvířat, očkovaných vakcínou VAC-SCF, se vyvinuly stejné klinické příznaky jako u kontrol, avšak v menším rozsahu. U jednoho vepře z této skupiny došlo
-12CZ 289302 B6 k rozvoji neurologických příznaků a zvíře muselo být usmrceno. Zvířata, očkovaná vakcínou VAC-SLY, byla postižena nejméně. Projevily se pouze mírné příznaky onemocnění, které vymizely rychleji než projevy onemocnění u ostatních skupin. Výsledky klinických pozorování jsou shrnuty v tabulce 4. Jak je zřejmé z tabulky 5, bylo možno při nekropsii vepřů, očkovaných placebem, pozorovat těžkou polyartritidu, zasažena byla většina kloubů. U vepřů, očkovaných vakcínou VAC-SCF, došlo rovněž k polyartritidě, avšak v menším rozsahu, kdežto většina kloubů u vepřů, očkovaných vakcínou VAC-SLY měla normální vzhled, jak je zřejmé z tabulky 5.
Streptococcus suis byl zpětně izolován u dvou ze tří vepřů, očkovaných placebem, a to z různých tkání, a také u všech vepřů, očkovaných vakcínou VAC-SCF, avšak mikroorganismus nebyl izolován u žádného z vepřů, očkovaných vakcínou VAC-SLY. Údaje, uvádějící relativní množství bakterií, reizolovaných z celkového množství zvířat v každé skupině jsou shrnuty v tabulce 5.
Histologické zkoumání vzorků mozku (tabulka 5) prokázalo meningitis u dvou vepřů, očkovaných vakcínou VAC-SCF a u dvou vepřů, očkovaných placebem.
Závěr
Přestože se u vepřů, očkovaných vakcínou VAC-SLY, objevily v průběhu několika dnů klinické příznaky, byly tyto příznaky méně závažné a měly kratší trvání ve srovnání s projevy, které se vyvinuly u vepřů po vakcinaci vakcínou VAC-SCF nebo placebem. Při nekropsii byl zánět kloubů méně častý a méně závažný u vepřů, očkovaných vakcínou VAC-SLY ve srovnání se zvířaty, očkovanými vakcínou VAC-SCF nebo placebem. Mimoto se u dvou vepřů po vakcinaci pomocí vakcíny VAC-SFC a u dvou vepřů, očkovaných placebem vyvinula meningitis, kdežto u žádného z vepřů, očkovaných vakcínou VAC-SLY, k projevům meningitidy nedošlo. Mimoto byly plíce, klouby a mozková tkáň vepřů, očkovaných vakcínou VAC-SLY zřejmě sterilní, kdežto z většiny těchto orgánů u obou ostatních skupin byl reizolován Streptococcus suis, typ 2. Při imunoblotové zkoušce reagovala séra vepřů, očkovaných vakcínou VAC-SLY (odebraná v den podání kultury patogenu) s pásem pro jediný antigen s molekulovou hmotností 54 000 v celém supematantu kultury, což potvrzuje, že hemolyzin je imunogenní a že užitý hemolyzin byl vysoce čistý.
Výsledky prokazují, že hemolyzin Streptococcus suis je důležitý faktor a že neutralizace tohoto faktoru je dostatečný pro ochranu vepřů před nepříznivými vlivy infekce Streptococcus suis a k zábraně průniku bakterií do různých orgánů a tkání.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je ve dráze A při elektroforéze na SDS-PAGE znázorněno značení sloučeninou s nízkou molekulovou hmotností, ve dráze B je nanesen koncentrovaný supematant kultury, ve dráze C čištěný hemolyzin Streptococcus suis a ve dráze D jsou uloženy značící látky s vysokou molekulovou hmotností. Gel byl barven briliantovou modří Coomassie. Číslování na pravé a levé straně označuje molekulovou hmotnost značících bílkovin.
