JP2756368B2 - 組換えポリペプチド及びペプチド、それをコードする核酸並びに結核の診断におけるこれらのポリペプチド及びペプチドの使用 - Google Patents

組換えポリペプチド及びペプチド、それをコードする核酸並びに結核の診断におけるこれらのポリペプチド及びペプチドの使用

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は結核の診断に用い得る組換えポリペプチド及
びペプチドに関する。本発明は、さらに、結果に対する
ワクチンを製造する場合に有効成分の一部として用い得
るような生物学的に純粋な状態にある上記のポリペプチ
ド及びペプチドの製造方法に関する。
本発明はまた、上記のポリペプチド及びペプチドをコ
ードする核酸に関する。
さらに、本発明は上記のポリペプチド及びペプチドを
用いるin vitro診断方法及びキット、並びに結核に対す
る有効成分としての、上記のポリペプチド及びペプチド
を含有するワクチンに関する。
“組換えポリペプチド及びペプチド”とは、効率的な
細胞宿主内での適切な調節要素の制御下での対応するDN
A配列の、転写及び翻訳を通じての遺伝子工学によって
産生されるポリペプチド鎖を有する任意の分子に関する
と理解されるべきである。したがって、本明細書中で用
いられるような“組換えポリペプチド”という表現は、
ポリペプチドがグリコシル化基のようなその他の基を含
む可能性を除外しない。
“組換え体”という用語は、実際、特にそれが上記の
宿主に用いられる発現ベクターに予め導入された対応す
る核酸配列の細胞宿主における発現に起因するために、
ポリペプチドが遺伝子工学によって産生されたという事
実を意味する。
にもかかわらず、この表現は、ポリペプチドが異なる
方法によって、例えば蛋白質合成において用いられる方
法に従った古典的化学合成により、又は大型分子の蛋白
質分解的切断によって産生される可能性を除外しない、
と理解されねばならない。
“生物学的に純粋である”とか又は“生物学的純度”
という表現は、一方では組換えポリペプチドがワクチン
接種組成物の生成のために用い得るような純度の等級
を、そして他方では汚染物質、特に天然汚染物質が存在
しないことを意味する。
結核は、開発途上国においては依然として主要な疾患
である。その状況はいくつかの国においては劇的であっ
て、特にその場合、AIDS患者の間の結核の高発生率はこ
の疾患の伝播の新しい出所を示す。
結核は細胞介在性免疫機序が本疾患の予防及び制御に
不可欠な役割を演じる慢性感染症である。
BCG接種、及びいくつかの有効な薬剤にもかかわら
ず、結核は依然として大きな世界的問題である。本疾患
のスクリーニングのために広く用いられているツベルク
リンPPD（蛋白質精製誘導体）の皮膚テストは、その他
の病原性又は環境性の腐生植物性マイコバクテリアとの
交叉反応性のために、特異性が不十分である。
さらに、ツベルクリンPPDは血清学的検定（ELISA）に
用いられる場合、BCG接種を受けたことのある患者又は
一次感染済の患者と、進展性結核を発症中であって初期
の且つ迅速な診断を必要とする患者とを区別出来ない。
分子量が32kDaの蛋白質が亜鉛欠損ウシ結核菌Mycobac
terium bovis BCG培養濾液（８）から精製された
（９）。ウシ結核菌のこの32kDa蛋白質は、フェニル−
セファロース上での疎水性クロマトグラフィー、DEAE−
セファセル上でのイオン交換、及びセファデックスＧ−
100上での分子篩いを順次用いて、ウシ結核菌BCGのSaut
on亜鉛欠損培養濾液から精製された。最終調製物は、い
くつかの分析に基づいて均質であることが判明した。こ
のP32蛋白質は、正常状態で増殖するBCG細胞の一構成成
分である。それは細胞抽出物の可溶性分画の約３％を示
し、そして正常Sauton培養濾液中に放出される主な蛋白
質と考えられる。この蛋白質は、SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及び分子篩いによって、32,000の分子
量を有することが判明している。
ウシ結核菌BCGの32kDa蛋白質のNH2−末端アミノ酸配
列（Phe−Ser−Arg−Pro−Gly−Leu）は、ウシ結核菌BC
G Tokyo亜株から精製されたMBP59蛋白質に関して報告さ
れたもの（34）と同一である。
ウシ結核菌BCGの精製P32は種々の交叉免疫電気泳動法
によって試験され、BCG抗原に関する参照系において抗
原85複合体に属することが示された。それは、BCG抗原
に関する交叉参照系において抗原85Bであるとさらに正
確に確定された（７）。
ウシ結核菌BCGの32kDa蛋白質に対するイムノグロブリ
ンＧ抗体レベルの増加が、70％の結核患者で検出された
（30）。
さらに、ウシ結核菌BCGの32kDa蛋白質は、進行中の結
核患者（12）及びPPD陽性の健康な被験者から採取した
抹消血白血球における特異的リンパ球増殖及びインター
フェロン（IFN−γ）産生を誘発する。最近の所見から
は、BCG感作マウス脾臓細胞中のウシ結核菌BCG誘発性IF
N−γの32kDa蛋白質の量はおそらくＨ−２制御下にある
ことが示されている（13）。最後に、フィブロネクチン
に対するマイコバクテリアの高親和性は、BCG85抗原複
合体の蛋白質に関連する（１）。
Matsuoら（17）は、最近、BCG（Tokyo亜種）により分
泌される主要蛋白質であって、そのNH2−末端アミノ酸
配列中のMPB59抗原との相同性が高く、さらにその最初
の６個のアミノ酸:Phe−Ser−Arg−Pro−Gly−Leuが一
致する抗原αをコードする遺伝子をクローニングした。
この遺伝子は、Tasakaら1983.“Purification and an
tigenic specificity of alpha protein（Yoneda and F
ukui）from Mycobacterium tuberculosis and Mycobact
erium intracellulare"Hiroshima J.Med,Sci.32,1−８
に記載されているようなヒト結核菌M.tuberculosisから
精製された抗原αのＮ末端アミノ酸配列と相同のヌクレ
オチドプローブを用いてクローン化された。
抗原85複合体と呼ばれる約30−32kDaの抗原の存在
は、ヒト結核菌のようなマイコバクテリアの培地から生
じる蛋白質の電気泳動パターンから明らかにされた。イ
ムノブロッティング法により、これらの抗原が、BCGの3
2kDa蛋白質に対して生じたウサギ血清と交叉反応するこ
とが示された（８）。
最近の研究は、癩腫癩患者の30kDa及び31kDa抗原に対
する、並びに結核様癩患者の32kDaに対する優先的体液
反応に関して報告している（24）。
フィブロネクチン（FN）結合抗原はヒト結核菌の短期
培養上澄の目立った成分であることが判明している。３
日目の上澄中では、30キロダルトン（kDa）蛋白質は主
な（FN）結合分子であると確認された。21日目上澄で
は、FNは約30〜32kDaの二重の蛋白質バンドと、より大
型な分子量（57〜60kDa）の一群の抗原に結合した
（１）。
他の実験では、ヒト結核菌からのDNAを含有する組換
えプラスミドで大腸菌Escherichia coliが形質転換さ
れ、３つのコロニーがヒト結核菌に対するポリクローン
抗血清との反応性によって選択された。各組換え体は35
−及び53キロダルトン蛋白質（それぞれ35K及び53K蛋白
質）を産生した（“Expression of Proteins of Mycoba
cteriumtuberculosis in Escherichia coli and Potent
ial of Recombinant Genes and Proteins for Developm
ent of Diagnostic Reagents",Mitchell L Cohen et a
l.,Journal of Clinical Microbiology,July 1987,p.11
76−1180）。
今日までに公知の種々の結果に関しては、ヒト結核菌
の抗原P32の物理化学的特性は正確ではなく、さらにそ
れが疑いの余地なく同一であることを確認したり、並び
にその構造的及び機能的要素を特徴付けるには不十分で
ある。
さらに、ヒト結核菌の病原性及び潜在的感染特性は、
この細菌の構成成分並びに分泌生成物質を確認し、精製
し、そして特性化し得る研究を妨げてきた。
本発明の一つの態様は、結核の検出及び制御のための
精製抗原として使用し得る組換えポリペプチドを提供す
ることである。
本発明の別の態様は、その大量生産を可能にする生物
学的に純粋な組換えポリペプチドのペプチド鎖をコード
する核酸を提供することである。
本発明の別の態様は、結核のin vitro迅速診断として
血清学的検定に用い得る抗原を提供することである。
本発明の別の態様は、進行中の結核罹患患者とBCG接
種を受けたことのある者又は過去に感染したことのある
者とを区別出来る、結核のin vitro迅速診断法を提供す
ることである。
本発明の別の態様は、結核のin vitro診断試薬並びに
マイコバクテリアの他の株からヒト結核菌を同定するた
めのin vitro診断試薬として用い得る核酸プローブを提
供することである。
本発明のポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に、
配列表の配列番号35における位置番号１〜294、４〜29
4、44〜294および222〜294のアミノ酸配列の群から選択
される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。
組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に次の
少なくとも一つのアミノ酸配列： − 図3a及び3bに示される（−29）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（12）番目のアミノ酸で構成
される末端から（31）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（36）番目のアミノ酸で構成
される末端から（55）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（77）番目のアミノ酸で構成
される末端から（96）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（101）番目のアミノ酸で構
成される末端から（12）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（175）番目のアミノ酸で構
成される末端から（194）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（211）番目のアミノ酸で構
成される末端から（230）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（275）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 並びに改変が次の： ポリペプチドがウシ結核菌BCG培養濾液の32kDa蛋白質
に対して生じたウサギポリクローン抗血清と反応する
か、及び／又は 結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者
からのヒト血清と選択的に反応するという特性を変え
ず、かつウシ結核菌BCGのα抗原のものとは異なる限り
における一つ又はいくつかのアミノ酸の置換による及び
／又は付加による及び／又は欠失による改変、及び／又
はアシル化もしくはエステル化による遊離カルボキシル
基の改変に起因するペプチド配列を含有する。
図3a及び3bにおいて、 −ＸはＧ又はGGを表し、 −ＹはＣ又はCCを表し、 −ＺはＣ又はＧを表し、 −ＷはＣ又はＧを表すが、Ｚとは異なり、 −ＫはＣ又はCGを表し、 −ＬはＧ又はCCを表し、 −a1−b1はALA−ARG又はGLY−ALA−ALAを表し、 −a2はarg又はglyを表し、 −a3−b3−c3−d3−e3−f3はhis−trp−val−pro−ar
g−pro又はala−leu−gly−alaを表し、 −a4はpro又はpro−asn−thrを表し、 −a5はpro又はala−proを表わす。
本発明のポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に、
配列表の配列番号37における位置番号１〜294、４〜29
4、44〜294および222〜294のアミノ酸配列の群から選択
される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。
組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に次の
少なくとも一つのアミノ酸配列： − 図4a及び4bに示される（−29）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（12）番目のアミノ酸で構成
される末端から（31）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（36）番目のアミノ酸で構成
される末端から（55）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（77）番目のアミノ酸で構成
される末端から（96）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（101）番目のアミノ酸で構
成される末端から（120）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（175）番目のアミノ酸で構
成される末端から（194）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（211）番目のアミノ酸で構
成される末端から（230）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（275）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 並びに改変が次の： ポリペプチドがウシ結核菌BCG培養濾液の32kDa蛋白質
に対して生じたウサギポリクローン抗血清と反応する
か、及び／又は 結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者
からのヒト血清と選択的に反応する という特性を変えず、かつウシ結核菌BCGのα抗原のも
のとは異なる限りにおける、一つ又はいくつかのアミノ
酸の置換による及び／又は付加による及び／又は欠失に
よる改変、及び／又はアシル化もしくはエステル化によ
る遊離カルボキシル基の改変に起因するペプチド配列を
含有する。
本発明のポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に、
配列表の配列番号39における位置番号１〜295、４〜29
5、44〜295および222〜295のアミノ酸配列の群から選択
される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。
組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に次の
少なくとも一つのアミノ酸配列： − 図５に示される（−30）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列、又は − 図５に示される（12）番目のアミノ酸で構成される
末端から（31）番目のアミノ酸で構成される末端にわた
る配列、又は − 図５に示される（36）番目のアミノ酸で構成される
末端から（55）番目のアミノ酸で構成される末端にわた
る配列、又は − 図５で示される（77）番目のアミノ酸で構成される
末端から（96）番目のアミノ酸で構成される末端にわた
る配列、又は − 図５に示される（101）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（120）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列、又は − 図５に示される（175）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（194）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列、又は − 図５に示される（211）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（230）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列、又は − 図５に示される（275）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（295）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列、 並びに改変が次の： ポリペプチドがウシ結核菌BCG培養濾液の32kDa蛋白質
に対して生じたウサギポリクローン抗血清と反応する
か、及び／又は 結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者
からのヒト血清と選択的に反応する という特性を変えず、かつウシ結核菌BCGのα抗原のも
のとは異なる限りにおける、一つ又はいくつかのアミノ
酸の置換による及び／又は付加による及び／又は欠失に
よる改変、及び／又はアシル化もしくはエステル化によ
る遊離カルボキシル基の改変に起因するペプチド配列を
含有する。
本発明の有益なポリペプチドは、それらがウシ結核菌
BCG培養濾液の32kDa蛋白質（以後BCGのP32蛋白質と呼
ぶ）に対して生じたウサギポリクローン抗血清と反応す
るという事実を特徴とする。
本発明の有益なポリペプチドは、それらが結核患者、
特に初期段階の進行性結核を発症中の患者からのヒト血
清と選択的に反応するという事実を特徴とする。
以下に、BCGのP32蛋白質に対して生じるウサギポリク
ローン抗血清の調製方法、並びに本発明のポリペプチド
とBCGのP32蛋白質に対して生じる上記のウサギポリクロ
ーン抗血清との反応の証拠を示すための試験を示すが、
本発明はこれに限定されない。
１）BCGのP32蛋白質に対して生じるウサギポリクローン
抗血清の調製方法： 培養上清からのBGGの血清P32蛋白質が使われる。
ａ）BCGのP32蛋白質の精製： P32蛋白質は、以下のようにして精製し得る： 使用する細菌株は、ウシ結核菌BCG1173P2亜株（Paste
ur Institute,Paris）及びGL2亜株（Pasteur institut
e,Brussels）である。
細菌の培養は、次のようにして得られる： ウシ結核菌BCGを、37.5℃で14日間、Sauton培地上で
増殖させて薄膜状にする。培地を蒸留水で調製する場合
は、硫酸亜鉛を加えて最終濃度を５μＭとする（標準Sa
uton培地）（De Bruyn J.,Weckx M.,Beumer−Jochmans
M.−P.Effect of zinc deficiency on Mycobacterium t
uberculosis var,bovis（BCG）、J.Gen.Microbiol.198
1: 124:353−７）。亜鉛欠損培地が必要な場合は、硫酸
亜鉛を省く。
亜鉛欠損培地からの濾液を得る方法を次に示す： 培地をデカンテーションによって透明にする。残留細
菌をMillipak100フィルターユニット（Millipore Cor
p.,Bedford,Mass.）を用いて濾過して除去する。精製の
ために用いる場合、濾液を320mM燐酸塩、450mMNaCl、1m
MEDTAとなるよう調節し、滅菌濾過前に5M HClでpHを7.3
とする。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって蛋白質分
析を実施する。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）をLacmmli（英国）（Cl
eavage of Structural poteins during the assembly o
f the head of bacteriophage T4.Nature 1970; 227:6
80−５）が記載しているように、13％（w/v）アクリル
アミド含有ゲル上で行なった。ゲルを定量分析のために
Coomassie Brilliant Blue R−250で染色し、DU8 Beckm
an分光光度計で595nmで走査する。純度を制御するため
に、銀染色（Biorad Laboratories,Richmond,Calif.）
を用いてゲルを示す。
P32の精製工程を次に示す： フェニル−セファロース上での疎水性クロマトグラフ
ィーを除いて、緩衝液はすべて、Tween80（最終濃度0.0
05％）を含有する。pHは、滅菌前に7.3に調節する。全
精製工程は、＋４℃で実施する。溶出では、280nmでの
吸光度を記録する。蛋白質を含有する分画をSDS−PAGE
で分析する。
（ｉ）通常、１リットル当たり125〜150mgの蛋白質を
含有する、４リットルの亜鉛欠損培養液からの処理濾液
を、予め0.45M NaCl及び1mM EDTAを含有する20mM燐酸塩
緩衝液（PB）で、平衡させたフェニル−セファロースCL
−4Bのカラム（5.0×5.0cm）（Pharmacia Fine Chemica
ls,Uppsala,Sweden）に１時間当たり800mlの流速で使用
する。次にゲルを１カラム容積の同一緩衝液で洗浄して
未固定物質を除去し、そして次に300mlの20mM及び4mM P
B、並びに10％エタノール（v/v）で順次洗浄する。
（ii）この分画の燐酸塩濃度が4mMに達した後、それ
をDEAE−セファセル（Pharmacia Fine Chemicals）のカ
