JPH09234096A - 組換えポリペプチド及びペプチド、それをコードする核酸並びに結核に対するその用途 - Google Patents

組換えポリペプチド及びペプチド、それをコードする核酸並びに結核に対するその用途

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JPH09234096A
JPH09234096A JP8330512A JP33051296A JPH09234096A JP H09234096 A JPH09234096 A JP H09234096A JP 8330512 A JP8330512 A JP 8330512A JP 33051296 A JP33051296 A JP 33051296A JP H09234096 A JPH09234096 A JP H09234096A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 結核の検出及び抑制のための精製された抗原
として使用できる組換えポリペプチド、それを含む免疫
原性組成物、ワクチン組成物を提供すること。 【解決手段】 そのポリペプチド鎖中に、配列表の配列
番号３４に示される（−２９）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される末端
にわたる配列などの配列を含有する組換えポリペプチ
ド、それを含む免疫原性組成物、ワクチン組成物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は結核の診断に用い得
る組換えポリペプチド及びペプチドに関する。本発明は
さらに、結核に対するワクチンを製造する場合に有効成
分の一部として用い得るような生物学的に純粋な状態に
ある上記のポリペプチド及びペプチドの製造方法に関す
る。本発明はまた、上記のポリペプチド及びペプチドを
コードする核酸に関する。さらに、本発明は上記のポリ
ペプチド及びペプチドを用いるin vitro診断方法及びキ
ット、並びに結核に対する有効成分としての、上記のポ
リペプチド及びペプチドを含有するワクチンに関する。
【０００２】“組換えポリペプチド及びペプチド”と
は、効率的な細胞宿主内での適切な調節要素の制御下で
の対応するＤＮＡ配列の、転写及び翻訳を通じての遺伝
子工学によって産生されるポリペプチド鎖を有する任意
の分子に関すると理解されるべきである。したがって、
本明細書中で用いられるような“組換えポリペプチド”
という表現は、ポリペプチドがグリコシル化基のような
その他の基を含む可能性を除外しない。
【０００３】“組換え体”という用語は、実際、特にそ
れが上記の宿主に用いられる発現ベクターに予め導入さ
れた対応する核酸配列の細胞宿主における発現に起因す
るために、ポリペプチドが遺伝子工学によって産生され
たという事実を意味する。
【０００４】にもかかわらず、この表現は、ポリペプチ
ドが異なる方法によって、例えば蛋白質合成において用
いられる方法に従った古典的化学合成により、又は大型
分子の蛋白質分解的切断によって産生される可能性を除
外しない、と理解されねばならない。
【０００５】“生物学的に純粋である”とか又は“生物
学的純度”という表現は、一方では組換えポリペプチド
がワクチン接種組成物の生成のために用い得るような純
度の等級を、そして他方では汚染物質、特に天然汚染物
質が存在しないことを意味する。
【０００６】
【従来の技術】結核は、開発途上国においては依然とし
て主要な疾患である。その状況はいくつかの国において
は劇的であって、特にその場合、ＡＩＤＳ患者の間の結
核の高発生率はこの疾患の伝播の新しい出所を示す。
【０００７】結核は細胞介在性免疫機序が本疾患の予防
及び制御に不可欠な役割を演じる慢性感染症である。
【０００８】ＢＣＧ接種、及びいくつかの有効な薬剤に
もかかわらず、結核は依然として大きな世界的問題であ
る。本疾患のスクリーニングのために広く用いられてい
るツベルクリンＰＰＤ（蛋白質精製誘導体）の皮膚テス
トは、その他の病原性又は環境性の腐生植物性マイコバ
クテリアとの交叉反応性のために、特異性が不十分であ
る。
【０００９】さらに、ツベルクリンＰＰＤは血清学的検
定（ELISA)に用いられる場合、ＢＣＧ接種を受けたこと
のある患者又は一次感染済の患者と、進展性結核を発症
中であって初期の且つ迅速な診断を必要とする患者とを
区別出来ない。
【００１０】分子量が３２kDa の蛋白質が亜鉛欠損ウシ
結核菌Mycobacterium bovis ＢＣＧ培養濾液（８）から
精製された（９）。ウシ結核菌のこの３２kDa 蛋白質
は、フェニル−セファロース上での疎水性クロマトグラ
フィー、ＤＥＡＥ−セファセル上でのイオン交換、及び
セファデックスＧ−１００上での分子篩いを順次用い
て、ウシ結核菌ＢＣＧのSauton亜鉛欠損培養濾液から精
製された。最終調製物は、いくつかの分析に基づいて均
質であることが判明した。このＰ32蛋白質は、正常状態
で増殖するＢＣＧ細胞の一構成成分である。それは細胞
抽出物の可溶性分画の約３％を示し、そして正常Sauton
培養濾液中に放出される主な蛋白質と考えられる。この
蛋白質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
び分子篩いによって、３２，０００の分子量を有するこ
とが判明している。
【００１１】ウシ結核菌ＢＣＧの３２kDa 蛋白質のＮＨ
2 −末端アミノ酸配列（Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）は、ウシ結核菌ＢＣＧ Tokyo亜株
から精製されたＭＢＰ５９蛋白質に関して報告されたも
の（３４）と同一である。
【００１２】ウシ結核菌ＢＣＧの精製Ｐ32は種々の交叉
免疫電気泳動法によって試験され、ＢＣＧ抗原に関する
参照系において抗原８５複合体に属することが示され
た。それは、ＢＣＧ抗原に関する交叉参照系において抗
原８５Ｂであるとさらに正確に確定された（７）。
【００１３】ウシ結核菌ＢＣＧの３２kDa 蛋白質に対す
るイムノグロブリンＧ抗体レベルの増加が、７０％の結
核患者で検出された（３０）。
【００１４】さらに、ウシ結核菌ＢＣＧの３２kDa 蛋白
質は、進行中の結核患者（１２）及びＰＰＤ陽性の健康
な被験者から採取した抹消血白血球における特異的リン
パ球増殖及びインターフェロン（ＩＦＮ−γ）産生を誘
発する。最近の所見からは、ＢＣＧ感作マウス脾臓細胞
中のウシ結核菌ＢＣＧ誘発性ＩＦＮ−γの３２kDa 蛋白
質の量はおそらくＨ−２制御下にあることが示されてい
る（１３）。最後に、フィブロネクチンに対するマイコ
バクテリアの高親和性は、ＢＣＧ８５抗原複合体の蛋白
質に関連する（１）。
【００１５】Matsuoら（１７）は、最近、ＢＣＧ（Toky
o 亜種）により分泌される主要蛋白質であって、そのＮ
Ｈ2 −末端アミノ酸配列中のＭＰＢ５９抗原との相同性
が高く、さらにその最初の６個のアミノ酸：Ｐｈｅ−Ｓ
ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕが一致する抗原
αをコードする遺伝子をクローニングした。
【００１６】この遺伝子は、Tasakaら 1983. "Purific
ation and antigenic specificityof alpha protein (Y
oneda and Fukui) from Mycobacterium tuberculosis a
ndMycobacterium intracellulare" Hiroshima J. Med,
Sci. 32, 1-8に記載されているようなヒト結核菌M. tub
erculosis から精製された抗原αのＮ末端アミノ酸配列
と相同のヌクレオチドプローブを用いてクローン化され
た。
【００１７】抗原８５複合体と呼ばれる約３０〜３２kD
a の抗原の存在は、ヒト結核菌のようなマイコバクテリ
アの培地から生じる蛋白質の電気泳動パターンから明ら
かにされた。イムノブロッティング法により、これらの
抗原が、ＢＣＧの３２kDa 蛋白質に対して生じたウサギ
血清と交叉反応することが示された（８）。
【００１８】最近の研究は、癩腫癩患者の３０kDa 及び
３１kDa 抗原に対する、並びに結核様癩患者の３２kDa
に対する優先的体液反応に関して報告している（２
４）。
【００１９】フィブロネクチン（ＦＮ）結合抗原はヒト
結核菌の短期培養上澄の目立った成分であることが判明
している。３日目の上澄中では、３０キロダルトン（kD
a)蛋白質は主な（ＦＮ）結合分子であると確認された。
２１日目上澄では、ＦＮは約３０〜３２kDa の二重の蛋
白質バンドと、より大型な分子量（５７〜６０kDa)の一
群の抗原に結合した（１）。
【００２０】他の実験では、ヒト結核菌からのＤＮＡを
含有する組換えプラスミドで大腸菌Escherichla coliが
形質転換され、３つのコロニーがヒト結核菌に対するポ
リクローン抗血清との反応性によって選択された。各組
換え体は３５−及び５３キロダルトン蛋白質（それぞれ
３５Ｋ及び５３Ｋ蛋白質）を産生した（"Expressionof
Proteins of Mycobacteriumtuberculosis in Escherich
ia coli and Potential of Recombinant Genes and Pro
teins for Development of Diagnostic Reagents", Mit
chell L Cohen et al., Journal of Clinical Microbio
logy, July 1987, p.1176-1180)。
【００２１】今日までに公知の種々の結果に関しては、
ヒト結核菌の抗原Ｐ32の物理化学的特性は正確ではな
く、さらにそれが疑いの余地なく同一であることを確認
したり、並びにその構造的及び機能的要素を特徴付ける
には不十分である。
【００２２】さらに、ヒト結核菌の病原性及び潜在的感
染特性は、この細菌の構成成分並びに分泌生成物質を確
認し、精製し、そして特性化し得る研究を妨げてきた。
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の一つの態様
は、結核の検出及び制御のための精製抗原として使用し
得る組換えポリペプチドを提供することである。本発明
の別の態様は、その大量生産を可能にする生物学的に純
粋な組換えポリペプチドのペプチド鎖をコードする核酸
を提供することである。本発明の別の態様は、結核のin
vitro迅速診断として血清学的検定に用い得る抗原を提
供することである。本発明の別の態様は、進行中の結核
罹患患者とＢＣＧ接種を受けたことのある者又は過去に
感染したことのある者とを区別出来る、結核のin vitro
迅速診断法を提供することである。本発明の別の態様
は、結核のin vitro診断試薬並びにマイコバクテリアの
他の株からヒト結核菌を同定するためのin vitro診断試
薬として用い得る核酸プローブを提供することである。
【００２４】
【課題を解決するための手段】本発明の組換えポリペプ
チドは、そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つの
アミノ酸配列： − 図３及び図４に示される（−２９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（１２）番目のアミノ酸で
構成される末端から（３１）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（３６）番目のアミノ酸で
構成される末端から（５５）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（７７）番目のアミノ酸で
構成される末端から（９６）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（１０１）番目のアミノ酸
で構成される末端から（１２０）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（１７５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（１９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（２１１）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２３０）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（２７５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、
【００２５】並びに改変が次の：ポリペプチドがウシ結
核菌ＢＣＧ培養濾液の３２kDa 蛋白質に対して生じたウ
サギポリクローン抗血清と反応するか、及び／又は結核
患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者からの
ヒト血清と選択的に反応するという特性を変えず、かつ
ウシ結核菌ＢＣＧのα抗原のものとは異なる限りにおけ
る、一つ又はいくつかのアミノ酸の置換による及び／又
は付加による及び／又は欠失による改変、及び／又はア
シル化若しくは改変に起因するペプチド配列を含有す
る。
【００２６】図３及び図４において、 − ＸはＧ又はＧＧを表し、 − ＹはＣ又はＣＣを表し、 − ＺはＣ又はＧを表し、 − ＷはＣ又はＧを表すが、Ｚとは異なり、 − ＫはＣ又はＣＧを表し、 − ＬはＧ又はＣＣを表し、 − ａ1 −ｂ1 はＡＬＡ−ＡＲＧ又はＧＬＹ−ＡＬＡ−
ＡＬＡを表し、 − ａ2 はａｒｇ又はｇｌｙを表し、 − ａ3 −ｂ3 −ｃ3 −ｄ3 −ｅ3 −ｆ3 はｈｉｓ−ｔ
ｒｐ−ｖａｌ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｐｒｏ又はａｌａ−ｌ
ｅｕ−ｇｌｙ−ａｌａを表し、 − ａ4 はｐｒｏ又はｐｒｏ−ａｓｎ−ｔｈｒを表し、 − ａ5 はｐｒｏ又はａｌａ−ｐｒｏを表わす。
【００２７】本発明の組換えポリペプチドは、そのポリ
ペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸配列： − 図５及び図６に示される（−２９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（１２）番目のアミノ酸で
構成される末端から（３１）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（３６）番目のアミノ酸で
構成される末端から（５５）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（７７）番目のアミノ酸で
構成される末端から（９６）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（１０１）番目のアミノ酸
で構成される末端から（１２０）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（１７５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（１９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（２１１）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２３０）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（２７５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、
【００２８】並びに改変が次の：ポリペプチドがウシ結
核菌ＢＣＧ培養濾液の３２ｋＤａ蛋白質に対して生じた
ウサギポリクローン抗血清と反応するか、及び／又は結
核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者から
のヒト血清と選択的に反応するという特性を変えず、か
つウシ結核菌ＢＣＧのα抗原のものとは異なる限りにお
ける、一つ又はいくつかのアミノ酸の置換による及び／
又は付加による及び／又は欠失による改変、及び／又は
アシル化若しくはエステル化による遊離カルボキシル基
の改変に起因するペプチド配列を含有する。
【００２９】本発明の組換えポリペプチドは、そのポリ
ペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸配列： − 図７〜９に示される（−３０）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（１２）番目のアミノ酸で構成
される末端から（３１）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（３６）番目のアミノ酸で構成
される末端から（５５）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（７７）番目のアミノ酸で構成
される末端から（９６）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（１０１）番目のアミノ酸で構
成される末端から（１２０）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（１７５）番目のアミノ酸で構
成される末端から（１９４）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（２１１）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２３０）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（２７５）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２９５）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、
【００３０】並びに改変が次の：ポリペプチドがウシ結
核菌ＢＣＧ培養濾液の３２kDa 蛋白質に対して生じたウ
サギポリクローン抗血清と反応するか、及び／又は結核
患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者からの
ヒト血清と選択的に反応するという特性を変えず、かつ
ウシ結核菌ＢＣＧのα抗原のものとは異なる限りにおけ
る、一つ又はいくつかのアミノ酸の置換による及び／又
は付加による及び／又は欠失による改変、及び／又はア
シル化若しくはエステル化による遊離カルボキシル基の
改変に起因するペプチド配列を含有する。
【００３１】本発明の有益なポリペプチドは、それらが
ウシ結核菌ＢＣＧ培養濾液の３２kDa 蛋白質（以後ＢＣ
ＧのＰ32蛋白質と呼ぶ）に対して生じたウサギポリクロ
ーン抗血清と反応するという事実を特徴とする。
【００３２】本発明の有益なポリペプチドは、それらが
結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者か
らのヒト血清と選択的に反応するという事実を特徴とす
る。
【００３３】
【発明の実施の形態】以下に、ＢＣＧのＰ32蛋白質に対
して生じるウサギポリクローン抗血清の調製方法、並び
に本発明のポリペプチドとＢＣＧのＰ32蛋白質に対して
生じる上記のウサギポリクローン抗血清との反応の証拠
を示すための試験を示すが、本発明はこれに限定されな
い。
【００３４】１）ＢＣＧのＰ32蛋白質に対して生じるウ
サギポリクローン抗血清の調製方法：培養上清からのＢ
ＧＧの精製Ｐ32蛋白質が使われる。 ａ）ＢＣＧのＰ32蛋白質の精製：Ｐ32蛋白質は、以下の
ようにして精製し得る：使用する細菌株は、ウシ結核菌
ＢＣＧ１１７３Ｐ２亜株（Pasteur Institute,Paris）
及びＧＬ２亜株（Pasteur Institute, Brussels)であ
る。
【００３５】細菌の培養は、次のようにして得られる：
ウシ結核菌ＢＣＧを、３７．５℃で１４日間、Sauton培
地上で増殖させて薄膜状にする。培地を蒸留水で調製す
る場合は、硫酸亜鉛を加えて最終濃度を５μMとする
（標準Sauton培地）（De Bruyn J., Weckx M., Beumer-
Jochmans M. -P.Effect of zinc deficiency on Mycoba
cterium tuberculosis var, bovis (BCG), J. Gen. Mic
robiol. 1981: 124:353-7）。亜鉛欠損培地が必要な場
合は、硫酸亜鉛を省く。
【００３６】亜鉛欠損培地からの濾液を得る方法を次に
示す：培地をデカンテーションによって透明にする。残
留細菌をMillipak１００フィルターユニット(Millipore
Corp., Bedford, Mass.）を用いて濾過して除去する。
精製のために用いる場合、濾液を２０mM燐酸塩、４５０
mMＮａＣｌ、１mMＥＤＴＡとなるよう調節し、滅菌濾過
前に５M ＨＣｌでpHを７．３とする。ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法によって蛋白質分析を実施する。ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をLacmmli （英国）（Cleavage o
f Structural poteins during the assembly of the he
ad of bacteriophage T4. Nature 1970; 227:680-5）が
記載しているように、１３％（ｗ／ｖ）アクリルアミド
含有ゲル上で行なった。ゲルを定量分析のためにCoomas
sie Brilliant Blue R-250で染色し、DU8 Beckman 分光
光度計で５９５nmで走査する。純度を制御するために、
銀染色（Biorad Laboratories, Richmond,Calif.)を用
いてゲルを示す。
【００３７】Ｐ32の精製工程を次に示す：フェニル−セ
ファロース上での疎水性クロマトグラフィーを除いて、
緩衝液はすべて、Tween ８０（最終濃度０．００５％）
を含有する。pHは、滅菌前に７．３に調節する。全精製
工程は、＋４℃で実施する。溶出では、２８０nmでの吸
光度を記録する。蛋白質を含有する分画をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分析する。
【００３８】（ｉ）通常、１リットル当たり１２５〜１
５０mgの蛋白質を含有する、４リットルの亜鉛欠損培養
液からの処理濾液を、予め０．４５M ＮａＣｌ及び１mM
ＥＤＴＡを含有する２０mM燐酸塩緩衝液（ＰＢ）で、平
衡させたフェニル−セファロースＣＬ−４Ｂのカラム
（５．０×５．０cm）（Pharmacia Fine Chemicals, Up
psala, Sweden)に１時間当たり８００mlの流速で使用す
る。次にゲルを１カラム容積の同一緩衝液で洗浄して未
固定物質を除去し、そして次に３００mlの２０mM及び４
mMＰＢ、並びに１０％エタノール（ｖ／ｖ）で順次洗浄
する。
【００３９】（ii）この分画の燐酸塩濃度が４mMに達し
た後、それをＤＥＡＥ−セファセル（Pharmacia Fine C
hemicals）のカラム（２．６×１０cm）に使用し、これ
を４mMＰＢで平衡させる。平衡緩衝液で洗浄後、試料を
１時間当たり５０mlの流速で２５mM燐酸塩で溶出する。
溶出液を、ＰＭ １０膜（Amicon Corp., Lexington,Ma
ss.）を装備した２０２Amicon撹拌セル中で濃縮する。
【００４０】（iii)濃縮物質を４mgのＢＣＧのＰ32蛋白
質（可溶性抽出物）で処理するか又は５０mMＰＢで平衡
されたセファデックスＧ−１００（Pharmacia)カラム
（２．６×４５cm）上で１２ml／時の流速で分子篩いに
かける。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて一つのバンドを示す
ピークの分画をプールする。生成された最終製剤の純度
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びその後の銀染色によって、並
びにファースト蛋白質液体クロマトグラフィー系（Phar
macia)において流速０．２ml／分で、０．００５％Twee
n ８０を含有する５０mMＰＢにより平衡されたスペロー
ス１２（Pharmacia)カラム（１２．０×３０cm）上で分
子篩いをすることによって制御する。溶出では、２８０
nm及び２１４nmでの吸光度を記録する。
【００４１】ｂ）ＢＣＧのＰ32蛋白質に対して生じるウ
サギポリクローン抗血清の調製：生理食塩水１ml当たり
４００μg のＢＣＧの精製Ｐ32蛋白質を１容積の不完全
フロインドアジュバントと混合する。その物質をホモジ
ェナイズし、ウサギの背中の１０部位に分けられる５０
μl の用量で、０、４、７及び８週目に皮内注射する
（最後の注射に関しては、アジュバントを希釈剤と置換
する）。１週間後、ウサギから採血して、抗体価に関し
て血清を試験し、その後アリコートに分配して−８０℃
で保存する；
【００４２】２）本発明のポリペプチドとＢＣＧのＰ32
蛋白質に対して生じる上記のウサギポリクローン抗血清
との間の反応の証拠を示すための試験：用いた試験はエ
ライザELISA 検定であった；抗体測定に関するエライザ
はEngvall とPerlmannの方法（Engvall, E., and P. Pe
rlmann, 1971. Enzyme-linkedimmunosorbent assay (EL
ISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immu
nochemistry 8:871-874）に基づくものである。１００
μl のトリス塩酸緩衝液（５０mM、pH８．２）中に溶解
した１μg の本発明のポリペプチドの一つを各ウェルに
加えてImmulon Microelisaプレート（Dynatech, Klote
n, Switzerland)を被う。湿室内で２７℃で２時間イン
キュベーション後、そのプレートを一晩４℃に保つ。そ
れを、Titertekマイクロプレート洗浄器（Flow Labor a
tories, Brussels, Belgium)を用いて、０．０５％Twee
n ２０を含有する０．０１M 燐酸塩緩衝塩水（pH７．
２）で４回洗浄する。ブロッキングは、０．０６M 炭酸
塩緩衝液（pH９．６）に溶解した０．５％ゼラチンを用
いて、１時間実施する。次にウェルを前と同様に洗浄
し、０．０５％Tween ２０及び０．５％ゼラチンを含有
する燐酸塩緩衝塩水中に希釈した上記の血清１００μl
を加える。予備実験で得られた結果に従って、使用希釈
度をＩｇＧ測定に関しては１：２００、ＩｇＡに関して
は１：２０、及びＩｇＭに関しては１：８０に設定す
る。各希釈は二重で実施する。２時間インキュベーショ
ン後にウェルを洗浄し、その後そこに、０．０５％Twee
n ２０及び０．５％ゼラチンを含有する燐酸塩緩衝塩水
中にそれぞれ１：４００、１：４，０００及び１：１，
２００に希釈した、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ
（Dakopatts, Copenbagen, Denmark）に対するペルオキ
シダーゼ−標識ウサギイムノグロブリン１００μl を入
れ、そして９０分間インキュベートする。洗浄後、ウェ
ルに結合したペルオキシダーゼの量を、基質として０．
１５M クエン酸塩緩衝液（pH５．０）中に溶解したｏ−
フェニレンジアミン（１０mg／１００ml）及び過酸化水
素（１００ml当たり８μl の３０％Ｈ2 Ｏ2)の新たに調
製した溶液を用いて、定量する。１５分間のインキュベ
ーション後、８ＮＨ2 ＳＯ4 を用いて酵素反応を停止す
る。Titertek Multiskan光度計（Flow Laboratories)で
４９２nmでの光学密度を読み取る。
【００４３】血清を入れていないウェルを標識体に関す
る対照として用いる。プレート毎の及び測定日による変
動を補正するために、各プレート上に１つの陰性参照血
清と中位及び低抗体レベルの２つの陽性参照血清を包含
して、各実験を行なう。抗体濃度は、参照血清の平均変
動に従って読み取り値を補正した後に得られる光学密度
値で表される。
【００４４】本発明のポリペプチドは結核患者からのヒ
ト血清によって選択的に認識されるという事実の証拠を
示すための試験を以下に示すが、これは本発明を限定す
るものではない。
【００４５】この試験は、イムノブロッティング（ウエ
スタンブロッティング）分析で、この場合、本発明のポ
リペプチドは組換え技術によって得られる。この試験
は、異なる製造方法によって得られる本発明のポリペプ
チドに対しても用い得る。ドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後、本発明のポリペプチ
ドを、Towbinら（２９）が記載したように、ニトロセル
ロース膜（Hybond C. (Amersham)）上にブロッティング
する。大腸菌E. coli Y1089 中のβ−ガラクトシダーゼ
に融合された本発明のポリペプチドの発現は、ポリクロ
ーンウサギ抗３２kDa ＢＣＧ蛋白質血清（１：１，００
０）の結合によって、又はモノクローン抗βガラクトシ
ダーゼ抗体（Promega)を用いて視覚化される。二次抗体
（それぞれ、アルカリホスファターゼ抗ウサギイムノグ
ロブリンＧ及び抗マウスアルカリホスファターゼイムノ
グロブリンＧ標識体）は、製造業者（Promega)の勧告に
従って希釈する。
【００４６】ヒト結核血清による本発明のポリペプチド
及び本発明の融合蛋白質の選択的認識を確認するため
に、これらの血清（１：５０）を用いてニトロセルロー
スシートを一晩インキュベートする（非特異的蛋白質結
合部位をブロッキング後）。ヒト結核血清は、後述の引
用文献の文献（３１）に記載のようなドットプロット検
定において検定されるＢＣＧの精製３２ｋＤａ抗原に対
するその反応性（高いか又は低いか）に関して選択され
る。ニトロセルロースシート上の反応領域は、ペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリンＧ抗体（Dako
patts, Copenhagen, Denmark）（１：２００）を用いて
４時間インキュベートすることによって明示され、繰り
返し洗浄後、ペルオキシダーゼ及び過酸化水素の存在下
でペルオキシダーゼ基質（α−クロロナフトール）（Bi
o-Rad Laboratories, Richmond, Calif.）を加えると発
色反応が発現する。
【００４７】いくつかのアミノ酸中に存在し、一方では
本発明のポリペプチドの組成の一部、特にＧｌｕ基又は
Ｃ末端アミノ酸が保有する遊離のカルボキシル基であ
り、他方でＮ末端アミノ酸又はペプチド鎖内アミノ酸、
例えばＬｙｓが保有する遊離ＮＨ2 基である遊離反応官
能基は、その改変が本ポリペプチドの上記の特性を変え
ない限りにおいて改変可能であることは、言うまでもな
い。
【００４８】このように改変される分子は、もちろん本
発明の一部である。上記のカルボキシル基は、アシル化
又はエステル化され得る。
【００４９】その他の改変も本発明の一部である。特
に、又はアミン又はエステル官能基、あるいは両方の末
端アミノ酸は、それ自体、他のアミノ酸との結合に関与
し得る。例えば、Ｎ末端アミノ酸は、別のペプチドのＣ
末端領域の一部に対応する１〜数個のアミノ酸を含む配
列に結合し得る。
【００５０】さらに、本発明のポリペプチドの１〜数個
のアミノ酸の置換及び／又は付加及び／又は欠失による
改変に起因する任意の配列は、この改変が上記のポリペ
プチドの上記の特性を変えない限りにおいて本発明の一
部である。
【００５１】本発明のポリペプチドは、特にＡｓｎ−Ｘ
−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ型（Ｘは任意のアミノ
酸を表す）のそのグリコシル化部位のいくつかにおい
て、グリコシル化され得ない場合もある。
【００５２】本発明の有益な組換えポリペプチドは、そ
のポリペプチド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸
配列を含有する： − 図３及び図４に示される（−４２）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−４７）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−４９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−５５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−５９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列。
【００５３】本発明の有益な組換えポリペプチドは、そ
のポリペプチド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸
配列を含有する： − 図５及び図６に示される（−４２）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−４７）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−４９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−５５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−５９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列。
【００５４】本発明の有益な組換えポリペプチドは、そ
のポリペプチド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸
配列を含有する： − 図７〜９に示される（−４３）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列。
【００５５】本発明の有益な組換えポリペプチドは、そ
のポリペプチド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸
配列を含有する： − 図３及び図４に示される（１）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−２９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−４２）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−４７）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−４９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−５５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−５９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列。
【００５６】本発明の有益な組換えポリペプチドは、そ
のポリペプチド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸
配列を含有する： − 図５及び図６に示される（１）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−２９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−４２）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−４７）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−４９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−５５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−５９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列。
【００５７】本発明の有益な組換えポリペプチドは、そ
のポリペプチド鎖中に少なくとも一つの以下のアミノ酸
配列を含有する： − 図７〜９に示される（１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端から（２９５）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（−３０）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２９５）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（−４３）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２９５）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列。
【００５８】本発明のその他の有益な組換えポリペプチ
ドは、以下のアミノ酸配列の一つから成る： − 図３及び図４に示される（−５９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−５５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−４９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−４７）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−４２）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−２９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列。
【００５９】本発明のその他の有益な組換えポリペプチ
ドは、以下のアミノ酸配列の一つから成る： − 図５及び図６に示される（−５９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−５５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−４９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−４７）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−４２）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−２９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列。
【００６０】本発明のその他の有益な組換えポリペプチ
ドは、以下のアミノ酸配列の一つから成る： − 図７〜９に示される（１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端から（２９５）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（−３０）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２９５）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（−４３）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２９５）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列。
【００６１】本発明のその他の有益な組換えポリペプチ
ドは、以下のアミノ酸配列の一つから成る： − 図３及び図４図に示される（−５９）番目のアミノ
酸で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−５５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−４９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−４７）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−４２）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（−２９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列。
【００６２】本発明のその他の有益な組換えポリペプチ
ドは、以下のアミノ酸配列の一つから成る： − 図５及び図６に示される（−５９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−５５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−４９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−４７）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−４２）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（−２９）番目のアミノ酸
で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成さ
れる末端にわたる配列。
【００６３】本発明のその他の有益な組換えポリペプチ
ドは、以下のアミノ酸配列の一つから成る： − 図７〜９に示される（−４３）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（−３０）番目のアミノ酸で構
成される末端から（−１）番目のアミノ酸で構成される
末端にわたる配列。
【００６４】真核細胞においては、これらのポリペプチ
ドはシグナルペプチドとして用い得る。その役割はその
合成部位からの蛋白質の転位を開始することであるが、
しかしそれは転位中に削除される。
【００６５】本発明のその他の有益な組換えポリペプチ
ドは、以下のアミノ酸配列の一つから成る： − 図３及び図４に示される（１２）番目のアミノ酸で
構成される末端から（３１）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（３６）番目のアミノ酸で
構成される末端から（５５）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（７７）番目のアミノ酸で
構成される末端から（９６）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（１０１）番目のアミノ酸
で構成される末端から（１２０）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（１７５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（１９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（２１１）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２３０）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図３及び図４に示される（２７５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列。
【００６６】本発明のその他の有益な組換えポリペプチ
ドは、以下のアミノ酸配列の一つから成る： − 図５及び図６に示される（１２）番目のアミノ酸で
構成される末端から（３１）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（３６）番目のアミノ酸で
構成される末端から（５５）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（７７）番目のアミノ酸で
構成される末端から（９６）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（１０１）番目のアミノ酸
で構成される末端から（１２０）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（１７５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（１９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（２１１）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２３０）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列、又は − 図５及び図６に示される（２７５）番目のアミノ酸
で構成される末端から（２９４）番目のアミノ酸で構成
される末端にわたる配列。
【００６７】本発明のその他の有益な組換えポリペプチ
ドは、以下のアミノ酸配列の一つから成る： − 図７〜９に示される（１２）番目のアミノ酸で構成
される末端から（３１）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（３６）番目のアミノ酸で構成
される末端から（５５）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（７７）番目のアミノ酸で構成
される末端から（９６）番目のアミノ酸で構成される末
端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（１０１）番目のアミノ酸で構
成される末端から（１２０）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（１７５）番目のアミノ酸で構
成される末端から（１９４）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（２１１）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２３０）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列、又は − 図７〜９に示される（２７５）番目のアミノ酸で構
成される末端から（２９５）番目のアミノ酸で構成され
る末端にわたる配列。
【００６８】上記のポリペプチドは、後述の実施例で説
明されるように、ヒト結核菌によって分泌される３２kD
a の蛋白質をコードするヌクレオチド配列に由来するＤ
ＮＡの発現物質から得られることに留意すべきである。
【００６９】本発明はさらに、上記のポリペプチド、及
びそのポリペプチドに関する蛋白質又は異種配列に関す
るものであって、その蛋白質又は異種配列は、例えば約
１〜約１，０００個のアミノ酸を含む。これらのアミノ
酸配列は融合蛋白質と呼ばれる。
【００７０】本発明の有益な融合蛋白質においては、異
種蛋白質はβ−ガラクトシダーゼである。
【００７１】本発明のその他の有益な融合蛋白質は、以
下のプラスミドの一つの発現に起因する異種蛋白質を含
有するものである： ｐＥＸ１ ｐＥＸ２ ｐＥＸ３ ｐＵＥＸ１ ｐｍＴＮＦ ＭＰＨ ｐＵＥＸ２ ｐＵＥＸ３
【００７２】本発明はさらに、本発明のポリペプチドを
コードする任意のヌクレオチド配列に関する。
【００７３】本発明はさらに、次のハイブリッド形成条
件下で上記の任意のポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含
む核酸に関する： − ハイブリッド形成及び洗浄媒体：３×ＳＳＣ，２０
％ホルムアミド（１×ＳＳＣは０．１５M ＮａＣｌ、
０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、 − ｘ−ｙによって、即ち図３及び図４に示される
（ｘ）位置のヌクレオチドで構成される末端から（ｙ）
位置のヌクレオチドで構成される末端にわたる配列によ
って限定される本発明の核酸のハイブリッド形成温度
（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）。
【００７４】１ − １８２ ＨＴ＝ＷＴ＝６９℃ １ − １９４ ＨＴ＝ＷＴ＝６９℃ １ − ２１２ ＨＴ＝ＷＴ＝６９℃ １ − ２１８ ＨＴ＝ＷＴ＝６９℃ １ − ２７２ ＨＴ＝ＷＴ＝６９℃ １ − ３５９ ＨＴ＝ＷＴ＝７１℃ １ −１２４１ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ １ −１３５８ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ １８３ − ３５９ ＨＴ＝ＷＴ＝７０℃ １８３ −１２４１ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ １８３ −１３５８ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ １９５ − ３５９ ＨＴ＝ＷＴ＝７０℃ １９５ −１２４１ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ １９５ −１３５８ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ ２１３ − ３５９ ＨＴ＝ＷＴ＝７０℃ ２１３ −１２４１ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ ２１３ −１３５８ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ ２１９ − ３５９ ＨＴ＝ＷＴ＝７１℃ ２１９ −１２４１ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ ２１９ −１３５８ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ ２３４ − ３５９ ＨＴ＝ＷＴ＝７１℃ ２３４ −１２４１ ＨＴ＝ＷＴ＝７４℃ ２３４ −１３５８ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ ２７３ − ３５９ ＨＴ＝ＷＴ＝７１℃ ２７３ −１２４１ ＨＴ＝ＷＴ＝７４℃ ２７３ −１３５８ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ ３６０ −１２４１ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ ３６０ −１３５８ ＨＴ＝ＷＴ＝７３℃ １２４２ −１３５８ ＨＴ＝ＷＴ＝６２℃
【００７５】上記の温度は、約±５℃と考えられるべき
である。
【００７６】本発明はさらに、上記の任意のポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチ
ド配列を含む核酸に関する。
【００７７】上記の、並びに後述の核酸において、産生
されるヌクレオチド配列はＴがＵに置き換えられるよう
なものであることに留意すべきである。
【００７８】本発明の好ましい核酸の群は、少なくとも
一つの次のヌクレオチド配列を包含する： − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１８２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（３６０）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１２４２）番目のヌクレ
オチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレ
オチドで構成される末端にわたる配列、 （ここで、図３及び図４に示されるＮは５つのＡ、Ｔ、
Ｃ、Ｇ、又はＩヌクレオチドの一つを表す）、か又はＴ
がＵに置き換えられる上記のヌクレオチド配列、又は上
記のヌクレオチド配列もしくはその相補的配列とハイブ
リダイズする核酸。
【００７９】本発明の好ましい核酸の群は、少なくとも
一つの次のヌクレオチド配列を包含する： − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１８２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（３６０）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１２４２）番目のヌクレ
オチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレ
オチドで構成される末端にわたる配列、 （ここで、図５及び図６に示されるＮは５つのＡ、Ｔ、
Ｃ、Ｇ、又はＩヌクレオチドの一つを表す）、か又はＴ
がＵに置き換えられる上記のヌクレオチド配列、又は上
記のヌクレオチド配列もしくはその相補的配列とハイブ
リダイズする核酸。
【００８０】本発明の好ましい核酸の群は、少なくとも
一つの次のヌクレオチド配列を包含する： − 図７〜９に示される（１３０）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２１９）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（２２０）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１１０４）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１１０４）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端から（１２９９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 （ここで、図７〜９に示されるＮは５つのＡ、Ｔ、Ｃ、
Ｇ、又はＩヌクレオチドの一つを表す）、か又はＴがＵ
に置き換えられる上記のヌクレオチド配列、又は上記の
ヌクレオチド配列もしくはその相補的配列とハイブリダ
イズする核酸。
【００８１】本発明のその他の好ましい核酸は、少なく
とも一つの次のヌクレオチド配列を包含する： − 図３及び図４に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列。
【００８２】本発明のその他の好ましい核酸は、少なく
とも一つの次のヌクレオチド配列を包含する： − 図５及び図６に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列。
【００８３】本発明の核酸の別の好ましい群は、次のヌ
クレオチド配列を包含する： − 図３及び図４に示される（３６０）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列。
【００８４】本発明の核酸の別の好ましい群は、次のヌ
クレオチド配列を包含する： − 図５及び図６に示される（３６０）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列。
【００８５】別の有益な態様によれば、本発明の核酸は
次の配列の一つを包含する： − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１９４）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２１２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２１８）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２７２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２３４）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２３４）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列。
【００８６】別の有益な態様によれば、本発明の核酸は
次の配列の一つを包含する： − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１９４）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２１２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２１８）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２７２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２３４）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２３４）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列。
【００８７】本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチ
ド配列の一つから成る： − 図３及び図４に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２３４）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列。
【００８８】本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチ
ド配列の一つから成る： − 図５及び図６に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２３４）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列。
【００８９】これらのヌクレオチド配列は、対応するシ
グナルペプチドをコードするヌクレオチドシグナル配列
として用い得る。
【００９０】本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチ
ド配列の一つから成る： − 図３及び図４に示される（３６０）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（３６０）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列。
【００９１】本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチ
ド配列の一つから成る： − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１８２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１９４）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２１２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２１８）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２７２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２３４）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２３４）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図３及び図４に示される（１２４２）番目のヌクレ
オチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレ
オチドで構成される末端にわたる配列。
【００９２】本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチ
ド配列の一つから成る： − 図５及び図６に示される（３６０）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（３６０）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列。
【００９３】本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチ
ド配列の一つから成る： − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１８２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１９４）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２１２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２１８）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２７２）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（３５９）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１８３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１９５）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２１９）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２３４）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２３４）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１２４１）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（２７３）番目のヌクレオ
チドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレオ
チドで構成される末端にわたる配列、 − 図５及び図６に示される（１２４２）番目のヌクレ
オチドで構成される末端から（１３５８）番目のヌクレ
オチドで構成される末端にわたる配列。
【００９４】本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチ
ド配列の一つから成る： − 図７〜９に示される（１）番目のヌクレオチドで構
成される末端から（１２９）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１）番目のヌクレオチドで構
成される末端から（２１９）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１）番目のヌクレオチドで構
成される末端から（１１０４）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１）番目のヌクレオチドで構
成される末端から（１２９９）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（９０）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（２１９）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（９０）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（１２９９）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（９０）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（１１０４）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１３０）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１１０４）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１３０）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１２９９）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（２２０）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１２９９）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列。
【００９５】本発明の好ましい核酸は、次のヌクレオチ
ド配列の一つから成る： − 図７〜９に示される（１）番目のヌクレオチドで構
成される末端から（１２９）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１）番目のヌクレオチドで構
成される末端から（２１９）番目のヌクレオチドで構成
される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１）番目のヌクレオチドで構
成される末端から（１１０４）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１）番目のヌクレオチドで構
成される末端から（１２９９）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（９０）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（２１９）番目のヌクレオチドで構
成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（９０）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（１１０４）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（９０）番目のヌクレオチドで
構成される末端から（１２９９）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１３０）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（２１９）番目のヌクレオチドで
構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１３０）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１１０４）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１３０）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１２９９）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（２２０）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１１０４）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（２２０）番目のヌクレオチド
で構成される末端から（１２９９）番目のヌクレオチド
で構成される末端にわたる配列、 − 図７〜９に示される（１１０４）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端から（１２９９）番目のヌクレオチ
ドで構成される末端にわたる配列。
【００９６】本発明はさらに、異種核酸中に挿入された
少なくとも一つの本発明の核酸を含有する任意の組換え
核酸に関する。
【００９７】本発明は特に、その制御下で上記の配列の
転写物がプロセッシングを受け易いプロモーター（特に
誘導プロモーター）が本発明のヌクレオチド配列に先行
し、そしておそらく転写終止シグナルをコードする配列
が後に続くと限定されるような組換え核酸に関する。
【００９８】本発明はさらに、本発明のポリペプチド及
びおそらくはシグナルペプチドをコードする核酸配列
が、それらが細菌遺伝子内で普通結合されるものに関し
て異種である制御要素、特にそれらの産生のために選択
された細胞宿主中のそれらの発現を制御するために改造
された調節要素を用いて組換えられる組換え核酸に関す
る。
【００９９】本発明はさらに、その複製のための非必須
部位の一つにおいて、特に基準プラスミド、コスミド又
はファージ、及び本発明の組換え核酸のベクター配列を
含む、特にクローニング及び／又は発現のための組換え
ベクターに関する。
【０１００】組換え抗原の発現に適したベクターを以下
に示す： ｐＥＸ１ ｐｍＴＮＦ ＭＰＨ ｐＥＸ２ ｐＩＧＲＩ ｐＥＸ３ ｐＵＥＸ１ ｐＵＥＸ２ ｐＵＥＸ３
【０１０１】ｐＥＸ１、ｐＥＸ２、及びｐＥＸ３ベクタ
ーは市販されていて、Boehringer Mannheim から購入で
きる。
【０１０２】ｐＵＥＸ１、ｐＵＥＸ２、及びｐＵＥＸ３
ベクターも市販されていて、Ａｍｅｒｓｈａｍから購入
できる。
【０１０３】本発明の有益な態様によれば、組換えベク
ターは、その複製のためのその非必須部位の一つにおい
て、細胞宿主内での本発明のポリペプチドの発現をプロ
モートするための必要な要素と、おそらくは細胞宿主の
ポリメラーゼによって認識されるプロモーター、特に誘
導プロモーター、並びにおそらくはシグナル配列及び／
又はアンカー配列を含有する。
【０１０４】本発明の別の態様によれば、組換えベクタ
ーは、ベクター中に挿入される本発明の核酸の大腸菌
Ｅ．ｃｏｌｉによる発現を可能にする要素、特にβ−ガ
ラクトシダーゼの遺伝子又はその一部の発現を可能にす
る要素を含む。
【０１０５】本発明はさらに、本発明の組換えベクター
によって形質転換される、そしてこの宿主内で本発明の
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可
能にする調節要素を含む細胞宿主に関する。
【０１０６】本発明はさらに、上記のようなそして実施
例に後述するようなベクターによって形質転換される大
腸菌E. coli のような細菌の中から選択される、あるい
はｐＡｃ ３７３ ｐＹＭ１又はｐＶＣ３のような好適
なベクターを含有するウイルスＡｃ Ｎ Ｐ Ｖ（Auto
grapha california nuclear polyhydrosis virus）に感
染されたＣＨＯ細胞、昆虫細胞、Ｓｆ９細胞〔Spodopte