Na obr. 2 je znázorněno chování emulze koncentrovaného supematantu kultury S. suis, typ 2, kmen Pl/7 po chromatografii na Superose-12. Pevná čára: absorpce při 280 nm, přerušovaná čára: titr hemolyzinu.
Na obr. 3 je znázorněn Western blot značících bílkovin (dráha A), koncentrovaný supematant kultury kmene Pl/7 (dráha B) a frakce ze sloupce Superose-12 (dráhy C-N). Dráha C: frakce 15, dráha D: frakce 18, dráha E: frakce 20, dráha F: frakce 23, dráha G: frakce 26, dráha H: frakce
-13CZ 289302 B6
28, dráha I: frakce 30, dráha J: frakce 32, dráha K: frakce 34, dráha L: frakce 36, dráha M: frakce 38, dráha N: frakce 40.
Značící bílkoviny (dráha A) byly barveny při použití briliantové modři Coomassie. Pro antigeny S. suis (dráhy B-N) bylo jako sonda použito králičí sérum a pak bylo provedeno barvení při použití konjugátu kozího séra proti králičím tkáním a diaminobenzidinu jako substrátu. Molekulová hmotnost značících bílkovin je uvedena na levé straně.
Charakterizace řetězců
1) obecná informace
1) přihlašovatel:
A) jméno: AKZO N.V.,
B) ulice: Velperweg 76
C) město: Amhem
E) stát: Nizozemí
F) poštovní kód (ZIP): 6824 BM
G) telefon: 04120-66381
H) telefax: 04120-50592
I) telex: 37503 akpha nl ii) Název vynálezu: Vakcína proti infekci Streptococcus suis.
iii) Počet řetězců: 1 iv) Forma, odečitatelná počítačem:
A) Typ prostředí: Floppy disk
B) Počítač: IBM PC-kompatibilní
C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS
D) Software: Patentln Release 1,0, Verse 1,25 (EPO)
2) Informace pro řetězec č. 1:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 16 aminokyselin
B) Typ: aminokyseliny
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: bílkovina iii) Hypotetický řetězec: 0
v) Typ fragmentu: N-terminální vi) Původní zdroj:
A) Organismus: Streptococcus suis
B) Kmen: Pl/7
C) Jednotlivý izolát: - vii) Použitý zdroj:
B) Klon: -14CZ 289302 B6 xi) Popis řetězce č. 1:
Asp Ser Lys Gin Asp Ile Asn Gin Tyr Phe Gin Ser Leu Thr Tyr Glu 51 5 10 15
Tabulka 1
Účinnost čištěného hemolyzinu po různém zpracování
| zpracování | doba zpracování | 21og titru hemolyzinu | 21og titru hemolyzinu po přidání 2% merkaptoethanolu |
| -20 °C | 7 dnů | 7 | NDa |
| 4°C | 7 dnů | 6 | ND |
| 20 °C | 7 dnů | 3 | ND |
| 37 °C | 7 dnů | 0 | 0 |
| 100 °C | 5 min. | 0 | 0 |
| 20 °C | 10 min. | 7 | ND |
| proteináza K 20 pg/ml beta-merkaptoethanol | 10 min. 20 °C | 0 | ND |
| 0,1% | 10 min. 20 °C | 12 | ND |
| H2O20,l% | 10 min. 20 °C | 0 | 12 |
| TLCK.0,1% | 10 min. 20 °C | 2 | 6 |
| cholesterol 0,1% | 10 min. 20 °C | 0 | 0 |
a ND = nebylo stanoveno
-15CZ 289302 B6
Tabulka 2
Prevalence molekul s účinkem hemolyzinu v supematantech kultury různých kmenů S. suis