ラム（2.6×10cm）に使用し、これを4mM PBで平衡させ
る。平衡緩衝液で洗浄後、試料を１時間当たり50mlの流
速で25mM燐酸塩で溶出する。溶出液を、PM10膜（Amicon
Corp.,Lexington,Mass.）を装備した202Amicon撹拌セ
ル中で濃縮する。
（iii）濃縮物質を4mgのBCGのP32蛋白質（可溶性抽出
物）で処理するか又は50mM PBで平衡されたセファデッ
クスＧ−100（Pharmacia）カラム（2.6×45cm）上で12m
l/時の流速で分子篩いにかける。SDS−PAGEにおいて一
つのバンドを示すピークの分画をプールする。生成され
た最終製剤の純度は、SDS−PAGE及びその後の銀染色に
よって、並びにファースト蛋白質液体クロマトグラフィ
ー系（Pharmacia）において流速0.2ml/分で、0.005％Tw
een80を含有する50mM PBにより平衡されたスペロース12
（Pharmacia）カラム（12.0×30cm）上で分子篩いをす
ることによって制御する。溶出では、280nm及び214nmで
の吸光度を記録する。
ｂ）BCGのP32蛋白質に対して生じるウサギポリクロー
ン抗血清の調製： 生理食塩水1ml当たり400μｇのBCGの精製P32蛋白質を
１容積の不完全フロインドアジュバントと混合する。そ
の物質をホモジェナイズし、ウサギの背中の10部位に分
けられる50μの用量で、０、４、７及び８週目に皮内
注射する（最後の注射に関しては、アジュバントを希釈
剤と置換する）。１週間後、ウサギから採血して、抗体
価に関して血清を試験し、その後アリコートに分配して
−80℃で保存する； ２）本発明のポリペプチドとBCGのP32蛋白質に対して
生じる上記のウサギポリクローン抗血清との間の反応の
証拠を示すための試験： 用いた試験はエライザELISA検定であった；抗体測定
に関するエライザはEngvallとPerlmannの方法（Engval
l,E.,and P.Perlmann,1971.Enzymelinked immunosorben
t assay（ELISA）.Quantitative assay of immunoglobu
lin G.Immunochemistry 8:871−874）に基づくものであ
る。
100μのトリス塩酸緩衝液（50mM、pH8.2）中に溶解
した１μｇの本発明のポリペプチドの一つを各ウエルに
加えてImmulon Microelisaプレート（Dynatech,Kloten,
Switzerland）を被う。湿室内で27℃で２時間インキュ
ベーション後、そのプレートを一晩４℃に保つ。それ
を、Titertekマイクロプレート洗浄器（Flow Labor ato
ries,Brussels,Belgium）を用いて、0.05％Tween20を含
有する0.01M燐酸塩緩衝塩水（pH7.2）で４回洗浄する。
ブロッキングは、0.06M炭酸塩緩衝液（pH9.6）に溶解し
た0.5％ゼラチンを用いて、１時間実施する。次にウェ
ルを前と同様に洗浄し、0.05％Tween20及び0.5％ゼラチ
ンを含有する燐酸塩緩衝塩水中に希釈した上記の血清10
0μを加える。予備実験で得られた結果に従って、使
用希釈度をIgG測定に関しては1:200、IgAに関しては1:2
0、及びIgMに関しては1:80に設定する。各希釈は二重で
実施する。２時間インキュベーション後にウェルを洗浄
し、その後そこに、0.05％Tween20及び0.5％ゼラチンを
含有する燐酸塩緩衝塩水中にそれぞれ1:400、1:4000及
び1:1,200に希釈した、ヒトIgG、IgA、又はIgM（Dakopa
tts,Copenbagen,Denmark）に対するペルオキシダーゼ−
標識ウサギイムノグロブリン100μを入れ、そして90
分間インキュベートする。洗浄後、ウェルに結合したペ
ルオキシダーゼの量を、気質として0.15Mクエン酸緩衝
液（pH5.0）中に溶解したｏ−フェニレシジアミン（10m
g/100ml）及び過酸化水素（100ml当たり８μの30％H2
O2）の新たに調製した溶液を用いて、定量する。15分間
のインキュベーション後、8NH2SO4を用いて酸素反応を
停止入する。Titertek Multiskan光度計（Flow Laborat
ories）で492nmでの光学密度を読み取る。
血清を入れていないウェルを標識体に関する対照とし
て用いる。プレート毎の及び測定日による変動を補正す
るために、各プレート上に１つの陰性参照血清と中位及
び低抵抗体レベルの２つの陽性参照血清を包含して、各
実験を行なう。抗体濃度は、参照血清の平均変動に従っ
て読み取り値を補正した後に得られる光学密度値で表さ
れる。
本発明のポリペプチドは結核患者からのヒト血清によ
って選択的に認識されるという事実の証拠を示すための
試験を以下に示すが、これは本発明を限定するものでは
ない。
この試験は、イムノブロッティング（ウエスタンブロ
ッティング）分析で、この場合、本発明のポリペプチド
は組換え技術によって得られる。この試験は、異なる製
造方法によって得られる本発明のポリペプチドに対して
も用い得る。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動後、本発明のポリペプチドを、Towbin
ら（29）が記載したように、ニトロセルロース膜（Hybo
nd C.（Amersham））上にブロッティングする。大腸菌
E.coli Y1089のβ−ガラクトシダーゼに融合された本発
明のポリペプチドの発現は、ポリクローンウサギ抗32kD
a BCG蛋白質血清（1:1,000）の結合によって、又はモノ
クローン抗βガラクトシダーゼ抗体（Promega）を用い
て視覚化される。二次抗体（それぞれ、アルカリホスフ
ァターゼ抗ウサギイムノグロブリンＧ及び抗マウスアル
カリホスファターゼイムノグロブリンＧ標識体）は、製
造業者（Promega）の勧告に従って希釈する。
ヒト結核血清による本発明のポリペプチド及び本発明
の融合蛋白質の選択的認識を確認するために、これらの
血清（1:50）を用いてニトロセルロースシートを一晩イ
ンキュベートする（非特異的蛋白質結合部位）をブロッ
キング後）。ヒト結核血清は、後述の引用文献の文献
（31）に記載のようなドットプロット決定において決定
されるBCGの精製32kDa抗原に対するその反応性（高いか
又は低いか）に関して選択される。ニトルセルロースシ
ート上の反応領域は、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト
イムノグロブリンＧ抗体（Dakopatts,Copenhagen,Denma
rk）（1:200）を用いて４時間インキュベートすること
によって明示され、繰り返し洗浄後、ペルオキシダーゼ
及び過酸化水素の現在下でペルオキシダーゼ基質（α−
クロロナフトール）（Bio−Rad Laboratories,Richmon
d,Calif.）を加えると発色反応が発現する。
いくつかのアミノ酸中に存在し、一方では本発明のポ
リペプチドの組成の一部、特にGlu基又はＣ末端アミノ
酸が保有する遊離のカルボキシル基であり、他方でＮ末
端アミノ酸又はペプチド鎖内アミノ酸、例えばLysが保
有する遊離NH2基である遊離反応官能基は、その改変が
本ポリペプチドの上記の特性を変えない限りにおいて改
変可能であることは、言うまでもない。
このように改変される分子は、もちろん本発明の一部
である。上記のカルボキシル基は、アシル化又はエステ
ル化され得る。
その他の改変も本発明の一部である。特に、又はアミ
ン又はエステル官能基、あるいは両方の末端アミノ酸
は、それ自体、他のアミノ酸との結合に関与し得る。例
えばＮ末端アミノ酸は、別のペプチドのＣ末端領域の一
部に対応する１〜数個のアミノ酸を含む配列に結合し得
る。
さらに、本発明のポリペプチドの１〜数個のアミノ酸
の置換及び／又は付加及び／又は欠失による改変に起因
する任意の配列は、この改変が上記のポリペプチドの上
記の特性を変えない限りにおいて本発明の一部である。
本発明のポリペプチドは、特にAsn−Ｘ−ser又はAsn
−Ｘ−Thr型（Ｘは任意のアミノ酸を表す）のそのグリ
コシル化部位のいくつかにおいて、グリコシル化され得
ない場合もある。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプ
チド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸配列を含有
する。
− 図3a及び3bに示される（−29）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−42）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−47）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−49）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−55）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−59）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプ
チド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸配列を含有
する： −図4a及び4bに示される（−29）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−42）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−47）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−49）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−55）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−59）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプ
チド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸配列を含有
する： − 図５に示される（−30）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列、 − 図５示される（−43）番目のアミノ酸で構成される
末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわ
たる配列。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプ
チド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸配列を含有
する： − 図3a及び図3bに示される（１）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−29）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−42）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−47）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−49）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−55）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−59）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプ
チド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸配列を含有
する： − 図4a及び4bに示される（１）番目のアミノ酸で構成
される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−29）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−42）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−47）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−49）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−55）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−59）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプ
チド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸配列を含有
する： − 図５示される（１）番目のアミノ酸で構成される末
端から（295）番目のアミノ酸で構成される末端にわた
る配列、 − 図５示される（−30）番目のアミノ酸で構成される
末端から（295）番目のアミノ酸で構成される末端にわ
たる配列、 − 図５示される（−43）番目のアミノ酸で構成される
末端から（295）番目のアミノ酸で構成される末端にわ
たる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下
のアミノ酸配列の一つから成る： − 図3a及び3bに示される（−59）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−55）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−49）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−47）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−42）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−29）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（１）番目のアミノ酸で構成
される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下
のアミノ酸配列の一つから成る： − 図4a及び4bに示される（−59）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−55）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−49）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−47）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−42）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−29）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（１）番目のアミノ酸で構成
される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下
のアミノ酸配列の一つから成る： − 図５に示される（１）番目のアミノ酸で構成される
末端から（295）番目のアミノ酸で構成される末端にわ
たる配列、 − 図５に示される（−30）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（295）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列、 − 図５に示される（−43）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（295）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下
のアミノ酸配列の一つから成る： − 図3a及び3bに示される（−59）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目アミノ酸で構成される末
端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−55）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−49）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−47）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−42）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図3a及び3bに示される（−29）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下
のアミノ酸配列の一つから成る： − 図4a及び4bに示される（−59）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−55）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−49）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−47）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−42）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図4a及び4bに示される（−29）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下
のアミノ酸配列の一つから成る： − 図５に示される（−43）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列、 − 図５に示される（−30）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列。
真核細胞においては、これらのポリペプチドはシグナ
ルペプチドとして用い得る。その役割はその合成部位か
らの蛋白質の転位を開始することであるが、しかしそれ
は転位中に削除される。
本発明に関連するその他の有益な組換えポリペプチド
は以下のアミノ酸配列の一つから成る： − 図3a及び3bに示される（12）番目のアミノ酸で構成
される末端から（31）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（36）番目のアミノ酸で構成
される末端から（55）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（77）番目のアミノ酸で構成
される末端から（96）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（101）番目のアミノ酸で構
成される末端から（120）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（175）番目のアミノ酸で構
成される末端から（194）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（211）番目のアミノ酸で構
成される末端から（230）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図3a及び3bに示される（275）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下
のアミノ酸配列の一つから成る： − 図4a及び4bに示される（12）番目のアミノ酸で構成
される末端から（31）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（36）番目のアミノ酸で構成
される末端から（55）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（77）番目のアミノ酸で構成
される末端から（96）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（101）番目のアミノ酸で構
成される末端から（120）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（175）番目のアミノ酸で構
成される末端から（194）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（211）番目のアミノ酸で構
成される末端から（230）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図4a及び4bに示される（275）番目のアミノ酸で構
成される末端から（294）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下
のアミノ酸配列の一つから成る： − 図５に示される（12）番目のアミノ酸で構成される
末端から（31）番目のアミノ酸で構成される末端にわた
る配列、又は − 図５に示される（36）番目のアミノ酸で構成される
末端から（55）番目のアミノ酸で構成される末端にわた
る配列、又は − 図５で示される（77）番目のアミノ酸で構成される
末端から（96）番目のアミノ酸で構成される末端にわた
