JPH04501811A - 組換えポリペプチド及びペプチド、それをコードする核酸並びに結核の診断におけるこれらのポリペプチド及びペプチドの使用 - Google Patents

組換えポリペプチド及びペプチド、それをコードする核酸並びに結核の診断におけるこれらのポリペプチド及びペプチドの使用

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えポリペプチド及びペプチド、それをコードする核酸並びに結核の診断にお けるこれらのポリペプチド及びペプチドの使用 本発明は結核の診断に用い得る組換えポリペプチド及びペプチドに関する。本発 明はさらに、結核に対するワクチンを製造する場合に有効成分の一部として用い 得るような生物学的に純粋な状態にある上記のポリペプチド及びペプチドの製造 方法に関する。
本発明はまた、上記のポリペプチド及びペプチドをコードする核酸に関する。
さらに、本発明は上記のポリペプチド及びペプチドを用いるｉｎ　ｖｉｔｒｏ診 断方法及びキット、並びに結核に対する有効成分としての、上記のポリペプチド 及びペプチドを含有するワクチンに関する。
“組換えポリペプチド及びペプチド”とは、効率的な細胞宿主内での適切な調節 要素の制御下での対応するＤＮＡ配列の、転写及び翻訳を通じての遺伝子工学に よって産生されるポリペプチド鎖を有する任意の分子に関すると理解されるべき である。したがって、本明細書中で用いられるような組換えポリペプチド”とい う表現は、ポリペプチドがグリコジル化基のようなその他の基を含む可能性を除 外しない。
“組換え体”という用語は、実際、特にそれが上記の宿主に用いられる発現ベク ターに予め導入された対応する核酸配列の細胞宿主における発現に起因するため に、ポリペプチドが遺伝子工学によって産生されたという事実を意味する。
にもかかわらず、この表現は、ポリペプチドが異なる方法によって、例えば蛋白 質合成において用いられる方法に従った古典的化学合成により、又は大型分子の 蛋白質分解的切断によって産生される可能性を除外しない、と理解されねばなら ない。
“生物学的に純粋である”とか又は゛生物学的純度゛という表現は、一方では組 換えポリペプチドがワクチン接種組成物の生成のために用い得るような純度の等 級を、そして他方では汚染物質、特に天然汚染物質が存在しないことを意味する 。
結核は、開発途上国においては依然として主要な疾患である。その状況はい（つ かの国においては劇的であって、特にその場合、ＡＩＤＳ患者の間の結核の高発 生率はこの疾患の伝播の新しい出所を示す。
結核は細胞介在性免疫機序が本疾患の予防及び制御に不可欠な役割を演じる慢性 感染症である。
ＢＣＧ接種、及びい（つかの有効な薬剤にもかかわらず、結核は依然として大き な世界的問題である。本疾患のスクリーニングのために広く用いられているツベ ルクリンＰＰＤ　（蛋白質精製誘導体）の皮膚テストは、その他の病原性又は環 境性の産生植物性マイコバクテリアとの交叉反応性のために、特異性が不十分で ある。
さらに、ツベルクリンＰＰＤは血清学的検定（ＥＬＩＳＡ）に用いられる場合、 ＢＣＧ接種を受けたことのある患者又は−次感染済の患者と、進展性結核を発症 中であって初期の且つ迅速な診断を必要とする患者とを区別出来ない。
分子量が３２ｋＤａの蛋白質が亜鉛欠損ウシ結核菌Ｍｙｃｏｂａｃｔ、ｅｒｉｕ ｍ　ｂｏｖｉｓ　Ｂ　ＣＧ培養濾液（８）から精製された（９）。ウシ結核菌の この３２ｋＤａ蛋白質は、フェニル−セファロース上での疎水性クロマトグラフ ィー、ＤＥＡＥ−セファセル上でのイオン交換、及びセファデックスＧ−１００ 上での分子篩いを順次用いて、ウシ結核菌ＢＣＧの５ａｕｔｏｎ亜鉛欠損培養濾 液から精製された。最終調製は、いくつかの分析に基づいて均質であることが判 明した。このＰ　３２蛋白質は、正常状態で増殖するＢＣＧ細胞の一構成成分で ある。
それは細胞抽出物の可溶性分画の約３％を示し、そして正常５ａｕｔｏｎ培養濾 液中に放出される主な蛋白質と考えられる。この蛋白質は、５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動及び分子篩いによって、３２゜０００の分子量を有するこ とが判明している。
ウシ結核菌ＢＣＧの３２ｋＤａ蛋白質のＮＨ２−末端アミノ酸配列（Ｐｈｅ−３ ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）は、ウシ結核菌Ｂ　ＣＧ　Ｔｏｋｙｏ 亜株から精製されたＭＢＰ５９蛋白質に関して報告されたもの（３４）と同一で ある。
ウシ結核菌ＢＣＧの精製Ｐ３□は種々の交叉免疫電気泳動法によって試験され、 ＢＣＧ抗原に関する参照系において抗原８５複合体に属することが示された。そ れは、ＢＣＧ抗原に関する交叉参照系において抗原８５Ａであるとさらに正確に 確定された（７）。
ウシ結核菌ＢＣＧの３２ｋＤａ蛋白質に対するイムノグロブリンＧ抗体レベルの 増加が、７０％の結核患者で検出された（３０）。
さらに、ウシ結核菌ＢＣＧの３２ｋＤａ蛋白質は、進行中の結核患者（１２）及 びＰＰＤ陽性の健康な被験者から採取した抹消面白血球における特異的リンパ球 増殖及びインターフェロン（ＩＦＮ−γ）産生を誘発する。最近の所見からは、 ＢＣＧ感作マウス牌臓細胞中のウシ結核菌ＢＣＧ誘発性ＩＦＮ−γの３２ｋＤａ 蛋白質の量はおそらくＨ−２制御下にあることが示されている（１３）。最後に 、フィブロネタチンに対するマイコバクテリアの高親和性は、ＢＣＧ８５抗原複 合体の蛋白質に関連する（１）。
Ｍａｔｓｕｏら（１７）は、最近、Ｂ　ＣＧ　（Ｔｏｋｙｏ亜種）により分泌さ れる主要蛋白質であって、そのＮ　Ｈ２−末端アミノ酸配列中のＭＰＢ５９抗原 との相同性が高く、さらにその最初の６個のアミノ酸：Ｐｈｅ−Ｓｅｔ−Ａｒｇ −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕが一致する抗原αをコードする遺伝子をクローニング した。
この遺伝子は、Ｔａ５ａｋａら＋９８３．　”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ 　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ａｌｐｈａ　ｐｒｏｔ ｅｉｎ（Ｙｏｎｅｄａ　ａｎｄ　Ｆｕｋｕｉ）　ｆｒｏｍ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ＋Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ　Ｊ、　Ｍｅｄ、　ＳＣｊ、 、　３２．１−８に記載されているようなヒト結核菌Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ ｓｉｓから精製された抗原αのＮ末端アミノ酸配列と相同のヌク１／オチドブロ ーブを用いてクローン化された。
抗原８５複合体と呼ばれる約３０〜３２ｋＤａの抗原の存在は、ヒト結核菌のよ うなマイコバクテリアの培地から生じる蛋白質の電気泳動パターンから明らかに された。イムノブロッティング法により、これらの抗原が、ＢＣＧの３２ｋＤａ 蛋白質に対して生じたウサギ血清と交叉反応することが示された（８）。
最近の研究は、癩腫癩患者の３０ｋＤａ及び３１ｋＤａ抗原に対する、並びに結 核様癲患者の３２ｋＤａに対する優先的体液反応に関して報告している（２４） 　。
フィブロネクチン（ＦＮ）結合抗原はヒト結核菌の短期培養上澄の目立った成分 であることが判明している。３８目の上澄中では、３０キロダルトン（ｋＤａ） 蛋白質は主な（Ｆ　Ｎ　）結合分子であると確認された。２１日目上澄では、Ｆ Ｎは約３０〜３２ｋＤａの二重の蛋白質バンドと、より大型な分子量（５７〜６ ０ｋＤａ）の一群の抗原に結合した（１）。
他の実験では、ヒト結核菌からのＤＮＡを含有する組換えプラスミドが大腸菌Ｅ ｓｅｈｅｒｉｃｈｌａ　ｃｏｌｉ中に形質転換され、３つのコロニーがヒト結核 菌に対するポリクローン抗血清との反応性によって選択された。各組換え体は３ ５−及び５３キロダルトン蛋白質（それぞれ３５Ｋ及び５３に蛋白質）を産生し た（＋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｉ　ａｎｄ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｇｅｎｅｓ 　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｏｒＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ”、　Ｍｊｔｃｈｅｌｌ　ＬＣｏｈｅｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ。
Ｊｕｌｙ　１９８７．　ｐ、１１７６−１１８０）。
今日までに公知の種々の結果に関しては、ヒト結核菌の抗原Ｐ３□の物理化学的 特性は正確ではなく、さらにそれが疑いの余地な（同一であることを確認したり 、並びにその構造的及び機能的要素を特徴付けるには不十分である。
さらに、ヒト結核菌の病原性及び潜在的感染特性は、この細菌の構成成分並びに 分泌生成物質を確認し、精製し、そして特性化し得る研究を妨げてきた。
本発明の一つの態様は、結核の検出及び制御のための精製抗原として使用し得る 組換えポリペプチドを提供することである。
本発明の別の態様は、その大量生産を可能にする生物学的に純粋な組換えポリペ プチドのペプチド鎖をコードする核酸を提供することである。
本発明の別の態様は、結核のｉｎ　ｖｉｔｒｏ迅速診断として血清学的検定に用 い得る抗原を提供することである。
本発明の別の態様は、進行中の結核罹患患者とＢＣＧ接種を受けたことのある者 又は過去に感染したことのある者とを区別出来る、結核のｉｎ　ｖｉｔｒｏ迅速 診断法を提供することである。
本発明の別の態様は、結核のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断試薬並びにマイコバクテリア の他の株からヒト結核菌を同定するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断試薬として用い 得る核酸プローブを提供することである。
本発明の組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つの アミノ酸配列：、−図３ａ及び３ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成 される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３８及び３ｂに示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（３ １）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３８及び３ｂに示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（５ ５）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び３ｂに示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（９ ６）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び３ｂに示される（１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から（ １２０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は−図３ａ及び３ｂ に示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（１９４）番目のア ミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は−図３８及び３ｂに示される（２１ １）番目のアミノ酸で構成される末端から（２３０）番目のアミノ酸で構成され る末端にわたる配列、又は−図３ａ及び３ｂに示される（２７５）番目のアミノ 酸で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配 列、 並びに改変が次の： ポリペプチドがウシ結核菌ＢＣＧ培養濾液の３２　！ｋＤａ蛋白質に対して生じ たウサギポリクローン抗血清と反応するか、及び／又は 結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者からのヒト血清と選択的に 反応する、及び／又は図３８及び３ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成さ れる末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたるアミノ酸配列 と反応するという特性を変えない限りにおける、一つ又はい（つかのアミノ酸の 置換による及び／又は付加による及び／又は欠失による改変に起因するペプチド 配列を含有する。
図３ａ及び３ｂにおいて、 −ＸはＧ又はＧＧを表し、 −ＹはＣ又はＣＣを表し、 −ＺはＣ又はＧを表し、 −ＷはＣ又はＧを表すが、Ｚとは異なり、−にはＣ又はＣＧを表し、 −りはＧ又はＣＣを表し、 −ａ、−ｂ＋はＡＬＡ−ＡＲＧ又はＧ　Ｌ　Ｙ　−Ａ　Ｌ　Ａ−ＡＬＡを表し、 −ａ、はａｒｇ又はｇｌｙを表し、 ａ　３　ｂ　３−　Ｃ３ｄ　ｚ　８　Ｊ　−ｆ　ｚはｈｉｓ−ｔｒｐ−ｖａｌ− ｐｒｏ−ａｒｇ−ｐｒｏ又はａｌａ−１ｅｕ−ｇｌｙ−ａｌａを表し、−８４は ｐｒｏ又はｐｒｏ−ａｓｎ−ｔｈｒを表し、 −ａ、はｐｒｏ又はａ、　１　ａ　−ｐ　ｒ　ｏを表わす。
本発明の組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つの アミノ酸配列ニー　図４ａ及び４ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成 される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び４ｂに示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（３ １）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び４ｂに示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（５ ５）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び４ｂに示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（９ ６）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び４ｂに示される（１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から（ １２０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は−図４８及び４ｂ に示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（１９４）番目のア ミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は−図４ａ及び４ｂに示される（２１ １）番目のアミノ酸で構成される末端から（２３０）番目のアミノ酸で構成され る末端にわたる配列、又は−図４８及び４ｂに示される（２７５）番目のアミノ 酸で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配 列、 並びに改変が次の： ポリペプチドがウシ結核菌ＢＣＧ培養濾液の３２ｋＤａ蛋白質に対して生じたウ サギポリクローン抗血清と反応するか、及び／又は 結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者からのヒト血清と選択的に 反応する、及び／又は図４ａ及び４ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成さ れる末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたるアミノ酸配列 と反応するという特性を変えない限りにおける、一つ又はい（つかのアミノ酸の 置換による及び／又は付加による及び／又は欠失による改変に起因するペプチド 配列を含有する。
本発明の組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つの アミノ酸配列ニー　図５に示される（−３０）番目のアミノ酸で構成される末端 から（−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（３１）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（５５）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（９６）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から（１２０）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（１９４）＠ 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（２１１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２３０）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（２７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 並びに改変が次の： ポリペプチドがウシ結核菌Ｂ　ＣＧ培養濾液の３２ｋＤａ蛋白質に対して生じた ウサギポリクローン抗血清と反応するか、及び／又は 結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者からのヒト血清と選択的に 反応する、及び／又は図５に示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端か ら（２９５）番目のアミノ酸で構成される末端にわたるアミノ酸配列と反応する とい）特性を変えない限りにおける、−・つ又はいくつかのアミノ酸の置換によ る及び／又は付加による及び／又は欠失による改変に起因するペプチド配列を含 有する。
本発明の有益なポリペプチドは、それらがウシ結核菌ＢＣＧ培養濾液の３２ｋＤ ａ蛋白質（以後ＢＣＧのＰ　ｘｗ蛋白質と呼ぶ）に対して生じたウサギポリクロ ーン抗血清と反応するという事実を特徴とする。
本発明の有益なポリペプチドは、それらが結核患者、特に初期段階の進行性結核 を発症中の患者からのヒト血清と選択的に反応するという事実を特徴とする。
以下に、ＢＣＧのＰ３２蛋白質に対して生じるウサギポリクローン抗血清の調製 方法、並びに本発明のポリペプチドとＢＣＧのＰｘ２蛋白質に対して生じる上記 のウサギポリクローン抗血清との反応の証拠を示すための試験を示すが、本発明 はこれに限定されない。
１）ＢＣＧのＰ３ｇ蛋白質に対して生じるウサギポリクローン抗血清の調製方法 ： 培養上清からのＢＧＧの精製Ｐｓｚ蛋白質が使われる。
ａ）ＢＣＧのＰ　ｓｚ蛋白質の精製： Ｐ３□蛋白質は、以下のようにして精製し得る：使用する細菌株は、ウシ結核菌 ＢＣＧ１１７３Ｐ２亜株（Ｐａｓｔｅｕｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｐａｒｉｓ ）及びＧＬ２亜株（Ｐａｓｔｅｕｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｂｒｕｓｓｅｌｓ ）である。
細菌の培養は、次のようにして得られる：ウシ結核菌Ｂ　ＣＧを、３７．５℃で １４日間、５ａｕｔｏｎ培地上で増殖させて薄膜状にする。培地を蒸留水で調製 する場合は、硫酸亜鉛を加えて最終濃度を５ＭＭとする（標準５ａｕｔｏｎ培地 ）　（Ｄｅ　Ｂｒｕｙｎ　Ｊ、、　ＷｅｃｋｘＭ、、　Ｂｅｕｍｅｒ−Ｊｏｃｈ ｍａｎｓ　Ｍ、　−Ｐ、　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｚｉｎｃｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ 　ｏｎ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｖａｒ。
ｂｏｖｉｓ　（ＢＣＧ）、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１９８１： 　１２４：３５３−７）。亜鉛欠損培地が必要な場合は、硫酸亜鉛を省く。
亜鉛欠損培地からの濾液を得る方法を次に示す：培地をデカンテーションによっ て透明にする。残留細菌をＭｉｌｌｉｐａｋｌ　ＯＯフィルターユニット（Ｍｉ ｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓ、）を用いて濾過し て除去する。精製のために用いる場合、濾液を２０ｍＭ燐酸塩、４５０ｍＭＮａ Ｃ１，１ｍＭＥＤＴＡとなるよう調節し、滅菌濾過前に５Ｍ　ＨＣＩでｐＨを７ ．３とする。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって蛋白質分析を実施する。ドデシル硫 酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をＬａｃｍ ｍｌｉ　（英国）　（Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｏｔ ｅｉｎｓｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　 ｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ丁４．　Ｎａｔｕｒｅ　１９７０；　２２７： ６８０−５）が記載しているように、１３％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミド含有ゲル 上で行なった。ゲルを定量分析のためにＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎ ｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ−２５０で染色し、ＤＵ８　Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計で５９ ５ｎｍで走査する。純度を制御するために、銀染色（Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒ ａｔ、ｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ。
Ｃａ１ｉｆ、）を用いてゲルを示す。
Ｐｓｔの精製工程を次に示す： フェニル−セファロース上での疎水性クロマトグラフィーを除いて、緩衝液はす べて、Ｔｗｅｅｎ　８０　（最終濃度０．００５％）を含有する。ｐＨは、滅菌 前に７．３に調節する。全精製工程は、＋４℃で実施する。溶出では、２８０止 での吸光度を記録する。蛋白質を含有する分画な５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
（１）通常、１リツトル当たり１２５〜１５０ｍｇの蛋白質を含有する、４リッ トルの亜鉛欠損培養液からの処理濾液を、予め０．４５Ｍ　ＮａＣ１及び１　ｍ ＭＥＤＴＡを含有する２０＋ｎＭ燐酸塩緩衝液（ＰＢ）で、平衡させたフェニル −セファロースＣＬ−４Ｂのカラム（５、ＯＸ　５　、　Ｏｃｍ）　（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ ）に１時間当たり８００ｄの流速で使用する。次にゲルを１カラム容積の同一緩 衝液で洗浄して未固定物質を除去し、そして次に３００−の２０ｍＭ及び４ｍＭ ＰＢ、並びにｉｏ％エタノール（Ｖ　／　Ｖ　）で順次洗浄する。
（１１）この分画の燐酸塩濃度が４ｍＭに達した後、それをＤＥＡＥ−セファセ ル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）のカラム（２，６Ｘ１ ０ｃｍ）に使用し、これを４ｍＭＰＨで平衡させる。平衡緩衝液で洗浄後、試料 を１時間当たり５Ｃ）１ｎｌの流速で２５ｍＭ燐酸塩で溶出する。溶出液を、Ｐ ＭＩＯ膜（Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、　。
Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、　Ｍａｓｓ、）を装備した２　０２　Ａｍ１ｃｏｎ撹拌セ ル中で濃縮する。
（ｉ）濃縮物質を４ｍｇのＢＣＧのＰ３□蛋白質（可溶性抽出物）で処理するか 又は５０ｍＭＰＢで平衡されたセファデックスＧ　−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）カラム（２，５Ｘ４５ｃｍ）上で１２−７時の流速で分子ｕいにかける。５ ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて一つのバンドを示すピークの分画をプールする。生成さ れた最終製剤の純度は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びその後の銀染色によって、並びに ファースト蛋白質液体クロマトグラフィー系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）において流 速０．２ｍｌ’／分で、０．００５％Ｔｗｅｅｎ　８０を含有する５０ｍＭＰＢ により平衡されたスペロース１２　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（１２，Ｏｘ ３０ｃｍ）上で分子篩いをすることによって制御する。溶出では、２８０ｎｍ及 び２１４ｎ口での吸光度を記録する。
ｂ）ＢＣＧのＰ、２蛋白質に対して生じるウサギポリクローン抗血清の調製： 生理食塩水１−当たり４ｃｏｎｇのＢＣＧの精製Ｐ３□蛋白質を１容積の不完全 フロインドアジュバントと混合する。その物質をホモジェナイズし、ウサギの背 中の１０部位に分けられる５０ｄの用量で、Ｏ１４，７及び８週目に皮肉注射す る（最後の注射に関しては、アジュバントを希釈剤と置換する）。１週間後、ウ サギから採血して、抗体価に関して血清を試験し、その後アリコートに分配して 一８０℃で保存する；２）本発明のポリペプチドとＢＣＧのｐｓｚ蛋白質に対し て生じる上記のウサギポリクローン抗血清との間の反応の証拠を示すための試験 ： 用いた試験はエライザＥＬＩＳＡ検定であった；抗体測定に関するエライザはＥ ｎｇｖａｌｌとＰｅｒｌｍａｎｎの方法（Ｅｎｇｖａｌｌ、　Ｅ、、　ａｎｄ　 Ｐ、　Ｐｅｒｌｍａｎｎ、　１９７１．　Ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍ ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　（ＥＬＩＳＡ）、　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉ ｖｅａｓｓａｙ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ８：８７１−８７４　）に基づくものである。
１００ｄのトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８，２）中に溶解した１Ｍｇの本 発明のポリペプチドの一つを各ウェルに加えてＩｍ＋ｎｕｌｏｎ　Ｍｉｃｒｏｅ ｌｉｓａプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、　Ｋｌｏｔｅｎ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａ ｎｄ）を被う。温室内で２７℃で２時間インキュベーション後、そのプレートを −晩４℃に保つ。それを、Ｔｉｔｅｒｔｅｋマイクロプレート洗浄器（Ｆｌｏｗ 　Ｌａｂｏｒ　ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、　Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用 いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含有する０゜０１Ｍ燐酸塩緩衝塩水（ｐＨ ７，２）で４回洗浄する。
ブロッキングは、０．０６Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した０、５％ゼ ラチンを用いて、１時間実施する。次にウェルを前と同様に洗浄し。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０及び０．５％ゼラチンを含有する燐酸塩緩衝塩水中 に希釈した上記の血清１００Ｉを加える。予備実験で得られた結果に従って、使 用希釈度をＩｇＧ測定に関しては１：２００、ＩｇＡに関しては１：２０、及び ＩｇＭに関しては１：８０に設定する。各希釈は二重で実施する。２時間インキ ュベーション後にウェルを洗浄し、その後そこに、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０ 及び０．５％ゼラチンを含有する燐酸塩緩衝塩水中にそれぞれｌ：４００．１： ４０００及び１：１，２００に希釈した、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩ　ｇ　Ｍ 　（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ。
Ｃｏｐｅｎｂａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）に対するペルオキシダーゼ−標識ウ サギイムノグロブリン１００４を入れ、そして９０分間インキュベートする。洗 浄後、ウェルに結合したペルオキシダーゼの量を、基質として０゜１５Ｍクエン 酸塩緩衝液（ｐＨ５，０）中に溶解した０−フェニレンジアミン（１０ｍｇ／　 １００ｍｌ’）及び過酸化水素（１００−当たり８μの３０％Ｈ２Ｏ２）の新た に調製した溶液を用いて、定量する。１５分間のインキュベーション後、８ＮＨ ，ＳＯ２を用いて酵素反応を停止する。Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ 光度計（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で４９２ｎｍでの光学密度を読み 取る。
血清を入れていないウェルを標識体に関する対照として用いる。プレート毎の及 び測定日による変動を補正するために、各プレート上に１つの陰性参照血清と中 位及び低抗体レベルの２つの陽性参照血清を包含して、各実験を行なう。抗体濃 度は、参照血清の平均変動に従って読み取り値を補正した後に得られる光学密度 値で表される。
本発明のポリペプチドは結核患者からのヒト血清によって選択的に認識されると いう事実の証拠を示すための試験を以下に示すが、これは本発明を限定するもの ではない。
この試験は、イムノブロッティング（ウェスタンブロッティング）分析で、この 場合、本発明のポリペプチドは組換え技術によって得られる。この試験は、異な る製造方法によって得られる本発明のポリペプチドに対しても用い得る。ドデシ ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、本発明のポリペプチド を、Ｔｏｗｂｉｎら（２９）が記載したように、ニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏ ｎｄ　Ｃ，（Ａｍｅｒｓｈａｍ））上にブロッティングする。大腸菌Ｅ、　ｃｏ ｌｔ　Ｙ］０８９中のβ−ガラクトシダーゼに融合された本発明のポリペプチド の発現は、ポリクローンウサギ抗３２ｋＤａ　ＢＣＧ蛋白質血清（１，：　１， ０００）の結合によって、又はモノクローン抗βガラクトシダーゼ抗体（Ｐｒｏ ｍｅｇａ）を用いて視覚化される。二次抗体（それぞれ、アルカリホスファター ゼ抗ウサギイムノグロブリンＧ及び抗マウスアルカリホスファターゼイムノグロ ブリンＧ標識体）は、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の勧告に従って希釈する。
ヒト結核血清による本発明のポリペプチド及び本発明の融合蛋白質の選択的認識 を確認するために、これらの血清（１：　５０）を用いてニトロセルロースシー トを一部インキユベートする（非特異的蛋白質結合部位をブロッキング後）。ヒ ト結核血清は、後述の引用文献の文献（３１）に記載のようなドツトプロット検 定において検定されるＢＣＧの精製３２ｋＤａ抗原に対するその反応性（高いか 又は低いか）に関して選択される。ニトロセルロースシート上の反応領域は、ペ ルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリンＧ抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、 　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）（１：　２００）を用いて４時間 インキュベートすることによって明示され、繰り返し洗浄後、ペルオキシダーゼ 及び過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼ基質（α−クロロナフトール）　（ Ｂｆｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｂｍｏｎｄ、　Ｃａ１３． ｆ、）を加えると発色反応が発現する。
い（つかのアミノ酸中に存在し、一方では本発明のポリペプチドの組成の一部、 特にＧｌｕ基又はＣ末端アミノ酸が保有する遊離のカルボキシル基であり、他方 でＮ末端アミノ酸又はペプチド鎖内アミノ酸、例えばＬｙｓが保有する遊離ＮＨ ２基である遊離反応官能基は、その改変が本ポリペプチドの上記の特性を変えな い限りにおいて改変可能であることは、言うまでもない。
このように改変される分子は、もちろん本発明の一部である。上記のカルボキシ ル基は、アシル化又はエステル化され得る。