| kmen | serotyp | refer. kmen (R) | fenotyp“ | 21og titr hemolyzinb | inhib. hemolyzinu 0,1% cholest? | reverz. inakt. ox/red.b | inhib. hemolyzinu P399b séra | přítomnost materiálu mol hmot. 54000 v imunoblotub |
| S428 | 1 | R | 5 | + | + | + | + | |
| RS2651 | 1/2 | R | 6 | + | + | + | + | |
| R735 | 2 | R | MRP*EF | 5 | + | + | + | + |
| Pl/7 | 2 | MRP+EF+ | 8 | + | + | + | + | |
| 688/9 | 2 | MRP+EF+ | 6 | + | + | + | + | |
| 4005 | 2 | MRP+EF+ | 5 | + | + | + | + | |
| D282 | 2 | MRP*EF+ | 7 | + | + | + | + | |
| 3921 | 2 | MRP+EF | 4 | + | + | *C | — | |
| 3977 | 2 | MRP*EF | 2 | + | + | * | — | |
| 3889 | 2 | MRP’EF | 6 | + | + | + | + | |
| T-15 | 2 | MRP~EF | 6 | + | + | + | + | |
| 4961 | 3 | R | 0 | NDd | ND | ND | — | |
| 6407 | 4 | R | 4 | + | + | + | — | |
| 11538 | 5 | R | 4 | + | + | * | — | |
| 2524 | 6 | R | 2 | + | + | * | — | |
| 8074 | 7 | R | 0 | ND | ND | ND | — | |
| 10681 | 7 | 0 | ND | ND | ND | — | ||
| 10727 | 7 | 0 | ND | ND | ND | — | ||
| 14391 | 7 | 2 | ND | ND | ND | — | ||
| 14636 | 8 | R | 5 | + | + | + | — | |
| NV92109 | 8 | 3 | + | + | * | — | ||
| 22083 | 9 | R | 0 | ND | ND | ND | — | |
| 220891KM | 9 | 3 | + | + | * | — | ||
| 4417 | 10 | R | 2 | + | + | * | + | |
| 12814 | 11 | R | 2 | + | + | * | — | |
| 8830 | 12 | R | 0 | ND | ND | ND | — | |
| 10581 | 13 | R | 2 | + | + | * | — | |
| 13730 | 14 | R | 6 | + | + | + | + | |
| 220891GV | 14 | 6 | + | + | + | + | ||
| T639 | 15 | R | 6 | + | + | + | + | |
| 2726 | 16 | R | 0 | ND | ND | ND | — | |
| 93A | 17 | R | 4 | + | + | + | — | |
| NT77 | 18 | R | 6 | + | + | + | + | |
| 42A | 19 | R | 3 | + | + | + | + | |
| 865192 | 20 | R | 0 | ND | ND | ND | — | |
| 14A | 21 | R | 0 | ND | ND | ND | — | |
| 88/1861 | 22 | R | 2 | + | + | * | - |
Vysvětlivky k tabulce 2:
a pro kmeny typu 2 jsou fenotypy popsány v publikaci Vecht a další (26,27).
b Titrace hemolytické účinnosti, její inhibice 0,1% cholesterolem, reverzibilní inaktivace této účinnosti inkubací s peroxidem vodíku a beta-merkaptoethanolem a její inhibice specifickým
-16CZ 289302 B6 sérem vepře P399 a také imunoblotová zkouška s použitím specifického myšího séra Ml89 byly prováděny podle odstavce Materiály a metody.
c# = test byl proveden, avšak výsledek nebyl získán vzhledem k příliš nízké hemolytické účinnosti.
dND = nebylo stanoveno.
Tabulka 3
Účinek imunizace různými vakcínami na dobu přežití myší po intraperitoneálním podání S. suis, kmenPl/7
| vakcína | doba přežití |
| VAC-CCS3 VAC-SCFb VAC-SLY0 Placebo | 9/9 6/10 10/10 0/10 |
a Vakcína s obsahem koncentrovaného supematantu kultury. b Vakcína s obsahem frakcí 19 až 31 ze sloupce Superosy.
' Vakcína s obsahem čištěného suilyzinu.