ra frugiperda 〕、ｐＢＥ５２０又はｐ８９Ｂ３１０の
ような好適なベクターを含有するウイルスＢｍＮＰＶに
感染されたＢｍＮ〔Bombyx mori 〕のような真核生物の
中から選択される細胞宿主に関する。
【０１０７】本発明は、本発明の形質転換細胞宿主によ
って発現される核酸の発現物質に関する。
【０１０８】本発明はさらに、いずれかの核酸と、又は
それらの相補的配列とハイブリダイズするヌクレオチド
プローブ、特に表１に収録され、図１４〜１７に示され
た以下のヌクレオチド配列の中から選択されるプローブ
に関する。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】ハイブリッド形成条件を次に示す： − ハイブリッド形成及び洗浄媒体：３×ＳＳＣ、２０
％ホルムアミド（１×ＳＳＣは０．１５M ＮａＣｌ、
０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、 − ハイブリッド形成温度（ＨＴ）及び洗浄温度（Ｗ
Ｔ）： （ＷＴ）℃： ＨＴ及びＷＴ（℃） Ａ（ｉ） ５０ Ａ（ii） ５０ Ａ（iii) ５２ Ａ（iv） ６０ Ａ（ｖ） ５２ Ｂ ４８ Ｃ ５０ Ｄ ４５ Ｅ ５２ Ｆ（ｉ） ５５ Ｆ（ii） ５９ Ｆ（iii) ５５ Ｆ（iv） ５９
【０１１１】これらのプローブは、 Mycobacterium tu
berculosisヒト結核菌をその他の細菌株と、特に次のマ
イコバクテリア種と区別し得る： − Mycobacterium marinum 海水魚結核菌、Mycobacter
ium scrofulaceum、Mycobacterium gordonae、Mycobact
erium szulgai 、Mycobacterium intracellulare、Myco
bacterium xenopi、Mycobacterium gastri、Mycobacter
ium nonchromogenicum、Mycobacterium terrae、及び M
ycobacteriumtriviale、特にM. bovisウシ結核菌、Myco
bacterium kansasii、Mycobacterium avium 鳥結核菌、
Mycobacterium phlei チモテ菌及びMycobacterium fort
uitum 。
【０１１２】本発明はさらに、米国特許第４，６８３，
２０２号及び第４，６８３，１９５号、並びに欧州特許
第２００３６２号に記載されているように、ＰＣＲ（ポ
リメラーゼチェインリアクション法）による本発明のヌ
クレオチド配列の合成に用い得るＤＮＡ又はＲＮＡプラ
イマーに関する。
【０１１３】本発明はさらに、本発明のポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列の約１５〜約２５ヌクレオ
チドで構成される任意のＤＮＡ又はＲＮＡプライマーに
関する。
【０１１４】本発明はさらに、本発明のポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列とハイブリッドを形成し易
い約１５〜約２５ヌクレオチドで構成される任意のＤＮ
Ａ又はＲＮＡプライマーに関する。
【０１１５】本発明はさらに、本発明のポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列と相補的な約１５〜約２５
ヌクレオチドで構成される任意のＤＮＡ又はＲＮＡプラ
イマーに関する。
【０１１６】プライマーとして用い得る配列を以下の表
２（配列Ｐ１〜Ｐ６、又はそれらの相補体）、及び図１
４〜１７に示す：
【０１１７】
【表２】
【０１１８】これらの配列は、本発明の任意のヌクレオ
チド配列、特に１番目のヌクレオチドで構成される末端
から１，３５８番目のヌクレオチドで構成される末端に
わたる配列、並びにＢＣＧのα抗原のヌクレオチド配列
についてのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法により酵素
的増幅を可能にする１２組の異なるプライマー（表３に
示されている）に組合わせ得る（１７）。
【０１１９】ＰＣＲ増幅物質の検出は、ＤＮＡを増幅す
るために用いられたＰＣＲプライマー間に位置する少な
くとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列との
ハイブリッド形成反応による。
【０１２０】本発明のヌクレオチド配列のＰＣＲ物質
は、表３に示されるプローブを用いるハイブリッド形成
法（ドット−スポット、サザンブロッティング等）によ
ってＢＣＧのα抗原遺伝子又はその一部と識別される。
これらのプローブの配列は、上記の表１に示されてい
る。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】酵素的増幅は、表２に示されるプライマー
の約１５の連続した塩基の配列を有するすべてのオリゴ
ヌクレオチドを用いても成し遂げられることに留意すべ
きである。５′末端に伸長を伴う、あるいは小程度のミ
スマッチを伴うプライマーは、そのミスマッチがプライ
マーの３′末端での塩基対合を妨げない場合は、酵素的
増幅の結果に相当に影響を及ぼすということはない。
【０１２３】本発明の（ＢＣＧ遺伝子のではなく）ヌク
レオチド配列の特異的な酵素的増幅は、プローブ（表１
に示されている）又はそれらの相補体が増幅プライマー
として用いられる場合に成し遂げられる。
【０１２４】上記の表１のプローブがプライマーとして
用いられる場合、そのプライマー組はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ又はＦから選択される任意のその他のヌクレオチド配
列の相補体に関連した表１の任意のヌクレオチド配列
（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）で構成されるが、この場
合、配列Ａは配列Ａ（ｉ）、Ａ（ii）、Ａ（iii)、Ａ
（iv）、Ａ（ｖ）のいずれかを意味し、配列Ｆは配列Ｆ
（ｉ）、Ｆ（ii）、Ｆ（iii)、Ｆ（iv）のいずれかを意
味すると理解されるべきである。
【０１２５】本発明のヌクレオチド配列の酵素的増幅に
有益なプライマー組は、後述の表３−２に示される以下
のプライマー組の一つである：
【０１２６】
【表４】
【０１２７】上記の表３−２に記載の上記の任意のプラ
イマー組を有する本発明のヌクレオチド配列の増幅の場
合、増幅ヌクレオチド配列の検出は、少なくとも１０ヌ
クレオチドのオリゴヌクレオチド配列とのハイブリッド
形成反応によって成し遂げられるが、その配列はヌクレ
オチド配列を増幅するために用いられたＰＣＲプライマ
ー間に位置する。上記の２つのプライマー間に位置する
オリゴヌクレオチド配列は、図１４〜１７（この場合、
プライマーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦはそれぞれプロー
ブ領域Ａ、プローブ領域Ｂ、プローブ領域Ｃ、プローブ
領域Ｄ、プローブ領域Ｅ及びプローブ領域Ｆと呼ばれる
矩形で囲まれた配列で表される）から確定される。
【０１２８】本発明はさらに、ＰＣＲ法によるヌクレオ
チド配列の酵素的増幅のための、及び以下の： − 表３に記載のＰＣＲプライマー組の一つ、及び本発
明の検出プローブ（表１に記載のプローブが有益であ
る）、又は表３−２に記載のＰＣＲプライマー組の一
つ、及び例えば少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌ
クレオチド配列から成る検出配列であって、上記の配列
は上記のヌクレオチド配列を増幅するために用いられた
プライマー組を構成する２つのＰＣＲプライマー間に位
置する（図１４〜１７）ものを含有する増幅ヌクレオチ
ド配列の検出のためのキットに関する。
【０１２９】本発明はさらに、以下の： − 本発明の核酸を含有する適当なベクターで予め形質
転換された細胞宿主の適切な培地での培養、 − 上記の培養液から上記の形質転換細胞宿主により産
生されるポリペプチドの回収、及び − 最後に固定金属イオンアフィニティークロマトグラ
フィー（ＩＭＡＣ）による産生されたポリペプチドの精
製からなる工程を包含する本発明のポリペプチドの製造
方法に関する。
【０１３０】本発明のポリペプチドは、ペプチド合成の
分野における古典的技法に従って製造され得る。
【０１３１】その合成は、均質溶液中又は固相で実施し
得る。例えば、用い得る均質溶液中での合成方法として
は、Houbenweylが"Methode der organischen chemie"
（有機化学の方法）という表題の本（編集者E. Wunsh,v
ol.15-I&II. THIEME, Stuttgart 1974)に記載した方法
が挙げられる。
【０１３２】本発明のポリペプチドは、R.D. Merrifiel
d が"Solid phase peptide synthesis" (J.P. Ham. Soc
ks., 45, 2149-2154）という表題の論文に記載した方法
に従って調製することもできる。
【０１３３】本発明はさらに、本発明の核酸の製造方法
に関する。
【０１３４】一本鎖核酸（本発明の精々１００ヌクレオ
チドを含有する）を化学的に製造するのに適した方法
は、次の工程： − Bioorganic Chemistry 4; 274-325,1986に記載の自
動β−シアノエチルホスホラミダイト法を用いるＤＮＡ
合成を含む。一本鎖ＤＮＡの場合、ＤＮＡ合成終了時に
生成される物質はこのように用いられる。
【０１３５】二本鎖核酸（本発明の高々１００bpを含有
する）を化学的に製造するのに適した方法は、以下の工
程を包含する： − Bioorganic Chemistry 4; 274-325,1986に記載の自
動β−シアノエチルホスホラミダイト法を用いる一つの
センスオリゴヌクレオチドのＤＮＡ合成、及び上記の自
動β−シアノエチルホスホラミダイト法を用いる一つの
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＤＮＡ合成、 − ＤＮＡ重複体を形成するためにハイブリッド形成に
よってセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを結
合する、 − 生成されたＤＮＡ重複体を適当なプラスミドベクタ
ー中にクローニングし、制限酵素消化及びアガロースゲ
ル電気泳動のような古典的方法に従ってＤＮＡを回収す
る。二本鎖核酸の場合、１００ヌクレオチド、又は１０
０bpより長い核酸の化学的製造方法には、以下の工程が
含まれる： − 化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの収集。そ
の末端に異なる制限部位を有する場合、その配列は、Pr
oc. Nat. Acad. Sci. USA 80; 7461-7465, 1983に記載
された原理によれば、天然ペプチドのアミノ酸列に一致
する。 − それによって生成されたＤＮＡ重複体を適当なプラ
スミドベクター中にクローニングし、制限酵素消化及び
アガロースゲル電気泳動のような古典的方法に従って所
望の核酸を回収する。
【０１３６】本発明はさらに、本発明のポリペプチドに
対して産生される抗体それ自体に関する。言うまでもな
く、この産生はポリクローン抗体に限定されない。
【０１３７】本発明はさらに、一方で本発明の精製ポリ
ペプチドに対して免疫された動物、特にマウス又はラッ
トの脾臓細胞と、他方骨髄腫細胞株の細胞とから古典的
方法によって生成され易く、動物を免疫するために最初
に用いられたポリペプチドを認識するモノクローン抗体
を産生するその能力によって選択される任意のハイブリ
ドーマにより産生される任意のモノクローン抗体に関す
る。
【０１３８】本発明はさらに、酵素、蛍光、又は放射能
等の適当な標識によって標識化される本発明の任意の抗
体に関する。
【０１３９】抗体、特にモノクローン抗体を生成するの
に用いると有益であるペプチドを、次の表４に示す：
【０１４０】
【表５】
【０１４１】表４に記載されたペプチドは、それらの意
図される用途によって変化し得る。例えば、ペプチドが
抗血清を生成するために用いられる場合は、そのペプチ
ドは付加される余分のシステイン残基を伴って合成され
得る。この余分のシステイン残基は、好ましくはアミノ
末端に付加され、そして小ペプチドを免疫原性にするの
に必要な担体蛋白質にペプチドが結合し易くする。ペプ
チドがラジオイムノアッセイに使用するために標識化さ
れる場合、ヨウ素化を促すためにアミノ又はカルボキシ
ル末端にチロシンを付加した蛋白質を合成するのが有益
である。したがって、これらのペプチドは表４に記載さ
れたペプチドの一次配列を有するが、しかし、蛋白質の
その一次配列中に認められない、そしてその唯一の機能
はペプチドに所望の化学的特性を付与することである付
加的アミノ酸を伴う。
【０１４２】本発明はさらに、その抗体を含有し易いヒ
トの生物学的試料中の結核に関連したin vitroでの抗体
の検出方法に関する。この方法は： − 生物試料を、上記のポリペプチドと生物試料中に存
在する可能性のある抗体との間のin vitro免疫反応を可
能にする条件下で、本発明のポリペプチド又はペプチド
と接触させ、そして − 生成され得る抗原／抗体複合体をin vitro検出する
工程から成る。
【０１４３】好ましくは、生物培地はヒト血清で構成さ
れる。検出は、任意の古典的方法によって実施し得る。
例えば、好ましい方法としては、エライザＥＬＩＳＡ法
又は蛍光抗体法又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等
による免疫酵素的方法が挙げられる。したがって、本発
明はさらに、酵素、蛍光、放射能等の適切な標識で標識
化される本発明の任意のポリペプチドに関する。
【０１４４】結核に関連したin vitroでの抗体を検出す
るためのこのような方法は、例えば次の： − 滴定マイクロプレートのウェルに確定量の本発明の
ポリペプチド組成物を固定させ、 − 上記のウェルに診断すべき血清の段階希釈液を入
れ、 − マイクロプレートをインキュベーションし、 − マイクロプレートを繰り返し洗浄し、 − マイクロプレートのウェルに血液イムノグロブリン
に対する標識抗体を入れ、 − 少なくとも指定の波長でのこの基質の放射線の吸収
を改変することにより基質を加水分解できるものの中か
ら選択される酵素によってこれらの抗体を標識化し、 − 加水分解基質の量の対照基準と比較することによっ
て検出する工程から成る。
【０１４５】本発明はさらに、それらを含有し得るヒト
の生物試料中のヒト結核菌のin vitroでの抗原の検出及
び同定方法に関する。この方法は： − 生物試料を、上記の抗体と生物試料中に存在する可
能性のあるヒト結核菌の抗原との間のin vitro免疫反応
を可能にする条件下で、本発明の適切な抗体と接触さ
せ、そして生成され得る抗原／抗体複合体をin vitro検
出する工程から成る。
【０１４６】好ましくは、生物培地は痰、胸膜滲出液、
気管支肺胞洗浄液、尿、生検又は剖検検体で構成され
る。
【０１４７】適切な抗体は、表４に記載されたペプチド
に対するモノクローン抗体が有益である。
【０１４８】本発明はさらに、ヒト結核菌に感染し易い
患者における結核のin vitro診断のための別の方法に関
する。この方法は： − 上記のようなＤＮＡプライマー組の方法により上記
の患者から採取した生物試料中に含有され得る本発明の
ヌクレオチド配列の量を予め増幅させ、 − 上記のプローブ及び上記のヌクレオチド配列間で生
成されるハイブリッド形成複合体の産生を可能にする条
件下で、上記の生物試料と本発明のヌクレオチドプロー
ブとを接触させる工程から成る。
【０１４９】上記のようにヒト結核菌に感染し易い患者
における結核のin vitro診断を実施するために、次の必
要物質又はキットを使用する。その必要物質又はキット
としては： − 本発明の確定量のヌクレオチドプローブ、 − 検出すべき配列と上記のプローブとの間のハイブリ
ッド形成反応を生じるために有益な、適切な培地、−ハ
イブリッド形成反応中にヌクレオチド配列とプローブと
の間に形成されるハイブリッド形成複合体の検出を可能
にするのに有益な試薬が含まれる。
【０１５０】本発明はさらに、ヒト結核菌に感染し易い
患者における結核のin vitro診断のための別の方法に関
する。この方法は： − 患者から採取した生物試料を、上記のポリペプチド
又はペプチドと生物試料中に存在する可能性のある抗体
との間のin vitro免疫反応を可能にする条件下で、本発
明のポリペプチド又はペプチドと接触させ、そして − 生成された可能性のある抗原／抗体複合体をin vit
ro検出する工程から成る。
【０１５１】ヒト結核菌に感染し易い患者における結核
のin vitro診断を実施するために、次の必要物質又はキ
ットを使用する。その必要物質又はキットとしては： − 本発明のポリペプチド又はペプチド、 − 免疫反応に適した培地を作成するための試薬、 − 免疫反応によって産生された抗原／抗体複合体の検
出を可能にする試薬（この試薬は、特に上記のポリペプ
チド又はペプチドが標識化されない場合、おそらく標識
を有するかあるいは標識化試薬に認識され易い）が含ま
れる。
【０１５２】本発明はさらに、ヒト結核菌に感染し易い
患者における結核のin vitro診断のための別の方法に関
する。この方法は： − 生物試料を、上記の抗体と生物試料中に存在する可
能性のあるヒト結核菌の抗原との間のin vitro免疫反応
を可能にする条件下で、本発明の適切な抗体と接触さ
せ、そして生成され得る抗原／抗体複合体をin vitro検
出する工程から成る。適切な抗体は、表４に記載された
ペプチドに対するモノクローン抗体が有益である。
【０１５３】ヒト結核菌に感染し易い患者における結核
のin vitro診断を実施するために、次の必要物質又はキ
ットを使用する。その必要物質又はキットとしては： − 本発明の抗体、 − 免疫反応に適した培地を作成するための試薬、 − 免疫反応によって産生された抗原／抗体複合体の検
出を可能にする試薬（この試薬は、特に上記の抗体が標
識化されない場合、おそらく標識を有するかあるいは標
識化試薬に認識され易い）が含まれる。
【０１５４】結核のin vitro診断に有益なキットには：
−少なくとも好適な固相系、例えばin vitro診断すべき
生物試料をそこに固定させるためのマイクロプレート、 − 本発明のモノクローン抗体の一つを含有する試料、
−上記のモノクローン抗体のための特異的検出系、 − 一方では試験試料と上記のモノクローン抗体との、
他方で結合モノクローン抗体と検出系との間の免疫反応
を実施するのに適した緩衝液が含まれる。
【０１５５】本発明はさらに、本発明のポリペプチド又
はペプチドの一つの試料を含む、上記のようなキットに
関する。本発明の上記の抗原は、競合投薬法で用いられ
るキットに対して、求められる抗原に関する基準（求め
られるヒト結核菌の抗原の定量測定のための）、又は競
合体である。
【０１５６】本発明はさらに、製薬上受容可能なビヒク
ルを伴って本発明のポリペプチド又はペプチドを包含す
る免疫原性組成物に関する。
【０１５７】本発明はさらに、その他の免疫原性成分の
中で、天然蛋白質と、あるいは抱合体が、ヒト結核菌を
中和する抗体のin vivo 産生を誘発するか、又はヒト結
核菌抗原反応性Ｔ細胞を活性化することによって細胞免
疫反応をin vivo で誘発することができるような十分な
分子量を有する合成ポリペプチドと結合する可能性のあ
る本発明のポリペプチド又はペプチド、もしくは本発明
の発現物質のいずれかを包含するワクチン組成物に関す
る。
【０１５８】免疫原性成分として用いると有益な本発明
のペプチドは、以下の配列の一つを有する：
【０１５９】
【表６】
【０１６０】本発明のその他の特徴及び利点は、本発明
を説明する以下の実施例及び図面において、明らかにな
る。
【０１６１】後述の表５は、ｐＩＧＲＩの完全制限部位
分析を示す。
【０１６２】
【表７】
【０１６３】
【表８】
【０１６４】
【表９】
【０１６５】
【表１０】
【０１６６】
【表１１】
【０１６７】後述の表６は、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨの完全
制限部位分析を示す。
【０１６８】
【表１２】
【０１６９】
【表１３】
【０１７０】
【表１４】
【０１７１】
【表１５】
【０１７２】
【表１６】
【０１７３】
【表１７】
【０１７４】表７は、ｐＩＧ２の完全制限部位分析を示
す。
【０１７５】
【表１８】
【０１７６】
【表１９】
【０１７７】
【表２０】
【０１７８】
【表２１】
【０１７９】
【表２２】
【０１８０】
【実施例】
実施例Ｉ：材料と方法抗３２kDa 抗血清によるλｇｔ１１ヒト結核菌組換え Ｄ
ＮＡライブラリーのスクリーニング ヒト結核菌（Ｅｒｄｍａｎ株）のゲノムＤＮＡから作成
されるλｇｔ１１組換えライブラリーは、R. Young（３
５）から入手した。文献の記載内容（１４、３５）に後
述するいくつかの変更を加えて、スクリーニングを実施
した。λｇｔ１１感染大腸菌E. coli Ｙ１０９０（１５
０mmプレート当たり１０5pfu）をＮＺＹＭプレート（Gi
bco)上に植え付け（１６）、４２℃で２４時間インキュ
ベートした。β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の発現を
誘発するために、プレートにイソプロピルβ−Ｄ−チオ
ガラクトシド（ＩＰＴＧ）−飽和フィルター（Hybond C
extra, Amersham）をかぶせて、３７℃で２時間インキ
ュベートした。ポリクローンウサギ抗３２kDa 抗血清を
用いてスクリーニングを実施した。上記のポリクローン
抗血清ウサギ抗３２kDa 抗血清は、以下のようにＰ32ウ
シ結核菌ＢＣＧ（１１７３Ｐ２株−Institut Pasteur P
aris）に対する抗血清を生じさせることにより得られ
た：生理的食塩水１ml当たり４００μg （ウシ結核菌Ｂ
ＣＧの精製Ｐ32蛋白質）を１容積の不完全フロイントア
ジュバントと混合した。その物質をホモジナイズし、
０、４、７及び８週目に、ウサギの背中の１０部位にわ
たって５０μl の用量で皮内注射した（アジュバントは
最後の注射に関しては、希釈液と置き換えた）。１週間
後、ウサギを採血し、アリコートに分ける前に抗体レベ
ルに関して血清を調べ、−８０℃で保存した。
【０１８１】ポリクローンウサギ抗３２kDa 抗血清を大
腸菌溶解物上で予吸収し（１４）、１：３００の最終希
釈で用いた。１：５，０００に希釈された二次アルカリ
ホスファターゼ抗ウサギＩｇＧ標識（Promega)を用い
て、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質を検出した。発色
させるために、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）
及び燐酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル（Ｂ
ＣＩＰ）を用いた。フィルター上の反応領域は、３０分
以内に濃紫色に変わった。通常、三連続精製工程を実施
して、純粋なクローンを得た。ＩＰＴＧ、ＢＣＩＰ、及
びＮＢＴは、Promega corp. (Madison WI.) から入手し
た。
【０１８２】後述の二次クローンＢＹ１、ＢＹ２及びＢ
Ｙ５を得るためのハイブリッド形成による −プラークス
クリーニング 用いた手法は、Maniatisら（１４）が記載したものであ
った。
【０１８３】λｇｔ１１組換え溶原菌からの粗製溶解物
の調製 大腸菌E. coli Ｙ１０８９のコロニーを、Hyunh ら（１
４）が記載したように適切なλｇｔ１１組換え体で溶原
化した。溶原化E. coli Ｙ１０８９の単一コロニーをＬ
Ｂ培地中に接種し、３０℃で６００nmで０．５の光学密
度に増殖させた。４５℃で２０分のヒートショック後、
ＩＰＴＧを加えて最終濃度を１０mMにすることによっ
て、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の産生を誘発し
た。３７℃で６０分間インキュベーションを継続し、遠
心分離して細胞を素早く集めた。細胞を緩衝液（１０mM
トリスpH８．０、２mMＥＤＴＡ）中に５０倍に濃縮し、
直ちに液体窒素中に凍結した。試料は解氷して溶解し、
ＥｃｏＲＩ制限緩衝液中の１００μg/mlＤＮａｓｅＩ
で、３７℃で５−１０分間処理した。
【０１８４】イムノブロッティング（ウエスタンブロッ
ティング）分析：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動処理後、組
換え溶原菌蛋白質を、Towbinら（２９）が記載したよう
にニトロセルロース膜（Hybond C, Amersham）上にブロ
ッティングした。E. coli Ｙ１０８９のβ−ガラクトシ
ダーゼに融合されたマイコバクテリア抗原の発現は、上
記の段落“抗３２kDa 抗血清によるλｇｔ１１ヒト結核
菌組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニング”に記載
のようにして得られたポリクローンウサギ抗３２kDa 抗
血清（１：１，０００）の結合により、モノクローン抗
−β−ガラクトシダーゼ抗体（Promega)を用いて視覚化
された。１：５，０００に希釈された二次アルカリホス
ファターゼ抗ウサギＩｇＧ標識（Promega)を用いて融合
蛋白質を検出した。
【０１８５】これらの種々の抗体の使用により、β−ガ
ラクトシダーゼ融合蛋白質の検出が可能になる。非融合
−β−ガラクトシダーゼも同一ゲル中に存在し、結核患
者からの血清によって認識されないという事実のため
に、この反応は、ヒト結核菌蛋白質に依っている。
【０１８６】ヒト結核血清による組換え融合蛋白質の選
択的認識を確認するために、ニトロセルロースシートを
これらの血清（１：５０）とともに一晩インキュベート
した（非特異的蛋白質結合部位をブロッキング後）。ヒ
ト結核血清は、以前記載されたように（３１）ドットブ
ロット検定で試験されたウシ結核菌ＢＣＧの精製３２kD
a 抗原に対するそれらの反応性（高いか低いか）に関し
て選択された。ニトロセルロースシート上の反応領域
は、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Dakopatt
s, Copenhagen, Denmark）（１：２００）とともに４時
間インキュベートすることによって明示され、数回洗浄
後、ペルオキシダーゼ及び過酸化水素の存在下でペルオ
キシダーゼ基質（α−クロロナフトール）（Bio-Rad)を
添加することによって発色反応が現れた。
【０１８７】組換えＤＮＡ分析 精製λｇｔ１１クローンにおけるヒト結核菌ＤＮＡ挿入
物の最初の確認は、ＥｃｏＲＩ制限によって行なった。
消化後、切り取られた挿入物をアガロースゲル上で動か
して、サザンハイブリッド形成を施した。プローブは、
ランダムプライミング（１０）によりα32Ｐ−ｄＣＴＰ
で標識化した。その他の制限部位は、ＨｉｎｄIII 、Ｐ
ｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＡｃｃＩ及びＳｐｈＩによる組換え
λｇｔ１１ファージＤＮＡ又はそのサブクローン化Ｅｃ
ｏＲＩ断片の単一及び二重消化によって位置を定めた。
【０１８８】シーケンシング Bluescribe−Ｍ１３（６）における、又はｍｐ１０及び
ｍｐ１１Ｍ１３ベクター（Methods in Enzymology, vo
l,101, 1983, p.20-89, Joachim Messing, NewM13 vect
ors for cloning, Academic Press)における特定の断片
のサブクローニング後、Sangerら（２５）のプライマー
延長ジデオキシ終止法によって配列分析を行なった。配
列分析は、ヒト結核菌ＤＮＡの高ＧＣ含量（６５％）に
より非常に妨げられた。したがって、シーケンシング反
応はいくつかのＤＮＡポリメラーゼ：Ｔ７ＤＮＡポリメ
ラーゼ（“シケナーゼ”ＵＳＢ）、ＤＮＡポリメラーゼ
ＩのKlenow断片（Amersham）を用いて、そしていくつか
の場合にはＡＭＶ逆転写酵素（Super RT, Anglian Biot
echnology Ltd.）を用いて、そして時としてはｄＧＴＰ
の代わりにｄＩＴＰを用いて実施した。配列の不明確な
領域に焦点を合わせるために、オリゴデオキシヌクレオ
チドを合成して、使用した。シーケンシング法は図２に
要約されている。いくつかの不明確な領域における人為
的に生じた可能性があるフレームシフトを突き止めるた
めに、特別なプログラムを用いて、高比率のＧＣを含有
する配列における最も可能性のあるオープンリーディン
グフレームを限定した（３）。人工産物を特にシーケン
シングしがちないくつかの領域が、化学的シーケンシン
グ（１８）によって確証又は修正された。このために、
化学的シーケンシングベクターｐＧＶ４６２（２１）中
で断片をサブクローニングし、前述のように分析した。
選択された約２５０〜３５０bpの制限断片を単離し、Kl
enowポリメラーゼ又はMungマメヌクレアーゼで処理して
ブラントエンドとして、ｐＧＶ４６２のＳｍａＩ又はＨ
ｉｎｃII部位でサブクローニングした。Ｔｔｈ １１１
Ｉ又はＢｓｔＥII（３２）での単一末端標識化、及び化
学的変質法の変法（３３）により、挿入ＤＮＡの両鎖を
シーケンシングした。
【０１８９】核酸及び推定上のアミノ酸配列の常用のコ
ンピューターを用いた分析を、Bellon（２）からのＬＧ
ＢＣプログラムで実施した。Pearson 及びLipman（２
３）からのＦＡＳＴＡプログラムを用いた相同性調査、
並びにNational Biomedical Research Fundation -Wash
ington (NBRF) (NBRF/PIR データバンク）からの蛋白質
同定源（ＰＩＲ）は、１６を公表する（１９８８年３
月）。
【０１９０】結果 − ポリクローン抗３２kDa 抗血清によるλｇｔ１１Ｍ
ヒト結核菌組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ：１．５×１０6 プラークを示すフィルター１０個を
ポリクローンウサギ抗３２kDa 抗血清（８）でプローブ
した。精製後、６つの別々の陽性クローンを得た。
【０１９１】組換えクローンの分析 これら６つの精製λｇｔ１１組換えクローンＤＮＡのＥ
ｃｏＲＩ制限分析（図１Ａ）から、４種類の異なる挿入
物が明示された。クローン１５は、１．８kb、１．５kb
及び０．５kbの３つのＤＮＡ断片を生じる２つの付加的
内部ＥｃｏＲＩ部位を伴う全長３．８kbの挿入物を有し
た。クローン１６のＤＮＡ挿入物は、１．７kb長であっ
た。クローン１７及び１９は、それぞれ２．７kb及び
２．８kbというほぼ同じ長さのＤＮＡ挿入物を有した。
【０１９２】最後に、クローン２３（図示していない）
及びクローン２４はともに、２．３kb及び１．７kbの２
つの断片を生じる１つの別のＥｃｏＲＩ制限部位を伴う
４kbの挿入物を含有した。サザン分析（データは示され
ていない）から、クローン１５、１６、１９のＤＮＡ挿
入物及びクローン２４の小断片（１．７kb）はそれ自体
とハイブリッドを形成するだけであるが、一方クローン
１７（２．７kb）はそれ自体とハイブリッドを形成する
がしかし同等にクローン２４の２．３kbＤＮＡ断片とも
良くハイブリッドを形成することが示された。したがっ
て、クローン１５、１６及び１９は１７、２３、２４群
と全く別で、無関係である。この解釈は、適切なλｇｔ
１１組換え体で溶原化され、ＩＰＴＧで誘発されるE. c
oli Ｙ１０８９の粗製溶解物の分析によって、さらに確
証された。ウエスタンブロット分析（図１Ｂ）は、クロ
ーン１５、１６及び１９を発現する細胞中でポリクロー
ン抗３２kDa 抗血清と反応する、成熟又は不完全な融合
蛋白質を示さなかった。したがって、クローン１５、１
６及び１９は、擬陽性であると考えられて、それ以上調
べなかった。これに対して、クローン２３及び２４で溶
原化される細胞は、３２kDa のうち約１０kDa を含有す
る免疫反応性融合蛋白質を産生した。最後に、クローン
１７は、外来ポリペプチド部分が約２５kDa 長である融
合蛋白質を発現した。クローン２４の２．３kb挿入物、
及びクローン１７の２．７kb断片の制限エンドヌクレア
ーゼ地図（図２）により、２つの挿入物を並べ、且つ配
向することができたが、これは、クローン１７の２．７
ｋｂ断片がクローン２４の２．３kbｂ挿入物を５′方向
に±０．５ｋｂ延長したものに相当することを示唆して
いる。
【０１９３】クローン１７が不完全であったので、同一
λｇｔ１１組換えヒト結核菌ＤＮＡライブラリーを、ク
ローン１７のＤＮＡ挿入物の丁度５′末端に対応する１
２０bpＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ１制限断片（ベクタークロー
ニング系により市販のブルースクリブベクター中に以前
サブクローンされた（Stratageneクローニング系））
（図２）とのハイブリッド形成によってスクリーニング
した。３つの５′−延長クローンＢｙ１、Ｂｙ２及びＢ
ｙ５を単離し、制限によって分析して、並べた。最大挿
入物Ｂｙ５は、３．１kb上流まで及び１．１kb下流まで
並べられた全コード領域（下記参照）に関する情報を含
有した（図２）。
【０１９４】ＤＮＡ配列 種々のλｇｔ１１重複クローンに由来する１３５８塩基
対ヌクレオチド配列を図３及び図４に示す。ＤＮＡ配列
は、１８３番目で開始し、１２４２番目でＴＡＧコドン
によって終止する１０５９塩基対のオープンリーディン
グフレームを含む。３６０番目でＴＴＴコドンによって
開始するヌクレオチド配列からこのオープンリーディン
グフレーム内に位置し得るＮＨ2 −末端アミノ酸配列
（ｐｈｅ−ｓｅｒ−ａｒｇ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｌｅｕ−
ｐｒｏ−ｖａｌ−ｇｌｕ−ｔｙｒ−ｌｅｕ−ｇｌｎ−ｖ
ａｌ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｍｅｔ−ｇｌ
ｙ−ａｒｇ−ａｓｐ−ｉｌｅ−ｌｙｓ−ｖａｌ−ｇｌｎ
−ｐｈｅ−ｇｌｎ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｌａ−
ａｓｎ）が、２０、２１、３１番目のアミノ酸（ＭＰＢ
５９においてはそれぞれｇｌｙ、ｃｙｓ及びａｓｎであ
る（３４））を除いて、ＭＰＢ５９抗原の同一ＮＨ2 末
端アミノ酸配列に対応するということが見いだされる。
したがって、この配列の上流のＤＮＡ領域は、３２kDa
の蛋白質の分泌に必要なシグナルペプチドをコードする
ことが予測される。したがって、成熟蛋白質は、おそら
く、Ｎ−末端Ｐｈｅ（ＴＴＴコドン）からＣ−末端Ａｌ
ａ（ＧＣＣコドン）までの２９５アミノ酸残基から成る
（図７〜９）。
【０１９５】６つのＡＴＧコドンは、同一リーディング
フレームの３６０番目のＴＴＴの前に位置することが判
明した。同一リーディングフレームの任意のこれらのＡ
ＴＧを用いると、２９、４２、４７、４９、５５及び５
９残基のシグナルペプチドの合成が起こる。
【０１９６】水治療法パターン 本発明の３２kDa の蛋白質の、そしてＢＣＧのα抗原
（１７）の水治療法パターンコード配列を、KyteとDool
ittle の方法（１５）によって調べた。ノナペプチドプ
ロフィルを図１０に示す。最初の疎水性シグナルペプチ
ド領域に加えて、いくつかの親水性ドメインが確認され
た。本発明の３２kDa 蛋白質の全親水性パターンがＢＣ
Ｇα抗原のものに匹敵するということに注目するとおも
しろい。両蛋白質に関して、最高の親水性を示すドメイ
ンは、アミノ酸残基２００と２５０の間で確認された。
【０１９７】相同性 Matsuoら（１７）は、近年、ＢＣＧのα抗原をコードす
る遺伝子に対応する１０９５ヌクレオチドクローン化Ｄ
ＮＡの配列を発表した。Infection and Immunity, vol.