る配列、又は − 図５に示される（101）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（120）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列、又は − 図５に示される（175）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（194）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列、又は − 図５に示される（211）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（230）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列、又は − 図５に示される（275）番目のアミノ酸で構成され
る末端から（295）番目のアミノ酸で構成される末端に
わたる配列。
上記のポリペプチドは、後述の実施例で説明されるよ
うに、ヒト結核菌によって分泌される32kDaの蛋白質を
コードするヌクレオチド配列に由来するDNAの発現物質
から得られることに留意すべきである。
本発明はさらに、上記のポリペプチド、及びそのポリ
ペプチドに関する蛋白質又は異種配列に関するものであ
って、その蛋白質又は異種配列は、例えば約１〜約1,00
0個のアミノ酸を含む。これらのアミノ酸配列は融合蛋
白質と呼ばれる。
本発明の有益な融合蛋白質においては、異種蛋白質は
β−ガラクトシダーゼである。
本発明のその他の有益な融合蛋白質は、以下のプラス
ミドの一つの発現に起因する異種蛋白質を含有するもの
である： pEX1 pEX2 pEX3 puEX1 pmTNF MPH pUEX2 pUEX3 本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする
任意のヌクレオチド配列に関する。
本発明はさらに、次のハイブリッド形成条件下で上記
の任意のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
ハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む核酸に関
する： −バイブリッド形成及び洗浄媒体:3 X SSC,20％ホルム
アミド（1 X SSCは0.15M NaCl,0.015M クエン酸ナトリ
ウム、pH7.0）、 −ｘ−ｙによって、即ち図3a及び図3bに示される（ｘ）
位置のヌクレオチドで構成される末端から（ｙ）位置の
ヌクレオチドで構成される末端にわたる配列によって限
定される本発明の核酸のハイブリッド形成温度（HT）及
び洗浄温度（WT）。
1 − 182 HT＝WT＝69℃ 1 − 194 HT＝WT＝69℃ 1 − 212 HT＝WT＝69℃ 1 − 218 HT＝WT＝69℃ 1 − 272 HT＝WT＝69℃ 1 − 359 HT＝WT＝71℃ 1 −1241 HT＝WT＝73℃ 1 −1358 HT＝WT＝73℃ 183 − 359 HT＝WT＝70℃ 183 −1241 HT＝WT＝73℃ 183 −1358 HT＝WT＝73℃ 195 − 359 HT＝WT＝70℃ 195 −1241 HT＝WT＝73℃ 195 −1358 HT＝WT＝73℃ 213 − 359 HT＝WT＝70℃ 213 −1241 HT＝WT＝73℃ 213 −1358 HT＝WT＝73℃ 219 − 359 HT＝WT＝71℃ 219 −1241 HT＝WT＝73℃ 219 −1358 HT＝WT＝73℃ 234 − 359 HT＝WT＝71℃ 234 −1241 HT＝WT＝74℃ 234 −1358 HT＝WT＝73℃ 273 − 359 HT＝WT＝71℃ 273 −1241 HT＝WT＝74℃ 273 −1358 HT＝WT＝73℃ 360 −1241 HT＝WT＝73℃ 360 −1358 HT＝WT＝73℃ 1242 −1358 HT＝WT＝62℃ 上記の温度は、約±５℃と考えられるべきである。
本発明はさらに、上記の任意のポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含
む核酸に関する。
上記の、並びに後述の核酸において、産生されるヌク
レオチド配列はＴがＵに置き換えられるようなものであ
ることに留意すべきである。
本発明の核酸は、配列表の配列番号34におけるヌクレ
オチド位置番号359〜1240、368〜1240、490〜1240およ
び1023〜1240のヌクレオチド配列の群から選択される少
なくとも一つのヌクレオチド配列、または該ヌクレオチ
ド配列の少なくとも一つに相補的で同じ長さのヌクレオ
チド配列もしくはすべてのＴヌクレオチドがＵヌクレオ
チドで置換されている該ヌクレオチド配列の一つを含
む。
本発明の核酸は、配列表の配列番号36におけるヌクレ
オチド番号359〜1240、368〜1240、490〜1240および102
3〜1240のヌクレオチド配列の群から選択される少なく
とも一つのヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配
列の少なくとも一つに相補的で同じ長さのヌクレオチド
配列もしくはすべてのＴヌクレオチドがＵヌクレオチド
で置換されている該ヌクレオチド配列の一つを含む。
本発明の核酸は、配列表の配列番号38におけるヌクレ
オチド位置番号220〜1104、229〜1104,350〜1104および
884〜1104のヌクレオチド配列の群から選択される少な
くとも一つのヌクレオチド配列、または該ヌクレアオチ
ド配列の少なくとも一つに相補的で同じ長さのヌクレオ
チド配列もしくはすべてのＴヌクレオチドがＵヌクレオ
チドで置換されている該ヌクレオチド配列の一つを含
む。
好ましい核酸の群は、少なくとも一つの次のヌクレオ
チド配列を包含する： −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（182）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（360）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（1242）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 （ここで、図3a及び図3bに示されるＮは５つのＡ、Ｔ、
Ｃ、Ｇ、又はＩヌクレオチドの一つを表す）、か又は ＴがＵに置き換えられる上記のヌクレオチド配列、又は 上記のヌクレオチド配列もしくはその相補的配列とハイ
ブリダイズする核酸。
好ましい核酸の群は、少なくとも一つの次のヌクレオ
チド配列を包含する： −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（182）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（360）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（1242）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 （ここで、図4a及び図4bに示されるＮは５つのＡ、Ｔ、
Ｃ、Ｇ、又はＩヌクレオチドの一つを表す）、か又は ＴがＵに置き換えられる上記のヌクレオチド配列、又は 上記のヌクレオチド配列もしくは相補的配列とハイブリ
ダイズする核酸。
好ましい核酸の群は、少なくとも一つの次のヌクレオ
チド配列を包含する： −図５に示される（130）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（219）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列、 −図５に示される（220）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（1104）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列、 −図５に示される（1104）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（1299）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列、 （ここで、図５に示される6Nは５つのＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、
又はＩヌクレオチドの一つを表す）、か又は ＴがＵに置き換えられる上記のヌクレオチド配列、又は 上記のヌクレオチド配列もしくは相補的配列とハイブリ
ダイズする核酸。
その他好ましい核酸は、少なくとも一つの次のヌクレ
オチド配列を包含する： −図3a及び図3bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列。
その他好ましい核酸は少なくとも一つの次のヌクレオ
チド配列を包含する： −図4a及び図4bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端ににわたる配列。
核酸の別の好ましい群は、次のヌクレオチド配列を包
含する： −図3a及び図3bに示される（360）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列。
本発明の核酸の別の好ましい群は、次のヌクレオチド
配列を含有する： −図4a及び図4bに示される（360）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列。
別の有益な態様によれば、核酸は別の配列の一つを包
含する： −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（194）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（212）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（218）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（272）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（234）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（234）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列。
別の有益な態様によれば、核酸は次の配列の一つを包
含する： −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（194）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（212）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（218）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（272）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（234）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（234）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列。
好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成
る： −図3a及び図3bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（234）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列。
好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成
る： −図4a及び図4bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（234）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列。
これらのヌクレオチド配列は、対応するシグナルペプ
チドをコードするヌクレオチドシグナル配列として用い
得る。
好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成
る： −図3a及び図3bに示される（360）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（360）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列。
好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成
る： −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（182）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（194）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（212）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（218）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（272）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（234）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（234）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図3a及び図3bに示される（1242）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列。
好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成
る： −図4a及び図4bに示される（360）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（360）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列。
好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成
る： −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（182）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（194）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（212）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（218）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（272）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（359）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（１）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（183）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（195）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（213）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（219）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（234）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（234）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1241）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（273）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 −図4a及び図4bに示される（1242）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（1358）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列。
好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成
る： −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（129）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（219）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（1104）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（1299）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（90）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（219）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（90）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（1299）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（90）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（1104）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（130）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（1104）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列、 −図５に示される（130）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（1299）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列、 −図５に示される（220）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（1299）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列。
好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成
る： −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（129）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（219）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（1104）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（1299）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（90）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（219）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（90）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（1104）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（90）番目のヌクレオチドで構成され
る末端から（1299）番目のヌクレオチドで構成される末
端にわたる配列、 −図５に示される（130）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（219）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列、 −図５に示される（130）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（1104）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列、 −図５に示される（130）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（1299）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列、 −図５に示される（220）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（1104）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列、 −図５に示される（220）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（1299）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列、 −図５に示される（1104）番目のヌクレオチドで構成さ