その他の改変も本発明の一部である。特に、又はアミン又はエステル官能基、あ るいは両方の末端アミノ酸は、それ自体、他のアミノ酸との結合に関与し得る。
例えば、Ｎ末端アミノ酸は、別のペプチドのＣ末端領域の一部に対応する１〜数 個のアミノ酸を含む配列に結合し得る。
さらに、本発明のポリペプチドの１〜数個のアミノ酸の置換及び／又は付加及び ／又は欠失による改変に起因する任意の配列は、この改変が上記のポリペプチド の上記の特性を変えない限りにおいて本発明の一部である。
本発明のポリペプチドは、特にＡ、　ｓ　ｎ　−Ｘ　−Ｓ　ｅ　ｒ又はＡｓｎ− Ｘ−Ｔｈｒ型（Ｘは任意のアミノ酸を表す）のそのグリコジル化部位のいくつか において、グリコジル化され得ない場合もある。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に少なくとも一つ の以下のアミノ酸配列を含有する。
−図３ａ及び３ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３８及び３ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３８及び３ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される＜−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に少なくとも一つ の以下のアミノ酸配列を含有するニ ー　図４ａ及び４ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４８及び４ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に少なくとも一つ の以下のアミノ酸配列を含有するニ ー　図５示される（−４３）番目のアミノ酸で構成される末端から（−１）番目 のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に少なくとも一つ の以下のアミノ酸配列を含有するニ ー　図３８及び３ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２ ９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３８及び３ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３８及び３ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に少なくとも一つ の以下のアミノ酸配列を含有するニ ー　図４ａ及び４ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２ ９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４８及び４ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
本発明の有益な組換えポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に少なくとも一つ の以下のアミノ酸配列を含有するニ ー　図５示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５示される（−３０）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番目 のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５示される（−４３）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番目 のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の一つから 成るニ ー　図３８及び３ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３８及び３ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３８及び３ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３８及び３ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９ ４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の一つから 成るニ ー　図４ａ及び４ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４，）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４８及び４ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４８及び４ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４８及び４ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４８及び４ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４８及び４ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９ ４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の一つから 成るニ ー　図５に示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番目 のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（−３０）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（−４３）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の一つから 成るニ ー　図３ａ及び３ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３８及び３ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び３ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３８及び３ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の一つから 成るニ ー　図４ａ及び４ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４８及び４ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び４ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から（ −１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の一つから 成るニ ー　図５に示される（−４３）番目のアミノ酸で構成される末端から（−１）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（−３０）番目のアミノ酸で構成される末端から（−１）番目 のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
真核細胞においては、これらのポリペプチドはシグナルペプチドとして用い得る 。その役割はその合成部位からの蛋白質の転位を開始することであるが、しかし それは転位中に削除される。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の一つから 成るニ ー　図３８及び３ｂに示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ３１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び３ｂに示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（５ ５）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び３ｂに示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（９ ６）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３８及び３ｂに示される（　１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から （１２０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は−図３ａ及び３ ｂに示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（１，９４）番目 のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は−図３ａ及び３ｂに示される（ ２１１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２３０）番目のアミノ酸で構成 される末端にわたる配列、又は−図３ａ及び３ｂに示される（２７５）番目のア ミノ酸で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわた る配列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の一つから 成るニ ー　図４ａ及び４ｂに示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ３１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４８及び４ｂに示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（５ ５）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び４ｂに示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（９ ６）番目のアミノ酸で構成される末端にオ）たる配列、又は −図４ａ及び４ｂに示される（１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から（ １２０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列５又は−図４ａ及び４ｂ に示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（１９４）番目のア ミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は−図４ａ及び４ｂに示される（２１ １）番目のアミノ酸で構成される末端から（２３０）番目のアミノ酸で構成され る末端にわたる配列、又は−図４８及び４ｂに示される（２７５）番目のアミノ 酸で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配 列。
本発明のその他の有益な組換えポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の一つから 成るニ ー　図５に示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（３１）番目 のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（５５）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（９６）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から（１２０）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（１９４）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（２１１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２３０）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（２７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列。
上記のポリペプチドは、後述の実施例で説明されるように、ヒト結核菌によって 分泌される３２ｋＤａの蛋白質をコードするヌクレオチド配列に由来するＤＮＡ の発現物質から得られることに留意すべきである。
本発明はさらに、上記のポリペプチド、及びそのポリペプチドに関する蛋白質又 は異種配列に関するものであって、その蛋白質又は異種配列は、例えば約１〜約 １，０００個のアミノ酸を含む。これらのアミノ酸配列は融合蛋白質と呼ばれる 。
本発明の有益な融合蛋白質においては、異種蛋白質はβ−ガラクトシダーゼであ る。
本発明のその他の有益な融合蛋白質は、以下のプラスミドの一つの発現に起因す る異種蛋白質を含有するものである： ｐＴＪＥＸｌ　ｐｍＴＮＦ　ＭＰＨ 本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列に 関する。
本発明はさらに、次のハイブリッド形成条件下で上記の任意のポリペプチドをコ ードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む核酸 に関するニ ーハイブリッド形成及び洗浄培地：３　Ｘ　ＳＳＣ。
２０％ホ７１／Ａアミド（Ｉ　Ｘ　ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣ１，０，０１５Ｍ 　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７゜Ｏ）、 −ｘ−ｙによって、即ち図３８及び図３ｂに示される（ｘ）位置のヌクレオチド で構成される末端から（ｙ）位置のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列 によって限定される本発明の核酸のハイブリッド形成温度（ＨＴ）及び洗浄温度 （ＷＴ）。
１　−　１８２　ＨＴ＝ＷＴ＝６９℃ １　−　１９４　ＨＴ＝ＷＴ＝６９℃ １　−　２１２　ＨＴ＝ＷＴ＝６９℃ １　−　２１８　ＨＴ＝ＷＴ＝６９℃ １　−　２７２　ＨＴ＝ＷＴ＝６９℃ １　−　３５９　ＨＴ＝ＷＴ＝７１℃ １　−１２４１　ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ １　−１．３５８　ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃１８３　−　３５９　ＨＴ＝ＷＴ＝７０ ℃１８３　−１２４１　ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃１８３　−ｆ３５８　ＨＴ＝ＷＴ＝ ７３℃１９５　−　３５９　ＨＴ＝ＷＴ＝７０℃１９５−１２４１　ＨＴ＝ＷＴ ＝７３℃１９５　−１３５８　ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃２１３　−　３５９　ＨＴ＝ ＷＴ＝７０℃２１３−１２４１　ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃２１３　−１３５８　ＨＴ ＝ＷＴ＝７３℃２１９　−　３５９　ＨＴ＝ＷＴ＝７１℃２１９−１２４１　Ｈ Ｔ＝ＷＴ＝７３℃２１９　−１．３５８　ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃２３４　−　３５ ９　ＨＴ＝ＷＴ＝７１℃２３４−１２４１　ＨＴ＝ＷＴ＝７４℃２３４　−１３ ５８　ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃２７３　−　３５９　ＨＴ＝ＷＴ＝７１℃２７３−１ ２４１　ＨＴ＝ＷＴ＝７４℃２７３　−１３５８　ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃３６０− １２４１　ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃３６０　−１３５８　ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃１２４ ２　−１３５８　ＨＴ＝ＷＴ＝６２℃上記の温度は、約±５℃と考えられるべき である。
本発明はさらに、上記の任意のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と相 補的なヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
上記の、並びに後述の核酸において、産生されるヌクレオチド配列はＴがＵに置 き換えられるようなものであることに留意すべきである。
本発明の好ましい核酸の群は、少な（とも一つの次のヌクレオチド配列を包含す るニ ー図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１８２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３８及び図３ｂに示される（２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及 び図３ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２ ４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂ に示される（１２４２）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１，３５８ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、（ここで、図３ａ及び図 ３ｂに示されるＮは５つのＡ、Ｔ、Ｃ，Ｇ、又は■ヌクレオチドの一つを表す） 、か又は ＴがＵに置き換えられる上記のヌクレオチド配列、又は 上記のヌクレオチド配列もしくはその相補的配列とハイブリダイズする核酸。
本発明の好ましい核酸の群は、少なくとも一つの次のヌクレオチド配列を包含す るニ ー図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１８２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４８及 び図４ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２ ４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂ に示される（　１２４．２　）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３ ５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、（ここで、図４ａ及 び図４ｂに示されるＮは５つのＡ、Ｔ％Ｃ，Ｇ、又は■ヌクレオチドの一つを表 す）、か又は ＴがＵに置き換えられる上記のヌクレオチド配列、又は 上記のヌクレオチド配列もしくはその相補的配列とハイブリダイズする核酸。
本発明の好ましい核酸の群は、少なくとも一つの次のヌクレオチド配列を包含す るニ ー図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（２２０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０ ４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１１０４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２ ９９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 （ここで、図５に示されるＮは５つのＡ、Ｔ、Ｃ１Ｇ、又はＩヌクレオチドの一 つを表す）、か又はＴがＵに置き換えられる上記のヌクレオチド配列、又は 上記のヌクレオチド配列もしくはその相補的配列とハイブリダイズする核酸。
本発明のその他の好ましい核酸は、少なくとも一つの次のヌクレオチド配列を包 含するニ ー図３ａ及び図３ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及 び図３ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに 示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目の ヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（ １８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列。
本発明のその他の好ましい核酸は、少なくとも一つの次のヌクレオチド配列を包 含するニ ー図４８及び図４ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及 び図４ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに 示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目の ヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（ １８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列。
本発明の核酸の別の好ましい群は、次のヌクレオチド配列を包含するニ ー図３ａ及び図３ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（１，３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列。
本発明の核酸の別の好ましい群は、次のヌクレオチド配列を包含するニ ー図４ａ及び図４ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列。
別の有益な態様によれば、本発明の核酸は次の配列の一つを包含するニ ー図３８及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１９４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３８及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３８及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３８及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２７２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３８及び図３ｂに示される（Ｌ）番目のヌクレオチドで構成される末端から （３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３８及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１，３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３８及び 図３ｂに示される（１８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５ ８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに 示される（ｉ８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目 のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３８及び図３ｂに示される （１９５）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレ オチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１９５ ）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで 構成される末端にわたる配列、−図３８及び図３ｂに示される（２１３）番目の ヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成され る末端にわたる配列、−図３８及び図３ｂに示される（２１３）番目のヌクレオ チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端に わたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構 成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配 列、−図３８及び図３ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される 末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図 ３ａ及び図３ｂに示される（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３８及び 図３ｂに示される（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４ １）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに 示される（２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１，）番 目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示され る（２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌク レオチドで構成される末端にわたる配列。
別の有益な態様によれば、本発明の核酸は次の配列の一つを包含するニ ー図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１９４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２７２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４８及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４８及び 図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示さ れる（１８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌ クレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４８及び図４ｂに示される（１ ８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列、−図４８及び図４ｂに示される（１９５）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成 される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１９５）番目のヌク レオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末 端にわたる配列、−図４８及び図４ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチド で構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわた る配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成さ れる末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ 及び図４ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１ ２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ ｂに示される（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４８及び図４ｂに示さ れる（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌ クレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２ ７３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列、−図４８及び図４ｂに示される（２７３）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（１，３５８）番目のヌクレオチドで構 成される末端にわたる配列。
本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成るニ ー図３ａ及び図３ｂに示される（１８３）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及 び図３ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに 示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目の ヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（ ２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列、−図３８及び図３ｂに示される（２３４）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで構成さ れる末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２７３）番目のヌクレ オチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端に わたる配列。
本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成るニ ー図４ａ及び図４ｂに示される（１８３）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４８及 び図４ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４８及び図４ｂに 示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目の ヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４８及び図４ｂに示される（ ２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２３４）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで構成さ れる末端にわたる配列、−図４８及び図４ｂに示される（２７３）番目のヌクレ オチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端に わたる配列。
これらのヌクレオチド配列は、対応するシグナルペプチドをコードするヌクレオ チドシグナル配列として用い得る。
本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成るニ ー図３ａ及び図３ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（ｉ２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３８ 及び図３ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１ ，３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列。