58, p.550-556, 1990 で修正されたようなウシ結核菌抗
原αの９７８bpコード領域と、本発明の３２kDa 蛋白質
の１０１７bpコード領域は、９４２整列領域で、７７．
５％の相同性を示す。アミノ酸レベルでは、両先駆体蛋
白質配列は、７５．６％の同一残基を占める。さらに、
１７．６％のアミノ酸が、比較のために用いられる算法
で限定されるような進化的に保存された置換に対応する
（ＰＡＭ２５０マトリックス、２３参照）。図１１〜１
２はシグナルペプチドのＮ末端における配列異同を示
す。両成熟蛋白質のアミノ末端配列−３２アミノ酸−
は、３１番目を除いて同一である。
【０１９８】ヒト血清は組換え３２k Da 蛋白質を認識す
る 図１３は、クローン１７を発現する粗製大腸菌抽出物で
イムノブロッティングした場合の結核患者からの血清試
料が、本発明の３２kDa 蛋白質を含む１４０kDa 融合蛋
白質（レーン４〜６）とは明瞭に反応するが、しかし平
衡抽出物中で発現される非融合β−ガラクトシダーゼ
（レーン１０〜１２）とは反応しないことを示す。本発
明の３２kDa の精製蛋白質と殆ど反応しないとして選択
された２つの陰性対照からの血清試料は、本発明の３２
kDa 蛋白質を含む１４０kDa 融合蛋白質を認識しない
か、あるいは非融合β−ガラクトシダーゼを認識しない
（レーン２，３並びに８及び９）。１４０kDa 融合蛋白
質及び非融合β−ガラクトシダーゼは、抗β−ガラクト
シダーゼモノクローン抗体と反応することが容易に突き
止められた（レーン１〜７）。
【０１９９】本発明は、３２kDa の蛋白質を特にコード
するＤＮＡ領域を調製できた（図７〜９と比較された
い）。上記のＤＮＡ領域は、３３８コドン（停止コドン
は含まれない）のオープンリーディングフレームを含有
する。２２０番目には、成熟蛋白質の最初のアミノ酸を
コードするＴＴＴの次に３２kDa の成熟蛋白質をコード
する２９５トリプレットが来る。このオープンリーディ
ングフレームの大きさ、得られた融合蛋白質の免疫反応
性、シグナルペプチドの存在、そして特に、ＭＰＢ５９
抗原（３１／３２アミノ酸相同性）において、並びにＢ
ＣＧα抗原（３１／３２アミノ酸相同性）において見い
だされるものと非常に相同性が高いＮＨ2−末端領域の
この遺伝子内での確認（図１１〜１２参照）は、記載さ
れたＤＮＡ断片が、ヒト結核菌により分泌される３２kD
a 蛋白質をコードする全シストロンを含み、今日まで不
明確でない方法で確認されたことがないということを、
強く示唆している。
【０２００】６つのＡＴＧコドンは、同一リーディング
フレームの２２０番目でこのＴＴＴに先行することが判
明した。同一オープンリーディングフレームの任意のこ
れらのＡＴＧを用いると、４３、４８、５０、５６又は
６０残基のシグナルペプチドの合成が起こる。これらの
種々の可能性のうち、開始はＡＴＧ91又はＡＴＧ52で起
きると考えられるが、これは、両方とももっともらしい
大腸菌様プロモーター及びShine-Dalgarnoモチーフが先
行するためである。
【０２０１】開始がＡＴＧ91で起きる場合、対応するシ
グナルペプチドは４３残基のかなり長いペプチドシグナ
ルをコードする。しかしながら、この長さは、グラム陽
性細菌からの分泌蛋白質の間では一般的でない（５）。
それは、適当な距離で、一般的大腸菌Shine-Dalgarnoモ
チーフ（ＡＧＧＡＧＧと相同の４／６残基）の後に位置
する。
【０２０２】開始がＡＴＧ52で起きる場合、対応するシ
グナルペプチドは５６残基のペプチドシグナルをコード
するが、しかし余り厳格でないShine-Dalgarnoリボソー
ム結合部位配列を有する。
【０２０３】翻訳終止トリプレットを取り囲む領域は、
シーケンシングゲル上にいわゆる圧縮を生じる二次構造
効果に特に感受性を有した。１１０５番目のＴＡＧ終止
コドンの前方では、２３残基のうち２２がＧ−Ｃ塩基対
であり、うち９つがＧである。
【０２０４】ＡＴＧ130 の上流では、１６ヌクレオチド
で分離されるヘキサヌクレオチド（ＴＴＧＡＧＡ）（Ｔ
ＴＧＡＣＡに対する相同性５／６）及びＡＡＧＡＡＴボ
ックス（ＴＡＴＡＡＴに対する相同性４／６）を含む大
腸菌プロモーターに類似の配列（１１）が観察された。
開始コドンと考えられるＡＴＧ91の上流では、大腸菌
“−３５ヘキサヌクレオチドボックス”と相同のいくつ
かの配列と、その後に続くＴＡＴＡＡＴに似た配列が検
出された。これらのうち、最も示唆に富んでいたものを
図３及び図４に示す。それは、１４ヌクレオチドでＧＡ
ＴＡＡＧ（ＴＡＴＡＡＴに対する相同性４／６）から分
離される５９番目でのＴＴＧＧＣＣ（図３及び図４）
（ＴＴＧＡＣＡに対する相同性４／６）を含む。面白い
ことに、この推論上のプロモーター領域は、ＢＣＧ蛋白
質α−遺伝子（１７）に関して記載されたプロモーター
領域との、あるいは６５kDa 蛋白質遺伝子（２６、２
８）に関して記載されたものとの広範な配列相同性を共
有しない。
【０２０５】ＮＢＲＦデータバンク（公布１６．０）を
調べた場合、本発明の３２kDa 蛋白質と任意のその他の
十分に公知の蛋白質配列との間の任意の有意の相同性は
検出できなかった。特に、３２kDa 蛋白質と、ヒトフィ
ブロネクチン受容体（１）のα及びβサブユニットとの
間に有意の相同は観察されなかった。本発明の３２kDa
蛋白質のＮＨ2 −末端配列は、ＢＣＧ ＭＰＢ５９抗原
（３４）に関して過去に発表されたものに対して−２９
／３２アミノ酸−、そしてＢＣＧα抗原の配列（Matsu
o. １７）に対して−３１／３２アミノ酸−相同性が高
く、さらにその最初の６アミノ酸においては、ウシ結核
菌ＢＣＧの３２kDa 蛋白質（９）と同一であった。しか
しながら、推定上の開始メチオニンは、α抗原の配列
（図１１〜１２と比較）とは異なる付加的２９又は４２
アミノ酸疎水性配列に先行するが、しかし原核生物にお
いて分泌されるポリペプチドのシグナル配列（２２）に
寄与する全特徴を示す。
【０２０６】興味深いことに、本発明の核酸（１−１３
５８）（図３及び図４と比較）とMatsuoのα抗原のＤＮ
Ａとの間の有意の相同性は、それらの推論上のプロモー
ター領域内には存在しない。
【０２０７】実施例II：ヒト結核菌の３２kDa 蛋白質の
全コ ード配列を含む細菌プラスミドの作成 前実施例では、図２において、ヒト結核菌からの３２kD
a 蛋白質遺伝子領域を包含する種々の重複λｇｔ１１単
離物を記載した。いくつかのＤＮＡ断片を、Blue Scrib
e Ｍ１３＋プラスミド（Stratagene）中でこれらのλｇ
ｔ１１ファージからサブクローニングした。これらのプ
ラスミドの中には３２kDa 蛋白質遺伝子の全コード配列
を含むものがないため、この配列を含有するプラスミド
を再構築した。
【０２０８】工程１：ＤＮＡ断片の調製： １）Blue Scribe Ｍ１３＋プラスミド(Stratagene)中で
Ｂｙ５のＨｉｎｄIII断片をサブクローニングして得ら
れたプラスミドＢＳ−Ｂｙ５−８００（図２と比較）
を、ＨｉｎｄIII で消化して８００bpの断片を得て、電
気溶離によって１％アガロースゲルから単離した。 ２）Blue Scribe Ｍ１３＋プラスミド(Stratagene)中で
λｇｔ１１−１７からの２．７kbＥｃｏＲＩ挿入物をサ
ブクローニングして得られたプラスミドＢＳ−４．１
（特許出願の図２を参照）を、ＨｉｎｄIII 及びＳｐｈ
Ｉで消化して１，５００bpの断片を得て、電気溶離によ
って１％アガロースゲルから単離した。 ３）メーカーの指示に従って、Blue Scribe Ｍ１３＋を
ＨｉｎｄIII 及びＳｐｈＩで消化し、子牛腸のアルカリ
ホスファターゼ（分子生物学に関する特殊な品質、Boeh
ringer Mannheim)で処理した。
【０２０９】工程２：連結反応： 連結反応は、次のものを含有した：１２５ngの８００bp
ＨｉｎｄIII 断片（１） １２５ngの１，５００bp ＳｐｈＩ−ＨｉｎｄIII 挿入
物（２） ５０ngのＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ消化ＢＳＭ１３＋ベク
ター（３） ２μl の１０連結反応緩衝液（Maniatisら １９８２） １μl （＝２．５Ｕ）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Amersha
m) ４μl のＰＥＧ６０００、２５％（Ｗ／Ｖ） ８μl のＨ2 Ｏ インキュベーションは、１６℃で４時間であった。
【０２１０】工程３：形質転換 メーカーの指示通りに、１００μl のＤＨ５ａ大腸菌
（Gibco BRL)を１０μlの連結反応液で（工程２）形質
転換し、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌアムビシリンプレート上
に広げた。約７０の白色コロニーが得られた。
【０２１１】工程４：８００bp断片を両配向で挿入し得
た場合、２２９及び２９４bpの小断片の存在を特徴とす
るクローン（クローン１１とは異なる）を選択するため
に、ＰｓｔＩで消化することによっていくつかのクロー
ンからのプラスミドＤＮＡを分析した。この構築物は、
正しい配向でＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ複
合体を含む。この新規の構築物を含有するプラスミド
を、“ＢＳ、ＢＫ、Ｐ38コンプレット”と名づけた。
【０２１２】実施例III ：大腸菌における本発明のポリ
ペプチドの 発現：ポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列、又はその一部は、発現ベクターの一部であるリボソ
ーム結合部位に結合し得るか、あるいは発現ベクター上
にすでに存在する別の蛋白質又はペプチドの情報と融合
し得る。前者の場合、情報はこのように発現され、それ
ゆえ任意の外来配列を欠く（大腸菌によって常に除去さ
れるわけではないアミノ末端メチオニンは除く）。後者
の場合、発現蛋白質はハイブリッド又は融合蛋白質であ
る。
【０２１３】ポリペプチドをコードする遺伝子、及び発
現ベクターを、連結反応を可能にする末端を生じるよう
に、適切な制限酵素で処理するか、又は別のやり方で操
作する。その結果生じる組換えベクターを用いて宿主を
形質転換する。挿入遺伝子の存在及び適正な配向に関し
て、形質転換株を分析する。さらに、選択された宿主の
その他の株を形質転換するために、クローニングベクタ
ーを用いてもよい。組換えベクターを調製し、それらを
宿主細胞に形質転換し、そしてポリペプチド及び蛋白質
を発現するための種々の方法及び材料は、Panayatatos,
N. が "Plasmids, a practical approach" (ed. K.G.
Hardy, IRL Press) pp.163-176, by Oldand Primrose,
principals of gene manipulation (2d Ed, 1981)に記
載しており、そして当業者に十分に公知である。
【０２１４】発現のために種々のクローニングベクター
を用い得る。プラスミドが好ましいけれども、ベクター
はバクテリオファージ又はコスミドであってもよい。選
択されるベクターは、選択される宿主細胞と協調的であ
るべきである。
【０２１５】さらに、プラスミドは、形質転換宿主細胞
を容易に確認し、形質転換されていないものと分離でき
る表現型特性を有するべきである。このような選択遺伝
子は、例えばテトラサイクリン、カルベニシリン、カナ
マイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン
等のような抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子であ
る。
【０２１６】大腸菌における遺伝子のコード配列を発現
するために、発現ベクターは、転写及び翻訳に必要なシ
グナルも含むべきである。
【０２１７】それゆえ、発現ベクターは、大腸菌中で機
能する、合成又は天然のプロモーターを含有すべきであ
る。好ましくは、通常は絶対に必要ではないけれども、
プロモーターは取扱者が制御できるべきである。大腸菌
における発現のために広範に用いられる制御可能プロモ
ーターの例としては、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、並びに
ラムダＰＬ及びＰＲプロモーターがある。
【０２１８】好ましくは、発現ベクターはさらに、大腸
菌中で機能する転写のターミネーターを含有すべきであ
る。用いられる転写のターミネーターの例としては、ｔ
ｒｐ及びｒｒｎＢターミネーターがある。
【０２１９】さらに、発現ベクターは、下流コード配列
の翻訳をそしてそれ故に発現を可能にする、合成又は天
然のリボソーム結合部位を含有すべきである。さらに、
外来配列を欠く発現を所望する場合は、それがその配列
をリボソーム結合部位の開始コドンに直接連結反応させ
るように配置される独特の制限部位が存在すべきであ
る。
【０２２０】この種の発現を実施するのに適したプラス
ミドは、ｐＫＫ２３３−２(Pharmacia）である。このプ
ラスミドは、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃ、Ｚリボソー
ム結合部位、及びｒｒｎＢ転写ターミネーターを含有す
る。
【０２２１】さらに好適であるのは、プラスミドｐＩＧ
Ｉ(Innogenetics, Ghent, Belgium)である。このプラス
ミドは、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びｐＡＴ
153(Bioexcellence, Biores B.V., Woerden, The Nethe
rlandsから市販されている）の複製の起点、ラムダＮ遺
伝子の５′未翻訳領域におけるＭｂｏII部位までのラム
ダＰＬプロモーター（ｐＰＬ（λ）から生じる；Pharma
cia)を含む。
【０２２２】ＰＬプロモーターから下流には、最初のシ
ストロン（Ｖａｌに変換される１番目のＬｅｕを除いて
ＴＮＦの最初の２５アミノ酸である）の停止コドンがSh
ine-Dalgarno配列と二次リボソーム結合部位の開始コド
ンとの間に位置する“２つのシストロン”の翻訳カセッ
トをコードする合成配列を導入した。ｐＩＧＲＩの制限
及び遺伝子地図を図１８に示す。
【０２２３】図１９〜３０及び表５は、それぞれｐＩＧ
ＲＩの核酸配列及び完全制限部位分析を表す。
【０２２４】しかしながら、ハイブリッド蛋白質として
の発現を所望する場合には、発現はさらに、適切な宿主
中でこのベクターによって（おそらく高度に）発現され
るペプチド又はポリペプチドのコード配列を含有すべき
である。
【０２２５】この場合、発現ベクターは、コード配列の
下流の一つ又はそれ以上の制限エンドヌクレアーゼに関
する独特の切断部位を含有すべきである。
【０２２６】このためには、プラスミドｐＥＸ１、２及
び３(Boehringer, Mannheim)、並びにｐＵＥＸ１、２及
び３(Amersham)1 が有用である。
【０２２７】それらは、アムビシリン耐性遺伝子及びｐ
ＢＲ３２２(Bolivarら (1977) Gene2, 95-113) 、その
天然遺伝子ｃｒｏの最初の９アミノ酸に対するコード配
列とともにその５′末端でラムダＰＲプロモーターに融
合するｌａｃＺ遺伝子、並びにβ−ガラクトシダーゼ融
合ポリペプチドの産生を可能にするｌａｃＺコード配列
の３′末端の多クローニング部位を含有する。
【０２２８】ｐＵＥＸベクターはさらに、バクテリオフ
ァージラムダＣ１リプレッサー遺伝子のＣＩ８５７対立
遺伝子を含む。
【０２２９】さらに有用なのはプラスミドｐｍＴＮＦ
ＭＰＨ（Innogenetics) である。それはテトラサイクリ
ン耐性遺伝子、及びｐＡＴ153 (Bioexcellence, Biores
B.V., Woerden, The Netherlands から市販されてい
る）の複製の起点、Ｎ遺伝子の５′末端翻訳領域におけ
るＭｂｏII部位までのラムダＰＬプロモーター（ｐＰＬ
（λ）から生じる；Pharmacia)、その後に合成リボソー
ム結合部位（配列データ参照）、及びｍＴＮＦの最初の
２５ＡＡをコードする情報（Ｖａｌに変換される最初の
Ｌｅｕを除く）を含有する。この配列は、次に６つの連
続したヒスチジンがならび、次いでいくつかの蛋白質分
解部位（それぞれギ酸、ＣＮＢｒ、カリクレイン、及び
大腸菌プロテアーゼVII 感受性部位）が続く。これらは
各々、プラスミドに関して独特の異なる制限酵素（それ
ぞれＳｍａＩ、ＮｃｏＩ、ＢｓｐＭII、及びＳｔｕＩ；
制限及び遺伝子地図 図３１参照）によって容易に得ら
れる。ポリリンカーから下流には、大腸菌ｔｒｐ−ター
ミネーター（合成）及びｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （ｐＫＫ２２
３−３から生じる）を含めていくつかの転写ターミネー
ターが存在する。この全核酸配列を図３２〜４３に示
す。
【０２３０】表６は、ｐｍＴＮＦ ＭＰＨの完全制限部
位分析を示す。
【０２３１】６つの連続したヒスチジンの存在により、
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー
（ＩＭＡＣ）により融合蛋白質が精製できる。
【０２３２】精製後、ハイブリッド蛋白質の外来部分
は、適当な蛋白質切断法により除去され、次いでその切
断物質を、同一のＩＭＡＣベースの精製方法を用いて未
切断分子から分離される。
【０２３３】ラムダＰＬ又はＰＲプロモーターを使用す
る上記の全プラスミドにおいては、宿主の染色体に組み
込まれる欠損プロファージ（Ｋ１２△Ｈ、ＡＴＣＣ第３
３７６７号）上に存在するか、又は二次協調性プラスミ
ド（ｐＡＣＹＣ誘導体）上に存在するラムダｃＩ ｔｓ
８５７対立遺伝子の発現により、プロモーターを温度
制御する。ｐＵＥＸベクターにおいてのみ、このｃＩ対
立遺伝子は、ベクターそれ自体の上に存在する。
【０２３４】上記のプラスミドは例として示したもので
あって、本発明の精神又は範囲を逸脱しない限りにおい
てその他のプラスミド又は発現ベクターを用い得る、と
理解されるべきである。
【０２３５】プラスミドの代わりにバクテリオファージ
又はファージミドを用いる場合は、それは、実質的に、
上記のようなプラスミドを選択するのに用いたものと同
じ特徴を有するべきである。
【０２３６】実施例IV：プラスミドｐＩＧＲＩにおける
Ｐ３２抗原のサブクローニング：ＤＮＡ１μg 当たり少
なくとも３単位の酵素を用いた以外は、メーカーが推奨
する条件に従って、１５μg のプラスミド“ＢＳ−ＢＫ
−Ｐ32コンプレット”（実施例II参照）をＥｃｌXI及び
ＢｓｔＥII(Boehringer, Mannheim)で消化した。Ｅｃｌ
XIは２２６番目で切断し（図７〜９）、ＢｓｔＥIIは１
１３６番目で切断するので、したがって成熟Ｐ32抗原の
開始及び停止コドンは非常に接近する。このＤＮＡは、
以後“Ｐ32抗原断片”をコードするＤＮＡと呼ぶ。
【０２３７】“Ｐ32抗原断片”をコードするＤＮＡ（上
記のように）を、任意の外来配列を欠くポリペプチドの
発現のために、ｐＩＧＲＩ（図１８参照）中でサブクロ
ーニングする。Ｐ32リーディングフレームを有するフレ
ーム内に発現ベクターのＡＴＧコドンを持っていくため
に、ｐＩＧ２中に中間構築物を作成する（制限及び遺伝
子地図に関しては、図４４参照；ＤＮＡ配列、図４５〜
５５参照；完全制限部位分析、表７参照）。
【０２３８】５μg のプラスミドｐＩＧ２をＮｃｏＩで
消化する。その５′粘性末端を、脱燐酸化の前に塞ぐ。
【０２３９】したがって、０．５mMの４つのｄＸＴＰを
全て（Ｘ＝Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）を含有する４０μl のＮＢ
緩衝液（０．０５M トリス−Ｃｌ pH７．４；１０mMＭ
ｇＣｌ2 ；０．０５％β−メルカプトエタノール）、及
び２μl の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片
（５U/μl 、Boehringer, Mannheim) 中で、１５℃で少
なくとも３時間、ＤＮＡをインキュベートした。
【０２４０】ブラント化後、ＤＮＡを２００mMトリス−
Ｃｌ pH８に対して平衡された１容積のフェノールで１
回、少なくとも２容積のジエチルエーテルで２回抽出
し、最後にメーカー推奨の“遺伝子クリーンキットTM”
（Ｂｉｏ１０１）を用いて収集した。次に３０μl のＣ
ＩＰ緩衝液（５０mMトリス−Ｃｌ pH８、１mMＺｎＣＬ
2)、 及び２０〜２５単位の子牛腸ホスファターゼ（高濃
度、Boehringer, Mannheim) 中で、ＤＮＡを５′末端で
脱燐酸化した。その混合液を３７℃で３０分インキュベ
ートし、次にＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−
アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′テトラ酢
酸）pH８を加えて、最終濃度を１０mMとした。次いで、
その混合液を、上記のようにフェノールで、その後ジエ
チルエーテルで抽出し、１／１０容積の３M ＫＡｃ（Ａ
ｃ＝ＣＨ3 ＣＯＯ）pH４．８及び２容積のエタノールを
加えてＤＮＡを沈殿させた後、−２０℃で少なくとも１
時間貯蔵した。
【０２４１】Biofuge Ａ(Hereaus) 中で１３，０００rp
m で５分間遠心分離後、ペレット化ＤＮＡをＨ2 Ｏに溶
解して、最終濃度を０．２μg/μl とした。“Ｐ32抗原
断片”（上記参照）をコードするＥｃｌXI−ＢｓｔＥII
断片を１％アガロースゲル（ＢＲＬ）上で電気泳動処理
してそれを残りのプラスミドから分離し、Millipore Ｈ
ＶＬＰフィルター（φ２cm）を通して遠心分離して（２
分間、１３，０００rpm 、Biofuge 、室温）ゲルから単
離し、上記のようにトリス平衡化フェノールで、次にジ
エチルエーテルで抽出した。
【０２４２】次に、メーカーの推奨する“遺伝子クリー
ンキットTM”（Ｂｉｏ１０１）を用いてＤＮＡを収集し
た。
【０２４３】その後、５′粘性末端を、上記のように大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１のKlenow断片で処理してブラ
ント化し、次いで、７μl のＨ2 Ｏに溶解するために、
“遺伝子クリーンキット7M”を用いてＤＮＡを再び収集
した。
【０２４４】１μl のベクターＤＮＡを、１μl の１０
×リガーゼ緩衝液（０．５M トリスＣｌ pH７．４、１
００mM ＭｇＣｌ2 、５mMＡＴＰ、５０mMＤＴＴ（ジチ
オトレイトール））及び１μl のＴ４ＤＮＡリガーゼ
（１U/μl 、Boehringer, Mannheim) とともに付加す
る。１３℃で６時間、連結反応を実施し、次にその混合
液５μl を用いて、上記のような標準形質転換法、例え
ばMamiatisらが"Molecularcloning, a laboratory manu
al"、Cold Spring Harbor Laboratory (1982)に記載の
方法によって、ＤＨ１株（ラムダ）〔ＤＨ１株−ＡＴＣ
Ｃ 第３３８４９号−野生型バクテリオファージλで溶
原化〕を形質転換する。
【０２４５】個々の形質転換株を増殖させ、標準的手法
（遺伝子融合実験、Cold Spring Harbor Laboratroy (1
984)（編集 T.J. Silhavy, H.L. Berman and L.W. Enq
uist))を用いてプラスミドＤＮＡを調製するために溶解
し、制限酵素分析により、プラスミド内の遺伝子の正し
い配向に関してＤＮＡ調製物をチェックする。
【０２４６】適正なブラント化に関するチェックは、抗
原コード配列の５′及び３′末端でのＮｃｏＩ部位の復
旧を実証することによって実施する。正しい配向でＰ32
抗原断片を含むクローンの一つを、さらに研究するため
に保存し、ｐＩＧ2 −Ｍｔ３２と命名する。この中間構
築物においては、抗原をコードするＤＮＡはＡＴＧコド
ンを有するフレーム内にはない。しかしながら、今日、
ＮｃｏＩ断片として別の発現ベクターに移動できる。
【０２４７】１５μg のｐＩＧ2 −Ｍｔ３２をＮｃｏＩ
で消化する。Ｐ32抗原をコードするＮｃｏＩ断片をゲル
精製し、上記のようにブラント化する。精製後、“遺伝
子クリーンキットTM”を用いてそれを７μl のＨ2 Ｏに
溶解する。
【０２４８】５μg のプラスミドｐＩＧＲＩを上記のよ
うにＮｃｏＩで消化し、ブラント化して、脱燐酸化す
る。フェノールで、次いでジエチルエーテルで抽出し、
エタノールで沈殿させた後、ペレットをＨ2 Ｏに溶解し
て、最終濃度を０．２μg/μlとする。
【０２４９】上記のようにして、ベクター及び“抗原断
片”ＤＮＡの連結反応を行なう。次に、連結反応混合物
をＤＨ１株（ラムダ）中で形質転換させて、制限酵素分
析によってプラスミド内の遺伝子の適正な配向に関して
個々の形質転換体を分析する。適正なブラント化に関す
るチェックは、抗原コード配列の５′及び３′末端での
新規のＮｓｉＩ部位の生成を実証することによって行な
う。正しい配向でＰ32抗原断片を含むクローンの一つ
を、さらに研究するために保存し、ｐＩＧＲＩ．Ｍｔ３
２と命名する。
【０２５０】実施例Ｖ：ｐｍＴＮＦ Ｍ ＰＨにおけるＰ
32抗原の サブクローニング：ＤＮＡ１μg 当たり少なく
とも３単位の酵素を用いた以外は、各メーカーが推奨す
る条件に従って、１５μg のプラスミドｐＩＧ２ Ｍｔ
３２（実施例IV参照）を制限酵素ＮｃｏＩ(Boehringer,
Mannheim)で消化した。
【０２５１】消化後、反応混合物を２００mMトリスＣ１
pH８に対して平衡されたフェノール（１容積）で、そ
の後ジエチルエーテル（２容積）で２回抽出し、１／１
０容積の３M ＫＡｃ（Ａｃ＝ＣＨ3 ＣＯＯ）pH４．８及
び２容積のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた後、
−２０℃で少なくとも１時間貯蔵した。Biofuge Ａ (He
reaus)中で１３，０００rpm で５分間遠心分離後、ＤＮ
Ａを１％アガロースゲル（ＢＲＬ）上で電気泳動処理す
る。
【０２５２】上記のように、“Ｐ32抗原断片”をコード
するＤＮＡを、Millipore ＨＶＬＰフィルター（φ２c
m）を通して遠心分離して（２分間、１３，０００rpm
、Biofuge 、室温）、トリス平衡化フェノールで１
回、次にジエチルエーテルで２回抽出する。次に、“遺
伝子クリーンキットTM”（Ｂｉｏ１０１）を用いてＤＮ
Ａを収集し、７μl のＨ2 Ｏに溶解する。
【０２５３】ＮｃｏＩでの消化によって生じたＤＮＡ断
片の５′突出末端を、０．５mMの４つのｄＸＴＰを全て
（Ｘ＝Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）を含有する４０μl のＮＢ緩衝
液（０．０５M トリス−Ｃ１ pH７．４；１０mMＭｇＣ
ｌ2 ；０．０５％β−メルカプトエタノール）、及び２
μl の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片（５U/
μl 、Boehringer, Mannheim) 中で、１５℃で少なくと
も３時間、ＤＮＡをインキュベートすることによって充
填した。プラント化後、ＤＮＡをフェノールで、次いで
ジエチルエーテルで抽出し、上記の“遺伝子クリーンキ
ットTM”を用いて収集した。
【０２５４】５μg のプラスミドｐｍＴＮＦ ＭＰＨを
ＳｔｕＩで消化し、次いで上記のようにフェノールでそ
の後ジエチルエーテルで抽出して、沈殿させる。制限消
化は、分析用１，２％アガロースゲル上で０．５μg の
試料を電気泳動処理して実証する。
【０２５５】次に、３０μl のＣＩＰ緩衝液（５０mMト
リス−Ｃ１ pH８、１mMＺｎＣｌ2)、 及び２０〜２５単
位の子牛腸ホスファターゼ（高濃度、Boehringer,Mannh
eim)中で自己連結反応を防ぐために、ＤＮＡを５′末端
で脱燐酸化した。その混合液を３７℃で３０分間インキ
ュベートし、次にＥＧＴＡ（エチレングリコールビス
（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′テ
トラ酢酸）pH８を加えて、最終濃度を１０mMとする。そ
の混合液をフェノールで、次いでジエチルエーテルで抽
出して、上記のようにＤＮＡを沈殿させる。沈殿物を、
Biofuge Ａ (Hereaus)中で１３，０００rpm で４℃で１
０分間遠心分離してペレット化し、そのペレットをＨ2
Ｏに溶解して、最終濃度を０．２μg/μl とした。
【０２５６】１μl のこのベクターＤＮＡを、“Ｐ32抗
原断片”（上記）をコードするＤＮＡ断片を含む７μl
溶液と混合し、１μl の１０×リガーゼ緩衝液（０．５
M トリス−Ｃ１ pH７．４、１００mM ＭｇＣｌ2 、５
mMＡＴＰ、５０mMＤＴＴ（ジチオトレイトール））＋１
μl のＴ4 ＤＮＡリガーゼ（１単位／μl 、Boehringe
r, Mannheim) を加える。その混合液を１３℃で６時間
インキュベートし、次に５μl の混合液を用いて、上記
のような標準形質転換法、例えばManiatisらが"Molecul
ar cloning, a laboratory manual"，Cold Spring Harb
or Laboratory (1982)に記載の方法によって、ＤＨ１株
（ラムダ）を形質転換する。
【０２５７】個々の形質転換株を増殖させ、標準的手法
（遺伝子融合による実験、Cold Spring Harbor Laborat
ory （1984）（編集 T.J. Silhavy, M.L. Berman and
L.W.Enquist))を用いてプラスミドＤＮＡを調製するた
めに溶解し、制限酵素分析により、プラスミド内の遺伝
子の正しい配向に関してＤＮＡ調製物をチェックする。
【０２５８】正しい配向で抗原断片をコードするＤＮＡ
配列を含有するクローンの一つをさらに研究するために
保持し、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ−Ｍｔ３２と命名した。そ
れは、アミノ酸配列の＋４位置を起点とするＰ32抗原の
全情報をコードする（図７〜９参照）。全融合蛋白質の
アミノ酸配列を図５６に示す。実施例VI ：ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ−Ｍｔ３２からの抗原発
現の誘導： Ａ−材料と方法
【０２５９】ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ−Ｍｔ３２のＤＮＡ
を、培養の増殖温度を２８℃に、そしてヒートショック
温度を３４℃に下げる以外は標準形質転換手法を用い
て、大腸菌E. coli Ｋ１２△Ｈ株（ＡＴＣＣ３３７６
７）中で形質転換させる。
【０２６０】１０μg/mlテトラサイクリンの存在下で、
激しく振盪しながら２８℃で、Luria ブロス中で一晩増
殖させた、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ−Ｍｔ３２を有するＫ１
２△Ｈの培養を、テトラサイクリン（１０μg/ml）を含
む新鮮なLuria ブロス中に植えつけ、一晩置いた培養の
場合と同じ条件で、６００ナノメーターの光学密度が
０．２となるよう増殖させる。
【０２６１】６００ナノメーターでの光学密度が０．２
に達した時点で、培養の半分を４２℃に移して発現を誘
発し、一方他の半分は対照として２８℃のままにおく。
数回の間隔でアリコートを採取し、これをＭ９塩（０．
１％塩化アンモニウム、０．３％カリウム ジヒドロゲ
ニウムホスフェート、１．５％ニナトリウムヒドロゲニ
ウムホスフェート、１２分子の水）及び１％ＳＤＳに対
して平衡された１容積のフェノールで抽出する。同時
に、培養の光学密度（６００nm）をチェックする。２容
積のアセトンを付加して蛋白質をフェノール相から沈殿
させて、−２０℃で一晩貯蔵する。沈殿物をペレット化
して（Biofuge Ａ、５分、１３，０００rpm 、室温）、
空気乾燥し、光学密度によって１容積のLaemmli （Natu
re (1970)227:680)試料緩衝液（＋βメルカプトエタノ
ール）に溶解して、３分間煮沸する。
【０２６２】次に、試料をLaemmli (1970)に従ってＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル上で処理する。Coomassie Br
illiant Blue（ＣＢＢ）染色、及びイムノブロッティン
グにより、ｍＴＮＦ−Ｈｉｓ6 −Ｐ32の温度誘導を監視
する。ＣＢＢ染色は１／１０希釈ＣＢＢ染色液（９０ml
メタノール：Ｈ2 Ｏ（１：１ｖ／ｖ）及び１０ml氷酢酸
中に溶解した０．５ｇ ＣＢＢ−Ｒ２５０（Serva)）の
１／１０希釈液にゲルを浸漬することによって実施し、
ゆっくり回転する台上に約１時間放置する。脱色液（３
０％メタノール、７％氷酢酸）中で２〜３時間脱色後、
蛋白質バンドが見えるようになるので、それを濃度計
（Ultroscan XL Enhanced Laser Densitometer, LKB)で
走査する。
【０２６３】イムノブロッティングに関しては、蛋白質
を、Townbin ら（1979）が記載したようにHybondＣ膜
（Amersham）上にブロッティングする。ブロッティング
後、膜上の蛋白質をPonceau Ｓ（Serva)で一時的に目で
見えるようにして、分子量マーカーの位置を示す。次に
Ｈ2 Ｏで洗浄して染色を除去する。非特異的蛋白質結合
部位を、ゆっくり回転する台上で約１時間、１０％脱脂
粉乳中でブロットをインキュベートしてブロックする。
ＮＴ緩衝液（２５mMトリス塩酸、pH８．０；１５０mMＮ
ａＣｌ）で２回洗浄後、ブロットを、大腸菌溶解物の存
在下で、実施例Ｉ（“抗３２kDa 抗血清によるλｇｔ１
１ヒト結核菌組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ”）に記載のようにして得られたポリクローンウサギ
抗３２kDa抗血清（１：１，０００）と共に、あるいは
ｍＴＮＦ（Innogenetics, 第１７Ｆ５Ｄ１０号）と交叉
反応するモノクローン抗−ｈＴＮＦ−抗体とともに、回
転台上で少なくとも２時間インキュベートする。ＮＴ緩
衝液＋０．０２％トリトン×１００で２回洗浄後、ブロ
ットを、第一の場合は二次抗血清：アルカリホスファタ
ーゼ−標識ブタ抗ウサギイムノグロブリン（１／５０
０；Prosan）と、第二の場合はアルカリホスファターゼ
−標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（１／５００；
Sigma)）と、少なくとも１時間、インキュベートする。
【０２６４】ブロットを再びＮＴ緩衝液＋０．０２％ト
リトン×１００で２回洗浄し、次にメーカー推奨の条件
を用いて、Promega から購入したニトロブルーテトラゾ
リウム（ＮＢＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−ホスファターゼ（ＢＣＩＰ）で視覚化する。
【０２６５】Ｂ．結果 ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ−Ｍｔ３２を含有するＫ１２△Ｈ細
胞を誘導する場合、明瞭に目に見える約３５kDa のバン
ドが、誘導開始後１時間目にすでにＣＢＢ染色ゲル上に
現れる（図５７）。細胞の総蛋白質含量のほぼ２５％に
相当するこのバンドは、イムノブロット上で抗３２kDa
及び抗ｍＴＮＦ抗血清と強く反応する（図５８）。しか
しながら、このバンドは、抗血清とも特異的に反応する
約３７kDa の小バンドもイムノブロット上に見えるため
に、元の融合蛋白質の切断物質を表す。これは、組換え
ｍＴＮＦ−Ｈｉｓ6 −Ｐ32の広範な切断がそのカルボキ
シ末端から約２〜３kDa で起こることを示唆している。
【０２６６】実施例VII ：固定化金 属イオンアフィニテ
ィークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）における組換え抗
原の精製：ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ−Ｍｔ３２を含有するＫ
１２△Ｈ細胞によって発現されるハイブリッド蛋白質ｍ
ＴＮＦ−Ｈｉｓ6 −Ｐ32（アミノ酸配列、図５６参照）
は、ポリリンカー配列の６連続ヒスチジンが金属イオン
に対して強い親和性をもたらすために（Hochuli ら、19
88）、ＩＭＡＣによる精製を促進するよう特に意図され
る。
【０２６７】ａ．粗細胞抽出物の調製：プラスミドｐｍ
ＴＮＦ−ＭＰＨ−Ｍｔ３２を含有する１２ ｌの大腸菌
細胞Ｋ１２△Ｈを、テトラサイクリン（１０μg/ml) を
含むLuria ブロス中で、２８℃で増殖させて、光学密度
（６００nm）を０．２とし、次いで温度を４２℃に上げ
て誘導した。誘導３時間後、遠心分離（Beckman 、ＪＡ
１０ローター、７，５００rpm 、１０分）によって細胞
を集めた。細胞ペーストを溶解緩衝液（１０mMＫＣｌ、
１０mMトリス塩酸 pH６．８、５mMＥＤＴＡ）に懸濁し
て、細胞最終濃度を５０％（Ｗ／ｖ）とした。
【０２６８】ε−ＮＨ2 −カプロン酸及びジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）を加えて最終濃度をそれぞれ２０mM及
び１mMとして蛋白質分解的変質を防止した。この細胞濃
縮懸濁液を、−７０℃で一晩保存した。
【０２６９】使用圧力８００〜１，０００psi でフレン
チプレス（SLM-Aminco）に３回通して、細胞を溶解し
た。溶解中及び溶解後、細胞を氷上に整然と保持した。
【０２７０】細胞溶解物を遠心分離で純粋にした（Beck