Tabulka 4
Klinické hodnocení v den podání antigenu a 1 až 7 dnů po něm klinické hodnocení ve dnech po antigenu
| vakcína | 0 | la | 2a | 3a | 4a | 5 | 6 | 7 | celkem |
| VAC-SLY | 0 | 3,7 | 3 | 1,7 | 0,8 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 10,2 |
| VAC-SCF | 0 | 4,7 | 4,2 | 5,5 | 5,5 | 5 | 4,7 | 4,7 | 34,3 |
| Placebo | 0 | 5,7 | 5,8 | 6 | 7,8 | 7,7 | 7,3 | 7,7 | 48 |
a Hodnocení ve dnech 1 až 4 je průměrem ze dvou hodnocení, dopoledne a odpoledne.
Tabulka 5
Klinické příznaky v den disekce, makroskopická pozorování při disekci, reizolace a počet případů meningitidy
| Vakcína | disekce počet dnů po antigenu | celkové hodnocení artritidy | celkové hodnocení reizolace | počet případů meningitidy |
| VAC-SLY | 7 | 3,5 | 0 | 0 |
| VAC-SCF | 7 | 8 | 7 | 2 |
| Placebo | 4 | 12 | 9 | 2 |
-17CZ 289302 B6
Tabulka 6
Výsledky pokusu, při němž byly skupiny 15 myší očkovány jedním podkožním podáním 0,4 ml různých vakcín v pomocném prostředku GNE. 4 týdny po očkování bylo intraperitoneálně podáno 0,5 ml 6 hodin staré kultury kmene Pl/7 nebo BIO s obsahem 3 x 108 9 bakterií/ml. Před podáním byla odebrána krev a sérum bylo zkoušeno imunoblotem na protilátky proti SLY nebo EF při použití supematantú kultur Pl/7 nebo B10 jako antigenů
| vakcína s obsahem | mortalita po Pl/7 | výsledky mortalita | po BIO index* 3dny po podání | přítomnost SLYb | přítomnost protilátek proti SLY* Pl/7 BIO | přítomnost EFb | přítomnost protilátek proti EF® Pl/7 BIO |
| BIO sup. | 4 | 1 | 3 | ++ | ++ +++ | — | — — |
| Pl/7 sup. | 9 | 0 | 0 | + | + ++ | ++ | + |
| P1/7EF | 14 | 1 | 17 | - | — — | +++ | + |
| kontroly | 15 | 3 | 21 | - | - | - | - - |
a (počet uhynulých myší x 3) + (počet nemocných myší x 1) b Přítomnost ve vakcíně při použití SDS-PAGE a barviva Coomassie c Přítomnost ve spojeném séru imunoblotem při použití antigenů ze supematantú kultury.
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Polypeptid Streptococcus suis s N-terminální sekvencí aminokyselin Asp-Ser-Lys-GlnAsp-Ile-Asn-Gln-Tyr-Phe-Gln-Ser-Leu-Thr-Tyr-Glu, s molekulovou hmotností 54 000 ±3000, aktivovatelný thiolem, inhibovatelný cholesterolem, mající hemolytickou účinnost v nativní formě, nebo část polypeptidů, schopná vyvolat imunitní odpověď proti tomuto polypeptidů.
- 2. Vakcína pro ochranu vepřů proti infekci Streptococcus suis, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároků 1.
- 3. Vakcína podle nároku 2, vyznačující se tím, že navíc obsahuje ještě jiný imunogen Streptococcus suis.
- 4. Vakcína podle nároků 2a 3, vyznačující se tím,že polypeptid je vázán na nosič.
- 5. Vakcína podle nároku 4, vyznačující se tím, že jako nosič obsahuje kapsulámí polysacharid.
- 6. Vakcína podle nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že obsahuje ještě pomocný prostředek.
- 7. Vakcína podle nároků 2až 6, vyznačující se tím, že obsahuje další imunogen, odvozený od viru nebo mikroorganismu, patogenního pro vepře.
- 8. Vakcína podle nároku 7, vyznačující se tím, že jako další imunogen obsahuje imunogenní látku ze skupiny Actinobacillus pleuropneumoniae, virus pseudorabies, virus chřipky-18CZ 289302 B6 vepřů, parvovirus vepřů, virus přenosné gastroenteritidy, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida nebo Bordetella bronchiseptica.