本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成るニ ー図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１８２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１９４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２７２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３８及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３８及び 図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３８及び図３ｂに示さ れる（１８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌ クレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１ ８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列、−図３８及び図３ｂに示される（１９５）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成 される末端にわたる配列、−図３８及び図３ｂに示される（１９５）番目のヌク レオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末 端にわたる配列、−図３８及び図３ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチド で構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわた る配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成さ れる末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３８ 及び図３ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１ ３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３８及び図３ ｂに示される（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示さ れる（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌ クレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２ ７３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２７３）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成 される末端にわたる配列、−図３８及び図３ｂに示される（１２４２）番目のヌ クレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される 末端にわたる配列。
本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成るニ ー図４０及び図４ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ 及び図４ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１ ３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列。
本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成るニ ー図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１８２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１９４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４８及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４８及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２７２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び 図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示さ れる（１８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌ クレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１ ８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１９５）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成 される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１９５）番目のヌク レオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末 端にわたる配列、−図４８及び図４ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチド で構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわた る配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成さ れる末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４８及び図４ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ 及び図４ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１ ３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ ｂに示される（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示さ れる（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌ クレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２ ７３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２７３）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（１，３５８）番目のヌクレオチドで構 成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１２４２）番目の ヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成され る末端にわたる配列。
本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成るニ ー図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９）番 目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９）番 目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０４） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９９） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成さ、れる末端から（１２９ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０４ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０ ４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（２２０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列。
本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチド配列の一つから成るニ ー図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９）番 目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９）番 目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０４） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９９） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０４ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９９ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０ ４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（２２０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０ ４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（２２０）番目のヌクｊ、ｌオチドで構成される末端から（１ ２９９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 一図５に示される（１１０４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２ ９９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列。
本発明はさらに、異種核酸中に挿入された少なくとも一つの本発明の核酸を含有 する任意の組換え核酸に関する。
本発明は特に、上記の配列の転写がプロセッシングを受け易い制御下でプロモー ター（特に誘導プロモーター）が本発明のヌクレオチド配列に先行し、そしてお そらく転写終止シグナルをコードする配列が後に続くと限定されるような組換え 核酸に関する。
本発明はさらに、本発明のポリペプチド及びおそら（はシグナルペプチドをコー ドする核酸配列が、それらが細菌遺伝子内で普通結合されるものに関して異種で ある制御要素、特にそれらの産生のために選択された細胞宿主中のそれらの発現 を制御するために改造された調節要素を用いて組換えられる組換え核酸に関する 。
本発明はさらに、その複製のための非必須部位の一つにおいて、特に基準プラス ミド、コスミド又はファージ、及び本発明の組換え核酸のベクター配列を含む、 特にクローニング及び／又は発現のための組換えベクターに関する。
組換え抗原の発現に適したベクターを以下に示す： ｐＥＸｌ　ｐｍＴＮＦ　ＭＰＨ ｐＥＸ２　ｐＩＧＲＩ ｐＥＸｌ、ｐＥＸ２、及びｐＥＸ３ベクターは市販されていて、Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入出来る。
ｐＵＥＸｌ、ｐＵＥＸ２、及びｐＵＥＸ３ベクターも市販されていて、Ａｍｅｒ ｓｈａｍから購入出来る。
本発明の有益な態様によれば、組換えベクターは、その複製のためのその非必須 部位の一つにおいて、細胞宿主内での本発明のポリペプチドの発現をプロモート するための必要な要素と、おそらくは細胞宿主のポリメラーゼによって認識され るプロモーター、特に誘導プロモーター、並びにおそらくはシグナル配列及び／ 又はアンカー配列を含有する。
本発明の別の態様によれば、組換えベクターは、ベクター中に挿入される本発明 の核酸の大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉによる発現を可能にする要素、特にβ−ガラクトシ ダーゼの遺伝子又はその一部の発現を可能にする要素を含む。
本発明はさらに、本発明の組換えベクターによって形質転換される、そしてこの 宿主内で本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にす る調節要素を含む細胞宿主に関する。
本発明はさらに、上記のようなそして実施例に後述するようなベクターによって 形質転換される大腸菌Ｅ、ｃｏｉｉのような細菌の中から選択される、あるいは ｐＡｃ　３７３　ｐＹＭｌ又はｐｖｃ３のような好適なベクターを含有するウィ ルスＡｃ　Ｎ　Ｐ　Ｖ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　ｎｕｃ ｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ）に感染されたＣＨＯ細胞、昆 虫細胞、Ｓｆ９細胞［５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　］　、　 ｐ　Ｂ　Ｅ　５２０又はｐ８９８３１０のような好適なベクターを含有するウィ ルスＢｍＮＰＶに感染されたＢ　ｍ　Ｎ　［Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ　］のような 真核生物の中から選択される細胞宿主に関する。
本発明は、本発明の形質転換細胞宿主によって発現される核酸の発現物質に関す る。
本発明はさらに、いずれかの核酸と、又はそれらの相補的配列とハイブリダイズ するヌクレオチドプローブ、特に表１に収録され、図９に示された以下のヌクレ オチド配列の中から選択されるプローブに関する。
表１ プローブ＾１　＾１１　＾１ｉ１　＾１ｖａｎｄＡＶＡ（１）　ＣＡＧＣＴＴＧ ＴＴＧＡＣＡＧＧＧＴＴＣＧＴＧＧＣ八（ｉｉ）　ＧＧＴｒＣＧＴＧＧＣＧＣＣ ＧＴＣＡＣＧ＾（ｉｉｉ）　ＣＧＴＣＧＣＧＣＧＣＣＴＡＧＴＧＴＣＧＧ八（ｉ Ｖ）　ＣＧＧＣＧＣＣＧＴＣＧＧＴＧＧＣＡＣＧＧＣＧＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧｋ ＡＣＧＴＣＧＧＧＡＡＧプローブＥ 入八ＧＣＣＧＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣ入ＡＣプローブＦ　ｉ　Ｆ　ｉｉ 　Ｆ　ｉｉｉ　ａｎｄ　Ｆ　１ｖＦ（１）　入ＣＧにＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡ ＣＧＣＣＣ入ＡＣＦ（ｉｉ）　＾ＣＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＣＧ Ｃ入Ｆ（ｉｉｉ）　入ＣＧＧＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＣＣ入ＡＣＦ（ ｉｖ）　ＡＣＧＣＣＣＣ入入ＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＣＣ入又はそれら の相補的ヌクレオチド配列。
ハイブリッド形成条件を次に示すニ ーハイ゛ブリッド形成及び洗浄培地：３　Ｘ　ＳＳＣ。
２０％ホルムアミド（ｌ　Ｘ　ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣ１，０，０１５Ｍ　ク エン酸ナトリウム、ｐＨ−ハイブリッド形成温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ） ： （ＷＴ）’Ｃ：　ＨＴ及びＷＴ　（”Ｃ）Ｄ　４５ Ｅ　５２ Ｆ（ｉｉｉ）　５５ Ｆ（ｉｖ）　５９ これらのプローブは、　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ　ヒト結核菌をその他の細菌株と、特に次のマイコバクテリア種と区別し得る ニ ー　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｒｉｎｕｍ海水魚結核菌、Ｍｙｃｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ　％Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇ ｏｒｄｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｚｕ１ｇａｉ％Ｍｙｃｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ 　ｘｅｎｏｐｉ。
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｏ ｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｅｒｒａｅ、 及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｒｉｖｉａｌｅ、特にＭ、ｂｏｖｉｓウシ 結核菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｋａｎｓａｓｉｉ％Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍａｖｉｕｍ鳥結核菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｌｅｉチモテ 菌及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ　。
本発明はさらに、米国特許第４，６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号 、並びに欧州特許第２００３６２号に記載されているように、ＰＣＲ（ポリメラ ーゼチェインリアクシコン法）による本発明のヌクレオチド配列の合成に用い得 るＤＮＡ又はＲＮＩＡプライマーに関する。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の約１５ 〜約２５ヌクレオチドで構成される任意のＤＮＡ又はＲＮＡプライマーに関する 。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブ リッドを形成し易い約１５〜約２５ヌクレオチドで構成される任意のＤ　Ｎ　Ａ 又はＲＮＡプライマーに関する。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と相補的 な約１５〜約２５ヌクレオチドで構成される任意のＤＮＡ又はＲＮＡプライマー に関する。
プライマーとして用い得る配列を以下の表２（配列ＰＩ−Ｐ６、又はそれらの相 補体）、及び図９に示す表２ Ｐ３　ｃｏｍｐｌ、ＴＣＣＣＡＣＴＴＧＴ入ＡＧＴＣＴＧＧＣ八Ｐ４　へ　ＴＣ ＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＣＧｃｏｍｐｌ、＝相補体 これらの配列は、本発明の任意のヌクレオチド配列、特に１番目のヌクレオチド で構成される末端から１３５８番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配 列、並びにＢＣＧのα抗原のヌクレオチド配列についてのポリメラーゼ鎖反応（ ＰＣＲ）法により酵素的増幅を可能にする１２組の異なるプライマー（表３に示 されている）に結合し得る（１７）。
ＰＣＲ増幅物質の検出は、ＤＮＡを増幅するために用いられたＰＣＲＣラプライ マー間目する少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列とのハイブ リッド形成反応による。
本発明のヌクレオチド配列のＰＣＲ物質は、表３に示されるプローブを用いるハ イブリッド形成法（ドツト−スポット、サザンブロッティング等）によってＢＣ Ｇのα抗原遺伝子又はその一部と識別される。これらのプローブの配列は、上記 の表１に示されている。
１且 １之ヱヱニｌ　プローブによる １、　Ｐｌ及びＢ２の相補体　Ｂ ２、　Ｐｌ及びＢ３の相補体　Ｂ ３、　Ｐｌ及びＢ４の相補体　Ｂ ４、ＰＬ及びＢ５の相補体　Ｂ又はＣ ５、Ｐｌ及びＢ６の相補体　Ｂ、Ｃ，Ｄ又はＢ６、　Ｂ２及びＢ５の相補体　Ｃ ７、Ｂ２及びＢ６の相補体　Ｃ，Ｄ又はＢ８、　Ｂ３及びＢ５の相補体　Ｃ ９、Ｂ３及びＢ６の相補体　Ｃ％Ｄ又はＥｌｏ、Ｂ４及びＢ５の相補体　Ｃ １１、Ｂ４及びＢ６の相補体　Ｃ，Ｄ又はＢ１２、Ｂ５及びＢ６の相補体　Ｄ又 はＥ　′酵素的増幅は、表２に示されるプライマーの約１５の連続した塩基の配 列を有するすべてのオリゴヌクレオチドを用いても成し遂げられることに留意す べきである。、５°末端に伸長を伴う、あるいは小程度のミスマツチを伴うプラ イマーは、そのミスマツチがプライマーの３゛末端での塩基対合を妨げない場合 は、酵素的増幅の結果に相当に影響を及ぼすということはない。
本発明の（ＢＣＧ遺伝子のではなく）ヌクレオチド配列の特異的な酵素的増幅は 、プローブ（表１に示されている）又はそれらの相補体が増幅プライマーとして 用いられる場合に成し遂げられる。
上記の表１のプローブがプライマーとして用いられる場合、そのプライマー組は Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ又はＦから選択される任意のその他のヌクレオチド配列の相 補体に関連した表１の任意のヌクレオチド配列（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ）で構 成されるが、この場合、配列Ａは配列Ａ　（ｉ）、Ａ　（ｉｔ）、Ａ（ｉｉｉ） 、Ａ（ｉｖ）、Ａ（ｖ）のいずれかを意味し、配列Ｆは配列Ｆ　（ｉ）、　Ｆ　 （ｉｉ）、Ｆ（ｉ　ｉ　ｉ）　、　Ｆ　（ｉｖ）のいずれかを意味すると理解さ れるべきである。
本発明のヌクレオチド配列の酵素的増幅に有益なプライマー組は、後述の表３− ２に示される以下のプライマー組の一つである： 又はＡ（ｉｉ） 又はＡ　（ｉ　ｉ　ｉ）　及びＢの相補体Ａ　（ｉ） 又はＡ（ｉｉ） 又はＡ　（ｉ　ｉ　ｉ）　及びＣの相補体Ｂ　及びＣの相補体 又はＡ　（ｉ　ｉ　ｉ）　及びＦの相補体又はＡ　（ｉ　ｉ　ｉ）　及びＤの相 補体又はＡ（ｉｉｉ）　及びＥの相補体 Ｂ　及びＤの相補体 Ｂ　及びＥの相補体 Ｂ　及びＦの相補体 Ｃ及びＤの相補体 Ｃ及びＥの相補体 Ｃ及びＦの相補体 Ｄ　及びＥの相補体 Ｄ　及びＦの相補体 Ｅ　及びＦの相補体 Ａ　（ｉ）、Ａ　（ｉｉ）、Ａ　（ｉｉｉ）、Ａ　（ｉｖ）、Ａ　（Ｖ）　、Ｂ 、Ｃ，Ｄ、Ｅ及びＦは表１に示されるヌクレオチド配列を有する。
上記の表３−２に記載の上記の任意のプライマー組を有する本発明のヌクレオチ ド配列の増幅の場合、増幅ヌクレオチド配列の検出は、少な（とも１０ヌクレオ チドのオリゴヌクレオチド配列とのハイブリッド形成反応によって成し遂げられ るが、その配列はヌクレオチド配列を増幅するために用いられたＰＣＲＣラプラ イマー間目する。上記の２つのプライマー間に番目するオリゴヌクレオチド配列 は、図９（この場合、プライマーＡ、Ｂ％Ｃ，Ｄ、Ｅ及びＦはそれぞれプローブ 領域Ａ、プローブ領域Ｂ、プローブ領域Ｃ、プローブ領域Ｄ、プローブ領域Ｅ及 びプローブ領域Ｆと呼ばれる矩形で囲まれた配列で表される）から確定される。
本発明はさらに、ＰＣＲ法によるヌクレオチド配列の酵素的増幅のための、及び 以下のニ ー表３に記載のＰＣＲプライマー組の一つ、及び本発明の検出プローブ（表１に 記載のプローブが有益である）、 又は表３−２に記載のＰＣＲプライマー組の一つ、及び例えば少なくとも１０ヌ クレオチドのオリゴヌクレオチド配列から成る検出配列であって、上記の配列は 上記のヌクレオチド配列を増幅するために用いられたプライマー組を構成する２ つのＰＣＲＣラプライマー間置する（図９）もの を含有する増幅ヌクレオチド配列の検出のためのキットに関する。
本発明はさらに、以下のニ 一本発明の核酸を含有する適当なベクターで予め形質転換された細胞宿主の適切 な培地での培養、−上記の培養液から上記の形質転換細胞宿主により産生される ポリペプチドの回収、及び −最後に固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による 産生されたポリペプチドの精製からなる工程を包含する本発明のポリペプチドの 製造方法に関する。
本発明のポリペプチドは、ペプチド合成の分野における古典的技法に従って製造 され得る。
その合成は、均質溶液中又は固相で実施し得る。
例えば、用い得る均質溶液中での合成方法としては、Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙ　１が ”　Ｍｅｔｈｏｄｅ　ｄｅｒｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　ｃｈｅｍｉｅ”　（有機 化学の方法）という表題の本（編集者　Ｅ、　Ｗｕｎｓｈ、ｖｏｌ、１５−Ｉ＆ ＩＩ。
ＴＨＩＥＭＥ、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　１９７４　）に記載した方法が挙げられ る。
本発明のポリペプチドは、Ｒ，Ｄ、Ｍｅｒｒ　ｉ　ｆ　１ｅｌｄが”５ｏｌｉｄ 　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ″（Ｊ、Ｐ。
Ｈａｍ、　５ｏｃｋｓ、、４５．２１４９−２１５４）という表題の論文に記載 した方法に従って調製することも出来る。
本発明はさらに、本発明の核酸の製造方法に関する。
一本鎖核酸（本発明の精々１００ヌクレオチドを含有する）を化学的に製造する のに適した方法は、次の工程ニ ーＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４；２７４−３２５．１９８６ に記載の自動β−シアノエチルホスホラミダイト法を用いるＤＮＡ合成 を含む。
一本１！　Ｄ　Ｎ　Ａの場合、ＤＮＡ合成終了時に生成される物質はこのように 用いられる。
二本鎖核酸（本発明の高々１００ｂｐを含有する）を化学的に製造するのに適し た方法は、以下の工程を包含するニ ーＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４；２７４−３２５．１９８６ に記載の自動β−シアノエチルホスホラミダイト法を用いる一つのセンスオリゴ ヌクレオチドのＤＮＡ合成、及び上記の自動β−シアノエチルホスホラミダイト 法を用いる一つのアンチセンスオリゴヌクレオチドのＤＮＡ合成、 −ＤＮＡ重複体を形成するためにハイブリッド形成によってセンス及びアンチセ ンスオリゴヌクレオチドを結合する、 一生成されたＤＮＡ重複体を適当なプラスミドベクター中にクローニングし、制 限酵素消化及びアガロースゲル電気泳動のような古典的方法に従ってＤＮＡを回 収する。二本鎖核酸の場合、１００ヌクレオチド、又は１　ｏｏｂｐより長い核 酸の化学的製造方法には、以下の工程が含まれるニ ー化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの収集。その末端に異なる制限部位を 有する場合、その配列は、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８ ０；７４６１−７４６５．　１９８３に記載された原理によれば、天然ペプチド のアミノ酸列に一致する。
−それによって生成されたＤＮＡ重複体を適当なプラスミドベクター中にクロー ニングし、制限酵素消化及びアガロースゲル電気泳動のような古典的方法に従っ て所望の核酸を回収する。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドに対して産生される抗体それ自体に関す る。
言うまでもなく、この産生はポリクローン抗体に限定されない。
本発明はさらに、一方で本発明の精製ポリペプチドに対して免疫化された動物、 特にマウス又はラットの牌臓細胞と、他方“骨髄腫細胞株の細胞とから古典的方 法によって生成され易（、動物の免疫化のために最初に用いられたポリペプチド を認識するモノクローン抗体を産生ずるその能力によって選択される任意のハイ ブリドーマにより産生される任意のモノクローン抗体に関する。
本発明はさらに、酵素、蛍光、又は放射能等の適当な標識によって標識化される 本発明の任意の抗体に関する。
抗体、特にモノクローン抗体を生成するのに用いると有益であるペプチドを、次 の表４に示す：表土Ａ（図４ａ及び４ｂ参照） アミノ酸位置　アミノ酸位置 （ＮＨ２末端）　（ＣＯＯＨ末端） １２　ＱＶＰＳＰＳＭＧＲＤＩ）ＣＶＱＦＯ５ＧＧ入　３１３６　ＬＹＬＬＤＧ ＬＲＡＱＤＤｒＳＧＷＤＩ）ｉ’Ｔ　５５フ７　５ｒｙｓｃ＋ｗｙｑｐＡｃＲＫ ＡａｃＱＴｙに　９６１０１　ＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮＲ）ｒＶ）ＣＭ’Ｇ； 　１２０１７５　ＫＡＳＤ囮ＧＰＫＥＤＰＡＷＱＦ研ＤＰＬ　１９４２１１　Ｃ ＧＮＧＫＰＳＤＩＩ、ＧＮＮＵ’ＡＸＦＬ１　２３０２７５　ｋＣＰＤＬＱＴｕ ＮｖＰＲｎＰＧＰＴ）ＱＧ入　２９４及ま上（図５参照） アミノ酸位置　アミノ酸位置 （ＮＨ，末端）　（ＣＯＯＨ末端） ７７　５ＦＹＳＤＷＹＱＰＡＣ（ＪＡＧＣＱＴＹ）Ｃ９６２７ｇ　ＰＤＬＱＲＡ 号ＡＴＰＮＴＧＰＡＰＱＧ＾　２９５アミノ酸配列は１文字コードで示されてい る。
表４に記載されたペプチドは、それらの意図される用途によって変化し得る。例 えば、ペプチドが抗血清を生成するために用いられる場合は、そのペプチドは付 加される余分のシスティン残基を伴って合成され得る。この余分のシスティン残 基は、好ましくはアミノ末端に付加され、そして小ペプチドを免疫原性にするの に必要な担体蛋白質にペプチドが結合し易（する。
ペプチドがラジオイムノアッセイに使用するために標識化される場合、ヨウ素化 を促すためにアミノ又はカルボキシル末端にチロシンを付加した蛋白質を合成す るのが有益である。したがって、これらのペプチドは表４に記載されたペプチド の一次配列を有するが、しかし、蛋白質のその一次配列中に認められない、そし てその唯一の機能はペプチドに所望の化学的特性を付与することである付加的ア ミノ酸を伴う。
本発明はさらに、その抗体を含有し易いヒトの生物学的試料中の結核に関連した ｉｎ　Ｖｉｔｒｏでの抗体の検出方法に関する。この方法はニ ー生物試料を、上記のポリペプチドと生物試料中に存在する可能性のある抗体と の間のｉｎ　ｖｉｔｒｏ免疫反応を可能にする条件下で、本発明のポリペプチド 又はペプチドと接触させ、そして 一生成され得る抗原／抗体複合体をｉｎ　ｖｉｔｒ。
検出する 工程から成る。
好ましくは、生物培地はヒト血清で構成される。
検出は、任意の古典的方法によって実施し得る。
例えば、好ましい方法としては、エライザＥＬＩＳＡ法又は蛍光抗体法又はラジ オイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）等による免疫酵素的方法が挙げられる。
したがって、本発明はさらに、酵素、蛍光、放射能等の適切な標識で標識化され る本発明の任意のポリペプチドに関する。
結核に関連したｉｎ　ｖｉｔｒｏでの抗体を検出するためのこのような方法は、 例えば次のニー滴定マイクロプレートのウェルに確定量の本発明のポリペプチド 組成物を固定させ、 一上記のウェルに診断すべき血清の段階希釈液を入れ、 一マイクロプレートをインキュベーションし、−マイクロプレートを繰り返し洗 浄し、−マイクロプレートのウェルに血液イムノグロブリンに対する標識抗体を 入れ、 一少なくとも指定の波長でのこの基質の放射線の吸収を改変することにより基質 を加水分解できるものの中から選択される酵素によってこれらの抗体を標識化し 、 一加水分解基質の量の対照基準と比較することによって検出する 工程から成る。
本発明はさらに、それらを含有し得るヒトの生物試料中のヒト結核菌のｉｎ　ｖ ｉｔｒｏでの抗原の検出及び同定方法に関する。この方法はニ ー生物試料を、上記の抗体と生物試料中に存在する可能性のあるヒト結核菌の抗 原との間の１ｎｖｉｔｒｏ免疫反応を可能にする条件下で、本発明の適切な抗体 と接触させ、そして生成され得る抗原／抗体複合体なｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出する 工程から成る。
好ましくは、生物培地は痰、胸膜滲出液、気管支肺胞洗浄液、尿、生検又は剖検 検体で構成される。
適切な抗体は、表４に記載されたペプチドに対するモノクローン抗体が有益であ る。
本発明はさらに、ヒト結核菌に感染し易い患者における結核のｉｎ　ｖｉｔｒｏ 診断のための別の方法に関する。この方法はニ ー上記のようなりＮＡプライマー組の方法により上記の患者から採取した生物試 料中に含有され得る本発明のヌクレオチド配列の量を予め増幅させ、−上記のプ ローブ及び上記のヌクレオチド配列間で生成されるハイブリッド形成複合体の産 生を可能にする条件下で、上記の生物試料と本発明のヌクレオチドプローブとを 接触させる 工程から成る。
上記のようにヒト結核菌に感染し易い患者における結核のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断 を実施するために、次の必要物質又はキットを使用する。その必要物質又はキッ トとしてはニ ー、本発明の確定量のヌクレオチドプローブ、−検出すべき配列と上記のプロー ブとの間のハイブリッド形成反応を生じるために有益な、適切な培地、−ハイブ リッド形成反応中にヌクレオチド配列とプローブとの間に形成されるハイブリッ ド形成複合体の検出を可能にするのに有益な試薬 が含まれる。
本発明はさらに、ヒト結核菌に感染し易い患者における結核のｉｎ　ｖｉｔｒｏ 診断のための別の方法に関する。この方法はニ ー患者から採取した生物試料を、上記のポリペプチド又はペプチドと生物試料中 に存在する可能性のある抗体との間のｉｎ　ｖｉｔｒｏ免疫反応を可能にする条 件下で、本発明のポリペプチド又はペプチドと接触させ、そして 一生成された可能性のある抗原／抗体複合体を１ｎｖｉｔｒｏ検出する 工程から成る。
ヒト結核菌に感染し易い患者における結核の１ｎｖｉｔｒｏ診断を実施するため に、次の必要物質又はキットを使用する。その必要物質又はキットとしてはニ 一本発明のポリペプチド又はペプチド、−免疫反応に適した培地を作成するため の試薬、−免疫反応によって産生された抗原／抗体複合体の検出を可能にする試 薬（この試薬は、特に上記のポリペプチド又はペプチドが標識化されない場合、 おそらく標識を有するかあるいは標識化試薬に認識され易い）が含まれる。
本発明はさらに、ヒト結核菌に感染し易い患者における結核のｉｎ　ｖｉｔｒｏ 診断のための別の方法に関する。この方法はニ ー生物試料を、上記の抗体と生物試料中に存在する可能性のあるヒト結核菌の抗 原との間の１ｎｖｉｔｒｏ免疫反応を可能にする条件下で、本発明の適切な抗体 と接触させ、そして生成され得る抗原／抗体複合体なｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出する 工程から成る。
適切な抗体は、表４に記載されたペプチドに対するモノクローン抗体が有益であ る。
ヒト結核菌に感染し易い患者における結核の１ｎｖｉｔｒｏ診断を実施するため に、次の必要物質又はキットを使用する。その必要物質又はキットとしてはニ 一本発明の抗体、 一免疫反応に適した培地を作成するための試薬、−免疫反応によって産生された 抗原／抗体複合体の検出を可能にする試薬（この試薬は、特に上記の抗体が標識 化されない場合、おそらく標識を有するかあるいは標識化試薬に認識され易い） が含まれる。