れる末端から（1299）番目のヌクレオチドで構成される
末端にわたる配列。
本発明はさらに、異種核酸中に挿入された少なくとも
一つの本発明の核酸を含有する任意の組換え核酸に関す
る。
本発明は特に、その制御下で上記の配列の転写物がプ
ロセッシングを受け易いプロモーター（特に誘導プロモ
ーター）が本発明のヌクレオチド配列に先行し、そして
おそらく転写終止シグナルをコードする配列が後に続く
と限定されるような組換え核酸に関する。
本発明はさらに、本発明のポリペプチド及びおそらく
はシグナルペプチドをコードする核酸配列が、それらが
細菌遺伝子内で普通結合されるものに関して異種である
制御要素、特にそれの産生のために選択された細胞宿主
中のそれらの発現を制御するために改造された調節要素
を用いて組換えられる組換え核酸に関する。
本発明はさらに、その複製のための非必須部位の一つ
において、特に基準プラスミド、コスミド又はファー
ジ、及び本発明の組換え核酸のベクター配列を含む、特
にクローニング及び／又は発現のための組換えベクター
に関する。
組換え抗原の発現に適したベクターを以下に示す： pEX1 pmTNF MPH pEX2 pIGRI pEX3 pUEX1 pUEX2 pUEX3 pEX1、pEX2、及びpEX3ベクターは市販されていて、Bo
ehringer Mannheimから購入出来る。
pUEX1、pUEX2、及びpUEX3ベクターも市販されてい
て、Amershamから購入出来る。
本発明の有益な態様によれば、組換えベクターは、そ
の複製のためのその非必須部位の一つにおいて、細胞宿
主内での本発明のポリペプチドの発現をプロモートする
ための必要な要素と、おそらくは細胞宿主のポリメラー
ゼによって認識されるプロモーター、特に誘導プロモー
ター、並びにおそらくはシグナル配列及び／又はアンカ
ー配列を含有する。
本発明の別の態様によれば、組換えベクターは、ベク
ター中に挿入される本発明の核酸の大腸菌E.coliによる
発現を可能にする要素、特にβ−ガラクトシダーゼの遺
伝子又はその一部の発現を可能にする要素を含む。
本発明はさらに、本発明の組換えベクターによって形
質転換される、そしてこの宿主内で本発明のポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする調
節要素を含む細胞宿主に関する。
本発明はさらに、上記のようなそして実施例に後述す
るようなベクターによって形質転換される大腸菌E.coli
のような細菌の中から選択される、あるいはpAc 373
pYM1又はpVC3のような好適なベクターを含有するウイル
スAc Ｎ Ｐ Ｖ（Autographa california nuclear po
lyhydrosis virus）に感染されたCHO細胞、昆虫細胞、S
f9細胞［Spodoptera frugiperda］、pBE520又はp89B310
のような好適なベクターを含有するウイルスBmNPVに感
染されたBmN［Bombyx mori］のような真核生物の中から
選択される細胞宿主に関する。
本発明は、本発明の形質転換細胞宿主によって発現さ
れる核酸の発現物質に関する。
本発明はさらに、いずれかの核酸と、又はそれらの相
補的配列とハイブリダイズするヌクレオチドプローブ、
特に表１に収録され、図９に示された以下のヌクレオチ
ド配列の中から選択されるプローブに関する。
又はそれらの相補的ヌクレオチド配列。
ハイブリッド形成条件を次に示す： −ハイブリッド形成及び洗浄培体:3 Ｘ SSC,20％ホル
ムアミド（１ Ｘ SSCは0.15M NaCl,0.015M クエン
酸ナトリウム、pH7.0）、 −ハイブリッド形成温度（HT）及び洗浄温度（WT）： （WT）℃： HT及びWT（℃） Ａ（ｉ） 50 Ａ（ii） 50 Ａ（iii） 52 Ａ（iv） 60 Ａ（ｖ） 52 Ｂ 48 Ｃ 50 Ｄ 45 Ｅ 52 Ｆ（ｉ） 55 Ｆ（ii） 59 Ｆ（iii） 55 Ｆ（iv） 59 これらのプローブは、Mycobacterium tuberculosis
ヒト結核菌をその他の細菌株と、特に次のマイコバク
テリア種と区別し得る： − Mycobacterium marinum海水魚結核菌、Mycobacter
ium scrofulaceum、Mycobacterium gordonae、Mycoba
cterium szulgai、Mycobacterium intracellulare、M
ycobacterium xenopi、Mycobacterium gastri、Mycob
acterium nonchromogenicum、Mycobacterium terra
e、及び Mycobacterium triviale、特にM.bovisウシ
結核菌、Mycobacterium kansasii、Mycobacterium av
ium鳥結核菌、Mycobacterium phleiチモテ菌及びMycob
acterium fortuitum。
本発明はさらに、米国特許第4,683,202号及び第4,68
3,195号、並びに欧州特許第200362号に記載されている
ように、PCR（ポリメラーゼチェインリアクション法）
による本発明のヌクレオチド配列の合成に用い得るDNA
又はRNAプライマーに関する。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列の約15〜約25ヌクレオチドで構成され
る任意のDNA又はRNAプライマーに関する。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列とハイブリッドを形成し易い約15〜約
25ヌクレオチドで構成される任意のDNA又はRNAプライマ
ーに関する。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列と相補的な約15〜約25ヌクレオチドで
構成される任意のDNA又はRNAプライマーに関する。
プライマーとして用い得る配列を以下の表２（配列P1
〜P6、又はそれらの相補体）、及び図９に示す： これらの配列は、本発明の任意のヌクレオチド配列、
特に１番目のヌクレオチドで構成される末端から1358番
目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、並び
にBCGのα抗原のヌクレオチド配列についてのポリメラ
ーゼ鎖反応（PCR）法により酵素的増幅を可能にする12
組の異なるプライマー（表３に示されている）に結合し
得る（17）。
PCR増幅物質の検出は、DNAを増幅するために用いられ
たPCRプライマー間に位置する少なくとも10ヌクレオチ
ドのオリゴヌクレオチド配列とのハイブリッド形成反応
による。
本発明のヌクレオチド配列のPCR物質は、表３に示さ
れるプローブを用いるハイブリッド形成法（ドット−ス
ポット、サザンブロッティング等）によってBCGのα抗
原遺伝子又はその一部と識別される。これらのプローブ
の配列は、上記の表１に示されている。
酵素的増幅は、表２に示されるプライマーの約15の連
続した塩基の配列を有するすべてのオリゴヌクレオチド
を用いても成し遂げられることに留意すべきである。
５′末端に伸長を伴う、あるいは小程度のミスマッチを
伴うプライマーは、そのミスマッチがプライマーの３′
末端での塩基対合を妨げない場合は、酵素的増幅の結果
に相当に影響を及ぼすということはない。
本発明の（BCG遺伝子のではなく）ヌクレオチド配列
の特異的な酵素的増幅は、プローブ（表１に示されてい
る）又はそれらの相補体が増幅プライマーとして用いら
れる場合に成し遂げられる。
上記の表１のプローブがプライマーとして用いられる
場合、そのプライマー組はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＦか
ら選択される任意のその他のヌクレオチド配列の相補体
に関連した表１の任意のヌクレオチド配列（Ａ、Ｂ、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）で構成されるが、この場合、配列Ａは
配列Ａ（ｉ）、Ａ（ii）、Ａ（iii）、Ａ（iv）、Ａ
（ｖ）のいずれかを意味し、配列Ｆは配列Ｆ（ｉ）、Ｆ
（ii）、Ｆ（iii）、Ｆ（iv）のいずれかを意味すると
理解されるべきである。
本発明のヌクレオチド配列の酵素的増幅に有益なプラ
イマー組は、後述の表３−２に示される以下のプライマ
ー組の一つである： Ａ（ｉ）、Ａ（ii）、Ａ（iii）、Ａ（iv）、Ａ
（ｖ）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦは表１に示されるヌクレ
オチド配列を有する。
上記の表３−２に記載の上記の任意のプライマー組を
有する本発明のヌクレオチド配列の増幅の場合、増幅ヌ
クレオチド配列の検出は、少なくとも10ヌクレオチドの
オリゴヌクレオチド配列とのハイブリッド形成反応によ
って成し遂げられるが、その配列はヌクレオチド配列を
増幅するために用いられたPCRプライマー間に位置す
る。上記の２つのプライマー間に位置するオリゴヌクレ
オチド配列は、図９（この場合、プライマーＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦはそれぞれプローブ領域Ａ、プローブ
領域Ｂ、プローブ領域Ｃ、プローブ領域Ｄ、プローブ領
域Ｅ及びプローブ領域Ｆと呼ばれる矩形で囲まれた配列
で表される）から確定される。
さらに、PCR法によるヌクレオチド配列の酵素的増幅
のための、及び以下の： −表３に記載のPCRプライマー組の一つ、及び本発明の
検出プローブ（表１に記載のプローブが有益である）、 又は表３−２に記載のPCRプライマー組の一つ、及び例
えば少なくとも10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配
列から成る検出配列であって、上記の配列は上記のヌク
レオチド配列を増幅するために用いられたプライマー組
を構成する２つのPCRプライマー間に位置する（図９）
もの を含有する増幅ヌクレオチド配列の検出のためのキット
も提供する。
本発明はさらに、以下の： −本発明の核酸を含有する適当なベクターで予め形質転
換された細胞宿主の適切な培地での培養、 −上記の培養液から上記の形質転換細胞宿主により産生
されるポリペプチドの回収、及び −最後に固定金属イオンアフィニティークロマトグラフ
ィー（IMAC）による産生されたポリペプチドの精製から
なる工程を包含する本発明のポリペプチドの製造方法に
関する。
本発明のポリペプチドは、ペプチド合成の分野におけ
る古典的技法に従って製造され得る。
その合成は、均質溶液中又は固相で実施し得る。
例えば、用い得る均質溶液中での合成方法としては、
Houbenweylが“Methode der organischen chemie"（有
機化学の方法）という表題の本（編集者 E.Wunsh, vo
l.15−Ｉ＆II.THIEME,Stuttgart 1974）に記載した方法
が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、R.D.Merrifieldが“Solid
phase peptide synthesis"（J.P.Ham.Socks.,45,2149−
2154）という表題の論文に記載した方法に従って調製す
ることも出来る。
さらに、本発明の核酸の製造方法を以下に説明する。
一本鎖核酸（本発明の精々100ヌクレオチドを含有す
る）を化学的に製造するのに適した方法は、次の工程： −Bioorganic Chemistry 4;274−325,1986に記載の自動
β−シアノエチルホスホラミダイト法を用いるDNA合成 を含む。
一本鎖DNAの場合、DNA合成終了時に生成される物質は
このように用いられる。
二本鎖核酸（本発明の高々100bpを含有する）を化学
的に製造するのに適した方法は、以下の工程を包含す
る： −Bioorganic Chemistry 4;274−325,1986に記載の自動
β−シアノエチルホスホラミダイト法を用いる一つのセ
ンスオリゴヌクレオチドのDNA合成、及び上記の自動β
−シアノエチルホスホラミダイト法を用いる一つのアン
チセンスオリゴヌクレオチドのDNA合成、 −DNA重複体を形成するためにハイブリッド形成によっ
てセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを結合す
る、 −生成されたDNA重複体を適当なプラスミドベクター中
にクローニングし、制限酵素消化及びアガロースゲル電
気泳動のような古典的方法に従ってDNAを回収する。二
本鎖核酸の場合、100ヌクレオチド、又は100bpより長い
核酸の化学的製造方法には、以下の工程が含まれる： −化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの収集。その
末端に異なる制限部位を有する場合、その配列は、Pro
c.Nat.Acad.Sci.USA 80;7461−7465,1983に記載された
原理によれば、天然ペプチドのアミノ酸列に一致する。
−それによって生成されたDNA重複体を適当なプラスミ
ドベクター中にクローニングし、制限酵素消化及びアガ
ロースゲル電気泳動のような古典的方法に従って所望の
核酸を回収する。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドに対して産生
される抗体それ自体に関する。
言うまでもなく、この産生はポリクローン抗体に限定
されない。
本発明はさらに、一方で本発明の精製ポリペプチドに
対して免疫された動物、特にマウス又はラットの脾臓細
胞と、他方骨髄腫細胞株の細胞とから古典的方法によっ
て生成され易く、動物を免疫するために最初に用いられ
たポリペプチドを認識するモノクローン抗体を産生する
その能力によって選択される任意のハイブリドーマによ
り産生される任意のモノクローン抗体に関する。
本発明はさらに、酵素、蛍光、又は放射能等の適当な
標識によって標識化される本発明の任意の抗体に関す
る。
抗体、特にモノクローン抗体を生成するのに用いると
有益であるペプチドを、次の表４に示す： アミノ酸配列は１文字コードで示されている。
表４に記載されたペプチドは、それらの意図される用
途によって変化し得る。例えば、ペプチドが抗血清を生
成するために用いられる場合は、そのペプチドは付加さ
れる余分のシステイン残基を伴って合成され得る。この
余分のシステイン残基は、好ましくはアミノ末端に付加
され、そして小ペプチドを免疫原性にするのに必要な担
体蛋白質にペプチドが結合し易くする。ペプチドがラジ
オイムノアッセイに使用するために標識化される場合、
ヨウ素化を促すためにアミノ又はカルボキシル末端にチ
ロシンを付加した蛋白質を合成するのが有益である。し
たがって、これらのペプチドは表４に記載されたペプチ
ドの一次配列を有するが、しかし、蛋白質のその一次配
列中に認められない、そしてその唯一の機能はペプチド
に所望の化学的特性を付与することである付加的アミノ
酸を伴う。
本発明はさらに、その抗体を含有し易いヒトの生物学
的試料中の結核に関連したin vitroでの抗体の検出方
法に関する。この方法は： −生物試料を、上記のポリペプチドと生物試料中に存在
する可能性のある抗体との間のin vitro免疫反応を可
能にする条件下で、本発明のポリペプチド又はペプチド
と接触させ、そして −生成され得る抗原／抗体複合体をin vitro検出する 工程から成る。
好ましくは、生物培地はヒト血清で構成される。
検出は、任意の古典的方法によって実施し得る。
例えば、好ましい方法としては、エライザELISA法又
は蛍光抗体法又はラジオイムノアッセイ（RIA）等によ
る免疫酵素的方法が挙げられる。
したがって、本発明はさらに、酵素、蛍光、放射能等
の適切な標識で標識化される本発明の任意のポリペプチ
ドに関する。
結核に関連したin vitroでの抗体を検出するための
このような方法は、例えば次の： −滴定マイクロプレートのウェルに確定量の本発明のポ
リペプチド組成物を固定させ、 −上記のウェルに診断すべき血清の段階希釈液を入れ、 −マイクロプレートをインキュベーションし、 −マイクロプレートを繰り返し洗浄し、 −マイクロプレートのウェルに血液イムノグロブリンに
対する標識抗体を入れ、 −少なくとも指定の波長でのこの基質の放射線の吸収を
改変することにより基質を加水分解できるものの中から
選択される酵素によってこれらの抗体を標識化し、 −加水分解基質の量の対照基準と比較することによって
検出する 工程から成る。
本発明はさらに、それらを含有し得るヒトの生物試料
中のヒト結核菌のin vitroでの抗原の検出及び同定方
法に関する。この方法は： −生物試料を、上記の抗体と生物試料中に存在する可能
性のあるヒト結核菌の抗原との間のin vitro免疫反応
を可能にする条件下で、本発明の適切な抗体と接触さ
せ、そして生成され得る抗原／抗体複合体をin vitro
検出する 工程から成る。
好ましくは、生物培地は痰、胸膜滲出液、気管支肺胞
洗浄液、尿、生検又は剖検検体で構成される。
適切な抗体は、表４に記載されたペプチドに対するモ
ノクローン抗体が有益である。
本発明はさらに、ヒト結核菌に感染し易い患者におけ
る結核のin vitro診断のための別の方法に関する。こ
の方法は： −上記のようなDNAプライマー組の方法により上記の患
者から採取した生物試料中に含有され得る本発明のヌク
レオチド配列の量を予め増幅させ、 −上記のプローブ及び上記のヌクレオチド配列間で生成
されるハイブリッド形成複合体の産生を可能にする条件
下で、上記の生物試料と本発明のヌクレオチドプローブ
とを接触させる 工程から成る。
上記のようにヒト結核菌に感染し易い患者における結
核のin vitro診断を実施するために、次の必要物質又
はキットを使用する。その必要物質又はキットとして
は： −本発明の確定量のヌクレオチドプローブ、 −検出すべき配列と上記のプローブとの間のハイブリッ
ド形成反応を生じるために有益な、適切な培地、 −ハイブリッド形成反応中にヌクレオチド配列とプロー
ブとの間に形成されるハイブリッド形成複合体の検出を
可能にするのに有益な試薬 が含まれる。
本発明はさらに、ヒト結核菌に感染し易い患者におけ
る結核のiv vitro診断のための別の方法に関する。こ
の方法は： −患者から採取した生物試料を、上記のポリペプチド又
はペプチドと生物試料中に存在する可能性のある抗体と
の間のin vitro免疫反応を可能にする条件下で、本発
明のポリペプチド又はペプチドと接触させ、そして −生成された可能性のある抗原／抗体複合体をin vitr
o検出する 工程から成る。
ヒト結核菌に感染し易い患者における結核のin vitr
o診断を実施するために、次の必要物質又はキットを使
用する。その必要物質又はキットとしては： −本発明のポリペプチド又はペプチド、 −免疫反応に適した培地を作製するための試薬、 −免疫反応によって産生された抗原／抗体複合体の検出
を可能にする試薬（この試薬は、特に上記のポリペプチ
ド又はペプチドが標識化されない場合、おそらく標識を
有するかあるいは標識化試薬に認識され易い）が含まれ
る。
本発明はさらに、ヒト結核菌に感染し易い患者におけ
る結核のin vitro診断のための別の方法に関する。こ
の方法は： −生物試料を、上記の抗体と生物試料中に存在する可能
性のあるヒト結核菌の抗原との間のin vitro免疫反応
を可能にする条件下で、本発明の適切な抗体と接触さ
せ、そして生成され得る抗原／抗体複合体をin vitro
検出する 工程から成る。
適切な抗体は、表４に記載されたペプチドに対するモ
ノクローン抗体が有益である。
ヒト結核菌に感染し易い患者における結核のin vitr
o診断を実施するために、次の必要物質又はキットを使
用する。その必要物質又はキットとしては： −本発明の抗体、 −免疫反応に適した培地を作成するための試薬、 −免疫反応によって産生された抗原／抗体複合体の検出
を可能にする試薬（この試薬は、特に上記の抗体が標識
化されない場合、おそらく標識を有するかあるいは標識
化試薬に認識され易い） が含まれる。
結核のin vitro診断に有益なキットには： −少なくとも好適な固相系、例えばin vitro診断すべ
き生物試料をそこに固定させるためのマイクロプレー
ト、 −本発明のモノクローン抗体の一つを含有する試料、 −上記のモノクローン抗体のための特異的検出系、 −一方では試験試料と上記のモノクローン抗体との、他
方で結合モノクローン抗体と検出系との間の免疫反応を
実施するのに適した緩衝液 が含まれる。
本発明はさらに、本発明のポリペプチド又はペプチド
の一つの試料を含む、上記のようなキットに関する。本
発明の上記の抗原は、競合投薬法で用いられるキットに
対して、求められる抗原に関する基準（求められるヒト
結核菌の抗原の定量測定のための）、又は競合体であ
る。
製薬上受容可能なビヒクルを伴って本発明のポリペプ
チド又はペプチドは、これらを包含する免疫原性組成物
とされる。
その他の免疫原性成分の中で、天然蛋白質と、あるい
は抱合体が、ヒト結核菌を中和する抗体のin vivo産生
を誘発するか、又はヒト結核菌抗原反応性Ｔ細胞を活性
化することによって細胞免疫反応を in vivoで誘発す
ることができるような十分な分子量を有する合成ポリペ
プチドと結合する可能性のある本発明のポリペプチド又
はペプチド、もしくは本発明の発現物質は、そのいずれ
かを包含するワクチン組成物として使用される。
免疫原性成分として用いると有益な本発明のペプチド
は、以下の配列の一つを有する： アミノ酸配列は１文字コードで示されている。
本発明のその他の特徴及び利点は、本発明を説明する
以下の実施例及び図面において、明らかになる。