- 9. Protilátky, monospecificky reaktivní s polypeptidem podle nároku 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93201401 | 1993-05-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ117594A3 CZ117594A3 (en) | 1995-02-15 |
| CZ289302B6 true CZ289302B6 (cs) | 2001-12-12 |
Family
ID=8213828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19941175A CZ289302B6 (cs) | 1993-05-17 | 1994-05-13 | Polypeptid Streptococcus suis, vakcína proti infekci Streptococcus suis a protilátky, reagující s polypeptidem Streptococcus suis |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5612042A (cs) |
| EP (1) | EP0626452B1 (cs) |
| JP (1) | JP3578799B2 (cs) |
| AT (1) | ATE183241T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ289302B6 (cs) |
| DE (1) | DE69419966T2 (cs) |
| DK (1) | DK0626452T3 (cs) |
| ES (1) | ES2137310T3 (cs) |
| GR (1) | GR3031698T3 (cs) |
| HU (1) | HU218154B (cs) |
| PL (1) | PL177219B1 (cs) |
| SK (1) | SK281324B6 (cs) |
| TW (1) | TW494103B (cs) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI93733C (fi) * | 1993-01-29 | 1995-05-26 | Kaarina Tikkanen | Streptococcus suis-bakteerin adhesiiniproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi |
| US5919466A (en) * | 1993-10-01 | 1999-07-06 | Gerbu Biotechnik Gmbh | Method for improving the yield of immunoantibodies in the vaccination of animals and humans |
| US6936259B2 (en) | 1995-06-08 | 2005-08-30 | University Of Saskatchewan | CAMP factor of Streptococcus uberis |
| AU709920B2 (en) * | 1995-06-08 | 1999-09-09 | University Of Saskatchewan | Camp factor of streptococcus uberis |
| US5863543A (en) * | 1996-06-05 | 1999-01-26 | University Of Saskatchewan | Camp factor of streptococcus uberis |
| ZA97452B (en) * | 1996-01-25 | 1997-08-15 | Trinity College Dublin | Streptococcus equi vaccine. |
| AU769539B2 (en) | 1999-01-29 | 2004-01-29 | Zoetis Services Llc | Adjuvants for use in vaccines |
| FR2791895B1 (fr) * | 1999-03-23 | 2001-06-15 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Utilisation de trehalose pour stabiliser un vaccin liquide |
| CA2881568C (en) * | 2000-10-27 | 2019-09-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b |
| NO318426B1 (no) | 2001-10-02 | 2005-04-18 | Neurozym Biotech As | Et materiale for a senke konsentrasjonen av patogene tarmpeptider |
| DE10239629A1 (de) * | 2002-08-23 | 2004-04-08 | Idt Impfstoffwerk Dessau-Tornau Gmbh | Nicht-rekombinate Subunit-Vakzine gegen Streptococcus suis-Infektionen des Schweines |
| RU2409385C2 (ru) * | 2006-03-30 | 2011-01-20 | Эмбрекс, Инк. | Способ иммунизации птицы против инфекции, вызванной бактериями clostridium |
| US7572457B2 (en) * | 2006-03-31 | 2009-08-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Use of Streptococcus suis 38 kDa polypeptide as an immunogen |
| JP5339243B2 (ja) * | 2008-04-24 | 2013-11-13 | 株式会社微生物化学研究所 | ストレプトコッカス・スイス感染症予防用ワクチン |
| TW201043242A (en) * | 2009-03-26 | 2010-12-16 | Intervet Int Bv | Vaccine for protection against Streptococcus suis bacteria of various serotypes |
| EP3319630A1 (en) | 2015-07-09 | 2018-05-16 | Intervacc AB | Vaccine against s.suis infection |
| CA3000201A1 (en) * | 2015-10-07 | 2017-04-13 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Streptococcus suis polysacchari de-protein conjugate composition |
| GB201703529D0 (en) * | 2017-03-06 | 2017-04-19 | Cambridge Entpr Ltd | Vaccine composition |
| CN113957057B (zh) * | 2021-11-16 | 2023-10-20 | 西南大学 | 一种杂交瘤细胞、能中和猪溶素的单克隆抗体及检测试剂盒 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5059419A (en) * | 1988-06-09 | 1991-10-22 | Grand Laboratories, Inc. | Streptococcus suis antiserum and its use in treating Streptococcus suis infections |