結核のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断に有益なキットにはニー少なくとも好適な固相系、 例えばｉｎ　ｖｉｔｒ。
診断すべき生物試料をそこに固定させるためのマイクロプレート、 一本発明のモノクローン抗体の一つを含有する試料、−上記のモノクローン抗体 のための特異的検出系、−一方では試験試料と上記のモノクローン抗体との、他 方で結合モノクローン抗体と検出系との間の免疫反応を実施するのに適した緩衝 液 が含まれる。
本発明はさらに、本発明のポリペプチド又はペプチドの一つの試料を含む、上記 のようなキットに関する。本発明の上記の抗原は、競合投薬法で用いられるキッ トに対して請求められる抗原に関する基準（求められるヒト結核菌の抗原の定量 測定のための）、又は競合体である。
本発明はさらに、製薬上受容可能なビヒクルを伴って本発明のポリペプチド又は ペプチドを包含する免疫原性組成物に関する。
本発明はさらに、その他の免疫原性成分の中で、天然蛋白質と、あるいは摺合体 が、ヒト結核菌を中和する抗体のｉｎ　ｖｉｖｏ産生を誘発するか、又はヒト結 核菌抗原反応性Ｔ細胞を活性化することによって細胞免疫反応な　ｉｎ　ｖｉｖ ｏで誘発することができるような十分な分子量を有する合成ポリペプチドと結合 する可能性のある本発明のポリペプチド又はペプチド、もしくは本発明の発現物 質のいずれかを包含するワクチン組成物に関する。
免疫原性成分として用いると有益な本発明のペプチドは、以下の配列の一つを有 する： 瓦土１（図４ａ及び４ｂ参照） アミノ酸位置　アミノ酸位置 （ＮＨ，末端＞　（ＣＯＯＨ末端） １２　ＱＶＰＳＰＳＭＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳにＧＡ　３１３６　ＬＹＬＬＤＧＩ ＪｔＡＱＤＤＦＳＧＷＤ工ＮＴ　５５７７　ＳＦ”ＹＳＤ讐ＹＱＰＡＣＲＸＡＧ ＣＱＴＹＫ　９６１０１　ＬＴＳＥＬＰＧＷＬＯＡＮＲ）ｒＶＸＰｒＧ５　１２ ０１７５　ＫＡＳＤＫＷＧＰＫＥＤＰＡＷＱＲＮＤＰＩ、　１９４２１１　ＣＧ ）ＪＧＫＰ！９ＤＬＧＧＮＮＬＰＡＫＦＬＥ　２３０２７５　ＫＰＤＬＱＲＨＷ ＶＰＲＰｒＰＧＰＰＱＧＡ　２９４及土上（図５参照） アミノ酸位置　アミノ酸位置 （ＮＨ，末端）　（ＣＯＯＨ末端） ７７　５ＦＹＳＤＷＹＱＰＡＣＧｌｉＪＧＣＱＴＹ）Ｃ９６２７６ＰＤＬＩＱＲ ＡＬＧＡ７ＰＮＴＧＰＡＰＯＧＡ　２９９アミノ酸配列は１文字コードで示され ている。
本発明のその他の特徴及び利点は、本発明を説明する以下の実施例及び図面にお いて、明らかになる。
図１　（Ａ）及びｌ　（Ｂ）は、６つの精製えｇｔｌｌヒト結核菌組換えクロー ンの鑑定を示す。図１　（Ａ）は、クローン１５、クローン１６、クローン１７ 、クローン１９、クローン２４、及びＥｃｏＲＩ−Ｈ４ｎｄＩＩＩ消化ラムダＤ ＮＡ分子量マーカーレーン（キロ塩基対）（Ｍ）（Ｂｏｅｈｒ　ｉ　ｎｇｅｒ） のＥｃ。
ＲＩ制限分析に相当する。
図１　（Ｂ）は、クローン１５、クローン１６、クローン１７、クローン１９、 クローン２３及びクローン２４で溶原化された大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉの粗製溶解物 のイムノブロッティング分析を示す。
矢印（−）は、組換えλｇｔｌｌ−ヒト結核菌クローンによって生成された融合 蛋白質を示す。発現及びイムノブロッティングは上記と同様であった。分子量（ ｋＤａで示される）は分子量マーカー（高分子ＳＤＳキャリブレーションキット 、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）との比較により見積もった。
図２は、上記のようにポリクローン抗３２ｋＤａ（ＢＣＧ）抗血清で確認された えｇｔｌｌヒト結核菌組換えクローン１７及び２４のＤＮＡ挿入物の、並びにク ローン１７の１２０ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ　Ｉ制限断片とのハイブリッド形成 によって選択されたクローンＢｙ１、ＢＮ２、及びＢＮ２の制限地図に相当する 。
ＤＮＡは、メーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ　）の記載通りに、ラムダ５ｏｒｂフアー ジ免疫吸着剤を用いて、んｇｔ１１ファージストックから単離した。制限部位は 上記のように位置した。いくつかの制限部位（＊）はヌクレオチド配列のコンピ ューター分析から推論した。
短い垂直線（＋−１）は組換えクローンのＤＮＡ挿入物を取り囲むＥｃｏＲＩ部 位由来リンカ−を表す。
その下の部分はシーケンシングされた分子量３２ｋＤａの抗原を含むＤＮＡ領域 を拡大したものである。矢印はジデオキシシーケンシングの計画及び方向を示す 。（−ｅ）Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　Ｈ１３中にサブクローンされる断片；（＋） ｍｐｌｏ及びｍｐＨＭ１３ベクター中にサブクローンされる断片；（−一）合成 オリゴヌクレオチドを用いて確定される配列。
図３ａ及び３ｂは本発明の抗原の一般式のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す 。
図４ａ及び４ｂは本発明の抗原の一つのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ共働プロモーター配列に類似した２つの配列群は矩形で囲ま れていて、共働に対する相同はイタリック体の太字で示される。肉太ローマ字は 推定上のＳｈ　ｉ　ｎｅ−Ｄａｌ　ｇａｒｎｏモチーフを表す。
二重線のアンダーラインを施された成熟蛋白質のＮＨ，末端アミノ酸配列は、Ｍ ＰＢ５９抗原のもの（３４）と非常に相同−２９／３２アミノ酸−である。２７ ３番目のＡＴＧの上流の５つの別のＡＴＧコドンが示されている（点線アンダー ライン）、垂直矢印（１）はクローン１７及びクローン２４の推定ＮＨ２末端を 示す。ここで任意になされたオプションは、Ａ　Ｔ　Ｇ　＋ｍｓに対応する５９ アミノ酸シグナルペプチドを表す。
図５は本発明の３２ｋＤａの抗原のヌク１／オチド及びアミノ酸配列を示す。
二重線のアンダーラインを施された成熟蛋白質のＮＨ２末端アミノ酸配列は、Ｍ ＰＢ５９抗原のもの（３４）と非常に相同−２９／３２アミノ酸−である。垂直 矢印（１）はクローン１７及びクローン２４の推定ＮＨｔ末端を示す。
図６は３２ｋＤａの分子量の本発明の抗原の、及びＢＣＧのα抗原（１７）の水 治療法パターンである。
図７は、本発明の３２　ｋＤａの抗原のアミノ酸配列とＢＣＧのα抗原のアミノ 酸配列（改変翻訳）との間の相同性を示す。
同一アミノ酸（：）、アミノ酸の進化的に保存された置換（、）、及び相同性な しくニ）が示されている。アンダーラインを施された配列（＝）はシグナルペプ チドを表し、ここで任意に採択されたオプションはＡＴＧ、、に対応する４３ア ミノ酸シグナルペプチドを表す。
配列中のダッシュは最適列を得るために必要な区切りを示す。
図８は、本発明の３２ｋＤａの蛋白質がヒト結核血清によって選択的に認識され るという事実を説明する。
図８は、ヒト結核血清、及び抗β−ガラクトシダーゼモノクローン抗体によるイ ムノブロッティングを表す。レーン１〜６：融合蛋白質（１４０ｋＤａ）を発現 する大腸菌溶解物；レーン７〜１２：未融合β−ガラクトシダーゼ（１１４ｋＤ ａ、）。クローン１７（７）ＤＮＡ挿入物（２，７に、ｂ）をｐ　Ｕ　Ｅ　Ｘ　 を中テサブクローニングし、融合蛋白質の発現をＢｒｅｓｓｏｎ及び５ｔａｎｌ ｅｙ　（４）が記載したようにして誘発した。レーン１及び７は抗βガラクトシ ダーゼでプローブした：レーン４．５．６、及び１０．１１．１２は、３２ｋＤ ａの本発明の精製蛋白質に対して高度に反応する３種類の異なるヒト結核血清で プローブした；レーン２及び３なら８及び９は２つの異なる低反応血清でプロー ブした。
図９は、本発明のヒト結核菌の３２ｋＤａ蛋白質遺伝子の核酸配列（上部ライン ）を表しており、これは本発明の図５の配列、図４８及び４ｂの遺伝子の配列（ 中間ライン）、並びにＢＣＧのα抗原に関する遺伝子の配列（下部ライン）に対 応する。
配列中のダッシュは、核酸配列の最適列を得るのに必要な区切りを示す。
酵素的増幅のプライマー領域を矩形で囲んである（Ｐｉ−Ｐ６）。
特異的プローブ領域を矩形で囲み、それぞれプローブ領域Ａ、プローブ領域Ｂ、 プローブ領域Ｃ、プローブ領域Ｄ、プローブ領域Ｅ及びプローブ領域Ｆと定める 。
１番目のヌクレオチド（図９の）が図３ａのヌクレオチド２３４に、そして図５ のヌクレオチド９１に対応するために、ヌクレオチドの番号付けは図３ａ及び図 ３ｂ、並びに図５の番号付けとは異なっている。
図１０ａは、大腸菌における本発明のＰ１２抗原の発現のために実施例ＩＶで用 いられるｐＩＧＲＩプラスミドの制限及び遺伝子地図を示す。
この図では、アンダーラインを施された制限部位が独特である。
図１０ｂは、ｐＩＧＲＩ核酸配列に対応する。
この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構築するために用いられる−続きのヌ クレオチドの起始を以下に示す。
位置 ３４２２−２０６：　ｐＰＬ　（え）のＥｃｏＲＩプラントＭｂｏＩＩプラント 断片を含有するラムダＰＬ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ　） ２０７−３８４　：　合成りＮＡ配列 ２２８−２３０　：　第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：　成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸を コードするＤＮＡ ３０６−３０８　：　第一シストロンの停止コドン（ＴＡＡ） ３１１−３１２：　第ニジストロンの開始コドン（ＡＴＧ） ３８５−８９０：　ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｓｐＩ断片を含 有するｒ　ｒ　ｎ　Ｂ　Ｔ　＋　Ｔ　２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　） ８９１−３４２１　：　テトラサイクリン耐性遺伝子を含有するｐＡＴ＋５ｓ （Ｂｉｏｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ　）のＤｒａＩ−ＥｃｏＲＩプラント断片、及 び複製の起始 後述の表５は、ｐＩＧＲＩの完全制限部位分析を示す。
ψ　いψり彎　０む管口へい　肖”−ＩＮ　１％　へ　ＦＩ　Ｆｌ　−ｒ’いへ ヘサ１〜　ｃＤｍ寸ｗｒ−、−１１”１０肖臂　曽■い■　ロ　豐　Φ　ロ　門 口小ｏト一−ｃＰＩＩ／Ｉｒ＋１Φ　へ―ψ肖Ｆ”ＮＦＩの色ロ　Φ　ψ　の　 −〇か中ψ寸ｉ豐Ｎ　ＮＮ　１−１−へＮＦ’ｌ　ＮＮ　Ｎ　ヘ　へ　１−ヘー へｉへｐ　ｌ＋Ｉ　Ｌｌ″ｌ　Ｉ”ｌ　＋Ｊ３’ａ　円口肖〜ロヘｉす１ヘト　 ロ　閂　小へ肖　小口曽−いｏｏ１へψトｃＤΦト　ψω〜Ｑのへ鎖円ｎωト　 ψ　ト　リΦト　むい曽〜臂小トｎａｈｎＷｔＯ管賃　へ０１−ψ−Ｎ門へい偽 　の　ト　のト啼　臂Φψ０臂ｒ−ＰＩ　ＯＮ　ＮＮ　ｐ−１−ＩＮＮＭＭ　へ −−−〜へ　−へ７へ　ヘヘＱＩＱＩＡＪクーｈａ・、−＋　・、＜＊Ｉ：　ｍ ｍｍｏｏｏｏｏｏｏｏｐ　ｐ　ｘメｐｐ＠＠ｎ’５””−’＞　、　＞’ＱＱｌ 　ｔｉｔｉ＋ａａｕｕｕｕｕｕｕａ　ｃ　００−−１！１ｃｏｍｕｕｕｕ　ｕ　 ｕｏロ　ロロロｕｗｗｗｗｗ：ｑｗｂ　ｂ　ｗｗｕ。
−Ｉ／ＩＩ／Ｉ小Ｉ＋１か彎００ｉのローψψ　−ゆｎ−へ臂豐１■ト　ヘロト ！−トロトロＰ″か！へ１−　苛１−ｉ−一ψ　む１〜の　ｌ／ｌ　ｑｙ　ｏｏ 臂−−苛Ｆｌ、〜１曽−豐ｒ＋ｗ　ｒ−ｗ■Ｎ　″へｎ哨へ門ト　ψトドー　− 小円Φの−　−争ｎヘヘーリＰ４−　Ｎ　Ｎｍへ　ヘｎ　へｎへ　−　ヘ　−　 〜　ｎ−門　閂ヘー色ｖＤψすｏｏいへΦ門■小ψ口色０色すｎ色閂トのトヘー 〇〜リーロ肖円トリー−〇　〇）　１１）ＩＮ　”　Ｉ”ｌ　９　ｕ　４　（ｈ 　ｊＨ’−Ｄ　Ｆ’ｌ　ｍｌ　ｍ−ＱＦＩ　Ｆｌ　（Ｐ＋　曽ｉｎ　ＦＩ　Ｏｌ ｎ@ＱＦ　ｒ　ＰＩ　ｌ’ｌ　Ｕ　トー ＮＦ’１１−１−へＮ＋／１彎０ψ〜肖へい［Ｆ］肖へｎ　小−いいロ　ηｉへ ｉト　ψｎ　！イＮ　Ｉ′＋Ｉ　Ｎ　ＮＮｌ＋１１−１　ｐ−＋−ｘ　−−へ　 −＋ＩＮ　Ｎ図１１ａは、大腸菌における本発明のｐｓｉ抗原の発現のために実 施例Ｖで用いられるｐｍＴＮＦ　ＭＰＨプラスミドの制限及び遺伝子地図を示す 。
図１１ｂは、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核酸配列に対応する。
この図における、プラスミドｐｍＴＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる− 続きのヌクレオチドの起始を以下に示す。
位置 １−２０８：　ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩプラントＭｂＯ工■プラント断片を含 有 するラムダＰ　Ｌ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）２０９−４３６　：　合成りＮＡ 断片 ２３０−２３２：　ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（ＡＴＧ） ２３６−３０７　：　成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸をコー ドする配列 ３０８−３８４：　３１５−３３２番目の配列をコードする Ｈ　ｉ　ｓ　ｓを含有する多 クローニング部位 ３５８−４３６　：　大腸菌ｔｒｐターミネータ−を含有する ＨＬｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片 ４３７−９４３　：　ｐＫＫ２２３　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）からのＨｆｎｄ Ｉ　Ｉ　ｌ−５ｓｐＩ 断片を含有するｒｒｎＢＴ＋ ９４４−３４７４　：　テトラサイタリン耐性遺伝子を含有するｐＡＴ、□ （Ｂｉｏｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ　）のＤｒａＩ−ＥｃｏＲＩプラント断片、及 び複製の起始 後述の表６は、ｐ　ｍ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｍ　Ｐ　Ｈの完全制限部位分析を示す。
ｒ−１６Ｗ　Ｃｏ　円　へ −門　の　啼偽　肖 ＋−１−ＮＮ　Ｎ ｗ−Ｎ　ｌ、ｌ＠！Ｉ／１　ｌ、ｌ曹ｎ　へ−ｉｎ　ｏ　。　〜たへ　の　い　 ＩＮ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　ψ＆ｎ　ｔｔ５　Ｉ、、Ｗ　Ｎ　Ｆ− ロか　０　ｎ　偽　ψ　の −１”ｌ　Ｎｌ”ｌ　ｌ’ｌ　ｌ’ｌ　””　ｌ”ｌ　、、−Ｎ　ｌ＋１へ　１ 〜−　Ｆ、ｌ／１　い口Φ　臂口Φ　ロ　ψへさミー−−ＮＦＩ　偽色−門　− 小Ｉ／ＩＮｒ＋ψ　寸へさ　Φ　Ｇの０ψ口さ　へ　さ　へ　―ＦＩＮ＆Ｉ’ｌ 　ｏ１１６ψ　鎖ｎ曽　ロロψ　！　ト啼ロヘロロ　い　０１　の！ト”　（’ １１′＋′ＮＦＩＮ　−へ　ＮＮＮＦＩ”　Ｎ　＋−１へ　Ｎ　Ｆ’ｌ　−ｒ′ 　Φ　ＮｑＦ　Φへｉ　ロロー　ｎ　門１０Ｏ１ｉ　ψ　−一　！　色へドロー 　〇　ＰＩＦ”　ＣＰＩＩ／ＩＮ　Ｎｖ＋”ｌｌ　Ｎ　Ｑ）ＣＤＯＯ１％ＣＤｅ ｌ　＊　ｔｚｃｈ　Ｊ　ｖｏｒｚｔｑｃｉ！　か　１／ＩＯＱの曹　ロ！閂　豐 　−いｎ−色の　へ　ｉｎ　へ　ｌ”ｌ　ＰＩ　Ｗ　Ｍ−へ―　Ｎ　Ｎｌ＋ｌ　 ｅ’４　＋＋Ｉ−ＩＮＩＮ　Ｎ　Ｆ’ｌ　へ　閂　−Ｎ　（ｈ 小　Ｍ　ＰＩ　ｌｌ’ｌ　ロ　啼　〜　１−Ｍ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｍ　Ｎ　Ｍ ｌ　０　ＭＴ−Ｉ　Ｉｔ’１ｌ−ＩＮ”　Ｉ＋ＩＯｌ／ｌφロ　トｉローい　小 　豐　門　啼　Ｏ口六＝　間開：：　ｃ；　：間開＝：８　ス禽二：　スまへ　 −−Ｎ　ＰＩ−ＭＭＮＭ　Ｎ　Ｎ　ｍ＋Ｍ仇　Ｎ　ｏ＋／ＩＮロトψ　−−ｐｐ ｘ”　Ｍ口管−−へ　の　ψ　ｉ　喰へ＝＝　七ま黛＝雲ま＝ミセ七＝スま　＝ ミ＝＝＝：Ｎ　Ｎ　Ｎ−−Ｍ　ＮＮＮ　−Ｎ　Ｎ　−Ｆ−１゛ミ鼾°北荘５°ヌ ミ罪ミ＝＝ミ＝ミ本恕ＩＩ＝本Ｎ　Ｆ’Ｉ　Ｎ　−一（Ｎ　ＮＮＮ　Ｍ　ヘ　ヘ 　Ｎ梢 鎖１Ｎ＋１０−へ口ψ　〜−い　ｏｏロヘ！ｏ−１苛へ豐０ψ臂色ωΦトカ宮石 はま＝素　＝工　＄時相　叱七繁：：”；ス＝畳＝電−−一　−−−Ｎ　Ｎ 図１２ａはプラスミドｐＩＧＲＩにおけるＰ。抗原のサブクローニングのために 実施例ＩＶに記載されたように、中間構築物ｐＩＧ２　Ｍｔ３２を作成するため に用いられるプラスミドｐＩＧ２の制限及び遺伝子地図を示す。
図１２ｂは、ｐＩＧ２核酸配列に対応する。
この図における、プラスミドｐＩＧ２を構築するために用いられる−続きのヌク レオチドの起始を以下に示す。
位置 ３３００−２０６：　ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩＭｂｏＩＩプラント断片を含有 するラムダＰ　Ｌ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）２０７−２６６：　ＡＴＧ開始コ ドンが２３２−２３４番目にある多クローニン グ部位及びリポソーム結合部位 を含有する合成配列 ２６フー７７２　：　ｐＫＫ２２３　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）からのＨｉｎｄ Ｉ　Ｉ　ｌ−５ｓｐＩ 断片を含有するｒ　ｒ　ｎ　Ｂ　Ｔ　ｒ７７３−３３００　：　テトラサイクリ ン耐性遺伝子、及びｐ　Ａ　Ｔ　１５３　（Ｂｉｏｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ　）の ＥｃｏＲＩ− ＤｒａＩ断片を含有する複製の 起始 表７は、ｐＩＧ２の完全制限部位分析を示す。
ωロ　ΦＯＮ　ｍ　の　− ｍＦ’ｌ　ｍＦＩ　Ｎ　〜　ヘ　ヘ ３　、　／／　４２℃　〃 ４　、　／／　４２℃　２時間導入 ５　、　ｎ　４２℃　３　〃 ６　、　ｎ　２８℃　４　〃 ７　、　／／　４２℃　４　〃 ８、　〃　２８℃　５　〃 ９、　／／　４２℃　５　〃 図１４ｂでは、レーンは以下のように対応している： レーン １　、　ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ−Ｍｔ３２　２８℃　１時間導入２　、ｔｉ　４２ ℃　１　〃 ３　、　ｌｌ　２８℃　４時間導入 ４、　／／　４２℃　４　〃 図１５は、実施例ＶＩＩに示されるように、ｐＨの漸減を伴う組換え抗原のＩＭ ＡＣ溶離プロフィルを示す。
図１６は、実施例ＶＩＩに示されるように、イミダゾール濃度の漸増を伴う組換 え抗原のＩＭＡＣ溶離プロフィルを示す。
図１７は、実施例ＶＩＩに示されるように、イミダゾール濃度の増加の段階勾配 を示す組換え抗原のＩＭＡＣ溶離プロフィルを示す。
実施例工： 材料と方法 ３２ｋＤａ　血２によるλ　ｔｌｌヒト±えＤＮＡライブラリーのスクリーニン グヒト結核菌（Ｅｒｄｍａｎ株）のゲノムＤＮＡから作成されるλｇｔｌ１組換 えライブラリーは、Ｒ，Ｙｏｕｎｇ　（３５）から入手した。文献の記載内容（ １４，３５）に後述するいくつかの変更を加えて、スクリーニングを実施した。
えｇｔｌｌ感染大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０　（１５０ｍｍプレート当たり ｉｏ’ｐｆｕ）をＮＺＹＭプレート（Ｇｉｂｃｏ　）上に植え付け（１６）、４ ２℃で２４時間インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の発現を 誘発するために、プレートにイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ ）−飽和フィルター（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｃｅｘｔｒａ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）をか ぶせて、３７℃で２時間インキュベートした。ポリクローンウサギ抗３２ｋＤａ 抗血清を用いてスクリーニングを実施した。上記のポリクローン抗血清ウサギ抗 ３２ｋＤａ抗血清は、以下のようにＰ３□ウシ結核菌ＢＣＧ　（１１７３Ｐ２株 −１ｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　Ｐａｒｉｓ）に対する抗血清を生じさせ ることにより得られた：生理的食塩水１ｍｌ当たり４００μｇ（ウシ結核菌ＢＣ Ｇの精製Ｐ３２蛋白質）を１容積の不完全フロインドアジュバントと混合した。
その物質をホモジナイズし、０．４．７及び８週目に、ウサギの背中の１０部位 にわたって５０ｔＬｌの用量で皮肉注射した（アジュバントは最後の注射に関し ては、希釈液と置き換えた）。１週間後、ウサギを採血し、アリコートに分ける 前に抗体レベルに関して血清を調べ、−８０℃で保存した。
ポリクローンウサギ抗３２ｋＤａ抗血清を大腸菌溶解物上で予吸収しく１４）、 １　：３００の最終希釈で用いた。１　：　５０００に希釈された二次アルカリ ホスファターゼ抗つサギＩｇＧ標識（Ｐｒｏ（ｍｅｇａ　）を用いて、β−ガラ クトシダーゼ融合蛋白質を検出した。発色させるために、ニトロブルーテトラゾ リウム（ＮＥＴ）及び燐酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル（ＢＣＩＰ ）を用いた。フィルター上の反応領域は、３０分以内に濃紫色に変わった。通常 、二連続精製工程を実施して、純粋なりローンを得た。
ＩＰＴＧ、ＢＣＩＰ、及びＮＢＴは、ＰｒｏｌＴｌｅｇａ　ｃｏｒｐ。
（Ｍａｄｆｓｏｎ　ＷＬ）から入手した。
パホの二゛クローンＢＹ１、ＢＹ２　びＢＹ５を′るためのハイブリラドン　に よる−プラークスクリーニング 用いた手法は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１４）が記載したものであった。
λ　ｔｌｌ　え２、からの　′　の・ 大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｙ１０８９のコロニーを、Ｈｙｕｎｈら（１４）が記載し たように適切なんｇｔ１１組換え体で溶原化した。溶原化Ｅ、ｃｏｌｉＹ１０８ ９の単一コロニーをＬＢ培地中に接種し、３０℃で６０Ｏｎ、ｍ″ｒ０．５の光 学密度に増殖させた。４５℃で２０分のヒートショック後、Ｉ　ＰＴＧを加えて 最終濃度を１０ｍＭにすることによって、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の産 生を誘発した。
３７℃で６０分間インキュベーションを継続し、遠心分離して細胞を素早く集め た。細胞を緩衝液（１０ｍＭ　トリス　ｐＨ８，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に５ ０倍に濃縮し、直ちに液体窒素中に凍結した。試料は解氷して溶解し、ＥｃｏＲ Ｉ制限緩衝液中の１００μｇ／ｍ１ＤＮａｓｅＩで、３７℃で５−１０分間処理 した。
イムノブロッテ　ング　ウエスタンプ口ツティンＬＬ公逝： ５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動処理後、組換え溶原菌蛋白質を、Ｔｏｗｂ　Ｌ　ｎら （２９）が記載したようにニトロセルロース膜（Ｈｙ　ｂ　ｏ　ｎ　ｄ　Ｃ，Ａ ｍｅｒｓｈａｍ）上にブロッティングした。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｙ１０８９のβ−ガ ラクトシダーゼに融合されたマイコバクテリア抗原の発現は、上記の段落”抗３ ２　ｋ　Ｄ　ａ抗血清によるλｇｔｌｌヒト結核菌組換えＤＮＡライブラリーの スクリーニングに記載のようにして得られたポリクローンウサギ抗３２ｋＤａ抗 血清（１：　１０００）の結合により、モノクローン抗−β−ガラクトシダーゼ 抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ　）を用いて視覚化された。１：５０００に希釈された二 次アルカリホスファターゼ抗つサギＩｇＧ標識（Ｐｒｏｍｅｇａ　）を用いて融 合蛋白質を検出した。
これらの種々の抗体の使用により、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の検出が可 能になる。非融合−β−ガラクトシダーゼも同一ゲル中に存在し、結核患者から の血清のよって認識されないという事実のために、この反応は、ヒト結核菌蛋白 質に依っている。
ヒト結核血清による組換え融合蛋白質の選択的認識を確認するために、ニトロセ ルロースシートをこれらの血清（１：　５０）とともに−晩インキユベートした （非特異的蛋白質結合部位をブロッキング後）。ヒト結核血清は、以前記載され たように（３１）ドツトプロット検定で試験されたウシ結核菌ＢＣＧの精製３２ に、　Ｄ　ａ抗原に対するそれらの反応性（高いが低いが）に関して選択された 。ニトロセルロースシート上の反応領域は、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩ ｇＧ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）　（ １：　２００　）とともに４時間インキュベートすることによって明示され、数 回洗浄後、ペルオキシダーゼ及び過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼ基質（ α−クロロナフトール）　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）を添加することによって発色反 応が現れた。
且塵ＪＤＮと分断 精製λｇｔｌｌクローンにおけるヒト結核菌ＤＮＡ挿入物の最初の確認は、Ｅｃ ｏＲＩ制限によって行なった。消化後、切り取られた挿入物をアガロースゲル上 で動かして、サザンハイブリッド形成を施した。
プローブは、ランダムブライミング（１０）によりα”Ｐ　−ｄ　ＣＴ　Ｐで標 識化した。その他の制限部位は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ％ＫｐｎＩ、Ａｃｃ Ｉ及びｓｐｈ　Ｉによる組換えんｇｔｌｌファージＤＮＡ又はそのサブクローン 化ＥｃｏＲＩ断片の単−及び二重消化によって位置を定めた。
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅ−Ｍ１３　（６）における、又はｍｐｌＯ及びｍｐＨＭ１ ３ベクター（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＬｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ、１０１．　 １９８３．　ｐ、２０−８９．ＪｏａｃｈｉｍＭｅｓｓｉｎｇ、Ｎｅｗ　Ｍ１３ 　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）に おける特定の断片のサブクローニング後、Ｓａｎｇｅｒら（２５）のプライマー 延長ジデオキシ終止法によって配列分析を行なった。配列分析は、ヒト結核菌Ｄ ＮＡの高ＧＣ含量（６５％）により非常に妨げられた。したがって、シーケンシ ング反応はいくつかのＤＮＡポリメラーゼ：　Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼじシケナ ーゼＵＳＢ）　、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（Ａｍｅｒｓｈａｍ ）を用いて、そしてい（つかの場合にはＡＭＶ逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＲＴ　、 　Ａｎｇｌｆａｎ　Ｂｆｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ、）を用いて、そして 時としてはｄＧＴＰの代わりにｄＴＴＰを用いて実施した。配列の不明確な領域 に焦点を合わせるために、オリゴデオキシヌクレオチドを合成して、使用した。
シーケンシング法は図２に要約されている。いくつかの不明確な領域における人 為的に生じた可能性があるフレームシフトを突き止めるために、特別なプログラ ムを用いて、高比率のＧＣを含有する配列における最も可能性のあるオーブニリ ーディングフレームを限定した（３）。人工産物を特にシーケンシングしがちな いくつかの領域が、化学的シーケンシング（１８）によって確証又は修正された 。このために、化学的シーケンシングベクターｐＧＶ４６２　（２１）中で断片 をサブクローニングし、前述のように分析した。選択された約２５０〜３５０ｂ ｐの制限断片を単離し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ又はＭｕｎｇマメヌクレアー ゼで処理してプラントエンドとして、ｐＧＶ４６２のＳｍａＩ又はＨｉｎｃＩＩ 部位でサブクローニングした。ＴｔｈｌｌｌＩ又はＢｓｔＥＩ　Ｉ（３２）での 単一末端標識化、及び化学的変質法の変法（３３）により、挿入ＤＮＡの両鎖を シーケンシングした。
核酸及び推定上のアミノ酸配列の常用のコンピューターを用いた分析を、Ｂｅ　 ｌ　１　ｏｎ　（２）からのＬＧＢＣプログラムで実施した。Ｐｅａｒｓｏｎ及 びＬｉｐｍａｎ　（２３）からのＦＡＳＴＡプログラムを用いた相同性調査、並 びにＮａｔｉｏｎａｌ　ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄａｔ ｉｏｎ　−Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　（ＮＢＲＦ）（ＮＢＲＦ／ＰＩＲデータバン ク）からの蛋白質同定源（Ｐ　Ｉ　Ｒ）は、１６を公表する（１９８８年３月） 。
結果 一ボリクローン　３２ｋＤａ　血・′によるλ　ｔｌ１Ｍヒト士　、　えＤＮＡ ライブラリーのスクリーニ！ｉ： １．５ｘｌＯ’プラークを示すフィルター１０個をポリクローンウサギ抗３２ｋ Ｄａ抗血清（８）でプローブした。精製後、６つの別々の陽性クローンを得た。
阻退」シと巨：」ゴλ迂折 これら６つの精製λｇｔｌ１組換えクローンＤＮＡのＥｃｏＲＩ制限分析（図Ｉ Ａ）から、４種類の異なる挿入物が明示された。クローン１５は、１．８ｋｂ、 １．５ｋｂ及び０．５ｋｂの３つのＤＮＡ断片を生じる２つの付加的内部Ｅｃｏ ＲＩ部位を伴う全長３．８ｋｂの挿入物を有した。クローン１６のＤＮＡ挿入物 は、１．７ｋｂ長であった。クローン１７及び１９は、それぞれ２．７ｋｂ及び ２．８ｋｂというほぼ同じ長さのＤＮＡ挿入物を有した。
最後に、クローン２３（図示していない）及びクローン２４はともに、２．３ｋ ｂ及び１．７ｋｂの２つの断片を生じる１つの別のＥｃｏＲＩ制限部位を伴う４ ｋｂの挿入物を含有した。サザン分析（データは示されていない）から、クロー ン１５．１６．１９のＤＮＡ挿入物及びクローン２４の小断片（１，７ｋｂ）は それ自体とハイブリッドを形成するだけであるが、一方クローン１７　（２，７ Ｋｂ）はそれ自体とハイブリッドを形成するがしかし同等にクローン２４の２． ３ｋｂＤＮＡ断片とも良くハイブリッドを形成することが示された。したがって 、クローン１５．１６及び１９は１７．２３．２４群と全く別で、無関係である 。この解釈は、適切なＬｇｔｌ１組換え体で溶原化され、Ｉ　ＰＴＧで誘発され るＥ、ｃｏｌｉＹ１０８９の粗製溶解物の分析によって、さらに確証された。ウ ェスタンプロット分析（図ＩＢ）は、クローン１５．１６及び１９を発現する細 胞中でポリクローン抗３２ｋＤａ抗血清と反応する、成熟又は不完全な融合蛋白 質を示さなかった。したがって、クローン１５．１６及び１９は、擬陽性である と考えられて、それ以上調べなかった。これに対して、クローン２３及び２４で 溶原化される細胞は、３２ｋＤａのうち約１０ｋＤａを含有する免疫反応性融合 蛋白質を産生じた。最後に、クローン１７は、外来ポリペプチド部分が約２５ｋ Ｄａ長である融合蛋白質を発現した。
クローン２４の２．３ｋｂ挿入物、及びクローン１７の２．７ｋｂ断片の制限エ ンドヌクレアーゼ地図（図２）により、２つの挿入物を並べ、且つ配向すること ができたが、これは、クローンエフの２．７ｋｂ断片がクローン２４の２．３ｋ ｂ挿入物を５°方向に±０．５ｋｂ延長したものに相当することを示唆している 。
クローン１７が不完全であったので、同一λｇｔ１１組換えヒト結核菌ＤＮＡラ イブラリーを、クローン１７のＤＮＡ挿入物の丁度５′末端に対応する１２０ｂ ｐＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎｌ制限断片（ベクタークローニング系により市販のブルー スフリブベクター中に以前サブクローンされた（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅクローニ ング系））（図２）とのハイブリッド形成によってスクリーニングした。３つの ５′−延長クローンＢｙｌ、Ｂ　ｙ　２及びＢｙ５を単離し、制限によって分析 して、並べた。最大挿入物Ｂｙ５は、３．１ｋｂ上流まで及び１．１ｋｂ下流ま で並べられた全コード領域（下記参照）に関する情報を含有した（図２）。
１独」郡 種々のλｇｔｌ１重複クローンに由来する１３５８塩基対ヌクレオチド配列を図 ３ａ及び図３ｂに示す。
ＤＮＡ配列は、１８３番目で開始し、１２４２番目でＴＡＧコドンによって終止 する１０５９塩基対のオーブンリーディングフレームを含む。３６０番目でＴＴ Ｔコドンによって開始するヌクレオチド配列からこのオーブンリーディングフレ ーム内に位置し得るＮＨ。
−末端アミノ酸配列　（ｐｈｅ−ｓｅｒ−ａｒｇ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−１ｅｕ−ｐ ｒｏ−ｖａｎ、−ｇｌｕ　−ｔｙｒ−１ｅｕ−ｇｉｎ−ｖａｔ−ｐｒｏ−ｓｅｒ 　−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｍｅｔ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ａｓｐ　−ｉ　ｌｅ−１ｙｓ− ｖａｌ−ｇｉｎ−ｐｈｅ−ｇｉｎ　−ｓｅｒ−ｇｉｙ−ｇｌｙ−ａｌ　ａ−ａｓ ｎ）が、２０．２１．３１番目のアミノ酸（ＭＰＢ　５９においてはそれぞれｇ ｌｙ、ｃｙｓ及びａｓｎである（３４））を除いて、ＭＰＢ　５９抗原の同−Ｎ Ｈ。