図１（Ａ）及び１（Ｂ）は、６つの精製λgt11ヒト結
核菌組換えクローンの鑑定を示す。図１（Ａ）は、クロ
ーン15、クローン16、クローン17、クローン19、クロー
ン24、及びEcoR I−Hind III消化ラムダDNA分子量マー
カーレーン（キロ塩基対）（Ｍ）（Boehringer）のEcoR
I制限分析に相当する。
図１（Ｂ）は、クローン15、クローン16、クローン1
7、クローン19、クローン23及びクローン24で溶原化さ
れた大腸菌E.coliの粗製溶解物のイムノブロッティング
分析を示す。
矢印（←）は、組換えλgt11−ヒト結核菌クローンに
よって生成された融合蛋白質を示す。発現及びイムノブ
ロッティングは上記と同様であった。分子量（kDaで示
される）は分子量マーカー（高分子SDSキャリブレーシ
ョンキット,Pharmacia）との比較により見積もった。
図２は、上記のようにポリクローン抗32kDa（BCG）抗
血清で確認されたλgt11ヒト結核菌組換えクローン17及
び24のDNA挿入物の、並びにクローン17の120bpEcoR I−
Kpn Ｉ制限断片とのハイブリッド形成によって選択さ
れたクローンBy1、By2、及びBy5の制限地図に相当す
る。
DNAは、メーカー（Promega）の記載通りに、ラムダSo
rbファージ免疫吸着剤を用いて、λgt11ファージストッ
クから単離した。制限部位は上記のように位置した。い
くつかの制限部位（＊）はヌクレオチド配列のコンピュ
ーター分析から推論した。
短い垂直線（｜−｜）は組換えクローンのDNA挿入物
を取り囲むEcoR I部位由来リンカーを表す。その下の部
分はシーケンシングされた分子量32kDaの抗原を含むDNA
領域を拡大したものである。矢印はジデオキシシーケン
シングの計画及び方向を示す。（→）Bluescribe M13
中にサブクローンされる断片；（）mp10及びmp11 M1
3ベクター中にサブクローンされる断片：（■→）合成
オリゴヌクレオチドを用いて確定される配列。
図3a及び3bは本発明の抗原の一般式のヌクレオチド及
びアミノ酸配列を示す。
図4a及び4bは本発明の抗原の一つのヌクレオチド及び
アミノ酸配列を示す。
大腸菌E.coli共働プロモーター配列に類似した２つの
配列群は矩形で囲まれていて、共働に対する相同はイタ
リック体の太字で示される。肉太ローマ字は推定上のSh
ine−Dalgarnoモチーフを表す。
二重線のアンダーラインを施された成熟蛋白質のNH2
末端アミノ酸配列は、MPB59抗原のもの（34）と非常に
相同−29/32アミノ酸−である。273番目のATGの上流の
５つの別のATGコドンが示されている（点線アンダーラ
イン）。垂直矢印（↓）はクローン17及びクローン24の
推定NH2末端を示す。ここで任意になされたオプション
は、ATG183に対応する59アミノ酸シグナルペプチドを表
す。
図５は本発明の32kDaの抗原のヌクレオチド及びアミ
ノ酸配列を示す。
二重線のアンダーラインを施された成熟蛋白質のNH2
末端アミノ酸配列は、MPB59抗原のもの（34）と非常に
相同−29/32アミノ酸−である。垂直矢印（↓）はクロ
ーン17及びクローン24の推定NH2末端を示す。
図６は32kDaの分子量の本発明の抗原の、及びBCGのα
抗原（17）の水治療法パターンである。
図７は、本発明の32kDaの抗原のアミノ酸配列とBCGの
α抗原のアミノ酸配列（改変翻訳）との間の相同性を示
す。
同一アミノ酸（：）、アミノ酸の進化的に保存された
置換（．）、及び相同性なし（）が示されている。アン
ダーラインを施された配列（＝）はシグナルペプチドを
表し、ここで任意に採択されたオプションはATG91に対
応する43アミノ酸シグナルペプチドを表す。
配列中のダッシュは最適列を得るために必要な区切り
を示す。
図８は、本発明の32kDaの蛋白質がヒト結核血清によ
って選択的に認識されるという事実を説明する。
図８は、ヒト結核血清、及び抗β−ガラクトシダーゼ
モノクローン抗体によるイムノブロッティングを表す。
レーン１〜6:融合蛋白質（140 kDa）を発現する大腸菌
溶解物；レーン７〜12:未融合β−ガラクトシダーゼ（1
14 kDa）。クローン17のDNA挿入物（2.7kb）をpUEX2中
でサブクローニングし、融合蛋白質の発現をBresson及
びStanley（４）が記載したようにして誘発した。レー
ン１及び７は抗βガラクトシダーゼでプローブした：レ
ーン４、５、６、及び10、11、12は、32kDaの本発明の
精製蛋白質に対して高度に反応する３種類の異なるヒト
結核血清でプローブした；レーン２及び３なら８及び９
は２つの異なる低反応血清でプローブした。
図９は、本発明のヒト結核菌の32kDa蛋白質遺伝子の
核酸配列（上部ライン）を表しており、これは本発明の
図５の配列、図4a及び4bの遺伝子の配列（中間ライ
ン）、並びにBCGのα抗原に関する遺伝子の配列（下部
ライン）に対応する。
配列中のダッシュは、核酸配列の最適列を得るのに必
要な区切りを示す。
酵素的増幅のプライマー領域を矩形で囲んである（P1
〜P6）。
特異的プローブ領域を矩形で囲み、それぞれプローブ
領域Ａ、プローブ領域Ｂ、プローブ領域Ｃ、プローブ領
域Ｄ、プローブ領域Ｅ及びプローブ領域Ｆと定める。
１番目のヌクレオチド（図９の）が図3aのヌクレオチ
ド234に、そして図５のヌクレオチド91に対応するため
に、ヌクレオチドの番号付けは図3a及び図3b、並びに図
５の番号付けとは異なっている。
図10aは、大腸菌における本発明のP32抗原の発現のた
めに実施例IVで用いられるpIGRIプラスミドの制限及び
遺伝子地図を示す。
この図では、アンダーラインを施された制限部位が独
特である。
図10bは、pIGRI核酸配列に対応する。
この図における、プラスミドpIGRIを構築するために
用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下に示す。
位置 3422−206: pPL（λ）のEcoR IブラントMbo IIブラン
ト断片を含有するラムダPL（Pharmacia） 207−384: 合成DNA配列 228−230: 第一シストロンの開始コドンATG 234−305: 成熟マウスTNFの２〜25アミノ酸をコ
ードするDNA 306−308: 第一シストロンの停止コドン（TAA） 311−312: 第二シストロンの開始コドン（ATG） 385−890: pKK223からのHind III−Ssp I断片を含有
するrrnBT1T2（Pharmacia） 891−3421: テトラサイクリン耐性遺伝子を含有するpA
T153（Bioexcellence）のDra I−EcoR Iブラント断片、
及び複製の起始 後述の表５は、pIGRIの完全制限部位分析を示す。
図11aは、大腸菌における本発明のP32抗原の発現のた
めに実施例Ｖで用いられるpmTNF MPHプラスミドの制限
及び遺伝子地図を示す。
図11bは、pmTNF−MPH核酸配列に対応する。
この図における、プラスミドpmTNF−MPHを構築するた
めに用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下に示
す。
位置 1−208: pPL（λ）のEcoR IブラントMbo IIブラン
ト断片を含有するラムダPL（Pharmacia） 209−436: 合成DNA断片 230−232: mTNF融合蛋白質の開始コドン（ATG） 236−307: 成熟マウスTNFの２〜25アミノ酸をコ
ードする配列 308−384: 315−332番目の配列をコードするHis
6を含有する多クローニング部位 358−436: 大腸菌trpターミネーターを含有する
Hind III断片 437−943: pKK223（Pharmacia）からのHind III−Ssp
I断片を含有するrrnBT1T2 944−3474: テトラサイクリン耐性遺伝子を含有する pAT153（Bioexcellence）のDra I−EcoR Iブラント断
片、及び複製の起始 後述の表６は、pmTNF−MPHの完全制限部位分析を示
す。
図12aはプラスミドpIGRIにおけるP32抗原のサブクロ
ーニングのために実施例IVに記載されたように、中間構
築物pIG2 Mt32を作成するために用いられるプラスミド
pIG2の制限及び遺伝子地図を示す。
図12bは、pIG2核酸配列に対応する。
この図における、プラスミドpIG2を構築するために用
いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下に示す。
位置 3300−206: pPL（λ）のEcoR I Mbo IIブラント断片
を含有するラムダPL（Pharmacia） 207−266: ATG開始コドンが232−234番目にある多ク
ローニング部位及びリボソーム結合部位を含有する合成
配列 267−772: pKK223（Pharmacia）からのHind III−Ssp
I断片を含有するrrnBT1T2 773−3300: テトラサイクリン耐性遺伝子、及びpAT153
（Bioexcellence）のEcoR I−Dra I断片を含有する複製
の起始 表７は、pIG2の完全制限部位分析を示す。
図13は全融合蛋白質mTNF−His6−P32のアミノ酸配列
に対応する。
この図において： −実線のアンダーラインを施された配列（＿）はmTNF配
列（最初の25アミノ酸）を表し、 −点線アンダーラインを施された配列 はポリリンカー配列を表し、 −二重線アンダーライン配列（＝）はクローニング部位
で作られた余分のアミノ酸を表し、そして −無印のアミノ酸は図５の４番目のアミノ酸を起点とす
る抗原配列である。
図14a及び14bは、実施例VIに示されるK12ΔＨにおけ
るmTNF−His6−P32融合蛋白質の発現に対応し、図14aは
Coomassie Brilliant Blue染色SDS−PAGEを表し、図1
4bは抗32kDa及び抗mTNF−抗体によるゲルのイムノブロ
ットを表す。
図14aにおいて、レーンは以下のように対応してい
る： レーン 1.蛋白質分子量マーカー 2.pmTNF−MPH−Mt32 28℃ １時間導入 3.pmTNF−MPH−Mt32 42℃ １時間導入 4.pmTNF−MPH−Mt32 42℃ ２時間導入 5.pmTNF−MPH−Mt32 42℃ ３時間導入 6.pmTNF−MPH−Mt32 28℃ ４時間導入 7.pmTNF−MPH−Mt32 42℃ ４時間導入 8.pmTNF−MPH−Mt32 28℃ ５時間導入 9.pmTNF−MPH−Mt32 42℃ ５時間導入 図14bでは、レーンは以下のように対応している： レーン 1.pmTNF−MPH−Mt32 28℃ １時間導入 2.pmTNF−MPH−Mt32 42℃ １時間導入 3.pmTNF−MPH−Mt32 28℃ ４時間導入 4.pmTNF−MPH−Mt32 42℃ ４時間導入 図15は、実施例VIIに示されるように、pHの漸減を伴
う組換え抗原のIMAC溶離プロフィルを示す。
図16は、実施例VIIに示されるように、イミダゾール
濃度の漸増を伴う組換え抗原のIMAC溶離プロフィルを示
す。
図17は、実施例VIIに示されるように、イミダゾール
濃度の増加の段階勾配を示す組換え抗原のIMAC溶離プロ
フィルを示す。
実施例I: 材料と方法 抗32kDa抗血清によるλgt11ヒト結核菌組換えDNAライブ
ラリーのスクリーニング ヒト結核菌（Erdman株）のゲノムDNAから作成される
λgt11組換えライブラリーは、R.Young（35）から入手
した。文献の記載内容（14,35）に後述するいくつかの
変更を加えて、スクリーニングを実施した。λgt11感染
大腸菌E.coli Y1090（150mmプレート当たり105pfu）を
NZYMプレート（Gibco）上に植え付け（16）、42℃で24
時間インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ融合蛋
白質の発現を誘発するために、プレートにイソプロピル
β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）−飽和フィルター
（Hybond Ｃ extra,Amersham）をかぶせて、37℃で２
時間インキュベートした。ポリクローンウサギ抗32kDa
抗血清を用いてスクリーニングを実施した。上記のポリ
クローン抗血清ウサギ抗32kDa抗血清は、以下のようにP
32ウシ結核菌BCG（1173P2株−Institut Pasteur Pari
s）に対する抗血清を生じさせることにより得られた：
生理的食塩水1ml当たり400μｇ（ウシ結核菌BCGの精製P
32蛋白質）を１容積の不完全フロイントアジュバントと
混合した。その物質をホモジナイズし、０、４、７及び
８週目に、ウサギの背中の10部位にわたって50μｌの用
量で皮内注射した（アジュバントは最後の注射に関して
は、希釈液と置き換えた）。１週間後、ウサギを採血
し、アリコートに分ける前に抗体レベルに関して血清を
調べ、−80℃で保存した。
ポリクローンウサギ抗32kDa抗血清を大腸菌溶解物上
で予吸収し（14）、1:300の最終希釈で用いた。1:5000
に希釈された二次アルカリホスファターゼ抗ウサギIgG
標識（Promega）を用いて、β−ガラクトシダーゼ融合
蛋白質を検出した。発色させるために、ニトロブルーテ
トラゾリウム（NBT）及び燐酸５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル（BCIP）を用いた。フィルター上の反
応領域は、30分以内に濃紫色に変わった。通常、三連続
精製工程を実施して、純粋なクローンを得た。IPTG、BC
IP、及びNBTは、Promega corp.（Madison WI.）から入
手した。
後述の二次クローンBY1、BY2及びBY5を得るためのハイ
ブリッド形成による−プラークスクリーニング 用いた手法は、Maniatisら（14）が記載したものであ
った。
λgt11組換え溶原菌からの粗製溶解物の調製 大腸菌E.coli Y1089のコロニーを、Hyunhら（14）が
記載したように適切なλgt11組換え体で溶原化した。溶
原化E.coli Y1089の単一コロニーをLB培地中に接種し、
30℃で600nmで0.5の光学密度に増殖させた。45℃で20分
のヒートショック後、IPTGを加えて最終濃度を10mMにす
ることによって、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の産
生を誘発した。37℃で60分間インキュベーションを継続
し、遠心分離して細胞を素早く集めた。細胞を緩衝液
（10mM トリス pH 8.0,2mM EDTA）中に50倍に濃縮し、
直ちに液体窒素中に凍結した。試料は解氷して溶解し、
EcoR I制限緩衝液中の100μg/m1DNaseIで、37℃で５−1
0分間処理した。
イムノブロッティング（ウエスタンブロッティング）分
析： SDS−PAGE電気泳動処理後、組換え溶原菌蛋白質を、T
owbinら（29）が記載したようにニトロセルロース膜（H
ybond C,Amersham）上にブロッティングした。E.coli Y
1089のβ−ガラクトシダーゼに融合されたマイコバクテ
リア抗原の発現は、上記の段落“抗32kDa抗血清による
λgt11ヒト結核菌組換えDNAライブラリーのスクリーニ
ング”に記載のようにして得られたポリクローンウサギ
抗32kDa抗血清（1:1000）の結合により、モノクローン
抗−β−ガラクトシダーゼ抗体（Promega）を用いて視
覚化された。1:5000に希釈された二次アルカリホスファ
ターゼ抗ウサギIgG標識（Promega）を用いて融合蛋白質
を検出した。
これらの種々の抗体の使用により、β−ガラクトシダ
ーゼ融合蛋白質の検出が可能になる。非融合−β−ガラ
クトシダーゼも同一ゲル中に存在し、結核患者からの血
清によって認識されないという事実のために、この反応
は、ヒト結核菌蛋白質に依っている。
ヒト結核血清による組換え融合蛋白質の選択的認識を
確認するために、ニトロセルロースシートをこれらの血
清（1:50）とともに一晩インキュベートした（非特異的
蛋白質結合部位をブロッキングした後）。ヒト結核血清
は、以前記載されたように（31）ドットブロット検定で
試験されたウシ結核菌BCGの精製32kDa抗原に対するそれ
らの反応性（高いか低いか）に関して選択された。ニト
ロセルロースシート上の反応領域は、ペルオキシダーゼ
標識ヤギ抗ヒトIgG（Dakopatts,Copenhagen,Denmark）
（1:200）とともに４時間インキュベートすることによ
って明示され、数回洗浄後、ペルオキシダーゼ及び過酸
化水素の存在下でペルオキシダーゼ基質（α−クロロナ
フトール）（Bio−Rad）を添加することによって発色反
応が現れた。
組換えDNA分析 精製λgt11クローンにおけるヒト結核菌DNA挿入物の
最初の確認は、EcoR I制限によって行った。消化後、切
り取られた挿入物をアガロースゲル上で動かして、サザ
ンハイブリッド形成を施した。プローブは、ランダムプ
ライミング（10）によりα32P−dCTPで標識化した。そ
の他の制限部位は、Hind III、Pst I、Kpn I、Acc I及
びSph Iによる組換えλgt11ファージDNA又はそのサブク
ローン化EcoR I断片の単一及び二重消化によって位置を
定めた。
シーケンシング Bluescribe−M13（６）における、又はmp10及びmp11M
13ベクター（Methods in Enzymology,vol,101,1983,p.2
0−89,Joachim Messing,New M13 vectors for cloning,
Academic Press）における特定の断片のサブクローニン
グ後、Sangerら（25）のプライマー延長ジデオキシ終止
法によって配列分析を行なった。配列分析は、ヒト結核
菌DNAの高GC含量（65％）により非常に妨げられた。し
たがって、シーケンシング反応はいくつかのDNAポリメ
ラーゼ:T7DNAポリメラーゼ（“シケナーゼ"USB）、DNA
ポリメラーゼＩのKlenow断片（Amersham）を用いて、そ
していくつかの場合にはAMV逆転写酵素（Super RT,Angl
ian Biotechnology Ltd.）を用いて、そして時としては
dGTPの代わりにdITPを用いて実施した。配列の不明確な
領域に焦点を合わせるために、オリゴデオキシヌクレオ
チドを合成して、使用した。シーケンシング法は図２に
要約されている。いくつかの不明確な領域における人為
的に生じた可能性があるフレームシフトを突き止めるた
めに、特別なプログラムを用いて、高比率のGCを含有す
る配列における最も可能性のあるオープンリーディング
フレームを限定した（３）。人工産物を特にシーケンシ
ングしがちないくつかの領域が、化学的シーケンシング
（18）によって確証又は修正された。このために、化学
的シーケンシングベクターpGV462（21）中で断片をサブ
クローニングし、前述のように分析した。選択された約
250〜350bpの制限断片を単離し、Klenowポリメラーゼ又
はMungマメヌクレアーゼで処理してブラントエンドとし
て、pGV462のSma I又はHinc II部位でサブクローニング
した。Tth 111I又はBstE II（32）での単一末端標識
化、及び化学的変質法の変法（33）により、挿入DNAの
両鎖をシーケンシングした。
核酸及び推定上のアミノ酸配列の常用のコンピュータ
ーを用いた分析を、Bellon（２）からのLGBCプログラム
で実施した。Pearson及びLipman（23）からのFASTAプロ
グラムを用いた相同性調査、並びにNational Biomedica
l Research Fundation−Washington（NBRF）（NBRF/PIR
データバンク）からの蛋白質同定源（PIR）は、16を公
表する（1988年３月）。
結果 −ポリクローン抗32kDa抗血清によるλgt11Mヒト結核菌
組換えDNAライブラリーのスクリーニング： 1.5×106プラークを示すフィルター10個をポリクロー
ンウサギ抗32kDa抗血清（８）でプローブした。精製
後、６つの別々の陽性クローンを得た。
組換えクローンの分析 これら６つの精製λgt11組換えクローンDNAのEcoR I
制限分析（図1A）から、４種類の異なる挿入物が明示さ
れた。クローン15は、1.8kb、1.5kb及び0.5kbの３つのD
NA断片を生じる２つの付加的内部EcoR I部位を伴う全長
3.8kbの挿入物を有した。クローン16のDNA挿入物は、1.
7kb長であった。クローン17及び19は、それぞれ2.7kb及
び2.8kbというほぼ同じ長さのDNA挿入物を有した。
最後に、クローン23（図示していない）及びクローン
24はともに、2.3kb及び1.7kbの２つの断片を生じる１つ
の別のEcoR I制限部位を伴う4kbの挿入物を含有した。
サザン分析（データは示されていない）から、クローン
15、16、19のDNA挿入物及びクローン24の小断片（1.7k
b）はそれ自体とハイブリッドを形成するだけである
が、一方クローン17（2.7kb）はそれ自体とハイブリッ
ドを形成するがしかし同等にクローン24の2.3kbDNA断片
とも良くハイブリッドを形成することが示された。した
がって、クローン15、16及び19は17、23、24群と全く別
で、無関係である。この解釈は、適切なλgt11組換え体
で溶原化され、IPTGで誘発されるE.coli Y1089の粗製溶
解物の分析によって、さらに確証された。ウエスタンブ
ロット分析（図1B）は、クローン15、16及び19を発現す
る細胞中でポリクローン抗32kDa抗血清と反応する、成
熟又は不完全な融合蛋白質を示さなかった。したがっ
て、クローン15、16及び19は、擬陽性であると考えられ
て、それ以上調べなかった。これに対して、クローン23
及び24で溶原化される細胞は、32kDaのうち約10kDaを含
有する免疫反応性融合蛋白質を産生した。最後に、クロ
ーン17は、外来ポリペプチド部分が約25kDa長である融
合蛋白質を発現した。クローン24の2.3kb挿入物、及び
クローン17の2.7kb断片の制限エンドヌクレアーゼ地図