-
1994
- 1994-05-09 AT AT94201295T patent/ATE183241T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 DE DE69419966T patent/DE69419966T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-09 ES ES94201295T patent/ES2137310T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 EP EP94201295A patent/EP0626452B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 DK DK94201295T patent/DK0626452T3/da active
- 1994-05-13 US US08/242,406 patent/US5612042A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-13 CZ CZ19941175A patent/CZ289302B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-05-13 SK SK563-94A patent/SK281324B6/sk unknown
- 1994-05-13 TW TW083104343A patent/TW494103B/zh not_active IP Right Cessation
- 1994-05-16 PL PL94303482A patent/PL177219B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-05-16 HU HU9401511A patent/HU218154B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-05-17 JP JP10308094A patent/JP3578799B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-11-03 GR GR990402789T patent/GR3031698T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3578799B2 (ja) | 2004-10-20 |
| GR3031698T3 (en) | 2000-02-29 |
| HU9401511D0 (en) | 1994-08-29 |
| DE69419966T2 (de) | 2000-01-20 |
| SK56394A3 (en) | 1995-07-11 |
| ES2137310T3 (es) | 1999-12-16 |
| EP0626452B1 (en) | 1999-08-11 |
| EP0626452A1 (en) | 1994-11-30 |
| ATE183241T1 (de) | 1999-08-15 |
| US5612042A (en) | 1997-03-18 |
| HU218154B (hu) | 2000-06-28 |
| DK0626452T3 (da) | 2000-02-14 |
| DE69419966D1 (de) | 1999-09-16 |
| TW494103B (en) | 2002-07-11 |
| HUT69796A (en) | 1995-09-28 |
| PL177219B1 (pl) | 1999-10-29 |
| SK281324B6 (sk) | 2001-02-12 |
| JPH0710774A (ja) | 1995-01-13 |
| PL303482A1 (en) | 1994-12-12 |
| CZ117594A3 (en) | 1995-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ289302B6 (cs) | Polypeptid Streptococcus suis, vakcína proti infekci Streptococcus suis a protilátky, reagující s polypeptidem Streptococcus suis | |
| KR100361562B1 (ko) | 프로테이나제k에대해내성을갖는네이쎄리아메닝기티디스의표면단백질 | |
| USRE46285E1 (en) | Streptococcus suis polypeptides and polybnucleotides encoding same and their use in vaccinal and diagnostic applications | |
| CZ284538B6 (cs) | Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky | |
| JPH10504717A (ja) | 肺炎双球菌感染症に対する免疫化のための肺炎双球菌多糖−組み換えニューモリシン結合体ワクチン類 | |
| EP0656014B1 (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group b streptococcus; process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
| HU211031B (en) | Method for preparation of actinobacillus pleuropneumoniae vaccine | |
| US10261092B2 (en) | Cross-reactive determinants and methods for their identification | |
| Akkoyunlu et al. | The acylated form of protein D of Haemophilus influenzae is more immunogenic than the nonacylated form and elicits an adjuvant effect when it is used as a carrier conjugated to polyribosyl ribitol phosphate | |
| US6015889A (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group B streptococcus: process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
| Kasten et al. | Lack of protection against avian cholera by vaccination with recombinant P6-like protein from Pasteurella multocida | |
| AU681130C (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity tomany strains of the group B streptococcus; process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
| KR100216390B1 (ko) | 헤모필루스 외부막 단백질 | |
| NZ272660A (en) | Pasteurella multocida antigens, antibodies, their production and use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20070513 |