末端アミノ酸配列に対応するということが見いだされる。したがって、この配列 の上流のＤＮＡ領域は、３２ｋＤａの蛋白質の分泌に必要なシグナルペプチドを コードすることが予測される。したがって、成熟蛋白質は、おそらく、Ｎ−末端 Ｐｈｅ　（ＴＴＴコドン）からＣ−末端Ａｌａ（ＧＣＣコドン）までの２９５ア ミノ酸残基から成る（図５）。
６つのＡＴＧコドンは、同一リーディングフレームの３６０番目のＴＴＴの前に 番目することが判明した。同一リーディングフレームの任意のこれらのＡＴＧを 用いると、２９．４２．４７．４９．５５及び５９残基のシグナルペプチドの合 成が起こる。
股豆！盪パヱニ２ 本発明の３２ｋＤａの蛋白質の、そしてＢＣＧのα抗原（１７）の水油療法パタ ーンコード配列を、ＫｙｔｅとＤＯＯｌｉｔｔｌｅの方法（１５）によって調べ た。ノナペプチドプロフィルを図６に示す。最初の疎水性シグナルペプチド領域 に加えて、い（つかの親水性ドメインが確認された。本発明の３２ｋＤａ蛋白質 の全親水性パターンがＢＣＧ　α抗原のものに匹敵するということに注目すると おもしろい。雨量白質に関して、最高の親水性を示すドメインは、アミノ酸残基 ２００と２５０の間で確認された。
徂皿ユ Ｍ　ａ　ｔ　ｓ　ｕ　ｏら（１７）は、近年、ＢＣＧのα抗原をコードする遺伝 子に対応する１０９５ヌクレオチドクローン化ＤＮＡの配列を発表した。Ｉｎｆ ｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ、　ｖｏｌ、５８．ｐ、５５０−５５６ ．１９９０で修正されたようなヒト結核菌抗原αの９７８ｂｐコード領域と、本 発明の３２ｋＤａ蛋白質の１０１７ｂｐコード領域は、９４２整列領域で、７７ ．５％の相同性を示す。アミノ酸レベルでは、両先駆体蛋白質配列は、７５．６ ％の同一残基を占める。さらに、１７．６％のアミノ酸が、比較のために用いら れる算法で限定されるような進化的に保存された置換に対応する（ＰＡＭ２５０ マトリツクス、２３参照）。図７はシグナルペプチドのＮ末端における配列分岐 を示す。両成熟蛋白質のアミノ末端配列−３２アミノ酸−は、３１番目を除いて 同一である。
図８は、クローン１７を発現する粗製大腸菌抽出物でイムノブロッティングした 場合の結核患者からの血清試料が、本発明の３２ｋＤａ蛋白質を含む１４０ｋＤ ａ融合蛋白質（レーン４〜６）とは明瞭に反応するが、しかし平衡抽出物中で発 現される非融合β−ガラクトシダーゼ（レーン１０〜１２）とは反応しないこと を示す。本発明の３２ｋＤａの精製蛋白質と殆ど反応しないとして選択された２ つの陰性対照からの血清試料は、本発明の３２ｋＤａ蛋白質を含む１４０ｋＤａ 融合蛋白質を認識しないか、あるいは非融合β−ガラクトシダーゼを認識しない （レーン２，３なら８及び９）。１４０ｋＤａ融合蛋白質及び非融合β−ガラク トシダーゼは、抗β−ガラクトシダーゼモノクローン抗体と反応することが容易 に突き止められた（レーン１〜７）。
本発明は、３２ｋＤａの蛋白質を特にコードするＤＮＡ領域を調製出来た（図５ と比較されたい）。上記のＤＮＡ領域は、３３８コドン（停止コドンは含まれな い）のオーブンリーディングフレームを含有する。
２２０番目では、成熟蛋白質の最初のアミノ酸をコードするＴＴＴの次に３２ｋ Ｄａの成熟蛋白質をコードする２９５トリブレツトが来る。このオーブンリーデ ィングフレームの大きさ、得られた融合蛋白質の免疫反応性、シグナルペプチド の存在、そして特にＭＰＢ　５９抗原（３１／３２アミノ酸相同性）において、 並びにＢＣＧ　α抗原（３１／３２アミノ酸相同性）において見いだされるもの と非常に相同性が高いＮ　Ｈｘ−末端領域のこの遺伝子内での確認（図７参照） は、記載されたＤＮＡ断片がヒト結核菌により分泌される３２ｋＤａ蛋白質をコ ードする全シストロンを含み、今日まで不明確な方法で確認されたことがないと いうことを、強く示唆している。
６つのＡＴＧコドンは、同一リーディングフレームの２２０番目でこのＴＴＴに 先行することが判明した。同一オーブンリーディングフレームの任意のこれらの ＡＴＧを用いると、４３．４８．５０．５６又は６０残基のシグナルペプチドの 合成が起こる。これらの種々の可能性のうち、開始はＡ　Ｔ　Ｇ　ｓ　＋又はＡ ＴＧ、□で起きると考えられるが、これは、両方とももつともらしい大腸菌様プ ロモーター及び５ｈｉｎｅ−Ｄａ　ｌ　ｇａｒｎｏモチーフが先行するためであ る。
開始がＡＴＧｌ、で起きる場合、対応するシグナルペプチドは４３残基のかなり 長いペプチドシグナルをコードする。しかしながら、この長さは、グラム陽性細 菌からの分泌蛋白質の間では一般的でない（５）。
それは、適当な距離で、一般的大腸菌５ｈｉｎｅ−］）ａｌ　ｇａｒｎｏモチー フ（ＡＧＧＡＧＧと相同の４７６残基）の後に番目する。
開始がＡ　Ｔ　Ｇ　ｌｌｔで起きる場合、対応するシグナルペプチドは５６残基 のペプチドシグナルをコードするが、しかし余り厳格でない５ｈｉｎｅ−Ｄａｌ 　ｇａｒｎｏリポソーム結合部位配列を有する。
翻訳終止トリブレットを取り囲む領域は、シーケンシングゲル上にいわゆる圧縮 を生じる二次構造効果に特に感受性を有した。１１０５番目のＴＡＧ終止コドン の前方では、２３残基のうち２２がＧ−Ｃ塩基対であり、うち９つがＧである。
ＡＴＧｌｌ。の上流では、１６ヌクレオチドで分離されるヘキサヌクレオチド（ ＴＴＧＡＧＡ）（ＴＴＧＡＣＡに対する相同性５／６及びＡＡＧＡＡＴボックス （ＴＡＴＡＡＴに対する相同性４／６）を含む大腸菌プロモーターに類似の配列 （１１）が観察された。開始コドンと考えられるＡＴＧ９．の上流では、その配 列は大腸菌”−３５へキサヌクレオチド　ボックス”と相同のいくつかの配列を 、その後ＴＡＴＡＡＴに似たはれを検出した。これらのうち、最も示唆に富んで いたものを図３８及び３ｂに示す。それは、１４ヌクレオチドでＧＡＴＡＡＧ　 （ＴＡＴＡＡＴに対する相同性４／６）から分離される５９番目でのＴＴＧＧＣ Ｃ（図３８及び３ｂ）（ＴＴＧＡＣＡに対する相同性４／６）を含む。面白いこ とに、この推論上のプロモーター領域は、ＢＣＧ蛋白質α−遺伝子（１７）に関 して記載されたプロモーター領域との、あるいは６５ｋＤａ蛋白質遺伝子（２６ ，２８）に関して記載されたものとの広範な配列相同性を共有しない。
ＮＢＲＦデータバンク（公布　１６．０）を調べた場合、本発明の３２ｋＤａ蛋 白質と任意のその他の十分に公知の蛋白質配列との間の任意の有意の相同性は検 出できなかった。特に、３２ｋＤａ蛋白質と、ヒトフィブロネクチン受容体（１ ）のα及びβサブユニットとの間に有意の相同は観察されなかった。本発明の３ ２ＫＤａ蛋白質のＮ　Ｈｚ−末端配列は、ＢＣＧＭＰＢ５９抗原（３４）に関し て過去に発表されたものに対して−２９／３２アミノ酸−１そしてＢＣＧα抗原 の配列（Ｍａｔｓｕｏ、１７）に対して一３１／３２アミノ酸−相同性が高く、 さらにその最初の６アミノ酸においては、ウシ結核菌ＢＣＧの３２ｋＤａ蛋白質 （９）と同一であった。しかしながら、推定上の開始メチオニンは、α抗原の配 列（図７と比較）とは異なる付加的２９又は４２アミノ酸疎水性配列に先行する が、しかし原核生物において分泌されるポリペプチドのシグナル配列（２２）に 寄与する全特徴を示す。
興味深いことに、本発明の核酸（１−１３５８）（図３ａ及び３ｂと比較）とＭ 　ａ　ｔ　ｓ　ｕ　Ｏのα抗原のＤＮＡとの間の有意の相同は、それらの推論上 のプロモーター領域内には存在しない。
１血■ユニ：と上”　の３２ｋＤａ　の　コード　１を　む　プラス」二１宜成 前実施例では、図２において、ヒト結核菌からの３２ｋＤａ蛋白質遺伝子領域を 包含する種々の重複λｇｔｌｌ単離物を記載した。いくつかのＤＮＡ断片を、Ｂ ｌｕｅ　５ｃｒｆｂｅ　Ｍ１３＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中でこれ らのんｇｔｌｌファージからサブクローニングした。これらのプラスミドの中に は３２ｋＤａ蛋白質遺伝子の全コード配列を含むものがないため、この配列を含 有するプラスミドを再構築した。
工程１：ＤＮＡ断片の調製： １）Ｂｌｕｅ　５ｃｒｆｂｅ　Ｍ１３＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中 でＢｙ５のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片をサブクローニングして得られたプラスミド ＢＳ−Ｂｙ５−８００　（図２と比較）を、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで消化して８０ ０ｂｐの断片を得て、電気溶離によって１％アガロースゲルから単離した。
２）Ｂｌｕｅ　５ｃｒｉｂｅ　Ｍ１３＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中 でλｇｔｌｌ−１７からの２．７ｋｂＥｃｏＲＩ挿入物をサブクローニングして 得られたプラスミドＢ５−４．１　（特許出願の図２を参照）を、ＨｉｎｄＩＴ Ｉ及び５ｐｈＩで消化して１５００ｂｐの断片を得て、電気溶離によって１％ア ガロースゲルから単離した。
３）メーカーの指示に従って、ＢｌｕｅＳｃｒｉｂｅ　Ｍｌ　３＋をＨｉｎｄＩ ＴＩ及び５ｐｈＩで消化し、子牛側のアルカリホスファターゼ（分子生物学に関 する特殊な品質、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で処理した。
工程２：連結反応： 連結反応は、次のものを含有した： １２５ｎｇの８００ｂｐ　ＨｉｎｄＩＩＩ断片１２５ｎｇの１５００ｂｐ　５ｐ ｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入物（２） ５０％ｇのＨｉｎｄＩ　Ｉ　ｌ−３ｐｈＩ消化ＢＳＭ１３＋ベクター（３） ２μｍの１０連結反応緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓら　１９８２） １μｍ　（＝２．５Ｕ）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ） ４μｍのＰＥＧ６０００，２５％（Ｗ／Ｖ）８μｍのＨ２０ インキュベーションは、１６℃で４時間であらた。
工程３：形質転換 メーカーの指示通りに、１００μｌのＤＨ５ａ　大腸菌（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ） を１０μｍの連結反応液で（工程２）形質転換し、ＩＰＴＧ、Ｘ、−Ｇａｌアム ビシリンプレート上に広げた。約７０の白色コロニーが得られた。
工程４： ８００ｂｐ断片を両配向で挿入し得た場合、２２９及び２９４ｂｐの小断片の存 在を特徴とするクローン（クローン１１とは異なる）を選択するために、Ｐ　ｓ 　ｔ　Ｉで消化することによっていくつかのクローンからのプラスミドＤＮＡを 分析した。この構築物は、正しい配向でＨｉｎｄＩ　Ｉ　ｌ−ＨｌｎｄＩ　Ｉ　 Ｉ　−５ｐｈＩ複合体を含む。この新規の構築物を含有するプラスミドを、“Ｂ Ｓ、ＢＫ、Ｐｓａコンブレット”と名づけだ。
に立主旦：　におむる　日のポリペプチドの現： ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又はその一部は、発現ベクターの一部で あるリポソーム結合部位に結合し得るか、あるいは発現ベクター上にすでに存在 する別の蛋白質又はペプチドの情報と融合し得る。
前者の場合、情報はこのように発現され、それゆえ任意の外米配列を欠く（大腸 菌によって常に除去されるわけではないアミノ末端メチオニンは除（）。
後者の場合、発現蛋白質はハイブリッド又は融合蛋白質である。
ポリペプチドをコードする遺伝子、及び発現ベクターを連結反応を可能にする末 端を生じるように、適切な制限酵素で処理するか、又は別のやり方で操作する。
その結果生じる組換えべくたーを用いて宿主を形質転換する。挿入遺伝子の存在 及び適正な配向に関して、形質転換株を分析する。さらに、選択された宿主のそ の他の株を形質転換するために、クローニングベクターを用いてもよい。組換え ベクターを調製し、それらを宿主細胞に形質転換し、そしてポリペプチド及び蛋 白質を発現するための種々の方法及び材料は。
Ｐａｎａｙａｔａｔｏｓ、　Ｎ、が”Ｐｌａｓｍｉｄｓ、　ａｐｒａｃｔｉｃａ ｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ”　（ｅｄ、に、Ｇ、Ｈａｒｄｙ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ） ｐｐ、１６３−１７６、ｂｙ　Ｏｌｄ　ａｎｄ　Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、ｐｒｉｎｃ ｉｐａｌｓ　ｏｆｇｅｎｅ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　（２ｄ　Ｅｄ、　１９ ８１）に記載しており、そして当業者に十分に公知である。
発現のために種々のクローニングベクターを用い得る。プラスミドが好ましいけ れども、ベクターはバクテリオファージ又はコスミドであってもよい。選択され るベクターは、選択される宿主細胞と協調的であるべきである。
さらに、プラスミドは、形質転換宿主細胞を容易に確認し、形質転換されていな いものと分離できる表現型特性を有するべきである。このような選択遺伝子は、 例えばテトラサイクリン、カルベニシリン、カナマイシン、クロラムフェニコー ル、ストレプトマイシン等のような抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子であ る。
大腸菌における遺伝子のコード配列を発現するために、発現ベクターは、転写及 び翻訳に必要なシグナルも含むべきである。
それゆえ、発現ベクターは、大腸菌中で機能する、合成又は天然のプロモーター を含有すべきである。好ましくは、通常は絶対に必要ないけれども、プロモータ ーは取扱者が制御できるべきである。大腸菌における発現のために広範に用いら れる制御可能プロモーターの例としては、Ｉａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、並びにラム ダＰＬ及びＰＲプロモーターがある。
好ましくは、発現ベクターはさらに、大腸菌中で機能する転写のターミネータ− を含有すべきである。用いられる転写のターミネータ−の例としては、ｔｒｐ及 びｒｒｎＢターミネータがある。
さらに、発現ベクターは、下流コード配列の翻訳をそしてそれ故に発現を可能に する、合成又は天然のリポソーム結合部位を含有すべきである。さらに、外米配 列を欠（発現を所望する場合は、それがその配列をリポソーム結合部位の開始コ ドンに直接連結反応させるように配置される独特の制限部位が存在すべきである 。
この種の発現を実施するのに適したプラスミドは、ｐ　Ｋ　Ｋ　２３３−２　（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。このプラスミドは、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃ 、Ｚリポソーム結合部位、及びｒｒｎＢ　転写ターミネータ−を含有する。
さらに好適であるのは、プラスミドｐＩＧＩ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｇ ｈｅｎｔ、　Ｂｅｌｇｉｕｍ）である。このプラスミドは、テトラサイクリン耐 性遺伝子、及びｐ　Ａ　Ｔ　＋ｔ＊（Ｂｉｏｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ、　Ｂｉｏｒ ｅｓ　Ｂ、Ｖ、、　Ｗｏｅｒｄｅｎ。
Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから市販されている）の複製の起点、ラムダＮ 遺伝子の５′未翻訳領域におけるＭｂｏＩＩ部位までのラムダＰＬプロモーター （ｐＰＬ（λ）から生じる；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む。
ＰＬプロモーターから下流には、最初のシストロン（Ｖａｌに変換される１番目 のＬｅｕを除いてＴＮＦの最初の２５アミノ酸である）の停止コドンがＳｈ　ｆ 　ｎｅ−Ｄａ　ｌ　ｇａｒｎｏ配列と二次リポソーム結合部位の開始コドンとの 間に番目する“２つのシストロン”の翻訳カセットをコードする合成配列を導入 した。ｐＩＧＲＩの制限及び遺伝子地図を図１０ａに示す。
図１０ｂ及び表５は、それぞれｐＩＧＲＩの核酸配列及び完全制限部位分析を表 す。
しかしながら、ハイブリッド蛋白質としての発現を所望する場合には、発現はさ らに、適切な宿主中でこのべくたーによって（おそらく高度に）発現されるペプ チド又はポリペプチドのコード配列を含有すべきである。
この場合、発現ベクターは、コード配列の下流の一つ又はそれ以上の制限エンド ヌクレアーゼに関する独特の切断部位を含有すべきである。
このためには、プラスミドｐＥＸ１．２及び３（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａ ｎｎｈｅｉｍ）、並びにｐｕＥｘｌ、２及び３　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）１が有用 である。
それらは、アムビシリン耐性遺伝子及びｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら　（１ ９７７）　Ｇｅｎｅ　２．９５−１１３）　、その天然遺伝子ｃｒｏの最初の９ アミノ酸に対するコード配列とともにその５′末端でラムダＰＲプロモーターに 融合するｌａｃ　Ｚ遺伝子、並びにβ−ガラクトシダーゼ融合ポリペプチドの産 生を可能にする１ａｃ２コ一ド配列の３′末端の多クローニング部位を含有する 。
ｐＵＥＸベクターはさらに、バクテリオファージランムダＣ１リプレッサー遺伝 子のＣｌ８５７対立遺伝子を含む。
さらに有用なのはプラスミドｐｍＴＮＦ　Ｍ　Ｐ　Ｈ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓ）である。それはテトラサイクリン耐性遺伝子、及びｐ　Ａ　Ｔ　＋ｇｓ　（ Ｂｉｏｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ、　ＢｉｏｒｅｓＢ、Ｖ、、　Ｗｏｅｒｄｅｎ、　 Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから市販されている）の複製の起点、Ｎ遺伝子 の５′末端翻訳領域におけるＭｂｏＩＩ部位までのラムダＰＬプロモーター（ｐ ＰＬ　（ん）から生じる；　Ｐｈａｒｍａｃｊ、ａ）、その後に合成リポソーム 結合部位（配列データ参照）、及びｍＴＮＦの最初の２５ＡＡをコードする情報 （Ｖａｌに変換される最初のＬｅｕを除く）を含有する。この配列は、次に６つ の連続したヒスチジンかならび、次いでいくつかの蛋白質分解部位（それぞれギ 酸、ＣＮＢｒ、カリクレイン、及び大腸菌プロテアーゼＶＩＩ感受性部位）が続 （。これらは各々、プラスミドに関して独特の異なる制限酵素（それぞれＳｍ、 ａｌ、、ＮｃｏＩ、ＢｓｐＭＩＩ、及び５ｔｕＩ；制限及び遺伝子地図　図１１ ａ９照）によって容易に得られる。ポリリンカーから下流には、大腸菌ｔｒｐ− ターミネータ−（合成）及びｒ　ｒ　ｎ　Ｂ　Ｔｔ　Ｔ　２（ｐＫＫ２２３−３ から生じる）を含めていくつかの転写ターミネータ−が存在する。この全核駿配 列を図１１ｂに示す。
表６は、ｐｍＴＮＦ　ＭＰＨの完全制限部位分析を示す。
６つの連続したヒスチジンの存在により、固定化金属イオンアフィニティークロ マトグラフィー（ＩＭＡＣ）により融合蛋白質が精製できる。
精製後、ハイブリッド蛋白質の外来部分は、適当な蛋白質切断法により除去され 、次いでその切断物質を、同　のＩＭＡＣベースの精製方法を用いて未切断分子 から分離される。
ラムダＰＬ又はＰＲプロモーターを使用する上記の全プラスミドにおいては、宿 主の染色体に組み込まれる欠損プロファージ（Ｋ１２△Ｈ，ＡＴＣＣ第３３７６ ７号）上に存在するか、又は二次協調性プラスミド（ｐＡＣＹＣ誘導体）上に存 在するラムダｃＩ　ｔｓ　８５７対立遺伝子の発現により、プロモーターを温度 制御する。ｐＵＥＸベクターにおいてのみ、このｃＩ対立遺伝子は、ベクターそ れ自体の上に存在する。
上記のプラスミドは例として示したものであって、本発明の精神又は範囲を逸脱 しない限りにおいてその他のプラスミド又は発現ベクターを用い得る、と理解さ れるべきである。
プラスミドの代わりにバクテリオファージ又はファージミドを用いる場合は、そ れは、実質的に、上記のようなプラスミドを選択するのに用いたものと同じ特徴 を有するべきである。
ＤＮＡ　ｌμｇ当たり少なくとも３単位の酵素を用いた以外は、メーカーが推奨 する条件に従って、１５μｇのプラスミド“ＢＳ−ＢＫ−Ｐ、、コンブレッド” 　（実施例ＩＩ参照）をＥｃｌＸＩ及びＢ　ｓ　ｔ　Ｅ　Ｉ　Ｉ　（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化した。
ＥｃｌＸＩは２２６番目で切断しく図５）、ＢｓｔＥＩ　Ｉは１１３６１３６番 目するので、したがって成熟Ｐ。抗原の開始及び停止コドンは非常に接近する。
このＤＮＡは、以後“Ｐ３２抗原断片”をコードするＤＮＡと呼ぶ。
“ｐｓｉ抗原断片”をコードするＤＮＡ　（上記のように）を、任意の外米配列 を欠くポリペプチドの発現のために、ｐｌＧＲＩ　（図１０ａ参照）中でサブク ローニングする。Ｐ３２リーディングフレームを有するフレーム内に発現ベクタ ーのＡＴＧコドンな持っていくために、ｐＩＧ２中に中間構築物を作成する（制 限及び遺伝子地図に関しては、図１２　ａ　＠照、ＤＮＡ配列、図１２ｂ参照； 完全制限部位分析、表７参照）。
５μｇのプラスミドｐＩＧ２をＮａｏＩで消化する。その５′粘性末端を、脱燐 酸化の前に塞ぐ。
したがって、０．５ｍＭの４一つのｄＸＴＰを全て（Ｘ＝Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇ）を含 有する４０ｇ１（７）ＮＢＩ衝液缶液、０５Ｍ　）−リス−ＣＩ　ｐＨ７，４， ｌ。
ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　；　０．０５％　β−メルカプトエタノール）、及び２Ｉｉ ｌの大腸菌Ｄ　Ｎ　、ＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（５Ｕ　／　ｕ　ｌ 　、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ。
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で、１５℃で少なくとも３時間、ＤＮＡをインキュベート した。
プラント化後、ＤＮＡを２００ｍＭ　トリス−Ｃ１ｐＨ８に対して平衡された１ 容積のフェノールで１回、少なくとも２容積のジエチルエーテルで２回抽出し、 最後にメーカー推奨の”遺伝子クリーンキットＴ１′”　（Ｂｉｏｌｏｌ）を用 いて収集した。次に３０μｍのＣＩＰ緩衝液（５０ｍＭ　トリス−０１ｐＨ８， １ｍＭ　ＺｎＣＬｚ）、及び２０−２５単位の子牛腸ホスファターゼ（高濃度、 １３０２ｈｒｉｎｇｅｒ。
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で、ＤＮＡを５′末端で脱燐酸化した。
その混合液を３７℃で３０分インキュベートし、次にＥＧＴＡ　（エチレングリ コールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ′、Ｎ′テトラ酢酸）ｐ Ｈ８を加えて、最終濃度を１０ｍＭとした。次いで、その混合液を、上記のよう にフェノールで、その後ジエチルエーテルで抽出し、１／１０容積の３Ｍ　ＫＡ ｃ（Ａｃ＝ＣＨ−Ｃｏｏ）ｐＨ４，８及び２容積のエタノールを加えてＤＮＡを 沈殿させた後、−２０℃で少なくとも１時間貯蔵した。
Ｂ　ｉ　ｏ　ｆ　ｕ　ｇ　ｅ　Ａ　（）Ｉｅｒｅａｕｓ）中で１３００Ｏｒｐｍ で５分間遠心分離後、ベレット化ＤＮＡをＨ，Ｏに溶解して、最終濃度を０．２ μｇ／μｍとした。
°°Ｐ３□抗原断片゛　（上記参照）をコードするＥｃｌＸニーＢｓｔＥＩＩ断 片を１％アガロースゲル（ＢＲＬ）上で電気泳動処理してそれを残りのプラスミ ドから分離し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＨＶＬＰフィルター（φ２ｃｍ）を通して 遠心分離して（２分間、１３０００ｒｐｍ、Ｂｉｏｆｕｇｅ、室温）ゲルから単 離し、上記のようにトリス平衡化フェノールで、次にジエチルエーテルで抽出し た。
次に、メーカーの推奨する”遺伝子クリーンキット丁Ｍ″　（ＢｉｏｌＯｌ）を 用いてＤＮＡを収集した。
その後、５′粘性末端を、上記のように大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌｅｎ ｏｗ断片で処理してプラント化し、次いで、７μｍのＨｚＯに溶解するために、 “遺伝子クリーンキット７Ｍ″を用いてＤＮＡを再び収集した。
１μｍのベクターＤＮＡを、１μｍの１０ｘリガーゼ緩衝液（０，５Ｍ　トリス Ｃ１ｐＨ７，４゜１００ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ　、５ｍＭ　ＡＴＰ、５０ｍＭＤＴＴ 　（ジチオトレイトール））及び１μｍのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉ　Ｕ　／　（ ｔ　ｌ　、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ。
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とともに付加する。１３℃で６時間、連結反応を実施し、次 にその混合液５μｌを用いて、上記のような標準形質転換法、例えばＭａｍｉａ ｔｉｓらが＋Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　ｍａｎｕａｌ″。
”Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２ ）に記載の方法によって、ＤＨＩ株（ラムダ）［ＤＨ１株−ＡＴＣＣ第３３８４ ９号−野生型バクテリオファージ先で溶原化］を形質転換する。
個々の形質転換株を増殖させ、標準的手法（遺伝子融合実験、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｒｏｙ　（１９８４）（編集　Ｔ、Ｊ、 ５ｉｌｈａｖｙ、　Ｈ，Ｌ、Ｂｅｒｍａｎ　ａｎｄ　Ｌ、Ｗ、Ｅｎｑｕｉｓｔ） を用いてプラスミドＤＮＡを調製するために溶解し、制限酵素分析により、プラ スミド内の遺伝子の正しい配向に関してＤＮＡ町政物をチェックする。
適正なプラント化に関するチェックは、抗原コード配列の５′及び３′末端での Ｎｃｏ　１部位の復旧を実証することによって実施する。正しい配向でＰ３□抗 原断片を含むクローンの一つを、さらに研究するために保存し、　ｐ　Ｉ　Ｇ　 ｚ　−Ｍ　ｔ　３２と命名する。この中間構築物においては、抗原をコードする ＤＮＡはＡＴＧコドンを有するフレーム内にはない。しかしながら、今日、Ｎｃ ｏＩ断片として別の発現ベクターに移動できる。
１５μｇのｐ　Ｉ　Ｇ　ｔ　Ｍ　ｔ　３２をＮｃｏ　Ｉで消化する。Ｐ３゜抗原 をコードするＮｃｏ　Ｉ断片をゲル精製し、上記のようにプラント化する。精製 後、“遺伝子クリーンキット１”を用いてそれを７μｍのＨ，Ｏに溶解する。
５μｇのプラスミドｐＩＧＲＩを上記のようにＮｃｏ　Ｉで消化し、プラント化 して、脱燐酸化する。
フェノールで、次いでジエチルエーテルで抽出し、エタノールで沈殿させた後、 ベレットをＨ２Ｏに溶解して、最終濃度を０．２μｇ／μｍとする。
上記のようにして、ベクター及び“抗原断片”ＤＮＡの連結反応を行なう。次に 、連結反応混合物をＤＨＩ株（ラムダ）中で形質転換させて、制限酵素分析によ ってプラスミド内の遺伝子の適正な配向に関して個々の形質転換体を分析する。
適正なプラント化に関するチェックは、抗原コード配列の５′及び３′末端での 新規のＮ５ｉＩ部位の生成を実証することによって行なう。正しい配向でＰ３２ 抗原断片を含むクローンの一つを、さらに研究するために保存し、ｐＩＧＲｌ、 Ｍｔ３２と命名する。
ＤＮＡ町政物当たり少な（とも３単位の酵素を用いた以外は、名メーカーが推奨 する条件に従って、１５μｇのプラスミドｐＩＧ２　Ｍｔ３２　（実施例ＩＶ参 照）を制限酵素Ｎ　ｃ　ｏ　Ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ。
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化した。
消化後、反応混合物を２００ｍＭ　トリスＣ１ｐＨ８に対して平衡されたフェノ ール（１容積）で、その後ジエチルエーテル（２容積）で２回抽出し、ｌ／１０ 容積の３Ｍ　ＫＡｃ　（Ａｃ＝ＣＨ＊　Ｃｏｏ）ｐＨ４，８及び２容積のエタノ ールを加えてＤＮＡを沈殿させた後、−２０℃で少なくとも１時間貯蔵した。
Ｂ　ｉ　ｏ　ｆ　ｕ　ｇ　ｅ　Ａ　（Ｈｅｒｅａｕｓ）中で１３０００ｒｐｍで ５分間遠心分離後、ＤＮＡを１％アガロースゲル（ＢＲＬ）上で電気泳動処理す る。
上記のように、“Ｐ　ｓｚ抗原断片”をコードするＤＮＡを、Ｍｉｌｌｊｐｏｒ ｅ　ＨＶＬＰフィルター（φ２ｃｍ）を通して遠心分離して（２分間、１３００ ０ｒｐｍ、Ｂｉｏｆｕｇｅ、室温）、トリス平衡化フェノールで１回、次にジエ チルエーテルで２回抽出する。次に、“遺伝子クリーンキット口”（Ｂｉｏｌｏ ｌ）を用いてＤＮＡを収集し、７μｍのＨ，Ｏに溶解する。
Ｎｃｏ　ｒでの消化によって生じたＤＮＡ断片の５′突出末端を、０．５ｍＭの ４つのｄＸＴＰを全て（Ｘ＝Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇ）を含有する４０μｍのＮ　Ｂ緩衝 液（０，０５Ｍ　）リス−ＣＩｐＨ７，４゜１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｘ　；０．０５ ％　β−メルカプトエタノール）、及び２μｍの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１の Ｋ　１　ｅ　ｎ　ｏ　ｗ断片（５Ｕ　／　ｕ　ｌ　、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ。
Ｍａｎｎｈｅｉｒ＋）中で、１５℃で少なくとも３時間、ＤＮＡをインキュベー トすることによって充填した。
プラント化後、ＤＮＡをフェノールで、次いでジエチルエーテルで抽出し、上記 の”遺伝子クリーンキットＴ′″を用いて収集した。
５μｇのプラスミドｐｍＴＮＦ　Ｍ　Ｐ　Ｈを５ｔｕＩで消化し、次いで上記の ようにフェノールでその後ジエチルエーテルで抽出して、沈殿させる。制限消化 は、分析用１．２％アガロースゲル上で０．５μｇの試料を電気泳動処理して実 証する。
次に、３０μｍのＣＩＰ緩衝液（５０ｍ　Ｍ　）リス−ＣＩ　ｐＨ８，１ｍＭ　 ＺｎＣ１ｇ）、及び２０〜２５単位の子牛腸ホスファターゼ（高濃度、Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で自己連結反応を防ぐために、ＤＮＡを ５′末端で脱燐酸化した。その混合液を３７℃で３０分間インキュベートし、次 にＥＧＴＡ　（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ。
Ｎ、Ｎ”、Ｎ’テトラ酢酸）ｐＨ８を加えて、最終濃度をｌｏｍＭとする。その 混合液をフェノールで、次いでジエチルエーテルで抽出して、上記のようにＤＮ Ａを沈殿させる。沈殿物を、ＢｉｏｆｕｇｅＡ　（Ｈｅｒｅａｕｓ）中で１３０ ０Ｏｒｐｍで４℃で】０分間遠心分離してベレット化し、そのベレットをＨｚＯ に溶解して、最終濃度を０．２μｇ／μｌとした。
１μｍのこのベクターＤＮＡを、“Ｐ３□抗原断片”（上記）をコードするＤＮ Ａ断片を含む７μｍ溶液と混合し、１μｍの１０ｘルガーゼ緩衝液（０，５Ｍ　 トリス−Ｃ１ｐＨ７，４，１００ｍＭＭｇＣ１ａ　、５ｍＭ　ＡＴＰ、５０ｍＭ 　ＤＴＴ　（ジチオトレイトール））＋１μｍのＴ、ＤＮＡリガーゼ（１単位／ 　ｕ　１　、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加える。
その混合液を１３℃で６時間インキュベートし、次に５１１１の混合液を用いて 、上記のような標準形質転換法、例えばＭａｍｉａｔｉｓらがＭｏｌｅｃｕｌａ ｒｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａ１″、　Ｃｏ１ｄ 　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１，９８２）に記載の 方法によって、ＤＨＩ株（ラムダ）を形質転換する。
個々の形質転換株を増殖させ、標準的手法（遺伝子融合による実験、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８４）　（編集Ｔ 、Ｊ、５ｉｌｈａｖｙ、　Ｍ、Ｌ、Ｂｅｒｍａｎ　ａｎｄ　Ｌ、Ｗ。
Ｅｎｑｕｉｓｔ）　）を用いてプラスミドＤＮＡを調製するために溶解し２、開 隔酵素分析により、プラスミド内の遺伝子の正しい配向に関してＤＮＡ調製物を チェックする。
正しい配向で抗原断片をコードするＤＮＡ配列を含有するクローンの一つをさら に研究するために保持し、ｐ　ｍ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｍ　Ｐ　Ｈ−Ｍ　ｔ　３２と 命名した。それは、アミノ酸配列の＋４位置を起点とするＰ　）２抗原の全情報 をコードする（図５参照）。全融合蛋白質のアミノ酸配列を図１３に示す。
実施例Ｖｌ　：　ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ−Ｍｔ３２からの抗原発現の誘導： Ａ−材料と方法 ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ−Ｍｔ３２のＤＮＡを、培養の増殖温度を２８℃に、そして ヒートショック温度を３４℃に下げる以外は標準形質転換手法を用いて、大腸菌 Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２ΔＨ株（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３７６７）中で形質転換させる。
１０Ｍｇ　／　ｍ　１テトラサイクリンの存在下で、激しく振盪しながら２８℃ で、Ｌ　ｕ　ｒ　ｉ　ａブロス中で一晩増殖させた、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ−Ｍｔ ３２を有するに１２△Ｈの培養を、テトラサイクリン（１０ＩＬｇ／ｍｌ）を含 む新鮮なＬｕｒ　ｉ　ａブロス中に植えつけ、−装置いた培養の場合と同じ条件 で、６００ナノメーターの光学密度が０．２となるよう増殖させる。