（図２）により、２つの挿入物を並べ、且つ配向するこ
とができたが、これは、クローン17の2.7kb断片がクロ
ーン24の2.3kb挿入物を５′方向に±0.5kb延長したもの
に相当することを示唆している。
クローン17が不完全であったので、同一λgt11組換え
ヒト結核菌DNAライブラリーを、クローン17のDNA挿入物
の丁度５′末端に対応する120bpEcoR I−Kpn 1制限断片
（ベクタークローニング系により市販のブルースクリブ
ベクター中に以前サブクローンされた（Stratagene ク
ローニング系））（図２）とのハイブリッド形成によっ
てスクリーニングした。３つの５′−延長クローンBy
1、By2及びBy5を単離し、制限によって分析して、並べ
た。最大挿入物By5は、3.1kb上流まで及び1.1kb下流ま
で並べられた全コード領域（下記参照）に関する情報を
含有した（図２）。
DNA配列 種々のλgt11重複クローンに由来する1358塩基対ヌク
レオチド配列を図3a及び図3bに示す。DNA配列は、183番
目で開始し、1242番目でTAGコドンによって終止する105
9塩基対のオープンリーディングフレームを含む。360番
目でTTTコドンによって開始するヌクレオチド配列から
このオープンリーディングフレーム内に位置し得るNH2
−末端アミノ酸配列（phe−ser−arg−pro−gly−leu−
pro−val−glu−tyr−leu−gln−val−pro−ser−pro−
ser−met−gly−arg−asp−ile−lys−val−gln−phe−
gln−ser−gly−gly−ala−asn）が、20、21、31番目の
アミノ酸（MPB 59においてはそれぞれgly、cys及びasn
である（34））を除いて、MPB 59抗原の同一NH2末端ア
ミノ酸配列に対応するということが見いだされる。した
がって、この配列の上流のDNA領域は、32kDaの蛋白質の
分泌に必要なシグナルペプチドをコードすることが予測
される。したがって、成熟蛋白質は、おそらく、Ｎ−末
端Phe（TTTコドン）からＣ−末端Ala（GCCコドン）まで
の295アミノ酸残基から成る（図５）。
６つのATGコドンは、同一リーディングフレームの360
番目のTTTの前に位置するが判明した。同一リーディン
グフレームの任意のこれらのATGを用いると、29、42、4
7、49、55及び59残基のシグナルペプチドの合成が起こ
る。
水治療法パターン 本発明の32kDaの蛋白質の、そしてBCGのα抗原（17）
の水治療法パターンコード配列を、KyteとDoolittleの
方法（15）によって調べた。ノナペプチドプロフィルを
図６に示す。最初の疎水性シグナルペプチド領域に加え
て、いくつかの親水性ドメインが確認された。本発明の
32kDa蛋白質の全親水性パターンがBCG α抗原のものに
匹敵するということに注目するとおもしろい。両蛋白質
に関して、最高の親水性を示すドメインは、アミノ酸残
基200と250の間で確認された。
相同性 Matsuoら（17）は、近年、BCGのα抗原をコードする
遺伝子に対応する1095ヌクレオチドクローン化DNAの配
列を発表した。Infection and Immunity,vol.58,p.550
−556,1990で修正されたようなウシ結核菌抗原αの978b
pコード領域と、本発明の32kDa蛋白質の1017bpコード領
域は、942整列領域で、77.5％の相同性を示す。アミノ
酸レベルでは、両先駆体蛋白質配列は、75.6％の同一残
基を占める。さらに、17.6％のアミノ酸が、比較のため
に用いられる算法で限定されるような進化的に保存され
た置換に対応する（PAM250 マトリックス,23参照）。図
７はシグナルペプチドのＮ末端における配列異同を示
す。両成熟蛋白質のアミノ末端配列−32アミノ酸−は、
31番目を除いて同一である。
ヒト血清は組換え32kDa蛋白質を認識する 図８は、クローン17を発現する粗製大腸菌抽出物でイ
ムノブロッティングした場合の結核患者からの血清試料
が、本発明の32kDa蛋白質を含む140kDa融合蛋白質（レ
ーン４〜６）とは明瞭に反応するが、しかし平衡抽出物
中で発現される非融合β−ガラクトシダーゼ（レーン10
〜12）とは反応しないことを示す。本発明の32kDaの精
製蛋白質と殆ど反応しないとして選択された２つの陰性
対照からの血清試料は、本発明の32kDa蛋白質を含む140
kDa融合蛋白質を認識しないか、あるいは非融合β−ガ
ラクトシダーゼを認識しない（レーン2,3ならびに８及
び９）。140kDa融合蛋白質及び非融合β−ガラクトシダ
ーゼは、抗β−ガラクトシダーゼモノクローン抗体と反
応することが容易に突き止められた（レーン１〜７）。
本発明は、32kDaの蛋白質を特にコードするDNA領域を
調製出来た（図５と比較されたい）。上記のDNA領域
は、338コドン（停止コドンは含まれない）のオープン
リーディングフレームを含有する。220番目には、成熟
蛋白質の最初のアミノ酸をコードするTTTの次に32kDaの
成熟蛋白質をコードする295トリプレットが来る。この
オープンリーディングフレームの大きさ、得られた融合
蛋白質の免疫反応性、シグナルペプチドの存在、そして
特に、MPB 59抗原（31/32アミノ酸相同性）において、
並びにBCG α抗原（31/32アミノ酸相同性）において見
い出されるものと非常に相同性が高いNH2−末端領域の
この遺伝子内での確認（図７参照）は、記載されたDNA
断片が、ヒト結核菌により分泌される32kDa蛋白質をコ
ードする全シストロンを含み、今日まで不明確でない方
法で確認されたことがないということを、強く示唆して
いる。
６つのATGコドンは、同一リーディングフレームの220
番目でこのTTTに先行することが判明した。同一オープ
ンリーディングフレームの任意のこれらのATGを用いる
と、43、48、50、56又は60残基のシグナルペプチドの合
成が起こる。これらの種々の可能性のうち、開始はATG
91又はATG52で起きると考えられるが、これは、両方と
ももっともらしい大腸菌様プロモーター及びShine−Dal
garnoモチーフが先行するためである。
開始がATG91で起きる場合、対応するシグナルペプチ
ドは43残基のかなり長いペプチドシグナルをコードす
る。しかしながら、この長さは、グラム陽性細菌からの
分泌蛋白質の間では一般的でない（５）。それは、適当
な距離で、一般的大腸菌Shine−Dalgarnoモチーフ（AGG
AGGと相同の4/6残基）の後に位置する。
開始がATG52で起きる場合、対応するシグナルペプチ
ドは56残基のペプチドシグナルをコードするが、しかし
余り厳格でないShine−Dalgarnoリボソーム結合部位配
列を有する。
翻訳終止トリプレットを取り囲む領域は、シーケンシ
ングゲル上にいわゆる圧縮を生じる二次構造効果に特に
感受性を有した。1105番目のTAG終止コドンの前方で
は、23残基のうち22がＧ−Ｃ塩基対であり、うち９つが
Ｇである。
ATG130の上流では、16ヌクレオチドで分離されるヘキ
サヌクレオチド（TTGAGA）（TTGACAに対する相同性5/
6）及びAAGAATボックス（TATAATに対する相同性4/6）を
含む大腸菌プロモーターに類似の配列（11）が観察され
た。開始コドンと考えられるATG91の上流では、大腸菌
“−35ヘキサヌクレオチド ボックス”と相同のいくつ
かの配列と、その後に続くTATAATに似た配列が検出され
た。これらのうち、最も示唆に富んでいたものを図3a及
び3bに示す。それは、14ヌクレオチドでGATAAG（TATAAT
に対する相同性4/6）から分離される59番目でのTTGGCC
（図3a及び3b）（TTGACAに対する相同性4/6）を含む。
面白いことに、この推論上のプロモーター領域は、BCG
蛋白質α−遺伝子（17）に関して記載されたプロモータ
ー領域との、あるいは65kDa蛋白質遺伝子（26,28）に関
して記載されたものとの広範な配列相同性を共有しな
い。
NBRFデータバンク（公布 16.0）を調べた場合、本発
明の32kDa蛋白質と任意のその他の十分に公知の蛋白質
配列との間の任意の有意の相同性は検出できなかった。
特に、32kDa蛋白質と、ヒトフィブロネクチン受容体
（１）のα及びβサブユニットとの間に有意の相同は観
察されなかった。本発明の32KDa蛋白質のNH2−末端配列
は、BCG MPB59抗原（34）に関して過去に発表されたも
のに対して−29/32アミノ酸−、そしてBCG α抗原の配
列（Matsuo.17）に対して−31/32アミノ酸−相同性が高
く、さらにその最初の６アミノ酸においては、ウシ結核
菌BCGの32kDa蛋白質（９）と同一であった。しかしなが
ら、推定上の開始メチオニンは、α抗原の配列（図７と
比較）とは異なる付加的29又は42アミノ酸疎水性配列に
先行するが、しかし原核生物において分泌されるポリペ
プチドのシグナル配列（22）に寄与する全特徴を示す。
興味深いことに、本発明の核酸（１−1358）（図3a及
び3bと比較）とMatsuoのα抗原のDNAとの間の有意の相
同性は、それらの推論上のプロモーター領域内には存在
しない。
実施例II:ヒト結核菌の32kDa蛋白質の全コード配列を含
む細菌プラスミドの作成 前実施例では、図２において、ヒト結核菌からの32kD
a蛋白質遺伝子領域を包含する種々の重複λgt11単離物
を記載した。いくつかのDNA断片を、Blue Scribe M13＋
プラスミド（Stratagene）中でこれらのλgt11ファージ
からサブクローニングした。これらのプラスミドの中に
は32kDa蛋白質遺伝子の全コード配列を含むものがない
ため、この配列を含有するプラスミドを再構築した。
工程1:DNA断片の調製： １）Blue Scribe M13＋プラスミド（Stratagene）中でB
y5のHind III断片をサブクローニングして得られたプラ
スミドBS−By5−800（図２と比較）を、Hind IIIで消化
して800bpの断片を得て、電気溶離によって１％アガロ
ースゲルから単離した。
２）Blue Scribe M13＋プラスミド（Stratagene）中で
λgt11−17からの2.7kbEcoR I挿入物をサブクローニン
グして得られたプラスミドBS−4.1（特許出願の図２を
参照）を、Hind III及びSph Iで消化して1500bpの断片
を得て、電気溶離によって１％アガロースゲルから単離
した。
３）メーカーの指示に従って、Blue Scribe M13＋をHin
d III及びSph Iで消化し、子牛腸のアルカルホスファタ
ーゼ（分子生物学に関する特殊な品質、Boehringer Man
nheim）で処理した。
工程2:連結反応： 連結反応は、次のものを含有した： 125ngの800bp Hind III断片（１） 125ngの1500bp Sph I−Hind III挿入物（２） 50ngのHind III−Sph I消化BSM13＋ベクター（３） ２μｌの10連結反応緩衝液（Maniatisら 1982） １μｌ（＝2.5U）のT4DNAリガーゼ（Amersham） ４μｌのPEG6000,25％（W/V） ８μｌのH2O インキュベーションは、16℃で４時間であった。
工程3:形質転換 メーカーの指示通りに、100μｌのDH5a 大腸菌（Gib
co BRL）を10μｌに連結反応液で（工程２）形質転換
し、IPTG,X−Galアムビシリンプレート上に広げた。約7
0の白色コロニーが得られた。
工程4: 800bp断片を両配向で挿入し得た場合、229及び294bp
の小断片の存在を特徴とするクローン（クローン11とは
異なる）を選択するために、Pst Iで消化することによ
っていくつかのクローンからのプラスミドDNAを分析し
た。この構築物は、正しい配向でHind III−Hind III−
Sph I複合体を含む、この新規の構築物を含有するプラ
スミドを、“BS,BK,P38コンプレット”と名づけた。
実施例III:大腸菌における本発明のポリペプチドの発
現： ポリペプチドをコードするDNA配列、又はその一部
は、発現ベクターの一部であるリボソーム結合部位に結
合し得るか、あるいは発現ベクター上にすでに存在する
別の蛋白質又はペプチドの情報と融合し得る。
前者の場合、情報はこのように発現され、それゆえ任
意の外来配列を欠く（大腸菌によって常に除去されるわ
けではないアミノ末端メチオニンは除く）。
後者の場合、発現蛋白質はハイブリッド又は融合蛋白
質である。
ポリペプチドをコードする遺伝子、及び発現ベクター
を、連結反応を可能にする末端を生じるように、適切な
制限酵素で処理するか、又は別のやり方で操作する。そ
の結果生じる組換えベクターを用いて宿主を形質転換す
る。挿入遺伝子の存在及び適正な配向に関して、形質転
換株を分析する。さらに、選択された宿主のその他の株
を形質転換するために、クローニングベクターを用いて
もよい。組換えベクターを調製し、それらを宿主細胞に
形質転換し、そしてポリペプチド及び蛋白質を発現する
ための種々の方法及び材料は、Panayatatos,N.が、“Pl
asmids,apractical approach"（ed.K.G.Hardy,IRL Pres
s）pp.163−176,by Old and Primrose,principals of g
ene manipulation（2d Ed,1981）に記載しており、そし
て当業者に十分に公知である。
発現のために種々のクローニングベクターを用い得
る。プラスミドが好ましいけれども、ベクターはバクテ
リオファージ又はコスミドであってもよい。選択される
ベクターは、選択される宿主細胞と協調的であるべきで
ある。
さらに、プラスミドは、形質転換宿主細胞を容易に確
認し、形質転換されていないものと分離できる表現型特
性を有するべきである。このような選択遺伝子は、例え
ばテトラサイクリン、カルベニシリン、カナマイシン、
クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等のような
抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子である。
大腸菌における遺伝子のコード配列を発現するため
に、発現ベクターは、転写及び翻訳に必要なシグナルも
含むべきである。
それゆえ、発現ベクターは、大腸菌中で機能する、合
成又は天然のプロモーターを含有すべきである。好まし
くは、通常は絶対に必要ではないけれども、プロモータ
ーは取扱者が制御できるべきである。大腸菌における発
現のために広範に用いられる制御可能プロモーターの例
としては、lac、trp、tac、並びにラムダPL及びPRプロ
モーターがある。
好ましくは、発現ベクターはさらに、大腸菌中で機能
する転写のターミネーターを含有すべきである。用いら
れる転写のターミネーターの例としては、trp及びrrnB
ターミネーターがある。
さらに、発現ベクターは、下流コード配列の翻訳をそ
してそれ故に発現を可能にする、合成又は天然のリボソ
ーム結合部位を含有すべきである。さらに、外来配列を
欠く発現を所望する場合は、それがその配列をリボソー
ム結合部位の開始コドンに直接連結反応させるように配
置される独特の制限部位が存在すべきである。
この種の発現を実施するのに適したプラスミドは、pK
K233−２（Pharmacia）である。このプラスミドは、trc
プロモーター、lac,Zリボソーム結合部位、及びrrnB
転写ターミネーターを含有する。
さらに好適であるのは、プラスミドpIGI（Innogeneti
cs,Ghent,Belgium）である。このプラスミドは、テトラ
サイクリン耐性遺伝子、及びpAT153（Bioexcellence,Bi
ores B.V.,Woerden,The Netherlandsから市販されてい
る）の複製の起点、ラムダＮ遺伝子の５′未翻訳領域に
おけるMbo II部位までのラムダPLプロモーター（pPL
（λ）から生じる;Pharmacia）を含む。
PLプロモーターから下流には、最初のシストロン（Va
lに変換される１番目のLeuを除いてTNFの最初の25アミ
ノ酸である）の停止コドンがShine−Dalgarno配列と二
次リボソーム結合部位の開始コドンとの間に位置する
“２つのシストロン”の翻訳カセットをコードする合成
配列を導入した。pIGRIの制限及び遺伝子地図を図10aに
示す。
図10b及び表５は、それぞれpIGRIの核酸配列及び完全
制限部位分析を表す。
しかしながら、ハイブリッド蛋白質としての発現を所
望する場合には、発現はさらに、適切な宿主中でこのベ
クターによって（おそらく高度に）発現されるペプチド
又はポリペプチドのコード配列を含有すべきである。
この場合、発現ベクターは、コード配列の下流の一つ
又はそれ以上の制限エンドヌクレアーゼに関する独特の
切断部位を含有すべきである。
このためには、プラスミドpEX1、２及び３（Boehring
er,Mannheim）、並びにpUEX1、２及び３（Amersham）１
が有用である。
それらは、アムビシリン耐性遺伝子及びpBR322（Boli
varら（1977）Gene 2,95−113）、その天然遺伝子croの
最初の９アミノ酸に対するコード配列とともにその５′
末端でラムダPRプロモーターに融合するlac Z遺伝子、
並びにβ−ガラクトシダーゼ融合ポリペプチドの産生を
可能にするlac Zコード配列の３′末端の多クローニン
グ部位を含有する。
pUEXベクターはさらに、バクテリオファージラムダC1
リプレッサー遺伝子のCI857対立遺伝子を含む。
さらに有用なのはプラスミドpmTNF MPH（Innogenetic
s）である。それはテトラサイクリン耐性遺伝子、及びp
AT153（Bioexcellence,Biores B.V.,Woerden,The Nethe
rlandsから市販されている）の複製の起点、Ｎ遺伝子の
５′末端翻訳領域におけるMbo II部位までのラムダPLプ
ロモーター（pPL（λ）から生じる;Pharmacia）、その
後に合成リボソーム結合部位（配列データ参照）、及び
mTNFの最初の25AAをコードする情報（Valに変換される
最初のLeuを除く）を含有する。この配列は、次に、６
つの連続したヒスチジンがならび、次いでいくつかの蛋
白質分解部位（それぞれギ酸、CNBr,カリクレイン、及
び大腸菌プロテアーゼVII感受性部位）が続く。これら
は各々、プラスミドに関して独特の異なる制限酵素（そ
れぞれSma I、Nco I、BspM II及びStu I;制限及び遺伝
子地図 図11a参照）によって容易に得られる。ポリリ
ンカーから下流には、大腸菌trp−ターミネーター（合
成）及びrrnBT1T2（pKK223−３から生じる）を含めてい
くつかの転写ターミネーターが存在する。この全核酸配
列を図11bに示す。
表６は、pmTNF MPHの完全制限部位分析を示す。
６つの連続したヒスチジンの存在により、固定化金属
イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）によ
り融合蛋白質が精製できる。
精製後、ハイブリッド蛋白質の外来部分は、適当な蛋
白質切断法により除去され、次いでその切断物質を、同
一のIMACベースの精製方法を用いて未切断分子から分離
される。
ラムダPL又はPRプロモーターを使用する上記の全プラ
スミドにおいては、宿主の染色体に組み込まれる欠損プ
ロファージ（K12ΔＨ、ATCC第33767号）上に存在する
か、又は二次協調性プラスミド（pACYC誘導体）上に存
在するラムダcI ts 857対立遺伝子の発現により、プロ
モーターを温度制御する。pUEXベクターにおいてのみ、
このcI対立遺伝子は、ベクターそれ自体の上に存在す
る。
上記のプラスミドは例として示したものであって、本
発明の精神又は範囲を逸脱しない限りにおいてその他の
プラスミド又は発現ベクターを用い得る、と理解される
べきである。
プラスミドの代わりにバクテリオファージ又はファー
ジミドを用いる場合は、それは、実質的に、上記のよう
なプラスミドを選択するのに用いたものと同じ特徴を有
するべきである。
実施例IV:プラスミドpIGRIにおけるP32抗原のサブくク
ローニング： DNA1μｇ当たり少なくとも３単位の酵素を用いた以外
は、メーカーが推奨する条件に従って、15μｇのプラス
ミド“BS−BK−P32コンプレット”（実施例II参照）をE
clX I及びBstE II（Boehringer,Mannheim）で消化し
た。EclX Iは226番目で切断し（図５）、BstE IIは1136
番目で切断するので、したがって成熟P32抗原の開始及
び停止コドンは非常に接近する。このDNAは、以後“P32
抗原断片”をコードするDNAと呼ぶ。
“P32抗原断片”をコードするDNA（上記のように）
を、任意の外来配列を欠くポリペプチドの発現のため
に、pIGRI（図10a参照）中でサブクローニングする。P
32リーディングフレームを有するフレーム内に発現ベク
ターのATGコドンを持っていくために、pIG2中に中間構
築物を作成する（制限及び遺伝子地図に関しては、図12
a参照;DNA配列、図12b参照；完全制限部位分析、表７参
照）。
５μｇのプラスミドpIG2をNco Iで消化する。その
５′粘性末端を、脱燐酸化の前に塞ぐ。
したがって、0.5mMの４つのdXTPを全て（Ｘ＝A,T,C,
G）を含有する40μｌのNB緩衝液（0.05M トリス−Cl pH
7.4;10mM MgCl2;0.05％ β−メルカプトエタノー
ル）、及び２μｌの大腸菌DNAポリメラーゼＩのKlenow
断片（5U/μl,Boehringer,Mannheim）中で、15℃で少な
くとも３時間、DNAをインキュベートした。
ブラント化後、DNAを200mM トリス−Cl pH8に対して
平衡された１容積のフェノールで１回、少なくとも２容
積のジエチルエーテルで２回抽出し、最後にメーカー推
奨の“遺伝子クリーンキットTM"（Bio101）を用いて収
集した。次に30μｌのCIP緩衝液（50mM トリス−Cl pH
8、1mM ZnCL2）、及び20〜25単位の子牛腸ホスファター
ゼ（高濃度、Boehringer,Mannheim）中で、DNAを５′末
端で脱燐酸化した。その混合液を37℃で30分インキュベ
ートし、次にEGTA（エチレングリコールビス（β−アミ