mann, ＪＡ２０、１８，０００rpm、２０分、４℃）。
予備試験により蛋白質が主として膜分画に局在すること
が示されたため、上澄（ＳＮ）を注意深く捨てて、膜及
び封入体を含むペレットをさらに研究するために保持し
た。
【０２７１】１００mM燐酸緩衝液pH７．２に溶解した７
M 塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ、ＩＣＮより市販）
をペレット容量に加えて、最終濃度を６M ＧｕＨＣｌと
した。ペレットを懸濁し、バウンス組織ホモジェナイザ
ー（１０サイクル）で抽出した。
【０２７２】清澄化（Beckmann, ＪＡ２０、１８，００
０rpm 、２０分、４℃）後、約１００mlの上澄を収集し
（＝抽出物１）、取り出したペレットを上記と同様に再
び抽出した（抽出物２、４０ml）。
【０２７３】異なる分画（ＳＮ、ＥＸ１、ＥＸ２）をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemmli, Nature1970; 227:680)上
で、誘導培養の対照試料とともに分析した。ゲルの走査
により、組換え蛋白質は誘導細胞培養の総蛋白質含量の
ほぼ２５％を構成することが明らかにされた。分別後、
蛋白質の殆どが抽出物中に戻っていることが判明した。
還元状態と非還元状態（プラス及びマイナスβ−メルカ
プトエタノール）との間の差異は認められなかった。
【０２７４】ｂ．Ｎｉ ++ＩＤＡ（イ ミノジ酢酸）カラム
の調製：５mlのキレート化ゲル、キレート化セファロー
ス６Ｂ（Pharmacia)を水で広範に洗浄して、それを保存
しているエタノールを除去し、次に“Ｅｃｏｎｏ−カラ
ム”（１×１０cm、Biorad）中に充填した。カラム上部
は流入液（試料、緩衝液等）と連絡し、一方末端は蠕動
性ジャンプを経てＵＶ280 検出器に至る。分画はフラク
ションコレクターで収集し、そして適当な場合には分画
のｐＨは手動で測定する。
【０２７５】カラムはＮｉ++（６mlＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2
Ｏ；５μg/μl)を負荷し、開始緩衝液（６M 塩酸グアニ
ジウム、１００mM燐酸緩衝液、pH７．２）で平衡させ
る。試料を投入後、カラムを開始緩衝液で広範に洗浄し
て、非結合物質を除去する。
【０２７６】結合物質を溶離するために、２つの異なる
溶離操作が実行可能である： １）pHを下げて溶離する、 ２）イミダゾール濃度を上げて溶離する。 両方ともに、本明細書中で考察されている。
【０２７７】カラムを再生するためには、２〜３回操業
後、２０ml（約５カラム容積）の以下の溶液を順次カラ
ムにポンプで送り込む操作を行なわねば成らない： − ０．０５M ＥＤＴＡ−０．５M ＮａＣｌ − ０．１M ＮａＯＨ − Ｈ2 Ｏ − ６ml ＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ（５mg/ml) 開始緩衝液で平衡後、カラムは再び使えるようになって
いる。
【０２７８】ｃ．クロマトグラフィー：クロマトグラフ
ィー中は、全緩衝液が６M 塩酸グアニジウムを含有し
た。カラムを、周囲温度で、０．５ml／分の流速で展開
した。２mlの分画を収集し、適当な場合には、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングを用いてさらに分析
した。ゲルを、Ansorge (1985)が記載したように、Coom
assie Brilliant BlueＲ２５０及び銀染色で染色した。
実施例Ｉに記載したように、イムノブロッティングを実
施した。用いた一次抗血清は、実施例Ｉ（“抗３２kDa
抗血清によるλｇｔ１１ヒト結核菌組換えＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニング”）に記載されたようにして得
られたポリクローン抗３２kDa 抗血清（１／１，００
０）、または抗大腸菌イムノグロブリン（１／５００、
Prosan) 又はｍＴＮＦ（Innogenetics,第１７Ｆ５Ｄ１
０号）と交叉反応するモノクローン抗ｈＴＮＦ抗体であ
った。二次抗血清は、アルカリホスファターゼ標識ブタ
抗ウサギイムノグロブリン（１／５００、Prosan）、又
はアルカリホスファターゼ標識ウサギ抗マウスイムノグ
ロブリン（１／５００、Sigma)であった。
【０２７９】Ｃ１．ｐＨ低減による溶離： 使用溶液： Ａ：６M ＧｕＨＣｌ １００mM燐酸塩pH７．２ Ｂ：６M ＧｕＨＣｌ ２５mM燐酸塩pH７．２ Ｃ：６M ＧｕＨＣｌ ５０mM燐酸塩pH４．２
【０２８０】３mlの抽出物１（ＯＤ280 ＝３２．０）を
適用し、溶液Ａで広範に洗浄後、カラムを溶液Ｂで平衡
させて、次に７．２〜４．２の直線的pHグラジエント
（２５mlの溶液Ｂと２５mlの溶液Ｃをグラジエント生成
器中で混合した）で展開した。溶離プロフィルを図５９
に示す。
【０２８１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Coomassie 及び銀
染色）から、最初は結合していた組換え蛋白質の殆ど
が、pH５．３〜４．７の分画で溶離した。
【０２８２】抗３２kDa 及び１７Ｆ５Ｄ１０モノクロー
ン抗体によるイムノブロット上でのこれらの分画のスク
リーニングから、無傷組換え蛋白質とともに、蛋白質の
何らかの減成物質及び高度の凝集形態も存在したが、し
かしごく少量であったことが示された。抗大腸菌抗体を
用いたブロッティングは、これらの分画（pH５．３〜
４．７）が依然として免疫的に検出可能な汚染大腸菌蛋
白質（７５、６５、４３、３５及び３１kDa バンド）、
及びリポ多糖類を含有することを明らかにした。
【０２８３】Ｃ２．イミダゾール濃度増大による溶離： 使用溶液： Ａ：６M ＧｕＨＣｌ １００mM燐酸塩pH７．２ Ｂ：６M ＧｕＨＣｌ ５０mMイミダゾールpH７．２ Ｃ：６M ＧｕＨＣｌ １００mMイミダゾールpH７．２ Ｄ：６M ＧｕＨＣｌ １５mMイミダゾールpH７．２ Ｅ：６M ＧｕＨＣｌ ２５mMイミダゾールpH７．２ Ｆ：６M ＧｕＨＣｌ ３５mMイミダゾールpH７．２
【０２８４】試料の投入及び洗浄は、Ｃ１の場合と同様
に実施したが、但し、洗浄後、６MＧｕＨＣｌ ２５mM
燐酸塩を用いて平衡させる必要はなかった。カラムを先
ず、０から５０mM（２５mlの溶液Ａと２５mlの溶液Ｂを
グラジエント生成器中で混合した）までのイミダゾール
の直線グラジエントで、その後１００mMイミダゾール
（溶液Ｃ）までの段階溶離で展開した。直線グラジエン
ト中は、蛋白質は広範なスメアで漸次溶離され、一方１
００mMまでの段階は、明瞭なピークを生じた（図６
０）。
【０２８５】分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、直線グ
ラジエントの最初の部分（ｆｒ １〜２４）では大半の
汚染大腸菌蛋白質は洗い流されていたが、一方グラジエ
ントの後半部分（ｆｒ ２５〜５０）及び１００mMピー
クは９０％以上の組換え蛋白質を含有することが明示さ
れた。
【０２８６】Ｃ１の場合と同様に、これらの分画は、無
傷組換え蛋白質の大きなバンドに加えて、減成及び凝集
蛋白質のいくつかの小バンドを示した。しかしながら、
この場合は、２４kDa 以下の領域は蛋白質バンドを殆ど
欠いていたようであり、これは、無傷蛋白質と共溶離す
る減成物質がほとんどないことを示唆する。さらに、３
１kDa バンドは余り強くなく、そしていくつかの分画で
は存在しないことさえあったが、Ｃ１の場合と同様に、
イムノブロッティングによって同一の汚染大腸菌蛋白質
が検出された。
【０２８７】第二段階では、我々は、漸増イミダゾール
濃度の段階グラジエントにより、カラムを展開した。試
料を投入してカラムを洗浄後、２カラム容積（約８ml）
の以下の溶液をカラムに順次入れた：溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、
そして最後に４カラム容積の溶液Ｃ。段階グラジエント
により、スケールアップに適した、さらに濃縮された溶
離プロフィルが得られた（図６１）。
【０２８８】要するに、ｍＴＮＦ−Ｈｉｓ6 −Ｐ32蛋白
質は、ＩＭＡＣによって少なくとも９０％まで精製され
た。さらなる精製は、次の工程を併用して達成される： − キレート化スパロース（Pharmacia)上でのＩＭＡＣ − イオン交換クロマトグラフィー（陰イオン又は陽イ
オン） − 逆相クロマトグラフィー − ゲル濾過クロマトグラフィー − イムノアフィニティークロマトグラフィー − ポリアクリルアミドゲルからの溶離 これらのクロマトグラフィー法は、一般に、蛋白質精製
のために用いられる。図１９〜３０、図３２〜４３、及
び図４５〜５５のプラスミドは新規である。
【０２８９】以下に、図中及び本文中に示したアミノ酸
及び／又はヌクレオチド配列を、配列表として示す。各
配列と図又は本文中の掲載箇所との対応は、次の表のと
おりである：
【０２９０】
【表２３】
【０２９１】
【表２４】
【０２９２】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 CAGCTTGTTG ACAGGGTTCG TGGC 24
【０２９３】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 GGTTCGTGGC GCCGTCACG 19
【０２９４】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 ＣＧＴＣＧＣＧＣＧＣ ＣＴＡＧＴＧＴＣＧＧ
２０
【０２９５】配列番号：４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 CGGCGCCGTC GGTGGCACGG CGA 23
【０２９６】配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 CGTCGGCGCG GCCCTAGTGT CGG 23
【０２９７】配列番号：６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNAハイホ゜セティカル : No アンチセンス： No 配列 TCGCCCGCCC TGTACCTG 18
【０２９８】配列番号：７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 GCGCTGACGC TGGCGATCTA TC 22
【０２９９】配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 CCGCTGTTGA ACGTCGGGAA G 21
【０３００】配列番号：９ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 AAGCCGTCGG ATCTGGGTGG CAAC 24
【０３０１】配列番号：１０ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 ACGGCACTGG GTGCCACGCC CAAC 24
【０３０２】配列番号：１１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 ACGCCCAACA CCGGGCCCGC CGCA 24
【０３０３】配列番号：１２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 ACGGGCACTG GGTGCCACGC CCAAC 25
【０３０４】配列番号：１３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 ACGCCCCAAC ACCGGGCCCG CGCCCCA 27
【０３０５】配列番号：１４ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 GAGTACCTGC AGGTGCCGTC GCCGTCGATG GGCCG 35
【０３０６】配列番号：１５ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 ATCAACACCC CGGCGTTCGA GTGGTAC 27
【０３０７】配列番号：１６ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： Yes 配列 GTACCACTCG AACGCCGGGG TGTTGAT 27
【０３０８】配列番号：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 TGCCAGACTT ACAAGTGGGA 20
【０３０９】配列番号：１８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： Yes 配列 TCCCACTTGT AAGTCTGGCA 20
【０３１０】配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： Ｎｏ 配列 ＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧ ＣＧＡＧＣＴＧＣＣＧ
２０
【０３１１】配列番号：２０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： Yes 配列 CGGCAGCTCG CTGGTCAGGA 20
【０３１２】配列番号：２１ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列 CCTGATCGGC CTGGCGATGG GTGACGC 27
【０３１３】配列番号：２２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： Yes 配列 GCGTCACCCA TCGCCAGGCC GATCAGG 27
【０３１４】配列番号：２３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： No アンチセンス： Yes 配列 GCGCCCCAGT ACTCCCAGCT GTGCGT 26
【０３１５】配列番号：２４ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： No フラグメント型：internal fragment 配列 Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys 5 10 Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala 15 20
【０３１６】配列番号：２５ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： No フラグメント型：internal fragment 配列 Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp 5 10 Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr 15 20
【０３１７】配列番号：２６ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： No フラグメント型：internal fragment 配列 Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro Ala 5 10 Cys Arg Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys 15 20
【０３１８】配列番号：２７ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： No フラグメント型：internal fragment 配列 Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln 5 10 Ala Asn Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser 15 20
【０３１９】配列番号：２８ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： No フラグメント型：internal fragment 配列 Lys Ala Ser Asp Met Trp Gly Pro Lys Glu 5 10 Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu 15 20
【０３２０】配列番号：２９ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： No フラグメント型：internal fragment 配列 Cys Gly Asn Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly 5 10 Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu Glu 15 20
【０３２１】配列番号：３０ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： No フラグメント型：C-terminal fragment 配列 Lys Pro Asp Leu Gln Arg His Trp Val Pro 5 10 Arg Pro Thr Pro Gly Pro Pro Gln Gly Ala 15 20
【０３２２】配列番号：３１ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： No フラグメント型：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ 配列 Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔ
ｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｌａ ５
１０ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃ
ｙｓ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ １５
２０
【０３２３】配列番号：３２ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： No フラグメント型：C-terminal fragment 配列 Pro Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr 5 10 Pro Asn Thr Gly Pro Ala Pro Gln Gly Ala 15 20
【０３２４】配列番号：３３ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： No フラグメント型：N-terminal fragment 配列の特徴 他の情報：ＭＰＢ５９抗原のＮ末端に相同性が高い（３
１／３２） 配列 Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr 5 10 Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg 15 20 Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly 25 30 Ala Asn
【０３２５】配列番号：３４ 配列の長さ：１３５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル： yes アンチセンス： no 配列の特徴 他の情報：X=G 又は GG; Y=C又は CC; Z=C又は G;W=C
又は G、かつＺとは異なる; K=C 又はCG;L=G 又は CC;
a1-b1=AlaArg 又は GlyAlaAla; a2=Arg又はGly; a3-b3-
c3-d3-e3-f3=HisTrpValProArgPro 又はAlaLeuGlyAla; a
4=Pro又は ProAsnThr; a5=Pro又は AlaPro 配列 CGACACATGC CCAGACACTG CGGAAATGCC ACCTTCAGGC CGTCGCGTCG GTCCCGAATT 60 GGCCGTGAAC GACCGCCGGA TAAGGGTTTC GGCGGTGCGC TTGATGCGGG TGGACGCCCA 120 AGTTGTGGTT GACTACACGA GCACTGCCGG GCCCAGCGCC TGCAGTCTGA CCTAATTCAG 180 G ATG CGC CCA AAC ATG CAT GGA TGC GTT GAG ATG AGG ATG AGG GAA GCA 229 MET Arg Pro Asn MET His Gly Cys Val Glu MET Arg MET Arg Glu Ala -59 -55 -50 -45 AGA ATG CAG CTT GTT GAC AGG GTT CGT GGC GCC GTC ACG GGT ATG TCG 277 Arg MET Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly MET Ser -40 -35 -30 CGT CGA CTC GTG GTC GGG GCC GTC XCG CXC YTA GTG TCG GGT CTG GTC 325 Arg Arg Leu Val Val Gly Ala Val a1 b1 Leu Val Ser Gly Leu Val -25 -20 -15 GGC GCC GTC GGT GGC ACG GCG ACC GCG GGG GCA TTT TCC CGG CCG GGC 373 Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly -10 -5 1 TTG CCG GTG GAG TAC CTG CAG GTG CCG TCG CCG TCG ATG GGC CGT GAC 421 Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser MET Gly Arg Asp 6 11 16 21 ATC AAG GTC CAA TTC CAA AGT GGT GGT GCC AAC TCG CCC GCC CTG TAC 469 Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr 26 31 36 CTG CTC GAC GGC CTG CGC GCG CAG GAC GAC TTC AGC GGC TGG GAC ATC 517 Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile 41 46 51 AAC ACC CCG GCG TTC GAG TGG TAC GAC CAG TCG GGC CTG TCG GTG GTC 565 Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val 56 61 66 ATG CCG GTG GGT GGC CAG TCA AGC TTC TAC TCC GAC TGG TAC CAG CCC 613 MET Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro 71 76 81 GCC TGC ZGC AAG GCC GGT TGC CAG ACT TAC AAG TGG GAG ACC TTC CTG 661 Ala Cys a2 Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu 86 91 96 101 ACC AGC GAG CTG CCG GGG TGG CTG CAG GCC AAC AGG CAC GTC AAG CCC 709 Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro 106 111 116 ACC GGA AGC GCC GTC GTC GGT CTT TCG ATG GCT GCT TCT TCG GCG CTG 757 Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser MET Ala Ala Ser Ser Ala Leu 121 126 131 ACG CTG GCG ATC TAT CAC CCC CAG CAG TTC GTC TAC GCG GGA GCG ATG 805 Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala MET 136 141 146 TCG GGC CTG TTG GAC CCC TCC CAG GCG ATG GGT CCC ACC CTG ATC GGC 853 Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala MET Gly Pro Thr Leu Ile Gly 151 156 161 CTG GCG ATG GGT GAC GCT GGC GGC TAC AAG GCC TCC GAC ATG TGG GGC 901 Leu Ala MET Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp MET Trp Gly 166 171 176 181 CCG AAG GAG GAC CCG GCG TGG CAG CGC AAC GAC CCG CTG TTG AAC GTC 949 Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val 186 191 196 GGG AAG CTG ATC GCC AAC AAC ACC CGC GTC TGG GTG TAC TGC GGC AAC 997 Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn 201 206 211 GGC AAG CCG TCG GAT CTG GGT GGC AAC AAC CTG CCG GCC AAG TTC CTC 1045 Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu 216 221 226 GAG GGC TTC GTG CGG ACC AGC AAC ATC AAG TTC CAA GAC GCC TAC AAC 1093 Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn 231 236 241 GCC GGT GGW ZGC CAC AAC GGC GTG TTC GAC TTC CCG GAC AGC GGT ACG 1141 Ala Gly Gly a2 His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr 246 251 256 261 CAC AGC TGG GAG TAC TGG GGC GCG CAG CTC AAC GCT ATG AAG CCC GAC 1189 His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala MET Lys Pro Asp 266 271 276 CTG CAA CGX CAC TGG GTG CCA CGC CCA ACA CCG GGC CCG KCL CAG GGC 1237 Leu Gln Arg a3 b3 c3 d3 e3 f3 Thr a4 Gly Pro a5 Gln Gly 281 286 291 GCC TAGCTCCGAA CAGACACAAC ATCTAGCNNC GGTGACCCTT GTGGNNCANA 1290 Ala TGTTTCCTAA ATCCCGTCCC TAGCTCCCGC NGCNNCCGTG TGGTTAGCTA CCTGACNNCA 1350 TGGGTTT 1357
【０３２６】配列番号：３５ 配列の長さ：２９４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル： yes 配列の特徴 他の情報：a1-b1=AlaArg又はGlyAlaAla; a2=Arg 又はGl
y;a3-b3-c3-d3-e3-f3=HisTrpValProArgPro又はAlaLeuGl
yAla;a4=Pro又は ProAsnThr; a5=Pro又はAlaPro 配列 MET Arg Pro Asn MET His Gly Cys Val Glu MET Arg MET Arg Glu Ala -59 -55 -50 -45 Arg MET Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly MET Ser -40 -35 -30 Arg Arg Leu Val Val Gly Ala Val a1 b1 Leu Val Ser Gly Leu Val -25 -20 -15 Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly -10 -5 1 Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser MET Gly Arg Asp 6 11 16 21 Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr 26 31 36 Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile 41 46 51 Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val 56 61 66 MET Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro 71 76 81 Ala Cys a2 Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu 86 91 96 101 Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro 106 111 116 Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser MET Ala Ala Ser Ser Ala Leu 121 126 131 Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala MET 136 141 146 Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala MET Gly Pro Thr Leu Ile Gly 151 156 161 Leu Ala MET Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp MET Trp Gly 166 171 176 181 Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val 186 191 196 Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn 201 206 211 Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu 216 221 226 Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn 231 236 241 Ala Gly Gly a2 His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr 246 251 256 261 His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala MET Lys Pro Asp 266 271 276 Leu Gln Arg a3 b3 c3 d3 e3 f3 Thr a4 Gly Pro a5 Gln Gly 281 286 291 Ala
【０３２７】配列番号：３６ 配列の長さ：１３５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列の特徴 他の情報：発表された刊行物 著者：Borremans, M De Wit, L Volckaert, G Ooms, J De Bruyn, J Huygen, K Van Vooren, J.P. Stelandre, M Verhofstadt, R Ｃｏｎｔｅｎｔ， Ｊ 題名：Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅ
ｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ａ ３２ ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ
ｏｆ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ 誌名：Infection and Immunity 巻 ：57 号 ：10 頁 ：3123-3130 日付：oct 1989 残基：配列番号３６の１〜１３５７ 配列 CGACACATGC CCAGACACTG CGGAAATGCC ACCTTCAGGC CGTCGCGTCG GTCCCGAATT 60 GGCCGTGAAC GACCGCCGGA TAAGGGTTTC GGCGGTGCGC TTGATGCGGG TGGACGCCCA 120 AGTTGTGGTT GACTACACGA GCACTGCCGG GCCCAGCGCC TGCAGTCTGA CCTAATTCAG 180 G ATG CGC CCA AAC ATG CAT GGA TGC GTT GAG ATG AGG ATG AGG GAA GCA 229 MET Arg Pro Asn MET His Gly Cys Val Glu MET Arg MET Arg Glu Ala -59 -55 -50 -45 AGA ATG CAG CTT GTT GAC AGG GTT CGT GGC GCC GTC ACG GGT ATG TCG 277 Arg MET Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly MET Ser -40 -35 -30 CGT CGA CTC GTG GTC GGG GCC GTC GCG CGC CTA GTG TCG GGT CTG GTC 325 Arg Arg Leu Val Val Gly Ala Val Ala Arg Leu Val Ser Gly Leu Val -25 -20 -15 GGC GCC GTC GGT GGC ACG GCG ACC GCG GGG GCA TTT TCC CGG CCG GGC 373 Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly -10 -5 1 TTG CCG GTG GAG TAC CTG CAG GTG CCG TCG CCG TCG ATG GGC CGT GAC 421 Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser MET Gly Arg Asp 6 11 16 21 ATC AAG GTC CAA TTC CAA AGT GGT GGT GCC AAC TCG CCC GCC CTG TAC 469 Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr 26 31 36 CTG CTC GAC GGC CTG CGC GCG CAG GAC GAC TTC AGC GGC TGG GAC ATC 517 Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile 41 46 51 AAC ACC CCG GCG TTC GAG TGG TAC GAC CAG TCG GGC CTG TCG GTG GTC 565 Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val 56 61 66 ATG CCG GTG GGT GGC CAG TCA AGC TTC TAC TCC GAC TGG TAC CAG CCC 613 MET Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro 71 76 81 GCC TGC CGC AAG GCC GGT TGC CAG ACT TAC AAG TGG GAG ACC TTC CTG 661 Ala Cys Arg Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu 86 91 96 101 ACC AGC GAG CTG CCG GGG TGG CTG CAG GCC AAC AGG CAC GTC AAG CCC 709 Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro 106 111 116 ACC GGA AGC GCC GTC GTC GGT CTT TCG ATG GCT GCT TCT TCG GCG CTG 757 Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser MET Ala Ala Ser Ser Ala Leu 121 126 131 ACG CTG GCG ATC TAT CAC CCC CAG CAG TTC GTC TAC GCG GGA GCG ATG 805 Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala MET 136 141 146 TCG GGC CTG TTG GAC CCC TCC CAG GCG ATG GGT CCC ACC CTG ATC GGC 853 Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala MET Gly Pro Thr Leu Ile Gly 151 156 161 CTG GCG ATG GGT GAC GCT GGC GGC TAC AAG GCC TCC GAC ATG TGG GGC 901 Leu Ala MET Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp MET Trp Gly 166 171 176 181 CCG AAG GAG GAC CCG GCG TGG CAG CGC AAC GAC CCG CTG TTG AAC GTC 949 Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val 186 191 196 GGG AAG CTG ATC GCC AAC AAC ACC CGC GTC TGG GTG TAC TGC GGC AAC 997 Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn 201 206 211 GGC AAG CCG TCG GAT CTG GGT GGC AAC AAC CTG CCG GCC AAG TTC CTC 1045 Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu 216 221 226 GAG GGC TTC GTG CGG ACC AGC AAC ATC AAG TTC CAA GAC GCC TAC AAC 1093 Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn 231 236 241 GCC GGT GGG CGC CAC AAC GGC GTG TTC GAC TTC CCG GAC AGC GGT ACG 1141 Ala Gly Gly Arg His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr 246 251 256 261 CAC AGC TGG GAG TAC TGG GGC GCG CAG CTC AAC GCT ATG AAG CCC GAC 1189 His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala MET Lys Pro Asp 266 271 276 CTG CAA CGG CAC TGG GTG CCA CGC CCA ACA CCG GGC CCG CCG CAG GGC 1237 Leu Gln Arg His Trp Val Pro Arg Pro Thr Pro Gly Pro Pro Gln Gly 281 286 291 GCC TAGCTCCGAA CAGACACAAC ATCTAGCNNC GGTGACCCTT GTGGNNCANA 1290 Ala TGTTTCCTAA ATCCCGTCCC TAGCTCCCGC NGCNNCCGTG TGGTTAGCTA CCTGACNNCA 1350 TGGGTTT 1357