６００ナノメーターでの光学密度が０．２に達した時点で、培養の半分を４２℃ に移して発現を誘発し、一方他の半分は対照として２８℃のままにおく。数回の 間隔でアリコートを採取し、これをＭ９塩（０，３％塩化アンモニウム、０．３ ％カリウム　ジヒドロゲニウムホスフェート、１．５％二ナトリウムヒドロゲニ ウムホスフエート、１２分子の水）及び１％ＳＤＳに対して平衡された１容積の フェノールで抽出する。
同時に、培養の光学密度（６００ｎ、ｍ、）をチェックする。２容積のアセトン を付加して蛋白質をフェノール相から沈殿させて、−２０℃で一晩貯蔵する。沈 殿物をベレット化して（Ｂｉ、ｏｆｕｇｅ　Ａ　、５分。
１３０００ｒｐｍ、室温）、空気乾燥し、光学密度によって１容積のＬ　ａ　ｅ 　ｍ　ｍ　］　ｉ　（Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）　２２７：６８０）試料緩衝 液（＋βメルカプトエタノール）に溶解して、３分間煮沸する。
次に、試料をＬａｅｍｍｌｊ、（１９７０）に従ってＳＤＳポリアクリルアミド ゲル上で処理する。
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染色、及びイム ノブロッティングにより、ｍ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｈｉ　Ｓ　ａ　−Ｐ　ｓ　ｚの温 度誘導を監視する。
ＣＢＢ染色はｌ／１０希釈ＣＢＢ染色液（９０ｍｌメタノール：Ｈ！　Ｏ（１： 　！　ｖ／ｖ）及び１０ｍ１氷酢酸中に溶解した０、５ｇ　ＣＢＢ−Ｒ２５０（ Ｓｅｒｖａ））の１７１０希釈液にゲルを浸漬することによって実施し、ゆつ（ り回転する台上に約１時間放置する。脱色液（３０％メタノール、７％氷酢酸） 中で２〜３時間時間後、蛋白質バンドが見えるようになるので、それを濃度計（ Ｕｌｔｒｏｓｃａｎ　ＸＬＥｎｈａｎｃｅｄ　Ｌａ５ｅｒ　Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅ ｔｅｒ、　ＬＫＢ　）で走査する。
イムノブロッティングに関しては、蛋白質を、Ｔ　ＯＷ　ｎ　ｂ　ｉ　ｎら（１ ，９７９）が記載したようにＨｙｂｏｎｄ　Ｃ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にブロ ッティングする。プロッティング後、膜上の蛋白質をＰｏｎｃｅａｕ　Ｓ　（Ｓ ｅｒｖａ　）で一時的に目で見えるようにして、分子量マーカーの位置を示す。
次にＨ，Ｏで洗浄して染色を除去する。非特異的蛋白質結合部位を、ゆっくり回 転する台上で約１時間、１０％脱脂粉乳中でプロットをインキュベートしてブロ ックする。ＮＴ緩衝液（２５ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ８，０；１５０ｍＭ　ＮａＣ １）で２回洗浄後、プロットを、大腸菌溶解物の存在下で、実施例Ｉじ抗３２ｋ Ｄａ抗血清によるλｇｔｌｌヒト結核菌組換えＤＮＡライブラリー・のスクリー ニング）に記載のようにして得られたポリクローンウサギ抗３２ｋＤａ抗血清（ １：　１０００）と共に、あるいはｍ、　Ｔ　Ｎ　Ｆ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓ、第１７　Ｆ　５　Ｄ　］、　Ｏ号）と交叉反応するモノクローン抗−ｈＴＮ Ｆ−抗体とともに、回転台上で少な（とも２時間インキュベートする。ＮＴ緩衝 液＋０．０２％トリトンｘｉｏｏで２回洗浄後、プロットを、第一の場合は二次 抗血清：アルカリホスファターゼー標識ブタ抗ウサギイムノグロブリン（１１５ ００；　Ｐｒｏｓａｎ）と、第二の場合はアルカリホスファターゼ−標識ウサギ 抗マウスイムノグロブリン（１１５００；　Ｓｉｇｍａ　）と、少なくとも１時 間、インキュベートする。
プロットを再びＮＴ緩衝液＋０．０２％トリトンＸ１００で２回洗浄し、次にメ ーカー推奨の条件を用いて、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した二Ｉ・ロブルーテトラ ゾリウム（ＮＥＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスファタ ーゼ（ＢＣＩＰ）で視覚化する。
Ｂ、結果 ｐ　ｍ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｍ　Ｐ　Ｈ−Ｍ　ｔ　３２を含有するＫ１２△Ｈ細胞を 誘導する場合、明瞭に目に見える約３５ｋＤａのバンドが、誘導開始後１時間目 にすでにＣＢＢ染色ゲル上に現れる（図１４ａ）。細胞の総蛋白質含量のほぼ２ ５％に相当するこのバンドは、イムノプロット上で抗３２ｋＤａ及び抗ｍ　Ｔ　 Ｎ　Ｆ抗血清と強く反応する（図１４ｂ）。しかしながら、このバンドは、抗血 清とも特異的に反応する約３７ｋＤａの小バンドもイムノプロット上に見えるた めに、元の融合蛋白質の切断物質を表す。これは、組換えｍＴＮＦ−Ｈｉｓｓ　 −Ｐｓ□の広範な切断がそのカルボキシ末端から約２〜３ｋＤａで起こることを 示唆している。
実施例ＶＩＩ：固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ ）における組換え抗原の精製： ｐ　ｍ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｍ　Ｐ　Ｈ−Ｍ　ｔ　３２を含有するに１２△Ｈ細胞に よって発現されるハイブリッド蛋白質ｍＴＮＦ−Ｈｉ　Ｓｓ　−Ｐｘｚ　（アミ ノ酸配列９図１３参照）は、ポリリンカー配列の６連続ヒスチジンが金属イオン に対して強い親和性をもたらすために（Ｈｏｃｈｕｌｉら、１９８８）　、Ｉ　 ＭＡ　Ｃによる精製を促進するよう特に意図される。
ａ、粗細胞抽出物の調製ニ プラスミドｐ　ｍ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｍ　Ｐ　Ｈ−Ｍ　ｔ　３２を含有する１２１ の大腸菌細胞に１２△Ｈを、テトラサイクリン（１０ｔｚ　ｇ　／　ｍ　１　） を含むＬ　ｕ　ｒ　ｉ　ａブロス中で、２８℃で増殖させて、光学密度（６００ ｎｍ）を０．２とし、次いで温度を４２℃に上げて誘導した。
誘導３時間後、遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ、、ＪＡｌ　０ローター、７，５００ ｒｐｍ、１０分）によって細胞を集めた。細胞ペーストを溶解緩衝液（１０ｍＭ ＫＣＩ、１０ｍＭ　トリス塩酸　ｐＨ６，８，５ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁して、細 胞最終濃度を５０％（Ｗ／　ｖ　）とした。
ε−Ｎ　Ｈｌ−カプロン酸及びジチオトレイ）・−ル（ＤＴＴ）を加えて最終濃 度をそれぞれ２０ｍＭ及び１ｍＭとして蛋白質分解的変質を防止した。この細胞 濃縮懸濁液を、−７０℃で一晩保存した。
使用圧力８００〜ｌ　０ＯＯｐｓ　ｉでフレンチプレス（ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ ）に３回通して、細胞を溶解した。溶解中及び溶解後、細胞を氷上に整然と保持 した。
細胞溶解物を遠心分離で純粋にした（　Ｂｅｃｋｍａｎｎ、　ＪＡ２０．１８， ０００ｒｐｍ、２０分、４℃）、予備試験により蛋白質が主として膜分画に局在 することが示されたため、上澄（ＳＮ）を注意深く捨てて、膜及び封入体を含む ベレットをさらに研究するために保持した。
１００ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７，２に溶解した７Ｍ塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣ ｌ、ＩＣＮより市販）をベレット容量に加えて、最終濃度を６Ｍ　ＧａＨＣｌと した。ベレットを懸濁し、バウンス組織ホモジエナイザー　（１０サイクル）で 抽出した。
清澄化（Ｂｅｃｋｍａｎｎ、ＪＡ　２０．　１８．０００　ｒ　ｐｍ。
２０分、４℃）後、約１００ｍ１の上澄を収集しく＝抽出物１）、取り出したベ レットを上記と同様に再び抽出した（抽出物２．４０ｍ１）。
異なる分画（Ｓ　Ｎ　、　Ｅ　Ｘ　３．　、　Ｅ　Ｘ　２　）を５ＤＳ−Ｐ　Ａ 　Ｇ　Ｅ　（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔ、ｕｒｅ　＋、９７０；２２７：６８０ ）　Ｊ：で、誘導培養の対照試料とともに分析した。ゲルの走査により、組換え 蛋白質は誘導細胞培養の総蛋白質含量のほぼ２５％を構成することが明らかにさ れた。分別後、蛋白質の殆どが抽出物中に戻っていることが判明した。還元状態 と非還元状態（プラス及びマイナスβ−メルカプトエタノール）との間の差異は 認められな５ｍｌのキレート化ゲル、キレート化セファロース６　Ｂ　（Ｐｈａ ｒｍａｃｔａ　）を水で広範に洗浄して、それを保存しているエタノールを除去 し１次に”ＩＥｃｏｎｏ−カラム”　（１ｘ　１０　ｃｍ、　Ｂｉｏｒａｄ）中 に充填した。カラム上部は流入液（試料、緩衝液等）と連絡し、一方末端は螺動 性ジャンプを経てＵ　Ｖ　、、、検出器に至る。
分画はフラクションコレクターで収集し、そして適当な場合には分画のｐＨは手 動で測定する。
カラムはＮｉ”（６ｍｌ　ＮｉＣ１ｚ　・６Ｈａ　Ｏ；５Ｍｇ／μｍ）を負荷し 、開始緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジウム、１００ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７，２）で 平衡させる。
試料を投入後、カラムを開始緩衝液で広範に洗浄して、非結合物質を除去する。
結合物質を溶離するために、２つの異なる溶離操作が実行可能である： １）ｐＨを下げて溶離する、 ２）イミダゾール濃度を上げて溶離する。
両方ともに、本明細書中で考察されている。
カラムを再生するためには、２〜３回操業後、２０ｍ１（約５カラム容ｆｌ）の 以下の溶液を順次カラムにポンプで送り込む操作を行なわねば成らないニー０． ０５Ｍ　ＥＤＴＡ−０，５Ｍ　ＮａＣ１−０，ＩＭ　ＮａＯＨ Ｈ２Ｏ −６ｍ１　ＮｉＣ１ｚ　・６Ｈｚ　Ｏ（５ｍｇ／ｍｌ）開始緩衝液で平衡後、カ ラムは再び使えるようにクロマトグラフィー中は、全緩衝液が６Ｍ塩酸グアニジ ウムを含有した。カラムを、周囲温度で、０．　５ｍｌ／分の流速で展開した。
２ｍｌの分画を収集し、適当な場合には、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッテ ィングを用いてさらに分析した。ゲルを、Ａｎｓｏｒｇｅ　（１９８５）が記載 したように、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌ、ｕｅＲ２５０及 び銀染色で染色した。実施例Ｉに記載したように、イムノブロッティングを実施 した。用いた一次抗血清は、実施例工じ抗３２ｋＤａ抗血清によるλｇｔｌｌヒ ト結核菌組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニング）に記載されたようにして 得られたポリクローン抗３２ｋＤａ抗血清（１／１０００）、または抗大腸菌イ ムノグロブリン（１１５００゜Ｐｒｏｓａｎ）又はｍ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　（Ｉｎｎｏ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１．７ＦＳＤｌＯ号）と交叉反応するモノクローン抗ｈＴ ＮＦ抗体であった。二次抗血清は、アルカリホスファターゼ橿識ブタ抗ウサギイ ムノグロブリン（１１５００゜Ｐｒｃｓａｎ）　、又はアルカリホスファターゼ 標識ウザギ抗マウスイムノグロブリン＜１１５００．　Ｓｆｇｍａ　）であった 。
Ｃ１，ｐ）！低減による溶離： 使用溶液： Ａ：６Ｍ　ＧｕＨＣｌ　１００ｍＭ燐酸塩ｐＨ７，２Ｂ：６Ｍ　ＧｕＨＣｌ　２ ５ｍＭ燐酸塩ｐＨ７，２Ｃ：６Ｍ　ＧｕＨＣｌ　５０ｍＭ燐酸塩ｐＨ４，２３ｍ １の抽出物ｉ　（ＯＤｇｓａ　＝３２．０）を適用し、溶液Ａで広範に洗浄後、 カラムを溶液Ｂで平衡させて、次に７．２〜４．２の直線的ｐＨグラジエント（ ２５ｍｌの溶液Ｂと２５ｍ１の溶液Ｃをグラジェント生成器中で混合した）で展 開した。溶離プロフィルを図１５に示す。
５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ｃｏｏｍａｓｓ　ｉ　ｅ　及び銀染色）から、最初は結 合していた組換え蛋白質の殆どが、ｐＨ５，３〜４．７の分画で溶離した。
抗３２ｋＤａ及び１７Ｆ５Ｄ１０モノクロ一ン抗体によるイムノプロット上での これらの分画のスクリーニングから、無傷組換え蛋白質とともに、蛋白質の何ら かの減成物質及び高度の凝集形態も存在したが、しかしごく少量であったことが 示された。抗大腸菌抗体を用いたプロッティングは、これらの分画（ｐＨ５，３ 〜４．７）が依然として免疫的に検出可能な汚染大腸菌蛋白質（７５，６５，４ ３，３５及び３１ｋＤａバンド）、及びリボ多糖類を含有することを明らかにし た。
Ｃ２，イミダゾール濃度増大による溶離：使用溶液： Ａ：６Ｍ　ＧｕＨＣｌ　１００ｍＭ燐酸塩ｐＨ７，２Ｂ　：　６　Ｍ　Ｇ　ｕ　 ＨＣ１５０ｍ　ＭイミダゾールｐＨ７，２ Ｃ：６Ｍ　ＧｕＨＣｌ　１００ｍＭイミダゾールｐＨ７，２ Ｄ：６Ｍ　ＧｕＨＣ１１５ｍＭイミダゾールｐＨ７、２ Ｅ：６Ｍ　ＧｕＨＣｌ　２５ｍＭイミダゾールｐＨ７、２ Ｆ２６Ｍ　ＧｕＨＣＩ　３５ｍＭイミダゾールｐＨ７，２ 試料の投入及び洗浄は、Ｃ１の場合と同様に実施したが、但し、洗浄後、６Ｍ　 ＧｕＨＣｌ　２５ｍＭ燐酸塩を用いて平衡させる必要はなかった。カラムを先ず 、０から５０ｍＭ（２５ｍｌの溶液Ａと２５ｍ１の溶液Ｂをグラジェント生成器 中で混合した）までのイミダゾールの直線グラジェントで、その後１００ｍＭイ ミダゾール（溶液Ｃ）までの段階溶離で展開した。
直線グラジェント中は、蛋白質は広範なスメアで漸次溶離され、一方１００ｍＭ までの段階は、明瞭なピークを生じた（図１６）。
分画の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、直線グラジェントの最初の部分（ｆｒ　１〜 ２４）では大半の汚染大腸菌蛋白質は洗い流されていたが、一方グラジエントの 後半部分（ｆｒ　２５〜５０）及び１００ｍＭピークは９０％以上の組換え蛋白 質を含有することが明示された。
Ｃ１の場合と同様に、これらの分画は、無傷組換え蛋白質の大きなバンドに加え て、減成及び凝集蛋白質のいくつかの小バンドを示した。しかしながら、この場 合は、２４ｋＤａ以下の領域は蛋白質バンドを殆ど欠いていたようであり、これ は、無傷蛋白質と共溶離する減成物質がほとんどないことを示唆する。さらに、 ３１　ｋＤａバンドは余り強（な（、モしてい（つかの分画では存在しないこと さえあったが、Ｃ１の場合と同様に、イムノブロッティングによって同一の汚染 大腸菌蛋白質が検出された。
第二段階では、我々は、漸増項数塩濃度の段階グラジェントにより、カラムを展 開した。試料を投入してカラムを洗浄後、２カラム容積（約８ｍ１）の以下の溶 液をカラムに順次大れた：溶液り、Ｅ、Ｆ、そして最後に４カラム容積の溶液Ｃ ，，段階グラジェントにより、スケールアップに適した、さらに濃縮された溶離 プロフィルが得られた（図１７）。
要するに、ｍ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｈｉ　Ｓ　ａ　Ｐ　３２蛋白質は、ＩＭＡＣによ って少なくとも９０％まで精製された。
さらなる精製は、次の工程を併用して達成されるニーキレート化スバロース（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　）上でのＩＭＡ、Ｃ −イオン交換クロマトグラフィー（陰イオン又は陽イオン） 一逆相クロマトグラフィー 一ゲル濾過クロマトグラフィー 一イムノアフィニティークロマトグラフィー−ポリアクリルアミドゲルからの溶 離 これらのクロマトグラフィー法は、一般に、蛋白質精製のために用いられる。
図１０ｂ、ｌｌｂ、及び１２ｂのプラスミドは新規である。
引用文献 １．　Ａｂｏｕ−Ｚａｉｄ、　Ｃ，、Ｔ、Ｌ、　Ｒａｔｌｉｆｆ、　）１．Ｇ、 　Ｗｉｋａｒ、　Ｍ、　Ｈａｒｂｏｅ。
Ｊ＋Ｂａｎｎａｄｓｅｎ　ａｎｄ　Ｇ、Ａ、Ｗ、　Ｒｏｏｋ、　１９８Ｂ、　Ｃ ｈａｒａｃｔ＠ｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆｆｌｂｒｏｎａｃｔｉｎ−ｂｉｄｉｎｇ 　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｒａｌｅａｓａｄ　ｂｙ　Ｍｙｃｏｂａｃｔａｒｉｕｍｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｍｙｃｏｂａｃｔａｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　 ＢＣＧ、　Ｉｎｆｅｃｔ＋Ｘｒｍｎ。
５６、　コ０４６−３０５１＋ ２、　Ｂａ１ｌｏｎ、　Ｂ、　１９８Ｂ＋Ａｐｐｌｅ　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ　ｐ ｒｏｇｒａｍｓ　ｆｏｒｎｕｃｌａｉｃ　ａｎｄ　ｐｒｏセｓｉｎ　ｓｅｑυｅ ｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ、　Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄＲｅｓ、１６：１８３ ７−ＩＥ１４６゜３、　Ｂｉｂｂ、　Ｈ，Ｊ、、　Ｐ、Ｒ，Ｆｉｎｄｌａｙ　ａ ｎｄ　Ｍ、Ｗ、　Ｊｏｎｈｓｏｒ＋、　１９８４．　Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｈｉｐ　ｂａｔｗｅａｎ　ｂａｓｓ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｄ ｏｎ　ｕｓａｇｅｉｎ　ｂａｃｔａｒｉａｌ　ｇａｎｇｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｕ ｓｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅ　１ｄｅｎｔｉ ｆ１ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔａｉｎ−ｃｏｄｉｎｇ　ｓａｑ＋１ａｎｃｅ ｓ。
Ｇａｎ４！、３０：　１５７−１６６゜４、　Ｂｒｅｓｓｏｎ、　Ｇ、Ｍ、　ａ ｎｄ　ＬＬ　５ｔａｎｌｅｙ、　１９８７．　ｐＵＥＸ、　ａｂａｃｔａｒｉａ ｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｒａｌａｔａｄ　ｔｏ　ｐＥＸ　ｗ ｉｔｈｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｈｏｓｔ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ、　Ｎｕｃｌ、 　Ａｃｉ、　Ｒ＠ｇ、　１５：１００５６゜５、　Ｃｈａｎｇ、　Ｓ、　Ｅｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔａｉｎ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｇｒ ａｍｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｂａｃセａｒｉａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、 、１５３：５０７−５１６゜６、　Ｃｈａｎ、　Ｅ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｐ、Ｈ，５ ｅｅｂｕｒｑ、　１９８５．　Ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：　ａ 　ｆａｓｔ　ｓｉｍｐｌａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐ ｌａｓｍｉｄＤＮ入、ＤＮＡ　４：１．６５−１７０゜フ、Ｃ１ａｓｓ、Ｏ，、 Ｍ、Ｈａｒｂｏａ、Ｎ、Ｈ，入ｘａｌｓｅｎ−Ｃｈｒｉｓｔａｎｓｅｎ　ａｎｄ Ｍ、　Ｍａｇｎｕｓｓａｎ、　１９８０＋Ｔｈａ　ａｎｔｉｇａｎｓ　ｏｆ　Ｍ ｙｃｏｂａｃｔａｒｉｕｍｂｏｖｉｓ、５ｔｒａｉｎ　ＢＣＧ、５ｔｕｃ５ｉｅ ｄ　ｂｙ　ｃｒｏｓｓ−ｉｍｍｕｎｏ−ａｌａｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：　ａ 　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｙｓｔｅｍ、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ 。
５１２Ｎ：２４９−２６１゜ Ｂ、　Ｄａ　Ｂｒｕｙｎ、　Ｊ、Ｒ，Ｂｏｓｍａｎｓ、　Ｊ、　Ｎｙａｂｅｎｄ ａ　ａｎｄ　Ｊ、Ｐ、　Ｖａｎｖｏｏｒｅｎ、　１９８９．　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏ ｆ　ｚｉｎｃ　ｄａｆｉｃｉａｎｃｙ　ｏｆ　ｔｈｅａｐｐｅａｒａｎｃａ　ｏ ｆ　ｔｗｏ　ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎ ｓ　（：１２−ｋＤａ　ａｎｄ　６５−ｋＤａ）　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒａ　ｆｉ ｌセｒａｔａｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ。
Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｉｏｂ、　１３５：　７９−８４゜９、　Ｄａ　Ｂｒ ｕｙｎ、　Ｊ、、　Ｋ、　Ｈｕｙｇｅｎ、　Ｒ，Ｂｏｓｔｏａｎｓ、　Ｍ、　Ｆ ａｕｖｉｌｌａ、　Ｒ。
Ｐａｔｈｏｑｅｎ、ｇ＝３５１−３６６゜：１．Ｏ，Ｆｅｌｎｂｅｒｇ、入、Ｐ 、ａｎｄ　Ｒ，Ｖｏｇａｌｓｔｅｉｎ、１９１１ゴ、入ｔｅｃｈｎｉｑｕ＠ｆｏ ｒ　ｒａｄｉｏｌａｂｇｌｌｉｎｇ　ＤＮＡ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄ ｏｎｕｃｌｅａｓａｆｒａｇｍａｎｔｓ　ｔｏ　ｈ、ｉｇｈ　５ｐｅｃｉｆｉｃ 　ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ、ａｍ。
ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＤＮＡ 　５ａｑｕｅｎｃｅｓ、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒａｓ、ｌｌ：２２３７ −２２５５゜１２、Ｈｕｙｇｅｎ、Ｋ、、Ｊ、Ｐ、Ｖａｎ　Ｖｏｏｒａｎ、Ｍ。
　’？’ｕｒｎｅｅｒ、Ｒ。
Ｂｏｓｍａｎｓ、Ｐ、Ｄｉｅｒｃｋｘ　ａｎｄ　Ｊ、Ｄａ　Ｂｒｕｙｎ、１９８ Ｂ、ＳｐｅｃｉｆｉｃｌｙｍｐｈｏｐｒｏＬｊ、ｆｅｒａｔｉｏｎ　−１ｎｔ＠ ｒｆｅｒｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｒｕｍｊ、ｍｍｕｎｏｇｌ ｏｂｕｌｉｎ　Ｇ　ｄｊ、ｒｅｃｔａｄ　ａｇａｉｎｓｔ　ａ　ｐｕｒｉｆｉｅ ｄ　３２−ｋＤａＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　（Ｐ３２）　 ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｖｉｔ、ｈ　ａｃｔｉｖｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、 ５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、２７：Ｌ８７−１９４゜ｉ、Ｌ　Ｈｕｙｇｅ ｎ、Ｋ、、Ｋ、Ｐａ１ｆｌｉｅｔ、Ｆ、Ｊｕｒｔｏｎ、Ｊ、ｉ（ｉｌｇｅｒｓ、 Ｒ。
ｔａｎ　Ｂｅｒｇ、Ｊ、Ｐ、Ｖａｎ　Ｖｏｏｒａｎ　ａｎｄ　Ｊ＋Ｄａ　Ｂｒ１ Ｊｙｎ、１９８９．　Ｈ−２−Ｌｉｎｋｅｄ　ｃｏｎｔｒｏＬ　ｏｆ　Ｌｎ　ｖ ｉｔｒｏ　Ｌｎｔａｒｆａｒｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　１ｎｒａｓｐｏｎｓ ａ　ｔｏ　３２−ｋｉｌｏｄａｌセｏｎ　（Ｐ３２）　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔ ａｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍａｔｔｅ−Ｇｕｊｒｉｎ、 Ｉｎｆｅｃｔ、Ｘｍｍ、５６：３１９６−３２００゜１４、Ｈｕｙｎｈ、Ｔ、Ｖ 、、Ｒ，Ａ、Ｙｏｕｎｇ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ、１９８５゜Ｃｏｎｓｔ ｒｕｃｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　１ｉｂｒａｒｉａｓ　ｉｎ　ｇ ｔｌｏ　ａｎｄ　ｇｔｌｌｐ、４９−７Ｌ　ｉｎ：　ＤＮＡ　ｅｌｏｎｉｎｑ、 Ｖａｌ、Ｉ、入　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ。
Ｅ（１，Ｄ＋Ｍ、Ｇ］、ｏｖｅｒ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｃｌ−Ｗａ ｓｈｔｎｇｔｏｎ、ｏ、ｃ。
１５、Ｋｙｔｅ、Ｊ、ａｎｄ　Ｒ，Ｆ、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、！９Ｂ２．　Ｓｉ ｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐ ａｔｈｙ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔａｉｎ。
ｌｌ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ＝　Ｌ≧二ｊ：　１０５−１３２゜１ｉ、Ｍａｎｉａ セｉＳ１丁、、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ａｒ、ｄ　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｌ ９８２−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　 ｘａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｒｉｇ）ｔａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ。
１フ、　Ｍａｔｓｕｏ、　Ｘ、、　Ｒ＋　Ｙａｍａｑｕｃｈｉ、　Ａ、　Ｙａｍ ａｚａｋｉ、　Ｈ，Ｔａ５ａｋａａｎｄ　Ｔ、Ｙａｍａｄａ、１９８Ｂ、Ｃｌｏ ｎＬｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ａｘ−ｔｒａｃｅｌｌｕｌａ ｒ　α−ａｎｔｉｇｅｎ、Ｊ、Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、ｌｌ９：３８４１−３８５ ４＋１Ｌ　Ｍａｗａｍ、入、Ｍ、ａｎｄ　Ｗ、Ｇ１１ｂａｒｔ、１９７７、入ｎ ｅｗ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒｓ＠ｑｕａｎｃｉｎｇ　ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、入ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４：５６０−５６４゜ｌＬ　Ｍｅｈｒａ、　 Ｖ、、　Ｄ、　ｓｗａａｔｓａｒ　ａｎｄ　Ｒ，入、　Ｙｏｕｎｇ、　１夕８６ ゜Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ｐｒｏｔａｉｎ　ａｎｔｉｇｅ ｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、入ｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＪＳＡ、８］ニア０１コー７０１７ ゜２０、Ｍｕｓｔａｆａ、入、Ｂ、、Ｈ，に、Ｇ１１ｌ、＾、Ｎｅｒｌａｎｄ、 Ｗ、Ｊ、Ｂｒ１ｔｔｏｎ。
Ｖ、Ｍｅｈｒａ、Ｂ、Ｒ，Ｂｌｏｏｍ、Ｒ＋入、Ｙｏｕｒ＋ｑ　ａｎｄ　Ｔ、Ｇ ａｄａｌ、１９８６゜Ｈｕｎａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｃｌａｎｇｓ　ｒｅｃｏｇｎ ｉｚｅ　ａ　ｍａｊｏｒ　Ｍ、Ｌａｐｒａａ　ｐｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｇｅｎ　 ａｘｐｒａｓｓａｃｌ、ｌｎ　Ｅ、ｃｏｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ） 。
３１９：６コー３８゜ ２１、Ｎｅｅｓｅｎ、に、ａｎｄ　Ｇ、Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ、１９８９．Ｃｏｎ ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄｓｈｕヒｔｌｉｎｇ　ｏｆ　ｎｏｖｅｌ　ｂｉｆｕ ｎｃｔｉｏｎａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ 、ａｎｄ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１７１：１５６９−１５７３゜ ２２、　０１ｉｖａｒ、Ｄ、１９８５．　Ｐｒｏｔａｉｎ　５ａｃｒｅｔｉｏｎ 　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、入ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｈｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、３９：６１５−６４８゜２コ、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｗ、Ｒ＋　ａｎｄ　Ｄ＋、 ｌ　Ｌｉｐｍａｎ、１９８Ｂ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｏｏｌｓｆｏｒ　ｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ、Ｐｒｏｃ＋　Ｎａｔ ｌ、入ｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５：２４４４−２４４８゜２４、Ｒｕｍｓｃｈｌａｇ、Ｈ， Ｓ−丁、Ｓ、５ｈｉｎｎｉｃｋ　ａｎｄ　Ｍ、Ｌ、Ｃｏｈａｎ。
１９１１ｇ、５ｅｒｏｌｏｑｉｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎ ｔｓ　ｗｉｔｈ　ｌｅｐｒｏｍａｔｏｕｓａｎｄ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ　１ ｅｐｒｏｓｙ　ｔｏ　：ｌＯ−、３１−ａｎｄ　３２−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎａ ｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ、Ｊ、　Ｃ１１ｎ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２６：２２００−２２０２゜２５、　５ａｎｑｅｒ、Ｆ、 、Ｓ、Ｎ１ｋｌｏｎ　ａｎｄ　Ａ、Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ、１９７７、ＤＮＡ５ｅ ｑｕ＠ｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ　ｔａｒｍｉｎａｔｉｏｎ　１ｎｈｉ ｂｉｔｏｒｓ、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳλ、　ヱ４：５４６３−５４８７゜２Ｇ、 ５ｈｉｎｎｉｃｋ、Ｔ、Ｍ、１９８７．　Ｔｈｅ　６５−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ 　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆＭｙｃｏｂａｃｔａｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｈａｒｍａｎｓ、Ａ、入、、Ｍ、、ｆｆａｎｓｏｎ、Ｒ，Ｒ，Ｐ、 Ｄｅ　Ｖｒｉａｓ。
Ａ、）ｆ、Ｊ、Ｘｏｌｋ　ａｎｄ　Ｊ、Ｄ、入、Ｖａｎ　Ｅｍｂｄｅｎ、１９８ ８．　０ｓｅ　ｏｆ６５−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　１４ ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ＋Ｉｎｆｅｃｔ、Ｘｍｎｕｎ、 ５６：１６１コ−１，６４０゜２１、Ｔｈｏｌａ、Ｊ、Ｅ、Ｒ，、Ｗ、Ｊ、Ｘａ ｕｌａｎ、、：ｒ、Ｄａ　Ｂｒｕｙｎ、λ、Ｈ，Ｊ。
ＫｏＬｋ、Ｄ、Ｇ、　Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓ、Ｌ、Ｇ、Ｂａｒｗａｌｄ、　Ｒ，Ｈ ，Ｔｉｅｓｊｅｍａ　ａｎｄＪ、Ｄ、Ａ、Ｖａｎ　Ｅｍｂｄｅｎ、１９Ｂ？、Ｃ ｈａｒａｃｔ＠ｒｉｚａｔｉｏｒｉ、ｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｒｍｉｎａｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｒｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ａ　６４−ｋｉｌｏｄ ａｌｔｏｎｐｒｏｔｅｆｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　 ＢＣＧ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　１ｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ−１ ２，Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｎｎ、５５：１４６６−１４７５゜２９、Ｔｏｗｂｉｎ、 Ｈ，、Ｔ、５ｔａｅｈｅｌｉｎ　ａｎｄ　Ｊ、Ｇｏｒｄｏｎ、１９７９゜Ｅｌｅ ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆａｒ　ｏｆ　ｐｒｏｔａｉｎｓ　ｆｒ ｏｍｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｇ　ｇｅｌｓ　ｔｏ　ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌ ｏｓｅ　５ｈｅｅｔｓ：　ｐｒｏｃａｄｕｒｅａｎｄ　ｓｏｍｅ　ａｐｐｌｉｃ ａｔｉｏｎｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＳＶ４ ０４：１５０−４３５４゜ ３０、Ｔｕｒｎｅａｒ、Ｈ，Ｉ　、Ｔ、Ｐ、Ｖａｎ　Ｖｏｏｒｅｎ、Ｊ、ｋ　Ｂ ｒｕｙｎ、Ｅ。