ノエチルエーテル）−N,N,N′,N′テトラ酢酸）pH8を加
えて、最終濃度を10mMとした。次いで、その混合液を、
上記のようにフェノールで、その後ジエチルエーテルで
抽出し、1/10容積の3M KAc（Ac＝CH3COO）pH4.8及び２
容積のエタノールを加えてDNAを沈殿させた後、−20℃
で少なくとも１時間貯蔵した。
Biofuge A（Hereaus）中で13000rpmで５分間遠心分離
後、ペレット化DNAをH2Oに溶解して、最終濃度を0.2μg
/μｌとした。
“P32抗原断片”（上記参照）をコードするEclX I−B
stE II断片を１％アガロースゲル（BRL）上で電気泳動
処理してそれを残りのプラスミドから分離し、Millipor
e HVLPフィルター（φ2cm）を通して遠心分離して（２
分間、13000rpm,Biofuge,室温）ゲルから単離し、上記
のようにトリス平衡化フェノールで、次にジエチルエー
テルで抽出した。
次に、メーカーの推奨する“遺伝子クリーンキッ
トTM"（Bio101）を用いてDNAを収集した。
その後、５′粘性末端を、上記のように大腸菌DNAポ
リメラーゼ１のKlenow断片で処理してブラント化し、次
いで、７μｌのH2Oに溶解するために、“遺伝子クリー
ンキット7M"を用いてDNAを再び収集した。
１μｌのベクターDNAを、１μｌの10xリガーゼ緩衝液
（0.5M トリスCl pH7.4,100mM MgCl2、5mM ATP,50mM DT
T（ジチオトレイトール））及び１μｌのT4DNAリガーゼ
（1U/μl,Boehringer,Mannheim）とともに付加する。13
℃で６時間、連結反応を実施し、次にその混合液５μｌ
を用いて、上記のような標準形質転換法、例えばManiat
isらが“Molecular cloning,a laboratory manual",“C
old Spring Harbor Laboratory（1982）に記載の方法に
よって、DH1株（ラムダ）［DH1株−ATCC 第33849号−
野生型バクテリオファージλで溶原化］を形質転換す
る。
個々の形質転換株を増殖させ、標準的手法（遺伝子融
合実験、Cold Spring Harbor Laboratroy（1984）（編
集 T.J.Silhavy,H.L.Berman and L.W.Enquist）を用い
てプラスミドDNAを調製するために溶解し、制限酵素分
析により、プラスミド内の遺伝子の正しい配向に関して
DNA調製物をチェックする。
適正なブラント化に関するチェックは、抗原コード配
列の５′及び３′末端でのNco I部位の復旧を実証する
ことによって実施する。正しい配向でP32抗原断片を含
むクローンの一つを、さらに研究するために保存し、pI
G2−Mt32と命名する。この中間構築物においては、抗原
をコードするDNAはATGコドンを有するフレーム内にはな
い。しかしながら、今日、Nco I断片として別の発現ベ
クターに移動できる。
15μｇのpIG2−Mt32をNco Iで消化する。P32抗原をコ
ードするNco I断片をゲル精製し、上記のようにブラン
ト化する。精製後、“遺伝子クリーンキットTM"を用い
てそれを７μｌのH2Oに溶解する。
５μｇのプラスミドpIGRIを上記のようにNco Iで消化
し、ブラント化して、脱燐酸化する。フェノールで、次
いでジエチルエーテルで抽出し、エタノールで沈殿させ
た後、ペレットをH2Oに溶解して、最終濃度を0.2μg/μ
ｌとする。
上記のようにして、ベクター及び“抗原断片"DNAの連
結反応を行なう。次に、連結反応混合物をDH1株（ラム
ダ）中で形質転換させて、制限酵素分析によってプラス
ミド内の遺伝子の適正な配向に関して個々の形質転換体
を分析する。適正なブラント化に関するチェックは、抗
原コード配列の５′及び３′末端での新規のNsi I部位
の生成を実証することによって行なう。正しい配向でP
32抗原断片を含むクローンの一つを、さらに研究するた
めに保存し、pIGRI.Mt32と命名する。
実施例V:pmTNF MPHにおけるP32抗原のサブクローニン
グ： DNA1μｇ当たり少なくとも３単位の酵素を用いた以外
は、各メーカーが推奨する条件に従って、15μｇのプラ
スミドpIG2 Mt32（実施例IV参照）を制限酵素Nco I（Bo
ehringer,Mannheim）で消化した。
消化後、反応混合物を200mM トリスCl pH8に対して平
衡されたフェノール（１容積）で、その後ジエチルエー
テル（２容積）で２回抽出し、1/10容積の3M KAc（Ac＝
CH3COO）pH4.8及び２容積のエタノールを加えてDNAを沈
殿させた後、−20℃で少なくとも１時間貯蔵した。
Biofuge A（Hereaus）中で13000rpmで５分間遠心分離
後、DNAを１％アガロースゲル（BRL）上で電気泳動処理
する。
上記のように、“P32抗原断片”をコードするDNAを、
Millipore HVLPフィルター（φ2cm）を通して遠心分離
して（２分間、13000rpm,Biofuge,室温）、トリス平衡
化フェノールで１回、次にジエチルエーテルで２回抽出
する。次に、“遺伝子クリーンキットTM"（Bio101）を
用いてDNAを収集し、７μｌのH2Oに溶解する。
Nco Iでの消化によって生じたDNA断片の５′突出末端
を、0.5mMの４つのdXTPを全て（Ｘ＝A,T,C,G）を含有す
る40μｌのNB緩衝液（0.05M トリス−Cl pH7.4;10mM Mg
CL2;0.05％ β−メルカプトエタノール）、及び２μｌ
の大腸菌DNAポリメラーゼＩのKlenow断片（5U/μl,Boeh
ringer,Mannheim）中で、15℃で少なくとも３時間、DNA
をインキュベートすることによって充填した。プラント
化後、DNAをフェノールで、次いでジエチルエーテルで
抽出し、上記の“遺伝子クリーンキットTM"を用いて収
集した。
５μｇのプラスミドpmTNF MPHをStu Iで消化し、次い
で上記のようにフェノールでその後ジエチルエーテルで
抽出して、沈殿させる。制限消化は、分析用1,2％アガ
ロースゲル上で0.5μｇの試料を電気泳動処理して実証
する。
次に、30μｌのCIP緩衝液（50mM トリス−Cl pH8.1mM
ZnCl2）、及び20〜25単位の子牛腸ホスファターゼ（高
濃度、Boehringer,Mannheim）中で自己連結反応を防ぐ
ために、DNAを５′末端で脱燐酸化した。その混合液を3
7℃で30分間インキュベートし、次にEGTA（エチレング
リコールビス（β−アミノエチルエーテル）−N,N,N′,
N′テトラ酢酸）pH8を加えて、最終濃度を10mMとする。
その混合液をフェノールで、次いでジエチルエーテルで
抽出して、上記のようにDNAを沈殿させる。沈殿物を、B
iofuge A（Hereaus）中で13000rpmで４℃で10分間遠心
分離してペレット化し、そのペレットをH2Oに溶解し
て、最終濃度を0.2μg/μｌとした。
１μｌのこのベクターDNAを、“P32抗原断片”（上
記）をコードするDNA断片を含む７μｌ溶液と混合し、
１μｌの10xリガーゼ緩衝液（0.5M トリス−Cl pH7.4,1
00mM MgCl2,5mM ATP,50mM DTT（ジチオトレイトー
ル））＋１μｌのT4DNAリガーゼ（１単位／μl,Boehrin
ger,Mannheim）を加える。その混合液を13℃で６時間イ
ンキュベートし、次に５μｌの混合液を用いて、上記の
ような標準形質転換法、例えばManiatisらが“Molecula
r cloning,a laboratory manual",Cold Spring Harbor
Laboratory（1982）に記載の方法によって、DH1株（ラ
ムダ）を形質転換する。
個々の形質転換株を増殖させ、標準的手法（遺伝子融
合による実験,Cold Spring Harbor Laboratory（1984）
（編集T.J.Silhavy,M.L.Berman and L.W.Enquist））を
用いてプラスミドDNAを調製するために溶解し、制限酵
素分析により、プラスミド内の遺伝子の正しい配向に関
してDNA調製物をチェックする。
正しい配向で抗原断片をコードするDNA配列を含有す
るクローンの一つをさらに研究するために保持し、pmTN
F−MPH−Mt32と命名した。それは、アミノ酸配列の＋４
位置を起点とするP32抗原の全情報をコードする（図５
参照）。全融合蛋白質のアミノ酸配列を図13に示す。
実施例VI:pmTNF−MPH−Mt32からの抗原発現の誘導： Ａ−材料と方法 pmTNF−MPH−Mt32のDNAを、培養の増殖温度を28℃
に、そしてヒートショック温度を34℃に下げる以外は標
準形質転換手法を用いて、大腸菌E.coli K12△Ｈ株（AT
CC 33767）中で形質転換させる。
10μg/mlテトラサイクリンの存在下で、激しく振盪し
ながら28℃で、Luriaブロス中で一晩増殖させた、pmTNF
−MPH−Mt32を有するK12△Ｈの培養を、テトラサイクリ
ン（10μg/ml）を含む新鮮なLuriaブロス中に植えつ
け、一晩置いた培養の場合と同じ条件で、600ナノメー
ターの光学密度が0.2となるよう増殖させる。
600ナノメーターでの光学密度が0.2に達した時点で、
培養の半分を42℃に移して発現を誘発し、一方他の半分
は対照として28℃のままにおく。数回の間隔でアリコー
トを採取し、これをM9塩（0.1％塩化アンモニウム、0.3
％カリウム ジヒドロゲニウムホスフェート、1.5％ニ
ナトリウムヒドロゲニウムホスフェート、12分子の水）
及び１％SDSに対して平衡された１容積のフェノールで
抽出する。同時に、培養の光学密度（600nm）をチェッ
クする。２容積のアセトンを付加して蛋白質をフェノー
ル相から沈殿させて、−20℃で一晩貯蔵する。沈殿物を
ペレット化して（Biofuge A,5分,13000rpm,室温）、空
気乾燥し、光学密度によって１容積のLaemmli（Nature
（1970）227:680）試料緩衝液（＋βメルカプトエタノ
ール）に溶解して、３分間煮沸する。
次に、試料をLaemmli（1970）に従ってSDSポリアクリ
ルアミドゲル上で処理する。Coomassie Brilliant Blue
（CBB）染色、及びイムノブロッティングにより、mTNF
−His6−P32の温度誘導を監視する。CBB染色は1/10希釈
CBB染色液（90mlメタノール:H2O（1:1 v/v）及び10ml氷
酢酸中に溶解した0.5g CBB−R250（Serva））の1/10希
釈液にゲルを浸漬することによって実施し、ゆっくり回
転する台上に約１時間放置する。脱色液（30％メタノー
ル、７％氷酢酸）中で２〜３時間脱色後、蛋白質バンド
が見えるようになるので、それを濃度計（Ultroscan XL
Enhanced Laser Densitometer,LKB）で走査する。
イムノブロッティングに関しては、蛋白質を、Townbi
nら（1979）が記載したようにHybond C膜（Amersham）
上にブロッティングする。ブロッティング後、膜上の蛋
白質をPonceau S（Serva）で一時的に目で見えるように
して、分子量マーカーの位置を示す。次にH2Oで洗浄し
て染色を除去する。非特異的蛋白質結合部位を、ゆっく
り回転する台上で約１時間、10％脱脂粉乳中でブロット
をインキュベートしてブロックする。NT緩衝液（25mMト
リス塩酸,pH8.0;150mM NaCl）で２回洗浄後、ブロット
を、大腸菌溶解物の存在下で、実施例Ｉ（“抗32kDa抗
血清にいよるλgt11ヒト結核菌組換えDNAライブラリー
のスクリーニング”）に記載のようにして得られたポリ
クローンウサギ抗32kDa抗血清（1:1000）と共に、ある
いはmTNF（Innogenetics,第17F5D10号）と交叉反応する
モノクローン抗−hTNF−抗体とともに、回転台上で少な
くとも２時間インキュベートする。NT緩衝液＋0.02％ト
リトンX100で２回洗浄後、ブロットを、第一の場合は二
次抗血清：アルカリホスファターゼ−標識ブタ抗ウサギ
イムノグロブリン（1/500;Prosan）と、第二の場合はア
ルカリホスファターゼ−標識ウサギ抗マウスイムノグロ
ブリン（1/500;Sigma）と、少なくとも１時間、インキ
ュベートする。
ブロットを再びNT緩衝液＋0.02％トリトンX100で２回
洗浄し、次にメーカー推奨の条件を用いて、Promegaか
ら購入したニトロブルーテトラゾリウム（NBT）及び５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスファター
ゼ（BCIP）で視覚化する。
B.結果 pmTNF−MPH−Mt32を含有するK12△Ｈ細胞を誘導する
場合、明瞭に目に見える約35kDaのバンドが、誘導開始
後１時間目にすでにCBB染色ゲル上に現れる（図14a）。
細胞の総蛋白質含量のほぼ25％に相当するこのバンド
は、イムノブロット上で抗32kDa及び抗mTNF抗血清と強
く反応する（図14b）。しかしながら、このバンドは、
抗血清とも特異的に反応する約37kDaの小バンドもイム
ノブロット上に見えるために、元の融合蛋白質の切断物
質を表す。これは、組換えmTNF−His6−P32の広範な切
断がそのカルボキシ末端から約２〜3kDaで起こることを
示唆している。
実施例VII:固定化金属イオンアフィニティークロマトグ
ラフィー（IMAC）における組換え抗原の精製： pmTNF−MPH−Mt32を含有するK12△Ｈ細胞によって発
現されるハイブリッド蛋白質mTNF−His6−P32（アミノ
酸配列，図13参照）は、ポリリンカー配列の６連続ヒス
チジンが金属イオンに対して強い親和性をもたらすため
に（Hochuliら、1988）、IMACによる精製を促進するよ
う特に意図される。
a.粗細胞抽出物の調製： プラスミドpmTNF−MPH−Mt32を含有する12 1の大腸菌
細胞K12△Ｈを、テトラサイクリン（10μg/ml）を含むL
uriaブロス中で、28℃で増殖させて、光学密度（600n
m）を0.2とし、次いで温度を42℃に上げて誘導した。誘
導３時間後、遠心分離（Beckman,JA10ローター、7,500r
pm,10分）によって細胞を集めた。細胞ペーストを溶解
緩衝液（10mM KCl,10mM トリス塩酸 pH6.8,5mM EDTA）
に懸濁して、細胞最終濃度を50％（W/v）とした。
ε−NH2−カプロン酸及びジチオトレイノトール（DT
T）を加えて最終濃度をそれぞれ20mM及び1mMとして蛋白
質分解的変質を防止した。この細胞濃縮懸濁液を、−70
℃で一晩保存した。
使用圧力800〜1000psiでフレンチプレス（SLM−Aminc
o）に３回通して、細胞を溶解した。溶解中及び溶解
後、細胞を氷上に整然と保持した。
細胞溶解物を遠心分離で純粋にした（Beckmann,JA20,
18,000rpm,20分,4℃）。予備試験により蛋白質が主とし
て膜分画に局在することが示されたため、上澄（SN）を
注意深く捨てて、膜及び封入体を含むペレットをさらに
研究するために保持した。
100mM燐酸緩衝液pH7.2に溶解した7M塩酸グアニジニウ
ム（GuHCl,ICNより市販）をペレット容量に加えて、最
終濃度を6M GuHClとした。ペレットを懸濁し、バウンス
組織ホモジェナイザー（10サイクル）で抽出した。
清澄化（Beckmann,JA 20,18,000rpm,20分,4℃）後、
約100mlの上澄を収集し（＝抽出物１）、取り出したペ
レットを上記と同様に再び抽出した（抽出物2,40ml）。
異なる分画（SN,EX1,EX2）をSDS−PAGE（Laemmli,Nat
ure 1970;227:680）上で、誘導培養の対照試料とともに
分析した。ゲルの走査により、組換え蛋白質は誘導細胞
培養の総蛋白質含量のほぼ25％を構成することが明らか
にされた。分別後、蛋白質の殆どが抽出物中に戻ってい
ることが判明した。還元状態と非還元状態（プラス及び
マイナスβ−メルカプトエタノール）との間の差異は認
められなかった。
b.Ni++IDA（イミノジ酢酸）カラムの調製： 5mlのキレート化ゲル、キレート化セファロース6B（P
harmacia）を水で広範に洗浄して、それを保存している
エタノールを除去し、次に“Econo−カラム”（1x10cm,
Biorad）中に充填した。カラム上部は流入液（試料、緩
衝液等）と連絡し、一方末端は蠕動性ジャンプを経てUV
280検出器に至る。分画はフラクションコレクターで収
集し、そして適当な場合には分画のpHは手動で測定す
る。
カラムはNi++（6ml NiCl2・6H2O;5μg/μｌ）を負荷
し、開始緩衝液（6M塩酸グアニジウム、100mM燐酸緩衝
液,pH7.2）で平衡させる。
試料を投入後、カラムを開始緩衝液で広範に洗浄し
て、非結合物質を除去する。
結合物質を溶離するために、２つの異なる溶離操作が
実行可能である： １）pHを下げて溶離する、 ２）イミダゾール濃度を上げて溶離する。
両方ともに、本明細書中で考察されている。
カラムを再生するためには、２〜３回操業後、20ml
（約５カラム容積）の以下の溶液を順次カラムにポンプ
で送り込む走査を行なわねば成らない： −0.05M EDTA−0.5M NaCl −0.1M NaOH −H2O −6ml NiCl2・6H2O（5mg/ml） 開始緩衝液で平衡後、カラムは再び使えるようになっ
ている。
c.クロマトグラフィー： クロマトグラフィー中は、全緩衝液が6M塩酸グアニジ
ウムを含有した。カラムを、周囲温度で、0.5ml/分の流
速で展開した。2mlの分画を収集し、適当な場合には、S
DS−PAGE及びイムノブロッティングを用いてさらに分析
した。ゲルを、Ansorge（1985）が記載したように、Coo
massie Brilliant Blue R250及び銀染色で染色した。実
施例Ｉに記載したように、イムノフロッティングを実施
した。用いた一次抗血清は、実施例Ｉ（“抗32kDa抗血
清によるλgt11ヒト結核菌組換えDNAライブラリーのス
クリーニング”）に記載されたようにして得られたポリ
クローン抗32kDa抗血清（1/1000）、または抗大腸菌イ
ムノグロブリン（1/500,Prosan）又はmTNF（Innogeneti
cs,第17F5D10号）と交叉反応するモノクローン抗hTNF抗
体であった。二次抗血清は、アルカリホスファターゼ標
識ブタ抗ウサギイムノグロブリン（1/500,Prosan）、又
はアルカリホスファターゼ標識ウサギ抗マウスイムノグ
ロブリン（1/500,Sigma）であった。
C1.pH低減による溶離： 使用溶液： A:6M GuHCl 100mM燐酸塩pH7.2 B:6M GuHCl 25mM燐酸塩pH7.2 C:6M GuHCl 50mM燐酸塩pH4.2 3mlの抽出物１（OD280＝32.0）を適用し、溶液Ａで広
範に洗浄後、カラムを溶液Ｂで平衡させて、次に7.2〜
4.2の直線的pHグラジエント（25mlの溶液Ｂと25mlの溶
液Ｃをグラジエント生成器中で混合した）で展開した。
溶離プロフィルを図15に示す。
SDS−PAGE分析（Coomassie及び銀染色）から、最初は
結合していた組換え蛋白質の殆どが、pH5.3〜4.7の分画
で溶離した。
抗32kDa及び17F5D10モノクローン抗体によるイムノブ
ロット上でのこれらの分画のスクリーニングから、無傷
組換え蛋白質とともに、蛋白質の何らかの減成物質及び
高度の凝集形態も存在したが、しかしごく少量であった
ことが示された。抗大腸菌抗体を用いたブロッティング
は、これらの分画（pH5.3〜4.7）が依然として免疫的に
検出可能な汚染大腸菌蛋白質（75、65、43、35及び31kD
aバンド）、及びリポ多糖類を含有することを明らかに
した。
C2.イミダゾール濃度増大による溶離： 使用溶液： A:6M GuHCl 100mM燐酸塩pH7.2 B:6M GuHCl150mMイミダゾールpH7.2 C:6M GuHCl 100mMイミダゾールpH7.2 D:6M GuHCl15mMイミダゾールpH7.2 E:6M GuHCl 25mMイミダゾールpH7.2 F:6M GuHCl 35mMイミダゾールpH7.2 試料の投入及び洗浄は、Clの場合と同様に実施した
が、但し、洗浄後、6M GuHCl 25mM燐酸塩を用いて平衡
させる必要はなかった。カラムを先ず、０から50mM（25
mlの溶液Ａと25mlの溶液Ｂをグラジエント生成器中で混
合した）までのイミダゾールの直線グラジエントで、そ
の後100mMイミダゾール（溶液Ｃ）までの段階溶離で展
開した。直線グラジエント中は、蛋白質は広範なスメア
で漸次溶離され、一方100mMまでの段階は、明瞭なピー
クを生じた（図16）。
分画のSDS−PAGE分析から、直線グラジエントの最初
の部分（fr 1〜24）では大半の汚染大腸菌蛋白質は洗い
流されていたが、一方グラジエントの後半部分（fr 25
〜50）及び100mMピークは90％以上の組換え蛋白質を含
有することが明示された。
C1の場合と同様に、これらの分画は、無傷組換え蛋白
質の大きなバンドに加えて、減成及び凝集蛋白質のいく
つかの小バンドを示した。しかしながら、この場合は、
24kDa以下の領域は蛋白質バンドを殆ど欠いていたよう
であり、これは、無傷蛋白質と共溶離する減成物質がほ
とんどないことを示唆する。さらに、31kDaバンドは余
り強くなく、そしていくつかの分画では存在しないこと
さえあったが、C1の場合と同様に、イムノブロッティン
グによって同一の汚染大腸菌蛋白質が検出された。
第二段階では、我々は、漸増イミダゾール濃度の段階
グラジエントにより、カラムを展開した。試料を投入し
てカラムを洗浄後、２カラム容積（約8ml）の以下の溶
液をカラムに順次入れた：溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、そして最後
に４カラム容積の溶液Ｃ。段階グラジエントにより、ス
ケールアップに適した、さらに濃縮された溶離プロフィ
ルが得られた（図17）。
要するに、mTNF−His6−P32蛋白質は、IMACによって
少なくとも90％まで精製された。さらなる精製は、次の
工程を併用して達成される： −キレート化スパロース（Pharmacia）上でのIMAC −イオン交換クロマトグラフィー（陰イオン又は陽イ