【０３２８】配列番号：３７ 配列の長さ：２９４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル： No 配列 MET Arg Pro Asn MET His Gly Cys Val Glu MET Arg MET Arg Glu Ala -59 -55 -50 -45 Arg MET Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly MET Ser -40 -35 -30 Arg Arg Leu Val Val Gly Ala Val Ala Arg Leu Val Ser Gly Leu Val -25 -20 -15 Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly -10 -5 1 Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser MET Gly Arg Asp 6 11 16 21 Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr 26 31 36 Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile 41 46 51 Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val 56 61 66 MET Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro 71 76 81 Ala Cys Arg Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu 86 91 96 101 Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro 106 111 116 Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser MET Ala Ala Ser Ser Ala Leu 121 126 131 Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala MET 136 141 146 Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala MET Gly Pro Thr Leu Ile Gly 151 156 161 Leu Ala MET Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp MET Trp Gly 166 171 176 181 Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val 186 191 196 Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn 201 206 211 Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu 216 221 226 Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn 231 236 241 Ala Gly Gly Arg His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr 246 251 256 261 His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala MET Lys Pro Asp 266 271 276 Leu Gln Arg His Trp Val Pro Arg Pro Thr Pro Gly Pro Pro Gln Gly 281 286 291 Ala
【０３２９】配列番号：３８ 配列の長さ：１２９９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ ハイポセティカル： No アンチセンス： No 起源 生物名： Mycobacterium tuberculosis 株名： Erdman 配列の特徴 特徴を表す記号：presumptive Shine Delgarno motif 存在位置：79-85 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：発表された刊行物 著者：De Wit, L De La Cuvellerie, A Ooms, J Content, J 題名：Nucleotide sequence of the 32 kDa protein ge
ne(antigen 85A) of Mycobacterium bovis BCG 誌名：Nucleic Acid Research 巻 ：8 号 ：13 頁 ：3995 日付：1990 残基：配列番号３８の１〜１２９９ 配列 ACTGCCGGGC CCAGCGCCTG CAGTCTGACC TAATTCAGGA TGCGCCCAAA CATGCATGGA 60 TGCGTTGAGA TGAGGATGAG GGAAGCAAGA ATG CAG CTT GTT GAC AGG GTT CGT 114 MET Gln Leu Val Asp Arg Val Arg -43 -40 GGC GCC GTC ACG GGT ATG TCG CGT CGA CTC GTG GTC GGG GCC GTC GGC 162 Gly Ala Val Thr Gly MET Ser Arg Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly -35 -30 -25 -20 GCG GCC CTA GTG TCG GGT CTG GTC GGC GCC GTC GGT GGC ACG GCG ACC 210 Ala Ala Leu Val Ser Gly Leu Val Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr -15 -10 -5 GCG GGG GCA TTT TCC CGG CCG GGC TTG CCG GTG GAG TAC CTG CAG GTG 258 Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val 1 6 11 CCG TCG CCG TCG ATG GGC CGT GAC ATC AAG GTC CAA TTC CAA AGT GGT 306 Pro Ser Pro Ser MET Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly 16 21 26 GGT GCC AAC TCG CCC GCC CTG TAC CTG CTC GAC GGC CTG CGC GCG CAG 354 Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln 31 36 41 GAC GAC TTC AGC GGC TGG GAC ATC AAC ACC CCG GCG TTC GAG TGG TAC 402 Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr 46 51 56 61 GAC CAG TCG GGC CTG TCG GTG GTC ATG CCG GTG GGT GGC CAG TCA AGC 450 Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val MET Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser 66 71 76 TTC TAC TCC GAC TGG TAC CAG CCC GCC TGC GGC AAG GCC GGT TGC CAG 498 Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln 81 86 91 ACT TAC AAG TGG GAG ACC TTC CTG ACC AGC GAG CTG CCG GGG TGG CTG 546 Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu 96 101 106 CAG GCC AAC AGG CAC GTC AAG CCC ACC GGA AGC GCC GTC GTC GGT CTT 594 Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu 111 116 121 TCG ATG GCT GCT TCT TCG GCG CTG ACG CTG GCG ATC TAT CAC CCC CAG 642 Ser MET Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln 126 131 136 141 CAG TTC GTC TAC GCG GGA GCG ATG TCG GGC CTG TTG GAC CCC TCC CAG 690 Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala MET Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln 146 151 156 GCG ATG GGT CCC ACC CTG ATC GGC CTG GCG ATG GGT GAC GCT GGC GGC 738 Ala MET Gly Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala MET Gly Asp Ala Gly Gly 161 166 171 TAC AAG GCC TCC GAC ATG TGG GGC CCG AAG GAG GAC CCG GCG TGG CAG 786 Tyr Lys Ala Ser Asp MET Trp Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln 176 181 186 CGC AAC GAC CCG CTG TTG AAC GTC GGG AAG CTG ATC GCC AAC AAC ACC 834 Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr 191 196 201 CGC GTC TGG GTG TAC TGC GGC AAC GGC AAG CCG TCG GAT CTG GGT GGC 882 Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly 206 211 216 221 AAC AAC CTG CCG GCC AAG TTC CTC GAG GGC TTC GTG CGG ACC AGC AAC 930 Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn 226 231 236 ATC AAG TTC CAA GAC GCC TAC AAC GCC GGT GGC GGC CAC AAC GGC GTG 978 Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val 241 246 251 TTC GAC TTC CCG GAC AGC GGT ACG CAC AGC TGG GAG TAC TGG GGC GCG 1026 Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala 256 261 266 CAG CTC AAC GCT ATG AAG CCC GAC CTG CAA CGG GCA CTG GGT GCC ACG 1074 Gln Leu Asn Ala MET Lys Pro Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr 271 276 281 CCC AAC ACC GGG CCC GCG CCC CAG GGC GCC TAGCTCCGAA CAGACACAAC 1124 Pro Asn Thr Gly Pro Ala Pro Gln Gly Ala 286 291 ATCTAGCGGC GGTGACCCTT GTGGTCGCCG CCGTAGATGT TTCCTAAATC CCGTCCCTAG 1184 CTCCCGCCGC GGGCCGTGTG GTTAGCTACC TGACGGGCTA GGGGTTGGCC GGGGCGGTTG 1244 ACGCCGGGTG CACACAGCCT ACACGAACGG AAGGTGGACA CATGAAGGGT CGGTC 1299
【０３３０】配列番号：３９ 配列の長さ：２９５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル： No 配列の特徴 特徴を表す記号：presumtive signal sequence 存在位置：-43 to -1 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 MET Gln Leu Val Asp Arg Val Arg -43 -40 Gly Ala Val Thr Gly MET Ser Arg Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly -35 -30 -25 -20 Ala Ala Leu Val Ser Gly Leu Val Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr -15 -10 -5 Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val 1 6 11 Pro Ser Pro Ser MET Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly 16 21 26 Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln 31 36 41 Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr 46 51 56 61 Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val MET Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser 66 71 76 Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln 81 86 91 Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu 96 101 106 Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu 111 116 121 Ser MET Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln 126 131 136 141 Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala MET Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln 146 151 156 Ala MET Gly Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala MET Gly Asp Ala Gly Gly 161 166 171 Tyr Lys Ala Ser Asp MET Trp Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln 176 181 186 Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr 191 196 201 Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly 206 211 216 221 Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn 226 231 236 Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val 241 246 251 Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala 256 261 266 Gln Leu Asn Ala MET Lys Pro Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr 271 276 281 Pro Asn Thr Gly Pro Ala Pro Gln Gly Ala 286 291
【０３３１】配列番号：４０ 配列の長さ：３４２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸（plasmid vector） ハイポセティカル： no 配列 TTCCGGGGAT CTCTCACCTA CCAAACAATG CCCCCCTGCA AAAAATAAAT TCATATAAAA 60 AACATACAGA TAACCATCTG CGGTGATAAA TTATCTCTGG CGGTGTTGAC ATAAATACCA 120 CTGGCGGTGA TACTGAGCAC ATCAGCAGGA CGCACTGACC ACCATGAAGG TGACGCTCTT 180 AAAAATTAAG CCCTGAAGAA GGGCAGGGGT ACCAGGAGGT TTAAATC ATG GTA AGA 236 MET Val Arg 1 TCA AGT AGT CAA AAT TCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAC GTC GTA GCA 284 Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala 6 11 16 AAC CAC CAA GTG GAG GAG CAG TAACCATGGT TACTGGAGAA GGGGGACCAA 335 Asn His Gln Val Glu Glu Gln 21 26 CTCAGCGCTG AGGTCAATCT GCCCAAGTCT AGAGTCGACC TGCAGCCCAA GCTTGGCTGT 395 TTTGGCGGAT GAGAGAAGAT TTTCAGCCTG ATACAGATTA AATCAGAACG CAGAAGCGGT 455 CTGATAAAAC AGAATTTGCC TGGCGGCAGT AGCGCGGTGG TCCCACCTGA CCCCATGCCG 515 AACTCAGAAG TGAAACGCCG TAGCGCCGAT GGTAGTGTGG GGTCTCCCCA TGCGAGAGTA 575 GGGAACTGCC AGGCATCAAA TAAAACGAAA GGCTCAGTCG AAAGACTGGG CCTTTCGTTT 635 TATCTGTTGT TTGTCGGTGA ACGCTCTCCT GAGTAGGACA AATCCGCCGG GAGCGGATTT 695 GAACGTTGCG AAGCAACGGC CCGGAGGGTG GCGGGCAGGA CGCCCGCCAT AAACTGCCAG 755 GCATCAAATT AAGCAGAAGG CCATCCTGAC GGATGGCCTT TTTGCGTTTC TACAAACTCT 815 TTTGTTTATT TTTCTAAATA CATTCAAATA TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT 875 AAATGCTTCA ATAATAAAAG GATCTAGGTG AAGATCCTTT TTGATAATCT CATGACCAAA 935 ATCCCTTAAC GTGAGTTTTC GTTCCACTGA GCGTCAGACC CCGTAGAAAA GATCAAAGGA 995 TCTTCTTGAG ATCCTTTTTT TCTGCGCGTA ATCTGCTGCT TGCAAACAAA AAAACCACCG 1055 CTACCAGCGG TGGTTTGTTT GCCGGATCAA GAGCTACCAA CTCTTTTTCC GAAGGTAACT 1115 GGCTTCAGCA GAGCGCAGAT ACCAAATACT GTCCTTCTAG TGTAGCCGTA GTTAGGCCAC 1175 CACTTCAAGA ACTCTGTAGC ACCGCCTACA TACCTCGCTC TGCTAATCCT GTTACCAGTG 1235 GCTGCTGCCA GTGGCGATAA GTCGTGTCTT ACCGGGTTGG ACTCAAGACG ATAGTTACCG 1295 GATAAGGCGC AGCGGTCGGG CTGAACGGGG GGTTCGTGCA CACAGCCCAG CTTGGAGCGA 1355 ACGACCTACA CCGAACTGAG ATACCTACAG CGTGAGCATT GAGAAAGCGC CACGCTTCCC 1415 GAAGGGAGAA AGGCGGACAG GTATCCGGTA AGCGGCAGGG TCGGAACAGG AGAGCGCACG 1475 AGGGAGCTTC CAGGGGGAAA CGCCTGGTAT CTTTATAGTC CTGTCGGGTT TCGCCACCTC 1535 TGACTTGAGC GTCGATTTTT GTGATGCTCG TCAGGGGGGC GGAGCCTATG GAAAAACGCC 1595 AGCAACGCGG CCTTTTTACG GTTCCTGGCC TTTTGCTGGC CTTTTGCTCA CATGTTCTTT 1655 CCTGCGTTAT CCCCTGATTC TGTGGATAAC CGTATTACCG CCTTTGAGTG AGCTGATACC 1715 GCTCGCCGCA GCCGAACGAC CGAGCGCAGC GAGTCAGTGA GCGAGGAAGC GGAAGAGCGC 1775 TGACTTCCGC GTTTCCAGAC TTTACGAAAC ACGGAAACCG AAGACCATTC ATGTTGTTGC 1835 TCAGGTCGCA GACGTTTTGC AGCAGCAGTC GCTTCACGTT CGCTCGCGTA TCGGTGATTC 1895 ATTCTGCTAA CCAGTAAGGC AACCCCGCCA GCCTAGCCGG GTCCTCAACG ACAGGAGCAC 1955 GATCATGCGC ACCCGTGGCC AGGACCCAAC GCTGCCCGAG ATGCGCCGCG TGCGGCTGCT 2015 GGAGATGGCG GACGCGATGG ATATGTTCTG CCAAGGGTTG GTTTGCGCAT TCACAGTTCT 2075 CCGCAAGAAT TGATTGGCTC CAATTCTTGG AGTGGTGAAT CCGTTAGCGA GGTGCCGCCG 2135 GCTTCCATTC AGGTCGAGGT GGCCCGGCTC CATGCACCGC GACGCAACGC GGGGAGGCAG 2195 ACAAGGTATA GGGCGGCGCC TACAATCCAT GCCAACCCGT TCCATGTGCT CGCCGAGGCG 2255 GCATAAATCG CCGTGACGAT CAGCGGTCCA GTGATCGAAG TTAGGCTGGT AAGAGCCGCG 2315 AGCGATCCTT GAAGCTGTCC CTGATGGTCG TCATCTACCT GCCTGGACAG CATGGCCTGC 2375 AACGCGGGCA TCCCGATGCC GCCGGAAGCG AGAAGAATCA TAATGGGGAA GGCCATCCAG 2435 CCTCGCGTCG CGAACGCCAG CAAGACGTAG CCCAGCGCGT CGGCCGCCAT GCCGGCGATA 2495 ATGGCCTGCT TCTCGCCGAA ACGTTTGGTG GCGGGACCAG TGACGAAGGC TTGAGCGAGG 2555 GCGTGCAAGA TTCCGAATAC CGCAAGCGAC AGGCCGATCA TCGTCGCGCT CCAGCGAAAG 2615 CGGTCCTCGC CGAAAATGAC CCAGAGCGCT GCCGGCACCT GTCCTACGAG TTGCATGATA 2675 AAGAAGACAG TCATAAGTGC GGCGACGATA GTCATGCCCC GCGCCCACCG GAAGGAGCTG 2735 ACTGGGTTGA AGGCTCTCAA GGGCATCGGT CGACGCTCTC CCTTATGCGA CTCCTGCATT 2795 AGGAAGCAGC CCAGTAGTAG GTTGAGGCCG TTGAGCACCG CCGCCGCAAG GAATGGTGCA 2855 TGCAAGGAGA TGGCGCCCAA CAGTCCCCCG GCCACGGGGC CTGCCACCAT ACCCACGCCG 2915 AAACAAGCGC TCATGAGCCC GAAGTGGCGA GCCCGATCTT CCCCATCGGT GATGTCGGCG 2975 ATATAGGCGC CAGCAACCGC ACCTGTGGCG CCGGTGATGC CGGCCACGAT GCGTCCGGCG 3035 TAGAGGATCC ACAGGACGGG TGTGGTCGCC ATGATCGCGT AGTCGATAGT GGCTCCAAGT 3095 AGCGAAGCGA GCAGGACTGG GCGGCGGCCA AAGCGGTCGG ACAGTGCTCC GAGAACGGGT 3155 GCGCATAGAA ATTGCATCAA CGCATATAGC GCTAGCAGCA CGCCATAGTG ACTGGCGATG 3215 CTGTCGGAAT GGACGATATC CCGCAAGAGG CCCGGCAGTA CCGGCATAAC CAAGCCTATG 3275 CCTACAGCAT CCAGGGTGAC GGTGCCGAGG ATGACGATGA GCGCATTGTT AGATTTCATA 3335 CACGGTGCCT GACTGCGTTA GCAATTTAAC TGTGATAAAC TACCGCATTA AAGCTTATCG 3395 ATGATAAGCT GTCAAACATG AGAATTAA 3423
【０３３２】配列番号：４１ 配列の長さ：３４７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸（plasmid vector） ハイポセティカル： no 配列 AATTCCGGGG ATCTCTCACC TACCAAACAA TGCCCCCCTG CAAAAAATAA ATTCATATAA 60 AAAACATACA GATAACCATC TGCGGTGATA AATTATCTCT GGCGGTGTTG ACATAAATAC 120 CACTGGCGGT GATACTGAGC ACATCAGCAG GACGCACTGA CCACCATGAA GGTGACGCTC 180 TTAAAAATTA AGCCCTGAAG AAGGGCAGGG GTACCAGGAG GTTTAAATC ATG GTA AGA 238 MET Val Arg 1 TCA AGT AGT CAA AAT TCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAC GTC GTA GCA 286 Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala 6 11 16 AAC CAC CAA GTG GAG GAG CAG GGA ATT CAC CAT CAC CAT CAC CAC GTG 334 Asn His Gln Val Glu Glu Gln Gly Ile His His His His His His Val 21 26 31 GAT CCC GGG CCC ATG GCT TTC CGG AGG CCT CTA GAG TCG ACC GGC ATG 382 Asp Pro Gly Pro MET Ala Phe Arg Arg Pro Leu Glu Ser Thr Gly MET 36 41 46 51 CAA GCT TAAGTAAGTA AGCCGCCAGT TCCGCTGGCG GCATTTTTTT TGATGCCCAA 438 Gln Ala GCTTGGCTGT TTTGGCGGAT GAGAGAAGAT TTTCAGCCTG ATACAGATTA AATCAGAACG 498 CAGAAGCGGT CTGATAAAAC AGAATTTGCC TGGCGGCAGT AGCGCGGTGG TCCCACCTGA 558 CCCCATGCCG AACTCAGAAG TGAAACGCCG TAGCGCCGAT GGTAGTGTGG GGTCTCCCCA 618 TGCGAGAGTA GGGAACTGCC AGGCATCAAA TAAAACGAAA GGCTCAGTCG AAAGACTGGG 678 CCTTTCGTTT TATCTGTTGT TTGTCGGTGA ACGCTCTCCT GAGTAGGACA AATCCGCCGG 738 GAGCGGATTT GAACGTTGCG AAGCAACGGC CCGGAGGGTG GCGGGCAGGA CGCCCGCCAT 798 AAACTGCCAG GCATCAAATT AAGCAGAAGG CCATCCTGAC GGATGGCCTT TTTGCGTTTC 858 TACAAACTCT TTTGTTTATT TTTCTAAATA CATTCAAATA TGTATCCGCT CATGAGACAA 918 TAACCCTGAT AAATGCTTCA ATAATAAAAG GATCTAGGTG AAGATCCTTT TTGATAATCT 978 CATGACCAAA ATCCCTTAAC GTGAGTTTTC GTTCCACTGA GCGTCAGACC CCGTAGAAAA 1038 GATCAAAGGA TCTTCTTGAG ATCCTTTTTT TCTGCGCGTA ATCTGCTGCT TGCAAACAAA 1098 AAAACCACCG CTACCAGCGG TGGTTTGTTT GCCGGATCAA GAGCTACCAA CTCTTTTTCC 1158 GAAGGTAACT GGCTTCAGCA GAGCGCAGAT ACCAAATACT GTCCTTCTAG TGTAGCCGTA 1218 GTTAGGCCAC CACTTCAAGA ACTCTGTAGC ACCGCCTACA TACCTCGCTC TGCTAATCCT 1278 GTTACCAGTG GCTGCTGCCA GTGGCGATAA GTCGTGTCTT ACCGGGTTGG ACTCAAGACG 1338 ATAGTTACCG GATAAGGCGC AGCGGTCGGG CTGAACGGGG GGTTCGTGCA CACAGCCCAG 1398 CTTGGAGCGA ACGACCTACA CCGAACTGAG ATACCTACAG CGTGAGCATT GAGAAAGCGC 1458 CACGCTTCCC GAAGGGAGAA AGGCGGACAG GTATCCGGTA AGCGGCAGGG TCGGAACAGG 1518 AGAGCGCACG AGGGAGCTTC CAGGGGGAAA CGCCTGGTAT CTTTATAGTC CTGTCGGGTT 1578 TCGCCACCTC TGACTTGAGC GTCGATTTTT GTGATGCTCG TCAGGGGGGC GGAGCCTATG 1638 GAAAAACGCC AGCAACGCGG CCTTTTTACG GTTCCTGGCC TTTTGCTGGC CTTTTGCTCA 1698 CATGTTCTTT CCTGCGTTAT CCCCTGATTC TGTGGATAAC CGTATTACCG CCTTTGAGTG 1758 AGCTGATACC GCTCGCCGCA GCCGAACGAC CGAGCGCAGC GAGTCAGTGA GCGAGGAAGC 1818 GGAAGAGCGC TGACTTCCGC GTTTCCAGAC TTTACGAAAC ACGGAAACCG AAGACCATTC 1878 ATGTTGTTGC TCAGGTCGCA GACGTTTTGC AGCAGCAGTC GCTTCACGTT CGCTCGCGTA 1938 TCGGTGATTC ATTCTGCTAA CCAGTAAGGC AACCCCGCCA GCCTAGCCGG GTCCTCAACG 1998 ACAGGAGCAC GATCATGCGC ACCCGTGGCC AGGACCCAAC GCTGCCCGAG ATGCGCCGCG 2058 TGCGGCTGCT GGAGATGGCG GACGCGATGG ATATGTTCTG CCAAGGGTTG GTTTGCGCAT 2118 TCACAGTTCT CCGCAAGAAT TGATTGGCTC CAATTCTTGG AGTGGTGAAT CCGTTAGCGA 2178 GGTGCCGCCG GCTTCCATTC AGGTCGAGGT GGCCCGGCTC CATGCACCGC GACGCAACGC 2238 GGGGAGGCAG ACAAGGTATA GGGCGGCGCC TACAATCCAT GCCAACCCGT TCCATGTGCT 2298 CGCCGAGGCG GCATAAATCG CCGTGACGAT CAGCGGTCCA GTGATCGAAG TTAGGCTGGT 2358 AAGAGCCGCG AGCGATCCTT GAAGCTGTCC CTGATGGTCG TCATCTACCT GCCTGGACAG 2418 CATGGCCTGC AACGCGGGCA TCCCGATGCC GCCGGAAGCG AGAAGAATCA TAATGGGGAA 2478 GGCCATCCAG CCTCGCGTCG CGAACGCCAG CAAGACGTAG CCCAGCGCGT CGGCCGCCAT 2538 GCCGGCGATA ATGGCCTGCT TCTCGCCGAA ACGTTTGGTG GCGGGACCAG TGACGAAGGC 2598 TTGAGCGAGG GCGTGCAAGA TTCCGAATAC CGCAAGCGAC AGGCCGATCA TCGTCGCGCT 2658 CCAGCGAAAG CGGTCCTCGC CGAAAATGAC CCAGAGCGCT GCCGGCACCT GTCCTACGAG 2718 TTGCATGATA AAGAAGACAG TCATAAGTGC GGCGACGATA GTCATGCCCC GCGCCCACCG 2778 GAAGGAGCTG ACTGGGTTGA AGGCTCTCAA GGGCATCGGT CGACGCTCTC CCTTATGCGA 2838 CTCCTGCATT AGGAAGCAGC CCAGTAGTAG GTTGAGGCCG TTGAGCACCG CCGCCGCAAG 2898 GAATGGTGCA TGCAAGGAGA TGGCGCCCAA CAGTCCCCCG GCCACGGGGC CTGCCACCAT 2958 ACCCACGCCG AAACAAGCGC TCATGAGCCC GAAGTGGCGA GCCCGATCTT CCCCATCGGT 3018 GATGTCGGCG ATATAGGCGC CAGCAACCGC ACCTGTGGCG CCGGTGATGC CGGCCACGAT 3078 GCGTCCGGCG TAGAGGATCC ACAGGACGGG TGTGGTCGCC ATGATCGCGT AGTCGATAGT 3138 GGCTCCAAGT AGCGAAGCGA GCAGGACTGG GCGGCGGCCA AAGCGGTCGG ACAGTGCTCC 3198 GAGAACGGGT GCGCATAGAA ATTGCATCAA CGCATATAGC GCTAGCAGCA CGCCATAGTG 3258 ACTGGCGATG CTGTCGGAAT GGACGATATC CCGCAAGAGG CCCGGCAGTA CCGGCATAAC 3318 CAAGCCTATG CCTACAGCAT CCAGGGTGAC GGTGCCGAGG ATGACGATGA GCGCATTGTT 3378 AGATTTCATA CACGGTGCCT GACTGCGTTA GCAATTTAAC TGTGATAAAC TACCGCATTA 3438 AAGCTTATCG ATGATAAGCT GTCAAACATG AGAATT 3474