５ｅｒｒｕｙｓ、Ｐ、Ｄｉｅｒｃｋｘ　ａｎｄ　、７．Ｃ，Ｙｅｒｎａｕｌｔ、 １９１１８．　ＨｕｍｏｒａｌｉＭｕｎａ　ｒｅｓｐｏｎｓ＠ｉｎ　ｈｕｍａｎ 　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：　ｉｍｍｕｎｏｑｌｏｂｕｌｉｎｓＧ、　Ａ　ａ ｎｄ　Ｍ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉａｄ　Ｐ コ２　ｐｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔａｒｉｕｍ　ｂ ｏｖｉｓ　ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕａｒｉｎ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ 、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２６：１７１４−１７１９゜３Ｌ　Ｖａｎ　Ｖｏｏｒｅ ｎ、Ｊ、Ｐ、、Ｃ，Ｍ、、Ｆａｒｂａｒ、Ｅ、Ｍａｉｌ、Ｎ。
Ｍａｖｒｏｕｄａｋｉｓ、Ｍ、Ｔｕｒｎｅｅｒ、Ｊ、Ｄａ　Ｂｒｕｙｎ、Ｆ、Ｌ ｅｇｒｏｓ　ａｎｄＪ、Ｃ，Ｙａｒｎａｕｌｔ、１９８９　Ｌｏｃａｌ　ａｎｔ ｉ−Ｐ］２　ｈｕｍｏｒａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　１ｎｔｕｂａｒｃｕｌｏｕｓ 　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、Ｔ’ｕｂａｒｃｌｅ、　ヱ９：１２コー１２６゜３２ 、　Ｖｏｌｃｋａａｒｔ、　Ｇ、　１．９８７．　入　ｓｙｓｔａｍａｔｉｃ　 ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔ。
ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｙ　ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ　ｉｎ 　ｐＧＶ４５１　ａｎｄ　ｄｅｒｉｖｅｄｖｅｃｔｏｒｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ ｎｚｙｒｎｏｌ、１５５：２コｌ−２５０゜３３、　Ｖｏｌｃｋａａｒｔ、　Ｇ 、、　Ｅｌ、Ｄ＠Ｖｉｅｅｓｃｈｏｕｗｅｒ、　Ｒ，Ｆｒａｎｋ　ａｎｄ　Ｈ。
Ｂｌｏｅｃｋｅｒ、　１９８４．八ｎａｖａｌ　ｔｙｐｅ　ｏｆ　ｃｌｏｎｉｎ ｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒｕＲｒａｒａｐｉｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｇｒ ａｄａセｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ＤＮＡ、　ＧｅｎｅＡｎａｌ、 Ｔｅｃｈｎ、１：５２−５９゜コ４．　Ｗｉｋ＠ｒ、Ｈ，Ｇ、、Ｍ。　Ｈａｒｂ ｏｅ、Ｓ、Ｎａｑａｌ、Ｍ、Ｅ、Ｐａｔａｒｒｏｙｏ。
Ｃ，Ｒａｍ１ｒｅｚ　ａｎｄ　Ｎ、Ｃｒｕｚ、１９８６．　ＭＰＢ５９．　ａ　 ｗｉｄｅ１７　ｃｒｏｓｓ−ｒａａｃｔｉｎｑ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｍｙｃ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ、　工ｎｔ、Ａｒｃｈ。
Ｍｙｃｏｂａｃｔａｒｉｕｎ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　 ｕｓｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮ入、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ； 　Ｓｃｉ、ｔＪｓＡ、８２：２５ａコー２５８７゜３１　Ｈｏｅ！（ＵＬＩ、Ｅ 、、ａＡ）Ｊ’Ｎ’ＷＡＲＴＨ，Ｗ、、Ｄ５ＢＥＬＩ、Ｈ，、ＧＥＮＴＺ、Ｒ。
ａｎｄ　５ＴＱＢＥＲ，Ｄ、（１９８Ｂ）、Ｇａｎｅｔｉｃ　入ｐｐｒｏａｃｈ 　ｔｏ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｃｏｍｈ ｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔａｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｅセａｌｃｈａ ｌａｔｅ　ａｄｓｏｒｂａｎｔ、　Ｂｉｏｔａｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｎｏｖ、１９ １３８．　ｐ。
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Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸配列： −図３ａ及び図３ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ３１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ５５）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ９６）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から （１２０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から （１９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（２１１）番目のアミノ酸で構成される末端から （２３０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（２７５）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 並びにこの改変が以下の： ポリペプチドがウシ結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ培養濾液の３２ｋＤａ蛋白 質に対して生じたウサギポリクローン抗血清と反応する、及び／又は 結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者からのヒト血清と反応する 、及び／又は−図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成される 末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたるアミノ酸配列と反 応するという特性を換えない限りにおける、１個又は数個のアミノ酸の置換及び ／又は付加及び／又は欠失による改変によって生じるペプチド配列を含有する組 換えポリペプチド。 ２．そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸配列： −図４ａ及び図４ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ３１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ５５）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ９６）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から （１２０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から （１９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（２１１）番目のアミノ酸で構成される末端から （２３０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（２７５）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 並びにこの改変が以下の： ポリペプチドがウシ結核菌ＢＣＧ培養濾液の３２ｋＤａ蛋白質に対して生じたウ サギポリクローン抗血清と反応する、及び／又は 結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者からのヒト血清と反応する 、及び／又は−図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成される 末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたるアミノ酸配列と反 応するという特性を換えない限りにおける、１個又は数個のアミノ酸の置換及び ／又は付加及び／又は欠失による改変によって生じるペプチド配列を含有する請 求項１記載の組換えポリペプチド。 ３．そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸配列： −図５に示される（−３０）番目のアミノ酸で構成される末端から（−１）番目 のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（３１）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（５５）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（９６）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から（１２０）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（１９４）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（２１１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２３０）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（２７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 並びにこの改変が以下の： ポリペプチドがウシ結核菌ＢＣＧ培養濾液の３２ｋＤａ蛋白質に対して生じたウ サギポリクローン抗血清と反応する、及び／又は 結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者からのヒト血清と反応する 、及び／又は−図５に示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２ ９５）番目のアミノ酸で構成される末端にわたるアミノ酸配列と反応する という特性を換えない限りにおける、１個又は数個のアミノ酸の置換及び／又は 付加及び／又は欠失による改変によって生じるペプチド配列を含有する請求項１ 記載の組換えポリペプチド。 ４．そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸配列： −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２ ９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列 を含有する請求項１記載の組換えポリペプチド。 ５．そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸配列： −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２ ９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列 を含有する請求項２記載の組換えポリペプチド。 ６．そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸配列： −図５に示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（−４３）番目のアミノ酸で構成される末端から（−１）番目 のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（−３０）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（−４３）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列を含有する請求項３記載の組換えポ リペプチド。 ７．そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸配列： −図３ａ及び図３ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２ ９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ３１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ５５）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ９６）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から （１２０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列 −図３ａ及び図３ｂに示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から （１９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（２１１）番目のアミノ酸で構成される末端から （２３０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（２７５）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列 を含有する請求項１記載の組換えポリペプチド。 ８．そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸配列： −図４ａ及び図４ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−５９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（−５５）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（−４９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（−４７）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（−４２）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（−２９）番目のアミノ酸で構成される末端から （−１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２ ９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ３１）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ５５）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（ ９６）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から （１２０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列 −図４ａ及び図４ｂに示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から （１９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（２１１）番目のアミノ酸で構成される末端から （２３０）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（２７５）番目のアミノ酸で構成される末端から （２９４）番目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列 を含有する請求項２記載の組換えポリペプチド。 ９．そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸配列： −図５に示される（−４３）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（−４３）番目のアミノ酸で構成される末端から（−１）番目 のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（−３０）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（−３０）番目のアミノ酸で構成される末端から（−１）番目 のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、又は −図５に示される（１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１２）番目のアミノ酸で構成される末端から（３１）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（３６）番目のアミノ酸で構成される末端から（５５）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（７７）番目のアミノ酸で構成される末端から（９６）番目の アミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１０１）番目のアミノ酸で構成される末端から（１２０）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列 −図５に示される（１７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（１９４）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（２１１）番目のアミノ酸で構成される末端から（２３０）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（２７５）番目のアミノ酸で構成される末端から（２９５）番 目のアミノ酸で構成される末端にわたる配列 を含有する請求項３記載の組換えポリペプチド。 １０．請求項１〜９記載のポリペプチドで構成されるアミノ酸配列、並びに約１ 〜約１０００個のアミノ酸から成る上記ポリペプチドに関する蛋白質又は異種配 列。 １１．異種蛋白質がβ−ガラクトシダーゼである請求項１０記載のアミノ酸配列 。 １２．−請求項１〜１１記載のポリペプチドのいずれか−をコードするヌクレオ チド配列、又は−請求項１〜１１記載のポリペプチドのいずれか−をコードする ヌクレオチド配列とハイブリッドを形成するヌクレオチド配列、又は −請求項１〜１１記載のポリペプチドのいずれか−をコードするヌクレオチド配 列と相補的であるヌクレオチド配列、又は −ＴがＵに置換される上記ヌクレオチド配列を含む核酸。 を１３．少なくとも一つの以下のヌクレオチド配列： を図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１８２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及 び図３ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２ ４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂ に示される（１２４２）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列（ここで、Ｎは５つのＡ、Ｔ 、Ｃ、Ｇ又はＩヌクレオチドの一つを表す）、 又はＴがＵに置換される上記ヌクレオチド配列、を含む請求項１２記載の核酸、 又は上記ヌクレオチド配列あるいはその相補配列とハイブリダイズする核酸。 １４．少なくとも一つの以下のヌクレオチド配列： −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１８２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及 び図４ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２ ４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂ に示される（１２４２）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列（ここで、Ｎは５つのＡ、Ｔ 、Ｃ、Ｇ又はＩヌクレオチドの一つを表す）、 又はＴがＵに置換される上記ヌクレオチド配列、を含む請求項１３記載の核酸、 又は上記ヌクレオチド配列あるいはその相補配列とハイブリダイズする核酸。 １５．少なくとも一つの以下のヌクレオチド配列： −図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（２２０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０ ４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１１０４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２ ９９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 又はＴがＵに置換される上記ヌクレオチド配列、を含む請求項１３記載の核酸、 又は上記ヌクレオチド配列あるいはその相補配列とハイブリダイズする核酸。 １６．以下の配列の一つ： −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１９４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及 び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１２） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及 び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１８） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及 び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２７２） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１８３）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及 び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示 される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌク レオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１８ ３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチド で構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１８３）番目 のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成さ れる末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１９５）番目のヌクレ オチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端 にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで 構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる 配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成され る末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、− 図３ａ及び図３ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端か ら（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及 び図３ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３ ５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂ に示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番 目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示され る（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレ オチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２３４ ）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで 構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２３４）番目の ヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成され る末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２７３）番目のヌクレオ チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端に わたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２７３）番目のヌクレオチドで構 成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配 列、−図３ａ及び図３ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される 末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列を含む 請求項１３記載の核酸。 １７．以下の配列の一つ： −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１９４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及 び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１２） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及 び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１８） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及 び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２７２） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１８３）番目のヌクレオチドで構成される末端 から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及 び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示 される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌク レオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１８ ３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチド で構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１８３）番目 のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成さ れる末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１９５）番目のヌクレ オチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端 にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで 構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる 配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成され る末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、− 図４ａ及び図４ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端か ら（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及 び図４ｂに示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３ ５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂ に示される（２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番 目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示され る（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレ オチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２３４ ）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで 構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２３４）番目の ヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成され る末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２７３）番目のヌクレオ チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端に わたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２７３）番目のヌクレオチドで構 成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配 列、−図４ａ及び図４ｂに示される（３６０）番目のヌクレオチドで構成される 末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列を含む 請求項１４記載の核酸。 １８．以下の配列の一つ： −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９）番 目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９）番 目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０４） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９９） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９９ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０４ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０ ４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（２２０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列 を含む請求項１５記載の核酸。 １９．