オン） −逆相クロマトグラフィー −ゲル濾過クロマトグラフィー −イムノアフィニティークロマトグラフィー −ポリアクリルアミドゲルからの溶離 これらのクロマトグラフィー法は、一般に、蛋白質精
製のために用いられる。
図10b、11b、及び12bのプラスミドは新規である。
以下、図中及び本文中に示したアミノ酸及び／又はヌ
クレオチド配列を、配列表として示す。各配列と図又は
本文中の掲載箇所との対応は、次の表のとおりである： 配列表 配列番号:1 配列の長さ:24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 CAGCTTGTTG ACAGGGTTCG TGGC 配列番号:2 配列の長さ:19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 GGTTCGTGGC GCCGTCACG 配列番号:3 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 CGTCGCGCGC CTAGTGTCGG 配列番号:4 配列の長さ:23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 CGGCGCCGTC GGTGGCACGG CGA 配列番号:5 配列の長さ:23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 CGTCGGCGCG GCCCTAGTGT CGG 配列番号:6 配列の長さ:18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 TCGCCCGCCC TGTACCTG 配列番号:7 配列の長さ:22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 GCGCTGACGC TGGCGATCTA TC 配列番号:8 配列の長さ:21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 CCGCTGTTGA ACGTCGGGAA G 配列番号:9 配列の長さ:24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 AAGCCGTCGG ATCTGGGTGG CAAC 配列番号:10 配列の長さ:24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 ACGGCACTGG GTGCCACGCC CAAC 配列番号:11 配列の長さ:24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 ACGCCCAACA CCGGGCCCGC CGCA 配列番号:12 配列の長さ:25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 ACGGGCACTG GGTGCCACGC CCAAC 配列番号:13 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 ACGCCCCAAC ACCGGGCCCG CGCCCCA 配列番号:14 配列の長さ:35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 GAGTACCTGC AGGTGCCGTC GCCGTCGATG GGCCG 配列番号:15 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 ATCAACACCC CGGCGTTCGA GTGGTAC 配列番号:16 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:Yes 配列 GTACCACTCG AACGCCGGGG TGTTGAT 配列番号:17 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 TGCCAGACTT ACAAGTGGGA 配列番号:18 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:Yes 配列 TCCCACTTGT AAGTCTGGCA 配列番号:19 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 TCCTGACCAG CGAGCTGCCG 配列番号:20 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:Yes 配列 CGGCAGCTCG CTGGTCAGGA 配列番号:21 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列 CCTGATCGGC CTGGCGATGG GTGACGC 配列番号:22 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:Yes 配列 GCGTCACCCA TCGCCAGGCC GATCAGG 配列番号:23 配列の長さ:26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:Yes 配列 GCGCCCCAGT ACTCCCAGCT GTGCGT 配列番号:24 配列の長さ:20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル:No フラグメント型:internal fragment 配列番号:25 配列の長さ:20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル:No フラグメント型:internal fragment 配列番号:26 配列の長さ:20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル:No フラグメント型:internal fragment 配列番号:27 配列の長さ:20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル:No フラグメント型:internal fragment 配列番号:28 配列の長さ:20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル:No フラグメント型:internal fragment 配列番号:29 配列の長さ:20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル:No フラグメント型:internal fragment 配列番号:30 配列の長さ:20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル:No フラグメント型:C−terminal fragment 配列番号:31 配列の長さ:20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル:No フラグメント型:internal fragment 配列番号:32 配列の長さ:20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル:No フラグメント型:C−teraminal fragment 配列番号:33 配列の長さ:32 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル:No フラグメント型:N−terminal fragment 配列の特徴 他の情報:MPB59抗原のＮ末端に相同性が高い（31/3
2） 配列番号:34 配列の長さ:1357 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA ハイポセティカル:yes アンチセンス:no 配列の特徴 他の情報:X＝Ｇ又はGG;Y＝Ｃ又はCC;Z＝Ｃ又はG; Ｗ＝Ｃ又はＧ、かつＺとは異なる;K＝Ｃ又
はCG; Ｌ＝Ｇ又はCG;a1−b1＝AlaArg又はGlyAlaA
la;a2＝Arg 又はGly;a3−b3−c3−d3−e3−f3＝HisTrp
ValProArgPro又は AlaLeuGlyAla;a4＝Pro又はProAsnThr;a5＝
Pro又はAlaPro 配列番号:35 配列の長さ:294 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル:yes 配列の特徴 他の情報:a1−b1＝AlaArg又はGlyAlaAla;a2＝Arg又は
Gly; a3−b3−c3−d3−e3−f3＝HisTrpValProAr
gPro又はAlaLeuGlyAla; a4＝Pro又はProAsnThr;a5＝Pro又はAlaPro 配列番号:36 配列の長さ:1357 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 配列の特徴 他の情報：発表された刊行物 著書:Borremans,M De Wit,L Volckaert,G Ooms,J De Bruyn,J Huygen,K Van Vooren,J.P. Stelandre,M Verhofstadt,R Content,J 題名:Cloning,sequence determination and expression
of a 32 kDa protein gene of M.tuberculosis 誌名:Infection and Immunity 巻 :57 号 :10 頁 :3123−3130 日付:oct 1989 残基：配列番号36の１〜1357 配列番号:37 配列の長さ:294 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル:No 配列番号:38 配列の長さ:1299 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA ハイポセティカル:No アンチセンス:No 起源 生物名:Mycobacterium tuberculosis 株名:Erdman 配列の特徴 特徴を表す記号:presumptive Shine Delgarno motif 存在位置:79−85 特徴を決定した方法:S 他の特徴：発表された刊行物 著書:De Wit,L De La Cuvellerie,A Ooms,J Content,J 題名:Nucleotide sequence of the 32 kDa protein gen
e（antigen 85A）of Mycobacterium bovis BCG 誌名:Nucleic Acid Research 巻 :8 号 :13 頁 :3995 日付:1990 残基：配列番号38の１〜1299 配列番号:39 配列の長さ:295 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル:No 配列の特徴 特徴を示す記号:presumtive signal sequence 存在位置：−43 to−１ 特徴を決定した方法:S 配列番号:40 配列の長さ:3423 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸（plasmid vector） ハイポセティカル:no 配列番号:41 配列の長さ:3474 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸（plasmid vector） ハイポセティカル:no 配列番号:42 配列の長さ:3301 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸（plasmid vector） ハイポセティカル:no 配列番号:43 配列の長さ:338 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル:No 配列の特徴 特徴を表す記号:N−terminal sequence of mTNF 存在位置:1−26 特徴を表す記号:sequence corresponding to polylinke
r 存在位置:27−44 特徴を表す記号:extra AA created at cloning site 存在位置:45−46 特徴を表す記号:sequence corresponding to P32 antig
en 存在位置:47−338
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ドゥ・ヴィト，ルーカス ベルギー国、ビー―2670 プール、ヴィ クトール・フェルゴーヴァンシュトラー ト 46 (72)発明者 ドゥ・ブリュイン，ジャックリーヌ ベルギー国、ビー―1640 ベーゼル、ホ ンガリエシュトラート 192 (72)発明者 ファン・フーラン，ジャン―ポール ベルギー国、ビー―1600 サン―ピエ テ・レーウ、ブリュッセルバーン 40 (56)参考文献 国際公開88／8456（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，ｖｏｌ. 170，Ｎｏ．９，Ｐ．3847−3854（1988) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊ ｕｌｙ，1987）Ｐ．1176−1180

Claims (25)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ポリペプチドであって、そのポリペプチド
    鎖中に、配列表の配列番号35における、位置番号１〜29
    4、４〜294、44〜294および222〜294のアミノ酸配列の
    群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含
    み、ウシ結核菌BCG培養濾液の32kDa蛋白質に対して生じ
    たウサギポリクローン抗血清と反応する、ポリペプチ
    ド。
  2. 【請求項２】少なくとも一つのアミノ酸配列が、配列表
    の配列番号37における位置番号１〜294、４〜294、44〜
    294および222〜294のアミノ酸配列の群から選択されて
    いる、請求項１記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】少なくとも一つのアミノ酸配列が、配列表
    の配列番号39における位置番号１〜295、４〜295、44〜
    295および222〜295のアミノ酸配列の群から選択されて
    いる、請求項１記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】ポリペプチドであって、該ポリペプチド
    が、配列表の配列番号35における位置番号−59〜−１、
    −55〜−１、−49〜−１、−47〜−１、−42〜−１およ
    び−29〜−１のアミノ酸配列の群から選択される少なく
    とも一つのアミノ酸配列を含む、請求項１記載のポリペ
    プチド。
  5. 【請求項５】ポリペプチドであって、該ポリペプチド
    が、配列表の配列番号37における位置番号−59〜−１、
    −55〜−１、−49〜−１、−47〜−１、−42〜−１およ
    び−29〜−１のアミノ酸配列の群から選択される少なく
    とも一つのアミノ酸配列を含む、請求項２記載のポリペ
    プチド。
  6. 【請求項６】ポリペプチドであって、該ポリペプチド
    が、配列表の配列番号39における位置番号−43〜−１お
    よび−30〜−１のアミノ酸配列の群から選択される少な
    くとも一つのアミノ酸配列を含む、請求項３記載のポリ
    ペプチド。
  7. 【請求項７】請求項１記載のポリペプチド配列と、１〜
    1000個のアミノ酸の異種アミノ酸配列とを含み、ウシ結
    核菌BCG培養濾液の32kDa蛋白質に対して生じたウサギポ
    リクローン抗血清と反応する、融合蛋白質。
  8. 【請求項８】異種アミノ酸配列が、β−ガラクトシダー
    ゼのアミノ酸配列である、請求項７記載の融合蛋白質。
  9. 【請求項９】請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペ
    プチドをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオ
    チド配列に相補的なヌクレオチド配列もしくは対応する
    RNA配列を含む核酸。
  10. 【請求項１０】配列表の配列番号34におけるヌクレオチ
    ド位置番号359〜1240、368〜1240、490〜1240および102
    3〜1240のヌクレオチド配列の群から選択される少なく
    とも一つのヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列
    の少なくとも一つに相補的で同じ長さのヌクレオチド配
    列もしくはすべてのＴヌクレオチドがＵヌクレオチドで
    置換されているヌクレオチド配列の一つを含む請求項９
    記載の核酸。
  11. 【請求項１１】配列表の配列番号36におけるヌクレオチ
    ド位置番号359〜1240、368〜1240、490〜1240および102
    3〜1240のヌクレオチド配列の群から選択される少なく
    とも一つのヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列
    の少なくとも一つに相補的で同じ長さのヌクレオチド配
    列もしくはすべてのＴヌクレオチドがＵヌクレオチドで
    置換されている該ヌクレオチド配列の一つを含む請求項
    10記載の核酸。
  12. 【請求項１２】配列表の配列番号38におけるヌクレオチ
    ド位置番号220〜1104、229〜1104、350〜1104および884
    〜1104のヌクレオチド配列の群から選択される少なくと
    も一つのヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の
    少なくとも一つに相補的で同じ長さのヌクレオチド配列
    もしくはすべてのＴヌクレオチドがＵヌクレオチドで置
    換されている該ヌクレオチド配列の一つを含む請求項10
    記載の核酸。
  13. 【請求項１３】請求項10記載の核酸配列のうち連続して
    15個のヌクレオチドを有する（ウシ結核菌のα抗原をコ
    ードする核酸配列の部分配列ではない）オリゴヌクレオ
    チド。
  14. 【請求項１４】異種核酸に挿入されている請求項10のヌ
    クレオチド配列の少なくとも一つを含むキメラ核酸。
  15. 【請求項１５】複製ヌクレオチドベクター配列および複
    製を妨げない位置で該ベクターヌクレオチド配列に挿入
    されている請求項10記載の核酸配列を含んでいる、組換
    えベクター。
  16. 【請求項１６】組換えベクターであって、ポリペプチド
    の発現を促進する核酸配列、細胞宿主のポリメラーゼに
    よって認識されるプロモーターおよびシグナル配列を含
    み、全てのものが複製を妨げない位置で前記複製ベクタ
    ーヌクレオチド配列に挿入されている、請求項15記載の
    組換えベクター。
  17. 【請求項１７】組換えベクターであって、前記プロモー
    ターが誘導プロモーターであり、複製を妨げない位置で
    前記複製ベクターヌクレオチド配列に挿入されているア
    ンカー配列を含む、請求項16記載の組換えベクター。
  18. 【請求項１８】E.coliにおける核酸の発現のための核酸
    配列およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子もしくは該β−
    ガラクトシダーゼ遺伝子の一部を含む、請求項16記載の
    組換えベクター。
  19. 【請求項１９】ポリペプチドの発現に必要な調節要素を
    含む、請求項15記載の組換えベクターで形質転換されて
    いる細胞宿主。
  20. 【請求項２０】前記宿主が、細菌または真核生物であ
    る、請求項19記載の細胞宿主。
  21. 【請求項２１】請求項20記載の形質転換されている宿主
    によって発現される核酸の発現産物。
  22. 【請求項２２】組換えポリペプチドを調製する方法であ
    って、 請求項15記載の組換えベクターで形質転換されている細
    胞宿主を培地中で培養する工程；および 該培地から、該形質転換細胞宿主によって産生された該
    ポリペプチドを回収する工程を含む方法。
  23. 【請求項２３】請求項１記載の組換えポリペプチドを調
    製する方法であって、 該ポリペプチドをコードする核酸配列を含有するベクタ
    ーで形質転換されている細胞宿主を培地中で培養して宿
    主に該ポリペプチドを産生させる工程；および該培地か
    ら、該形質転換細胞宿主によって産生された該ポリペプ
    チドを回収する工程を含む方法。
  24. 【請求項２４】生物試料中の結核を検出するin vitroの
    方法であって、 該生物試料を、請求項１記載のポリペプチドと、該ポリ
    ペプチドと、該試料中に存在するならば、結核菌に対す
    る抗体との免疫複合体を形成させる条件下で接触させる
    工程：および 結核の指標として、いかなるものであってもよい免疫複
    合体の存在を検出する工程を含む方法。
  25. 【請求項２５】生物試料中の結核を検出するための、in
    vitro検出キットであって、 請求項１記載のポリペプチド； 該ポリペプチドと、該試料中に存在するならば、結核菌
    に対する任意の抗体との免疫複合体を形成させ得る培
    地；および 結核を表示する免疫複合体の存在を検出する試薬 を含むキット。
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