【０３３３】配列番号：４２ 配列の長さ：３３０１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸（plasmid vector） ハイポセティカル： no 配列 TTCCGGGGAT CTCTCACCTA CCAAACAATG CCCCCCTGCA AAAAATAAAT TCATATAAAA 60 AACATACAGA TAACCATCTG CGGTGATAAA TTATCTCTGG CGGTGTTGAC ATAAATACCA 120 CTGGCGGTGA TACTGAGCAC ATCAGCAGGA CGCACTGACC ACCATGAAGG TGACGCTCTT 180 AAAAATTAAG CCCTGAAGAA GGGCAGGGGT ACCAGGAGGT TTAAATATTC CATGGGGGGG 240 ATCCTCTAGA GTCGACCTGC AGCCCAAGCT TGGCTGTTTT GGCGGATGAG AGAAGATTTT 300 CAGCCTGATA CAGATTAAAT CAGAACGCAG AAGCGGTCTG ATAAAACAGA ATTTGCCTGG 360 CGGCAGTAGC GCGGTGGTCC CACCTGACCC CATGCCGAAC TCAGAAGTGA AACGCCGTAG 420 CGCCGATGGT AGTGTGGGGT CTCCCCATGC GAGAGTAGGG AACTGCCAGG CATCAAATAA 480 AACGAAAGGC TCAGTCGAAA GACTGGGCCT TTCGTTTTAT CTGTTGTTTG TCGGTGAACG 540 CTCTCCTGAG TAGGACAAAT CCGCCGGGAG CGGATTTGAA CGTTGCGAAG CAACGGCCCG 600 GAGGGTGGCG GGCAGGACGC CCGCCATAAA CTGCCAGGCA TCAAATTAAG CAGAAGGCCA 660 TCCTGACGGA TGGCCTTTTT GCGTTTCTAC AAACTCTTTT GTTTATTTTT CTAAATACAT 720 TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATAAAAGGAT 780 CTAGGTGAAG ATCCTTTTTG ATAATCTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG AGTTTTCGTT 840 CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC CTTTTTTTCT 900 GCGCGTAATC TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG TTTGTTTGCC 960 GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG CGCAGATACC 1020 AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT CTGTAGCACC 1080 GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG GCGATAAGTC 1140 GTGTCTTACC GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG 1200 AACGGGGGGT TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG AACTGAGATA 1260 CCTACAGCGT GAGCATTGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG CGGACAGGTA 1320 TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG GAGCTTCCAG GGGGAAACGC 1380 CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG CCACCTCTGA CTTGAGCGTC GATTTTTGTG 1440 ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT TTTTACGGTT 1500 CCTGGCCTTT TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GTTCTTTCCT GCGTTATCCC CTGATTCTGT 1560 GGATAACCGT ATTACCGCCT TTGAGTGAGC TGATACCGCT CGCCGCAGCC GAACGACCGA 1620 GCGCAGCGAG TCAGTGAGCG AGGAAGCGGA AGAGCGCTGA CTTCCGCGTT TCCAGACTTT 1680 ACGAAACACG GAAACCGAAG ACCATTCATG TTGTTGCTCA GGTCGCAGAC GTTTTGCAGC 1740 AGCAGTCGCT TCACGTTCGC TCGCGTATCG GTGATTCATT CTGCTAACCA GTAAGGCAAC 1800 CCCGCCAGCC TAGCCGGGTC CTCAACGACA GGAGCACGAT CATGCGCACC CGTGGCCAGG 1860 ACCCAACGCT GCCCGAGATG CGCCGCGTGC GGCTGCTGGA GATGGCGGAC GCGATGGATA 1920 TGTTCTGCCA AGGGTTGGTT TGCGCATTCA CAGTTCTCCG CAAGAATTGA TTGGCTCCAA 1980 TTCTTGGAGT GGTGAATCCG TTAGCGAGGT GCCGCCGGCT TCCATTCAGG TCGAGGTGGC 2040 CCGGCTCCAT GCACCGCGAC GCAACGCGGG GAGGCAGACA AGGTATAGGG CGGCGCCTAC 2100 AATCCATGCC AACCCGTTCC ATGTGCTCGC CGAGGCGGCA TAAATCGCCG TGACGATCAG 2160 CGGTCCAGTG ATCGAAGTTA GGCTGGTAAG AGCCGCGAGC GATCCTTGAA GCTGTCCCTG 2220 ATGGTCGTCA TCTACCTGCC TGGACAGCAT GGCCTGCAAC GCGGGCATCC CGATGCCGCC 2280 GGAAGCGAGA AGAATCATAA TGGGGAAGGC CATCCAGCCT CGCGTCGCGA ACGCCAGCAA 2340 GACGTAGCCC AGCGCGTCGG CCGCCATGCC GGCGATAATG GCCTGCTTCT CGCCGAAACG 2400 TTTGGTGGCG GGACCAGTGA CGAAGGCTTG AGCGAGGGCG TGCAAGATTC CGAATACCGC 2460 AAGCGACAGG CCGATCATCG TCGCGCTCCA GCGAAAGCGG TCCTCGCCGA AAATGACCCA 2520 GAGCGCTGCC GGCACCTGTC CTACGAGTTG CATGATAAAG AAGACAGTCA TAAGTGCGGC 2580 GACGATAGTC ATGCCCCGCG CCCACCGGAA GGAGCTGACT GGGTTGAAGG CTCTCAAGGG 2640 CATCGGTCGA CGCTCTCCCT TATGCGACTC CTGCATTAGG AAGCAGCCCA GTAGTAGGTT 2700 GAGGCCGTTG AGCACCGCCG CCGCAAGGAA TGGTGCATGC AAGGAGATGG CGCCCAACAG 2760 TCCCCCGGCC ACGGGGCCTG CCACCATACC CACGCCGAAA CAAGCGCTCA TGAGCCCGAA 2820 GTGGCGAGCC CGATCTTCCC CATCGGTGAT GTCGGCGATA TAGGCGCCAG CAACCGCACC 2880 TGTGGCGCCG GTGATGCCGG CCACGATGCG TCCGGCGTAG AGGATCCACA GGACGGGTGT 2940 GGTCGCCATG ATCGCGTAGT CGATAGTGGC TCCAAGTAGC GAAGCGAGCA GGACTGGGCG 3000 GCGGCCAAAG CGGTCGGACA GTGCTCCGAG AACGGGTGCG CATAGAAATT GCATCAACGC 3060 ATATAGCGCT AGCAGCACGC CATAGTGACT GGCGATGCTG TCGGAATGGA CGATATCCCG 3120 CAAGAGGCCC GGCAGTACCG GCATAACCAA GCCTATGCCT ACAGCATCCA GGGTGACGGT 3180 GCCGAGGATG ACGATGAGCG CATTGTTAGA TTTCATACAC GGTGCCTGAC TGCGTTAGCA 3240 ATTTAACTGT GATAAACTAC CGCATTAAAG CTTATCGATG ATAAGCTGTC AAACATGAGA 3300 A
【０３３４】配列番号：４３ 配列の長さ：３３８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル： No 配列の特徴 特徴を表す記号：N-terminal sequence of mTNF 存在位置：1-26 特徴を表す記号：sequence corresponding to polylink
er 存在位置：27-44 特徴を表す記号：extra AA created at cloning site 存在位置：45-46 特徴を表す記号：sequence corresponding to P32 anti
gen 存在位置：４７−３３８ 配列 Ｍｅｔ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｓ
ｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ ５
１０ １５ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｖａ
ｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ ２０
２５ ３０ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｈｉｓ ３５
４０ ４５ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｙ
ｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ ５０
５５ ６０ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌ
ｎ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ ６５
７０ ７５ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓ
ｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｐ ８０
８５ ９０ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ ９５
１００ １０５ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｍｅ
ｔ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １１０
１１５ １２０ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｐｒ
ｏ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃｙｓ １２５
１３０ １３５ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｈ
ｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ １４０
１４５ １５０ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｖａ
ｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ １５５
１６０ １６５ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｉｌｅ １７０
１７５ １８０ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｙ
ｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ １８５
１９０ １９５ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌ
ｙ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ ２００
２０５ ２１０ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｙ
ｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ２１５
２２０ ２２５ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ａｒ
ｇ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ ２３０
２３５ ２４０ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ ２４５
２５０ ２５５ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ ２６０
２６５ ２７０ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈ
ｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｐ ２７５
２８０ ２８５ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｈｉ
ｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｒｏ ２９０
２９５ ３００ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌ
ｕ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ ３０５
３１０ ３１５ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒ
ｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ ３２０
３２５ ３３０ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌ
ａ ３３５
【０３３５】
【表２５】
【０３３６】
【表２６】
【０３３７】
【表２７】
【０３３８】
【表２８】
【０３３９】
【表２９】
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）及び（Ｂ）は、６つの精製λｇｔ１１ヒ
ト結核菌組換えクローンの鑑定を示す。（Ａ）は、クロ
ーン１５、クローン１６、クローン１７、クローン１
９、クローン２４、及びＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
消化ラムダＤＮＡ分子量マーカーレーン（キロ塩基対）
（Ｍ）（Boehringer）のＥｃｏＲＩ制限分析に相当す
る。（Ｂ）は、クローン１５、クローン１６、クローン
１７、クローン１９、クローン２３及びクローン２４で
溶原化された大腸菌E. coli の粗製溶解物のイムノブロ
ッティング分析を示す。矢印（←）は、組換えλｇｔ１
１−ヒト結核菌クローンによって生成された融合蛋白質
を示す。発現及びイムノブロッティングは上記と同様で
あった。分子量（kDa で示される）は分子量マーカー
（高分子ＳＤＳキャリブレーションキット、Pharmacia)
との比較により見積もった。
【図２】上記のようにポリクローン抗３２kDa （ＢＣ
Ｇ）抗血清で確認されたλｇｔ１１ヒト結核菌組換えク
ローン１７及び２４のＤＮＡ挿入物の、並びにクローン
１７の１２０bpＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ Ｉ制限断片とのハ
イブリッド形成によって選択されたクローンＢｙ１、Ｂ
ｙ２、及びＢｙ５の制限地図に相当する。ＤＮＡは、メ
ーカー（Promega)の記載通りに、ラムダＳｏｒｂファー
ジ免疫吸着剤を用いて、λｇｔ１１ファージストックか
ら単離した。制限部位は上記のように位置した。いくつ
かの制限部位（* ）はヌクレオチド配列のコンピュータ
ー分析から推論した。短い垂直線（ｌ−ｌ）は組換えク
ローンのＤＮＡ挿入物を取り囲むＥｃｏＲＩ部位由来リ
ンカーを表す。その下の部分はシーケンシングされた分
子量３２kDaの抗原を含むＤＮＡ領域を拡大したもので
ある。矢印はジデオキシシーケンシングの計画及び方向
を示す。（→）Blue scribe Ｍ１３中にサブクローンさ
れる断片；（←→）ｍｐ１０及びｍｐ１１ Ｍ１３ベク
ター中にサブクローンされる断片；（■→）合成オリゴ
ヌクレオチドを用いて確定される配列。
【図３】本発明の抗原の一般式のヌクレオチド及びアミ
ノ酸配列を示す。
【図４】図３の続きであり、本発明の抗原の一般式のヌ
クレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図５】本発明の抗原の一つのヌクレオチド及びアミノ
酸配列を示す。大腸菌E. coli 共働プロモーター配列に
類似した２つの配列群は矩形で囲まれていて、共働に対
する相同はイタリック体の太字で示される。肉太ローマ
字は推定上のShine-Dalgarnoモチーフを表す。二重線の
アンダーラインを施された成熟蛋白質のＮＨ2 末端アミ
ノ酸配列は、ＭＰＢ５９抗原のもの（３４）と非常に相
同−２９／３２アミノ酸−である。２７３番目のＡＴＧ
の上流の５つの別のＡＴＧコドンが示されている（点線
アンダーライン）。垂直矢印（↓）はクローン１７及び
クローン２４の推定ＮＨ2 末端を示す。ここで任意にな
されたオプションは、ＡＴＧ183 に対応する５９アミノ
酸シグナルペプチドを表す。
【図６】図５の続きであり、本発明の抗原の一つのヌク
レオチド及びアミノ酸配列を示す。大腸菌E. coli 共働
プロモーター配列に類似した２つの配列群は矩形で囲ま
れていて、共働に対する相同はイタリック体の太字で示
される。肉太ローマ字は推定上のShine-Dalgarnoモチー
フを表す。二重線のアンダーラインを施された成熟蛋白
質のＮＨ2 末端アミノ酸配列は、ＭＰＢ５９抗原のもの
（３４）と非常に相同−２９／３２アミノ酸−である。
２７３番目のＡＴＧの上流の５つの別のＡＴＧコドンが
示されている（点線アンダーライン）。垂直矢印（↓）
はクローン１７及びクローン２４の推定ＮＨ2 末端を示
す。ここで任意になされたオプションは、ＡＴＧ183 に
対応する５９アミノ酸シグナルペプチドを表す。
【図７】本発明の３２kDa の抗原のヌクレオチド及びア
ミノ酸配列を示す。二重線のアンダーラインを施された
成熟蛋白質のＮＨ2 末端アミノ酸配列は、ＭＰＢ５９抗
原のもの（３４）と非常に相同−２９／３２アミノ酸−
である。垂直矢印（↓）はクローン１７及びクローン２
４の推定ＮＨ2 末端を示す。
【図８】図７の続きであり、本発明の３２kDa の抗原の
ヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。二重線のアンダ
ーラインを施された成熟蛋白質のＮＨ2 末端アミノ酸配
列は、ＭＰＢ５９抗原のもの（３４）と非常に相同−２
９／３２アミノ酸−である。垂直矢印（↓）はクローン
１７及びクローン２４の推定ＮＨ2 末端を示す。
【図９】図８の続きであり、本発明の３２kDa の抗原の
ヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。二重線のアンダ
ーラインを施された成熟蛋白質のＮＨ2 末端アミノ酸配
列は、ＭＰＢ５９抗原のもの（３４）と非常に相同−２
９／３２アミノ酸−である。垂直矢印（↓）はクローン
１７及びクローン２４の推定ＮＨ2 末端を示す。
【図１０】３２kDa の分子量の本発明の抗原の、及びＢ
ＣＧのα抗原（１７）の水治療法パターンである。
【図１１】本発明の３２kDa の抗原のアミノ酸配列とＢ
ＣＧのα抗原のアミノ酸配列（改変翻訳）との間の相同
性を示す。同一アミノ酸（：）、アミノ酸の進化的に保
存された置換（．）、及び相同性なし（）が示されてい
る。アンダーラインを施された配列（＝）はシグナルペ
プチドを表し、ここで任意に採択されたオプションはＡ
ＴＧ91に対応する４３アミノ酸シグナルペプチドを表
す。配列中のダッシュは最適列を得るために必要な区切
りを示す。
【図１２】図１１の続きであり、本発明の３２kDa の抗
原のアミノ酸配列とＢＣＧのα抗原のアミノ酸配列（改
変翻訳）との間の相同性を示す。同一アミノ酸（：）、
アミノ酸の進化的に保存された置換（．）、及び相同性
なし（）が示されている。アンダーラインを施された配
列（＝）はシグナルペプチドを表し、ここで任意に採択
されたオプションはＡＴＧ91に対応する４３アミノ酸シ
グナルペプチドを表す。配列中のダッシュは最適列を得
るために必要な区切りを示す。
【図１３】本発明の３２kDa の蛋白質がヒト結核血清に
よって選択的に認識されるという事実を説明する。ヒト
結核血清、及び抗β−ガラクトシダーゼモノクローン抗
体によるイムノブロッティングを表す。レーン１〜６：
融合蛋白質（１４０kDa)を発現する大腸菌溶解物；レー
ン７〜１２：未融合β−ガラクトシダーゼ（１１４kD
a)。クローン１７のＤＮＡ挿入物（２．７kb）をｐＵＥ
Ｘ2 中でサブクローニングし、融合蛋白質の発現をBres
son 及びStanley （４）が記載したようにして誘発し
た。レーン１及び７は抗βガラクトシダーゼでプローブ
した：レーン４、５、６、及び１０、１１、１２は、３
２kDa の本発明の精製蛋白質に対して高度に反応する３
種類の異なるヒト結核血清でプローブした；レーン２及
び３並びに８及び９は２つの異なる低反応血清でプロー
ブした。
【図１４】本発明のヒト結核菌の３２kDa 蛋白質遺伝子
の核酸配列（上部ライン）を表しており、これは本発明
の図７〜９の配列、図５及び６の遺伝子の配列（中間ラ
イン）、並びにＢＣＧのα抗原に関する遺伝子の配列
（下部ライン）に対応する。配列中のダッシュは、核酸
配列の最適列を得るのに必要な区切りを示す。酵素的増
幅のプライマー領域を矩形で囲んである（Ｐ１〜Ｐ
６）。特異的プローブ領域を矩形で囲み、それぞれプロ
ーブ領域Ａ、プローブ領域Ｂ、プローブ領域Ｃ、プロー
ブ領域Ｄ、プローブ領域Ｅ及びプローブ領域Ｆと定め
る。１番目のヌクレオチド（図１４〜１７の）が図３の
ヌクレオチド２３４に、そして図７〜９のヌクレオチド
９１に対応するために、ヌクレオチドの番号付けは図３
及び図４、並びに図７〜９の番号付けとは異なってい
る。
【図１５】図１４の続きであり、本発明のヒト結核菌の
３２kDa 蛋白質遺伝子の核酸配列（上部ライン）を表し
ており、これは本発明の図７〜９の配列、図５及び６の
遺伝子の配列（中間ライン）、並びにＢＣＧのα抗原に
関する遺伝子の配列（下部ライン）に対応する。配列中
のダッシュは、核酸配列の最適列を得るのに必要な区切
りを示す。酵素的増幅のプライマー領域を矩形で囲んで
ある（Ｐ１〜Ｐ６）。特異的プローブ領域を矩形で囲
み、それぞれプローブ領域Ａ、プローブ領域Ｂ、プロー
ブ領域Ｃ、プローブ領域Ｄ、プローブ領域Ｅ及びプロー
ブ領域Ｆと定める。１番目のヌクレオチド（図１４〜１
７の）が図３のヌクレオチド２３４に、そして図７〜９
のヌクレオチド９１に対応するために、ヌクレオチドの
番号付けは図３及び図４、並びに図７〜９の番号付けと
は異なっている。
【図１６】図１５の続きであり、本発明のヒト結核菌の
３２kDa 蛋白質遺伝子の核酸配列（上部ライン）を表し
ており、これは本発明の図７〜９の配列、図５及び６の
遺伝子の配列（中間ライン）、並びにＢＣＧのα抗原に
関する遺伝子の配列（下部ライン）に対応する。配列中
のダッシュは、核酸配列の最適列を得るのに必要な区切
りを示す。酵素的増幅のプライマー領域を矩形で囲んで
ある（Ｐ１〜Ｐ６）。特異的プローブ領域を矩形で囲
み、それぞれプローブ領域Ａ、プローブ領域Ｂ、プロー
ブ領域Ｃ、プローブ領域Ｄ、プローブ領域Ｅ及びプロー
ブ領域Ｆと定める。１番目のヌクレオチド（図１４〜１
７の）が図３のヌクレオチド２３４に、そして図７〜９
のヌクレオチド９１に対応するために、ヌクレオチドの
番号付けは図３及び図４、並びに図７〜９の番号付けと
は異なっている。
【図１７】図１６の続きであり、本発明のヒト結核菌の
３２kDa 蛋白質遺伝子の核酸配列（上部ライン）を表し
ており、これは本発明の図７〜９の配列、図５及び６の
遺伝子の配列（中間ライン）、並びにＢＣＧのα抗原に
関する遺伝子の配列（下部ライン）に対応する。配列中
のダッシュは、核酸配列の最適列を得るのに必要な区切
りを示す。酵素的増幅のプライマー領域を矩形で囲んで
ある（Ｐ１〜Ｐ６）。特異的プローブ領域を矩形で囲
み、それぞれプローブ領域Ａ、プローブ領域Ｂ、プロー
ブ領域Ｃ、プローブ領域Ｄ、プローブ領域Ｅ及びプロー
ブ領域Ｆと定める。１番目のヌクレオチド（図１４〜１
７の）が図３のヌクレオチド２３４に、そして図７〜９
のヌクレオチド９１に対応するために、ヌクレオチドの
番号付けは図３及び図４、並びに図７〜９の番号付けと
は異なっている。
【図１８】大腸菌における本発明のＰ32抗原の発現のた
めに実施例IVで用いられるｐＩＧＲＩプラスミドの制限
及び遺伝子地図を示す。この図では、アンダーラインを
施された制限部位が独特である。
【図１９】ｐＩＧＲＩ核酸配列に対応する。この図にお
ける、プラスミドｐＩＧＲＩを構築するために用いられ
る一続きのヌクレオチドの起始を以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmaci
a) ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄIII −Ｓ
ｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Pharmacia) ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図２０】図１９の続きであり、ｐＩＧＲＩ核酸配列に
対応する。この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構
築するために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を
以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmaci
a) ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄIII −Ｓ
ｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ） ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ１５３ （Bioexcellence)のＤｒａＩ−Ｅｃ
ｏＲＩブラント断片、及び複製の起始
【図２１】図２０の続きであり、ｐＩＧＲＩ核酸配列に
対応する。この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構
築するために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を
以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmaci
a) ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄIII −Ｓ
ｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Pharmacia) ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図２２】図２１の続きであり、ｐＩＧＲＩ核酸配列に
対応する。この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構
築するために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を
以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmaci
a) ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄIII −Ｓ
ｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Pharmacia) ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図２３】図２２の続きであり、ｐＩＧＲＩ核酸配列に
対応する。この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構
築するために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を
以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmaci
a) ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄIII −Ｓ
ｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Pharmacia) ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図２４】図２３の続きであり、ｐＩＧＲＩ核酸配列に
対応する。この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構
築するために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を
以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmaci
a) ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄIII −Ｓ
ｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Pharmacia) ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図２５】図２４の続きであり、ｐＩＧＲＩ核酸配列に
対応する。この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構
築するために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を
以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmaci
a) ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄIII −Ｓ
ｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Pharmacia) ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図２６】図２５の続きであり、ｐＩＧＲＩ核酸配列に
対応する。この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構
築するために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を
以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmaci
a) ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄIII −Ｓ
ｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Pharmacia) ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図２７】図２６の続きであり、ｐＩＧＲＩ核酸配列に
対応する。この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構
築するために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を
以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmaci
a) ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄIII −Ｓ
ｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Pharmacia) ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図２８】図２７の続きであり、ｐＩＧＲＩ核酸配列に