以下のヌクレオチド配列の一つ：−図３ａ及び図３ｂに示される（１）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（１８２）番目のヌクレオチドで構成さ れる末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１９４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２７２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図３ａ及び図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び 図３ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示さ れる（１８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌク レオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１８ ３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチド で構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１８３）番目 のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成さ れる末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１９５）番目のヌクレ オチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端に わたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで構 成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配 列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで構成される 末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図 ３ａ及び図３ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端から （３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図 ３ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示 される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目の ヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（ ２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２１９）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成 される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２１９）番目のヌク レオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末 端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２３４）番目のヌクレオチド で構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる 配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（２３４）番目のヌクレオチドで構成され る末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、− 図３ａ及び図３ｂに示される（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端か ら（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及 び図３ｂに示される（２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに 示される（２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目 のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列−図３ａ及び図３ｂに示される（ ２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ チドで構成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（３６０） 番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構 成される末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（３６０）番目のヌ クレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される 末端にわたる配列、−図３ａ及び図３ｂに示される（１２４２）番目のヌクレオ チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端に わたる配列から成る請求項１３記載の核酸。 ２０．以下のヌクレオチド配列の一つ：−図４ａ及び図４ｂに示される（１）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（１８２）番目のヌクレオチドで構成さ れる末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１９４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２１８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （２７２）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図４ａ及び図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から （１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び 図４ｂに示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示さ れる（１８３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌク レオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１８ ３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチド で構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１８３）番目 のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成さ れる末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１９５）番目のヌクレ オチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端に わたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで構 成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配 列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１９５）番目のヌクレオチドで構成される 末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図 ４ａ及び図４ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端から （３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図 ４ｂに示される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示 される（２１３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目の ヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（ ２１９）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ ドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２１９）番 目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成 される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２１９）番目のヌク レオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末 端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２３４）番目のヌクレオチド で構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる 配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（２３４）番目のヌクレオチドで構成され る末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、− 図４ａ及び図４ｂに示される（２３４）番目のヌクレオチドで構成される末端か ら（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及 び図４ｂに示される（２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（３５ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに 示される（２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目 のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列−図４ａ及び図４ｂに示される（ ２７３）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ チドで構成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（３６０） 番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチドで構 成される末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（３６０）番目のヌ クレオチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される 末端にわたる配列、−図４ａ及び図４ｂに示される（１２４２）番目のヌクレオ チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチドで構成される末端に わたる配列から成る請求項１４記載の核酸。 ２１．以下のヌクレオチド配列の一つ：−図５に示される（１）番目のヌクレオ チドで構成される末端から（１２９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわ たる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９）番 目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０４） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９９） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９） 番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０４ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（９０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９９ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（２１９ ）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０ ４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列 −図５に示される（１３０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（２２０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１１０ ４）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（２２０）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２９ ９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列、 −図５に示される（１１０４）番目のヌクレオチドで構成される末端から（１２ ９９）番目のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列 から成る請求項１５記載の核酸。 ２２．異種核酸に挿入された請求項１３〜２１記載の少なくとも一つのヌクレオ チド配列を含有する組換え核酸 ２３．以下の配列の一つで構成されるＤＮＡ又はＲＮＡプライマー： Ａ（ｉ）ＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＣＡＧＧＧＴＴＣＧＴＧＧＣＡ（ｉｉ）ＧＧＴ ＴＣＧＴＧＧＣＧＣＣＧＴＣＡＣＧＡ（ｉｉｉ）ＣＧＴＣＧＣＧＣＣＴＡＧＴＧ ＴＣＧＧＡ（ｉｖ）ＣＧＧＣＧＣＣＧＧＴＣＧＧＴＧＧＣＡＣＧＧＣＧＡＡ（ｖ ）ＣＧＴＣＧＧＣＧＣＧＧＣＣＣＴＡＧＴＧＴＣＧＧＢ　ＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣ ＴＧＴＡＣＣＴＧＣ　ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＡＴＣＤ　ＣＣ ＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＣＧＧＧＡＡＧＥ　ＡＡＧＣＣＧＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧ ＧＴＧＧＣＡＡＣＦ（ｉ）ＡＣＧＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＣＣＡＡＣ Ｆ（ｉｉ）ＡＣＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＦ（ｉｉｉ）Ａ ＣＧＧＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＣＣＡＡＣＦ（ｉｖ）ＡＣＧＣＣＣＣ ＡＡＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＣＣＡ２４．Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、又はＦ ［ここで、ＡはＡ（ｉ）、Ａ（ｉｉ）、Ａ（ｉｉｉ）、Ａ（ｉｖ）、Ａ（ｖ）の いずれかを意味し、ＦはＦ（ｉ）、Ｆ（ｉｉ）、Ｆ（ｉｉｉ）、Ｆ（ｉｖ）のい ずれかを意味し、Ａ（ｉ）、Ａ（ｉｉ）、Ａ（ｉｉｉ）、Ａ（ｉｖ）、Ａ（ｖ） 、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ（ｉ）、Ｆ（ｉｉ）、Ｆ（ｉｉｉ）、及びＦ（ｉｖ）は請 求項１１の意味を有する］から選択される任意の他のヌクレオチド配列の相補体 を伴うヌクレオチド配列Ａ（ｉ）、Ａ（ｉｉ）、Ａ（ｉｉｉ）、Ａ（ｉｖ）、Ａ （ｖ）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ（ｉ）、Ｆ（ｉｉ）、Ｆ（ｉｉｉ）、又はＦ（ｉｖ ）のいずれかで構成され、そして 次の成分： Ａ（ｉ） 又はＡ（ｉｉ） 又はＡ（ｉｉｉ）　及びＢの相補体 又はＡ（ｉｖ） 又はＡ（ｖ） Ａ（ｉ） 又はＡ（ｉｉ） 又はＡ（ｉｉｉ）　及びＣの相補体 又はＡ（ｉｖ） 又はＡ（ｖ） Ｂ　及びＣの相補体 Ａ（ｉ） 又はＡ（ｉｉ） 又はＡ（ｉｉｉ）　及びＦの相補体 又はＡ（ｉｖ） 又はＡ（ｖ） Ａ（ｉ） 又はＡ（ｉｉ） 又はＡ（ｉｉｉ）　及びＤの相補体 又はＡ（ｉｖ） 又はＡ（ｖ） Ａ（ｉ） 又はＡ（ｉｉ） 又はＡ（ｉｉｉ）　及びＥの相補体 又はＡ（ｉｖ） 又はＡ（ｖ） Ｂ　及びＤの相補体 Ｂ　及びＥの相補体 Ｂ　及びＦの相補体 Ｃ　及びＤの相補体 Ｃ　及びＥの相補体 Ｃ　及びＦの相補体 Ｄ　及びＥの相補体 Ｄ　及びＦの相補体 Ｅ　及びＦの相補体 で有利に構成されるＤＮＡ又はＲＮＡプライマー組。 ２５．特にプラスミド、コスミド、又はファージといった種類のベクター配列、 並びにその複製のための非必須部位の−つに請求項１３〜２１のいずれか一に記 載の組換え核酸を含む、特にクローニング及び／又は発現のための組換えベクタ ー。 ２６．その複製のためのその非必須部位の一つに、細胞宿主における請求項１〜 １２のいずれか−に記載のポリペプチドの発現をプロモートするための必要成分 、及びおそらくは細胞宿主のポリメラーゼによって認識されるプロモーター、特 に誘導可能なプロモーター、並びにシグナル配列及び／又はアンカー配列を含む 請求項２５記載の組換えベクター。 ２７．ベクター中に挿入された請求項６〜９のいずれか−に記載の核酸の大腸菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現を可能にする成分、特にβ−ガラクトシダーゼの遺 伝子又はその一部の発現を可能にする成分を含む請求項２６記載の組換えベクタ ー。 ２８．宿主における請求項１〜１２のいずれか−に記載のポリペプチドをコード するヌクレオチド配列の発現を可能にする調節成分を含む、請求項２５〜２７の いずれか一に記載の組換えベクターによって形質転換される細胞宿主。 ２９．請求項２５記載のベクターにより形質転換される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） のような細菌の中から選択されるか、又は請求項２５記載のベクターによって形 質転換される真核生物の中から選択される請求項２８記載の細胞宿主。 ３０．請求項２８又は２９のいずれかに記載の形質転換細胞宿主によって発現さ れる核酸の発現物質。 ３１．請求項１〜１２のいずれか−に記載の組換えポリペプチドに対するもので あるという事実を特徴とする抗体。 ３２．請求項１３〜２１に記載の核酸のいずれか−と、又はそれらの相補的配列 とハイブリッド形成をするヌクレオチドプローブ、特に以下のヌクレオチド配列 ： プローブ　Ａ（ｉ）、Ａ（ｉｉ）、Ａ（ｉｉｉ）、Ａ（ｉｖ）及びＡ（ｖ） Ａ（ｉ）ＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＣＡＧＧＧＴＴＣＧＴＧＧＣＡ（ｉｉ）ＧＧＴ ＴＣＧＴＧＧＣＧＣＣＧＴＣＡＣＧＡ（ｉｉｉ）ＣＧＴＣＧＣＧＣＧＣＣＴＡＧ ＴＧＴＣＧＧＡ（ｉｖ）ＣＧＧＣＧＣＣＧＴＣＧＧＴＧＧＣＡＣＧＧＣＣＡＡ（ ｖ）ＣＧＴＣＧＧＣＧＣＧＧＣＣＣＴＡＧＴＧＴＣＧＧプローブＢ ＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧプローブＣ ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＡＴＣプローブＤ ＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＧＧＡＡＧプローブＥ ＡＡＧＣＣＧＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＣプローブ（ｉ）及びＦ（ｉ ｉ） Ｆ（ｉ）ＡＣＧＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＣＣＡＡＣＦ（ｉｉ）ＡＣＧ ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＦ（ｉｉｉ）ＡＣＧＧＧＣＡＣＴ ＧＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＣＣＡＡＣＦ（ｉｖ）ＡＣＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＧ ＣＣＣＧＣＧＣＣＣＣＡ又はそれらの相補的ヌクレオチド配列の中から選択され るプローブ。 ３３．以下の： −請求項１２〜２２のいずれか−に記載の核酸を含有する適切なベクターによっ て予め形質転換された細胞宿主の適切な培地における培養と、 −上記の培地からの上記の形質転換細胞宿主によって産生されたポリペプチドの 回収 の工程から成る請求項１〜１２のいずれか−に記載の組換えポリペプチドの調製 方法。 ３４．以下の工程から成るヒト結核菌に感染され易い患者における結核のｉｎ　 ｖｉｔｒｏ診断方法：−請求項２４記載のＤＮＡプライマー組により上記患者か ら採取される生物試料に含まれがちな請求項１２〜２２のいずれか−に記載のヌ クレオチド配列の量の可能なかぎりの以前の増幅、 −上記プローブと上記ヌクレオチド配列との間で形成されるハイブリッド形成複 合体の産生を可能にする条件下での、上記生物試料と請求項３２記載のヌクレオ チドプローブとの接触、 −形成されたと考えられる上記ハイブリッド形成複合体の検出。 ３５．−上記ポリペプチドと生物試料中に存在する可能性のある抗体とのｉｎ　 ｖｉｔｒｏ免疫反応を可能にする条件下で、患者から採取された生物試料を請求 項１〜１１のいずれか−に記載のポリペプチドと接触させ、 −形成された可能性のある抗原／抗体複合体をｉｎｖｉｔｒｏ検出する ことを含むヒト結核菌に感染され易い患者における結核のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断 方法。 ３６．以下の： −生物試料中に存在する可能性のあるヒト結核菌の上記の抗原及び抗体間のｉｎ 　ｖｉｔｒｏ免疫反応を可能にする条件下で、生物試料を請求項３１記載の適切 な抗体と接触させ、 −形成された可能性のある抗原／抗体複合体をｉｎｖｉｔｒｏ検出する 工程から成るヒト結核菌に感染され易い患者における結核のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診 断方法。 ３７．次の： −請求項３２記載の確定量のヌクレオチドプローブ−有利には、検出される配列 と上記プローブとの間のハイブリッド形成反応を生じるのに適した培地、−有利 には、ハイブリッド形成反応中にヌクレオチド配列とプローブとの間で形成され たハイブリッド形成複合体の検出を可能にする試薬を含む請求項３４記載のヒト 結核菌に感染され易い患者における結核のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断法のための必要 物又はキット。 ３８．次の： −請求項１〜１１のいずれか−に記載のポリペプチド、 −免疫反応を起こすのに適した培地にする試薬、−免疫反応により形成された抗 原／抗体複合体の検出を可能にする試薬であって、特に上記ポリペプチドが標識 化されていない場合、標識を有するか又は標識化試薬に認識され易い試薬 を含む請求項３５記載のヒト結核菌に感染され易い患者における結核のｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ診断法のための必要物又はキット。 ３９．−請求項３１記載の抗体、 −免疫反応を起こすのに適した培地にする試薬、−免疫反応により形成された抗 原／抗体複合体の検出を可能にする試薬であって、特に上記抗体が標識化されて いない場合、標識を有するか又は標識化試薬に認識され易い試薬 ４０．医薬品として許容されるビヒクルとともに請求項１〜１１のいずれか−に 記載のポリペプチドを含む免疫原性組成物。 ４１．その他の免疫原性のうち、請求項１〜１１のいずれか−に記載のポリペプ チド、もしくは天然蛋白質と、又は抱合体がヒト結核菌を中和する抗体のｉｎｖ ｉｖｏ産生を誘導するか、あるいはヒト結核菌抗原反応性Ｔ細胞を活性化するこ とによってｉｎｖｉｖｏ細胞免疫反応を誘導することができるような十分な分子 量を有する合成ポリペプチドと結合する可能性のある請求項３０記載の発現物質 のいずれかを含むワクチン組成物。 ４２．請求項１２〜２２記載のヌクレオチド配列の酵素的増幅のための、及び増 幅ヌクレオチド配列の検出のための方法であって、 −増幅がプライマー組を用いるＰＣＲ法によって達成され、ＰＣＲ増幅物質の検 出が少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列により構成される検 出プローブを用いるハイブリッド形成反応によって達成され（上記配列は上記の ヌクレオチド配列を増幅するために用いられた２つのＰＣＲプライマー間に番目 する）、 −用いられるプライマー組及び検出プローブが好ましくは次の成分の中から選択 されるプライマー組及び検出プローブ： プライマー組 Ｐ１　ＧＡＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＧＣ ＣＧＰ２複合体　ＧＴＡＣＣＡＣＴＣＧＡＡＣＧＣＣＧＧＧＧＴＧＴＴＧＡＴプ ローブＢ ＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧプライマー組 Ｐ１　ＧＡＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＧＣ ＣＧＰ３複合体ＴＣＣＣＡＣＴＴＧＴＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡプローブＢ ＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧプライマー組 Ｐ１　ＧＡＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＧＣ ＣＧＰ４複合体ＣＧＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＡプローブＢ ＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧプライマー組 Ｐ１　ＧＡＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＧＣ ＧＰ５複合体ＧＣＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＣＡＧＧプロー ブＢ ＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧはプローブＣ ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＡＴＣプライマー組 Ｐ１　ＧＡＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＧＣ ＣＧＰ６複合体ＧＣＧＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＴプロー ブＢ ＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧ又はプローブＣ ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＡＴＣ又はプローブＤ ＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＧＧＡＡＧ又はプローブＥ ＡＡＧＣＣＧＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＣプライマー組 Ｐ２　ＡＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＧＴＧＧＴＡＣＰ５複合体Ｇ ＣＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＣＡＧＧプローブＣ ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＡＴＣプライマー組 Ｐ２　ＡＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＧＴＧＧＴＡＣＰ６複合体Ｇ ＣＧＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＴプローブＣ ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＡＴＣ又はプローブＤ ＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＧＧＡＡＧ又はプローブＥ ＡＡＧＣＣＧＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＣプライマー組 Ｐ３　ＴＧＣＣＡＧＡＣＴＴＡＣＡＡＧＴＧＧＧＡＰ５複合体ＧＣＧＴＣＡＣＣ ＣＡＴＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＣＡＧＧプローブＣ ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＡＴＣプライマー組 Ｐ３　ＴＧＣＣＡＧＡＣＴＴＡＣＡＡＧＴＧＧＧＡＰ６複合体ＧＣＧＣＣＣＣＡ ＧＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＴプローブＣ ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＡＴＣ又はプローブＤ ＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＧＧＡＡＣ又はプローブＥ ＡＡＧＣＣＧＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＣプライマー組 Ｐ４　ＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＣＧＰ５複合体ＧＣＧＴＣＡＣＣ ＣＡＴＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＣＡＧＧプローブＣ ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＡＴＣプライマー組 Ｐ４　ＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＣＧＰ６複合体ＧＣＧＣＣＣＣＡ ＧＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＴプローブＣ ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＡＴＣ又はプローブＤ ＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＧＧＡＡＣ又はプローブＥ ＡＡＧＣＣＧＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＣプライマー組 Ｐ５　ＣＣＴＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＧＣＧＡＴＧＧＧＴＧＡＣＧＣＰ６複合体Ｇ ＣＧＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＴプローブＤ ＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＧＴＣＣＧＧＡＡＧ又はプローブＥ ＡＡＧＣＣＧＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＣ又は、プライマー組が好ま しくは請求項２４記載のプライマー組の中から選択され、そして検出プローブが 少なくとも１０ヌクレオチドの任意のオリゴヌクレオチド配列で構成される（上 記配列は上記のヌクレオチド配列を増幅するために用いられたプライマー組から 成る２つのＰＣＲプライマー間に番目する）方法。 ４３．図１０ｂに示される核酸配列、又は図１１ｂに示される核酸配列、又は図 １２ｂに示される核酸配列を有する請求項２５記載の組換えベクターの一部を構 成するベクター配列。 ４４．図１０ｂの核酸配列、又は図１１ｂの核酸配列、又は図１２ｂの核酸配列 を含むプラスミド。 ４５．抗体、特にモノクローン抗体を産生するのに有益に用いられ、以下のアミ ノ酸配列を有する請求項１のペプチド： アミノ酸番目　アミノ酸番目 （ＮＨ２末端）　（ＣＯＯＨ末端） １２　ＱＶＰＳＰＳＨＧＴＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＡ　３１３６　ＬＹＬＬＤＧＬ ＲＡＱＤＤＦＳＧＷＤＩＮＴ　５５７７　ＳＦＹＳＤＷＹＱＰＡＣＲＫＡＧＣＱ ＴＹＫ　９６１０１　ＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰＴＧＳ　１２０１７ ５　ＫＡＳＤＭＷＧＰＫＥＤＰＡＷＱＲＮＤＰＬ　１９４２１１　ＣＧＮＧＬＰ ＳＤＬＧＧＮＮＬＰＡＫＰＬＥ　２３０２７５　ＫＰＤＬＱＲＨＷＶＰＲＰＴＰ ＧＰＰＱＧＡ　２９４７７　ＳＦＹＳＤＷＹＱＰＡＣＧＫＡＧＣＱＴＹＫ　９６ ２７６　ＰＤＬＱＲＡＬＧＡＴＰＮＴＧＰＡＰＱＧＡ　２９９
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