対応する。この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構
築するために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を
以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmaci
a) ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄIII −Ｓ
ｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Pharmacia) ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図２９】図２８の続きであり、ｐＩＧＲＩ核酸配列に
対応する。この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構
築するために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を
以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ） ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄＩＩＩ
−ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Pharmaci
a) ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図３０】図２９の続きであり、ｐＩＧＲＩ核酸配列に
対応する。この図における、プラスミドｐＩＧＲＩを構
築するために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を
以下に示す。 位置 ３４２２−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラント
ＭｂｏIIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmaci
a) ２０７−３８４：合成ＤＮＡ配列 ２２８−２３０：第一シストロンの開始コドンＡＴＧ ２３４−３０５：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードするＤＮＡ ３０６−３０８：第一シストロンの停止コドン（ＴＡ
Ａ） ３１１−３１２：第二シストロンの開始コドン（ＡＴ
Ｇ） ３８５−８９０：ｐＫＫ２２３からのＨｉｎｄIII −Ｓ
ｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 （Pharmacia) ８９１−３４２１：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図３１】大腸菌における本発明のＰ32抗原の発現のた
めに実施例Ｖで用いられるｐｍＴＮＦ ＭＰＨプラスミ
ドの制限及び遺伝子地図を示す。
【図３２】ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核酸配列に対応する。こ
の図における、プラスミドｐｍＴＮＦ−ＭＰＨを構築す
るために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下
に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図３３】図３２の続きであり、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核
酸配列に対応する。この図における、プラスミドｐｍＴ
ＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる一続きのヌク
レオチドの起始を以下に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図３４】図３３の続きであり、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核
酸配列に対応する。この図における、プラスミドｐｍＴ
ＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる一続きのヌク
レオチドの起始を以下に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図３５】図３４の続きであり、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核
酸配列に対応する。この図における、プラスミドｐｍＴ
ＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる一続きのヌク
レオチドの起始を以下に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図３６】図３５の続きであり、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核
酸配列に対応する。この図における、プラスミドｐｍＴ
ＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる一続きのヌク
レオチドの起始を以下に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図３７】図３６の続きであり、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核
酸配列に対応する。この図における、プラスミドｐｍＴ
ＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる一続きのヌク
レオチドの起始を以下に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図３８】図３７の続きであり、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核
酸配列に対応する。この図における、プラスミドｐｍＴ
ＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる一続きのヌク
レオチドの起始を以下に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図３９】図３８の続きであり、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核
酸配列に対応する。この図における、プラスミドｐｍＴ
ＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる一続きのヌク
レオチドの起始を以下に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図４０】図３９の続きであり、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核
酸配列に対応する。この図における、プラスミドｐｍＴ
ＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる一続きのヌク
レオチドの起始を以下に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図４１】図４０の続きであり、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核
酸配列に対応する。この図における、プラスミドｐｍＴ
ＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる一続きのヌク
レオチドの起始を以下に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図４２】図４１の続きであり、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核
酸配列に対応する。この図における、プラスミドｐｍＴ
ＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる一続きのヌク
レオチドの起始を以下に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図４３】図４２の続きであり、ｐｍＴＮＦ−ＭＰＨ核
酸配列に対応する。この図における、プラスミドｐｍＴ
ＮＦ−ＭＰＨを構築するために用いられる一続きのヌク
レオチドの起始を以下に示す。 位置 １−２０８：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩブラントＭｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０９−４３６：合成ＤＮＡ断片 ２３０−２３２：ｍＴＮＦ融合蛋白質の開始コドン（Ａ
ＴＧ） ２３６−３０７：成熟マウスＴＮＦの２〜２５アミノ酸
をコードする配列 ３０８−３８４：３１５−３３２番目の配列をコードす
るＨｉｓ6 を含有する多クローニング部位 ３５８−４３６：大腸菌ｔｒｐターミネーターを含有す
るＨｉｎｄIII 断片 ４３７−９４３：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ９４４−３４７４：テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
するｐＡＴ153 （Bioexcellence)のＤｒａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉブラント断片、及び複製の起始
【図４４】プラスミドｐＩＧＲＩにおけるＰ32抗原のサ
ブクローニングのために実施例IVに記載されたように、
中間構築物ｐＩＧ２ Ｍｔ３２を作成するために用いら
れるプラスミドｐＩＧ２の制限及び遺伝子地図を示す。
【図４５】ｐＩＧ２核酸配列に対応する。この図におけ
る、プラスミドｐＩＧ２を構築するために用いられる一
続きのヌクレオチドの起始を以下に示す。 位置 ３３００−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩ Ｍｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０７−２６６：ＡＴＧ開始コドンが２３２−２３４番
目にある多クローニング部位及びリボソーム結合部位を
含有する合成配列 ２６７−７７２：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ７７３−３３００：テトラサイクリン耐性遺伝子、及び
ｐＡＴ１５３（Bioexcellence)のＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ
断片を含有する複製の起始
【図４６】図４５の続きであり、ｐＩＧ２核酸配列に対
応する。この図における、プラスミドｐＩＧ２を構築す
るために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下
に示す。 位置 ３３００−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩ Ｍｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０７−２６６：ＡＴＧ開始コドンが２３２−２３４番
目にある多クローニング部位及びリボソーム結合部位を
含有する合成配列 ２６７−７７２：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ７７３−３３００：テトラサイクリン耐性遺伝子、及び
ｐＡＴ１５３（Bioexcellence)のＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ
断片を含有する複製の起始
【図４７】図４６の続きであり、ｐＩＧ２核酸配列に対
応する。この図における、プラスミドｐＩＧ２を構築す
るために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下
に示す。 位置 ３３００−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩ Ｍｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０７−２６６：ＡＴＧ開始コドンが２３２−２３４番
目にある多クローニング部位及びリボソーム結合部位を
含有する合成配列 ２６７−７７２：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ７７３−３３００：テトラサイクリン耐性遺伝子、及び
ｐＡＴ１５３（Bioexcellence)のＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ
断片を含有する複製の起始
【図４８】図４７の続きであり、ｐＩＧ２核酸配列に対
応する。この図における、プラスミドｐＩＧ２を構築す
るために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下
に示す。 位置 ３３００−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩ Ｍｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０７−２６６：ＡＴＧ開始コドンが２３２−２３４番
目にある多クローニング部位及びリボソーム結合部位を
含有する合成配列 ２６７−７７２：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ７７３−３３００：テトラサイクリン耐性遺伝子、及び
ｐＡＴ１５３（Bioexcellence)のＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ
断片を含有する複製の起始
【図４９】図４８の続きであり、ｐＩＧ２核酸配列に対
応する。この図における、プラスミドｐＩＧ２を構築す
るために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下
に示す。 位置 ３３００−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩ Ｍｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０７−２６６：ＡＴＧ開始コドンが２３２−２３４番
目にある多クローニング部位及びリボソーム結合部位を
含有する合成配列 ２６７−７７２：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ７７３−３３００：テトラサイクリン耐性遺伝子、及び
ｐＡＴ１５３（Bioexcellence)のＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ
断片を含有する複製の起始
【図５０】図４９の続きであり、ｐＩＧ２核酸配列に対
応する。この図における、プラスミドｐＩＧ２を構築す
るために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下
に示す。 位置 ３３００−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩ Ｍｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０７−２６６：ＡＴＧ開始コドンが２３２−２３４番
目にある多クローニング部位及びリボソーム結合部位を
含有する合成配列 ２６７−７７２：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ７７３−３３００：テトラサイクリン耐性遺伝子、及び
ｐＡＴ１５３（Bioexcellence)のＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ
断片を含有する複製の起始
【図５１】図５０の続きであり、ｐＩＧ２核酸配列に対
応する。この図における、プラスミドｐＩＧ２を構築す
るために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下
に示す。 位置 ３３００−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩ Ｍｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０７−２６６：ＡＴＧ開始コドンが２３２−２３４番
目にある多クローニング部位及びリボソーム結合部位を
含有する合成配列 ２６７−７７２：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ７７３−３３００：テトラサイクリン耐性遺伝子、及び
ｐＡＴ１５３（Bioexcellence)のＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ
断片を含有する複製の起始
【図５２】図５１の続きであり、ｐＩＧ２核酸配列に対
応する。この図における、プラスミドｐＩＧ２を構築す
るために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下
に示す。 位置 ３３００−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩ Ｍｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０７−２６６：ＡＴＧ開始コドンが２３２−２３４番
目にある多クローニング部位及びリボソーム結合部位を
含有する合成配列 ２６７−７７２：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ７７３−３３００：テトラサイクリン耐性遺伝子、及び
ｐＡＴ１５３（Bioexcellence)のＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ
断片を含有する複製の起始
【図５３】図５２の続きであり、ｐＩＧ２核酸配列に対
応する。この図における、プラスミドｐＩＧ２を構築す
るために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下
に示す。 位置 ３３００−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩ Ｍｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０７−２６６：ＡＴＧ開始コドンが２３２−２３４番
目にある多クローニング部位及びリボソーム結合部位を
含有する合成配列 ２６７−７７２：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ７７３−３３００：テトラサイクリン耐性遺伝子、及び
ｐＡＴ１５３（Bioexcellence)のＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ
断片を含有する複製の起始
【図５４】図５３の続きであり、ｐＩＧ２核酸配列に対
応する。この図における、プラスミドｐＩＧ２を構築す
るために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下
に示す。 位置 ３３００−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩ Ｍｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０７−２６６：ＡＴＧ開始コドンが２３２−２３４番
目にある多クローニング部位及びリボソーム結合部位を
含有する合成配列 ２６７−７７２：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ2 ７７３−３３００：テトラサイクリン耐性遺伝子、及び
ｐＡＴ１５３（Bioexcellence)のＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ
断片を含有する複製の起始
【図５５】図５４の続きであり、ｐＩＧ２核酸配列に対
応する。この図における、プラスミドｐＩＧ２を構築す
るために用いられる一続きのヌクレオチドの起始を以下
に示す。 位置 ３３００−２０６：ｐＰＬ（λ）のＥｃｏＲＩ Ｍｂｏ
IIブラント断片を含有するラムダＰＬ（Pharmacia) ２０７−２６６：ＡＴＧ開始コドンが２３２−２３４番
目にある多クローニング部位及びリボソーム結合部位を
含有する合成配列 ２６７−７７２：ｐＫＫ２２３（Pharmacia)からのＨｉ
ｎｄIII −ＳｓｐＩ断片を含有するｒｒｎＢＴ1 Ｔ２ ７７３−３３００：テトラサイクリン耐性遺伝子、及び
ｐＡＴ１５３（Ｂｉｏｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ）のＥｃｏ
ＲＩ−ＤｒａＩ断片を含有する複製の起始
【図５６】全融合蛋白質ｍＴＮＦ−Ｈｉｓ6 −Ｐ32のア
ミノ酸配列に対応する。この図において： − 実線のアンダーラインを施された配列（ ）はｍ
ＴＮＦ配列（最初の２５アミノ酸）を表し、 − 点線アンダーラインを施された配列（----）はポリ
リンカー配列を表し、 − 二重線アンダーライン配列（＝）はクローニング部
位で作られた余分のアミノ酸を表し、そして − 無印のアミノ酸は図７〜９の４番目のアミノ酸を起
点とする抗原配列である。
【図５７】実施例VIに示されるＫ１２ΔＨにおけるｍＴ
ＮＦ−Ｈｉｓ6 −Ｐ32融合蛋白質の発現に対応し、Coom
assie Brilliant Blue染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。レ
ーンは以下のように対応している： レーン １．蛋白質分子量マーカー ２．pmTNF-MPH-Mt32 ２８℃ １時間導入 ３． 〃 ４２℃ 〃 ４． 〃 ４２℃ ２時間導入 ５． 〃 ４２℃ ３ 〃 ６． 〃 ２８℃ ４ 〃 ７． 〃 ４２℃ ４ 〃 ８． 〃 ２８℃ ５ 〃 ９． 〃 ４２℃ ５ 〃
【図５８】実施例VIに示されるＫ１２ΔＨにおけるｍＴ
ＮＦ−Ｈｉｓ6 −Ｐ32融合蛋白質の発現に対応し、抗３
２kDa 及び抗ｍＴＮＦ−抗体によるゲルのイムノブロッ
トを表す。レーンは以下のように対応している： レーン １．pmTNF-MPH-Mt32 ２８℃ １時間導入 ２． 〃 ４２℃ １ 〃 ３． 〃 ２８℃ ４時間導入 ４． 〃 ４２℃ ４ 〃
【図５９】実施例VII に示されるように、pHの漸減を伴
う組換え抗原のＩＭＡＣ溶離プロフィルを示す。
【図６０】実施例VII に示されるように、イミダゾール
濃度の漸増を伴う組換え抗原のＩＭＡＣ溶離プロフィル
を示す。
【図６１】実施例VII に示されるように、イミダゾール
濃度の増加の段階勾配を示す組換え抗原のＩＭＡＣ溶離
プロフィルを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年３月２５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】（Ａ）及び（Ｂ）は、６つの精製λｇｔ１１ヒ
ト結核菌組換えクローンの鑑定を示す電気泳動のブロッ
ティング図である。（Ａ）は、クローン１５、クローン
１６、クローン１７、クローン１９、クローン２４、及
びＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 消化ラムダＤＮＡ分子量マ
ーカーレーン（キロ塩基対）（Ｍ）（Boehringer）のＥ
ｃｏＲＩ制限分析に相当する。（Ｂ）は、クローン１
５、クローン１６、クローン１７、クローン１９、クロ
ーン２３及びクローン２４で溶原化された大腸菌E. col
i の粗製溶解物のイムノブロッティング分析を示す。矢
印（←）は、組換えλｇｔ１１−ヒト結核菌クローンに
よって生成された融合蛋白質を示す。発現及びイムノブ
ロッティングは上記と同様であった。分子量（kDa で示
される）は分子量マーカー（高分子ＳＤＳキャリブレー
ションキット、Pharmacia)との比較により見積もった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】本発明の３２kDa の蛋白質がヒト結核血清に
よって選択的に認識されるという事実を説明する電気泳
動のブロッティング図である。ヒト結核血清、及び抗β
−ガラクトシダーゼモノクローン抗体によるイムノブロ
ッティングを表す。レーン１〜６：融合蛋白質（１４０
kDa)を発現する大腸菌溶解物；レーン７〜１２：未融合
β−ガラクトシダーゼ（１１４kDa)。クローン１７のＤ
ＮＡ挿入物（２．７kb）をｐＵＥＸ2 中でサブクローニ
ングし、融合蛋白質の発現をBresson 及びStanley
（４）が記載したようにして誘発した。レーン１及び７
は抗βガラクトシダーゼでプローブした：レーン４、
５、６、及び１０、１１、１２は、３２kDa の本発明の
精製蛋白質に対して高度に反応する３種類の異なるヒト
結核血清でプローブした；レーン２及び３並びに８及び
９は２つの異なる低反応血清でプローブした。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５７】実施例VIに示されるＫ１２ΔＨにおけるｍＴ
ＮＦ−Ｈｉｓ6 −Ｐ32融合蛋白質の発現に対応し、Coom
assie Brilliant Blue染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアク
リルアミドゲル電気泳動）を表す。レーンは以下のよう
に対応している： レーン １．蛋白質分子量マーカー ２．pmTNF-MPH-Mt32 ２８℃ １時間導入 ３． 〃 ４２℃ 〃 ４． 〃 ４２℃ ２時間導入 ５． 〃 ４２℃ ３ 〃 ６． 〃 ２８℃ ４ 〃 ７． 〃 ４２℃ ４ 〃 ８． 〃 ２８℃ ５ 〃 ９． 〃 ４２℃ ５ 〃
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ６１Ｋ 39/40 // Ａ６１Ｋ 39/40 49/00 Ａ 49/00 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ドゥ・ヴィト，ルーカス ベルギー国、ビー−2670 プール、ヴィク トール・フェルゴーヴァンシュトラート 46 (72)発明者 ドゥ・ブリュイン，シャックリーヌ ベルギー国、ビー−1640 ベーゼル、ホン ガリエシュトラート 192 (72)発明者 ファン・フーラン，ジャン−ポール ベルギー国、ビー−1600 サンーピエテ・ レーウ、ブリュッセルバーン 40

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 医薬として許容される担体とともに、 そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸
    配列： − 配列表の配列番号３４に示される（−２９）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸
    で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（１２）番目のア
    ミノ酸で構成される末端から（３１）番目のアミノ酸で
    構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（３６）番目のア
    ミノ酸で構成される末端から（５５）番目のアミノ酸で
    構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（７７）番目のア
    ミノ酸で構成される末端から（９６）番目のアミノ酸で
    構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（１０１）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（１２０）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（１７５）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（１９４）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（２１１）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（２３０）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（２７５）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（２９４）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、 並びにこの改変が以下の：ポリペプチドがウシ結核菌
    （M. bovis）ＢＣＧ培養濾液の３２kDa 蛋白質に対して
    生じたウサギポリクローン抗血清と反応する、及び／又
    は結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者
    からのヒト血清と選択的に反応するという特性を変え
    ず、かつウシ結核菌ＢＣＧのα抗原のものとは異なる限
    りにおける、１個又は数個のアミノ酸の置換及び／又は
    付加及び／又は欠失による改変、及び／又はアシル化も
    しくはエステル化による遊離カルボキシル基の改変によ
    って生じるペプチド配列を含有する組換えポリペプチ
    ド、又は、そのポリペプチドと１〜１，０００個のアミ
    ノ酸から成る異種蛋白質とを含むキメラ蛋白質を含む免
    疫原性組成物。
  2. 【請求項２】 その他の免疫原性成分の中に、 ａ）ポリペプチド、 ｂ）前記ａ）のポリペプチドと１〜１，０００個のアミ
    ノ酸から成る異種蛋白質とを含むキメラ蛋白質、 又は、 ｃ）核酸の発現物質 を含む組成物であって、前記ａ）のポリペプチドが、 そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸
    配列： − 配列表の配列番号３４に示される（−２９）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸
    で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（１２）番目のア
    ミノ酸で構成される末端から（３１）番目のアミノ酸で
    構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（３６）番目のア
    ミノ酸で構成される末端から（５５）番目のアミノ酸で
    構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（７７）番目のア
    ミノ酸で構成される末端から（９６）番目のアミノ酸で
    構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（１０１）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（１２０）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（１７５）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（１９４）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（２１１）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（２３０）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（２７５）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（２９４）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、 並びにこの改変が以下の：ポリペプチドがウシ結核菌
    （M. bovis）ＢＣＧ培養濾液の３２kDa 蛋白質に対して
    生じたウサギポリクローン抗血清と反応する、及び／又
    は結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者
    からのヒト血清と選択的に反応するという特性を変え
    ず、かつウシ結核菌ＢＣＧのα抗原のものとは異なる限
    りにおける、１個又は数個のアミノ酸の置換及び／又は
    付加及び／又は欠失による改変、及び／又はアシル化も
    しくはエステル化による遊離カルボキシル基の改変によ
    って生じるペプチド配列を含有する組換えポリペプチド
    であり、 前記ｃ）の核酸の発現物質が、 ｉ）特にプラスミド、コスミド、もしくはファージタイ
    プのベクター配列及びその複製のための非必須部位の一
    つに、組換え核酸であって、前記ａ）のポリペプチドも
    しくは前記ｂ）のキメラ蛋白質をコードするヌクレオチ
    ド配列、前記ａ）のポリペプチドもしくは前記ｂ）のキ
    メラ蛋白質をコードするヌクレオチド配列とハイブリッ
    ドを形成するヌクレオチド配列、前記ａ）のポリペプチ
    ドもしくは前記ｂ）のキメラ蛋白質をコードするヌクレ
    オチド配列と相補的であるヌクレオチド配列、又は、Ｔ
    がＵに置換される前記ヌクレオチド配列を含んでいる核
    酸を含む、特にクローニング及び／又は発現のための組
    換えベクターによって形質転換される細胞宿主であっ
    て、宿主において、前記ａ）のポリペプチドもしくは前
    記ｂ）のキメラ蛋白質をコードするヌクレオチド配列の
    発現を可能にする調節成分を含む細胞宿主によって発現
    され、 ii）天然蛋白質と、又は、その複合体がヒト結核菌を中
    和する抗体のin vivo産生を誘導できるか、もしくは、
    ヒト結核菌抗原反応性Ｔ細胞を活性化することによって
    in vivo での細胞免疫反応を誘導することができるのに
    十分な分子量を有する合成ポリペプチドと結合する発現
    物質である、ワクチン組成物。
  3. 【請求項３】 抗体、特にモノクローナル抗体を産生す
    るのに用いられる、 そのポリペプチド鎖中に次の少なくとも一つのアミノ酸
    配列： − 配列表の配列番号３４に示される（−２９）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（−１）番目のアミノ酸
    で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（１２）番目のア
    ミノ酸で構成される末端から（３１）番目のアミノ酸で
    構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（３６）番目のア
    ミノ酸で構成される末端から（５５）番目のアミノ酸で
    構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（７７）番目のア
    ミノ酸で構成される末端から（９６）番目のアミノ酸で
    構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（１０１）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（１２０）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（１７５）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（１９４）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（２１１）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（２３０）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、又は − 配列表の配列番号３４に示される（２７５）番目の
    アミノ酸で構成される末端から（２９４）番目のアミノ
    酸で構成される末端にわたる配列、 並びにこの改変が以下の：ポリペプチドがウシ結核菌
    （M. bovis）ＢＣＧ培養濾液の３２kDa 蛋白質に対して
    生じたウサギポリクローン抗血清と反応する、及び／又
    は結核患者、特に初期段階の進行性結核を発症中の患者
    からのヒト血清と選択的に反応するという特性を変え
    ず、かつウシ結核菌ＢＣＧのα抗原のものとは異なる限
    りにおける、１個又は数個のアミノ酸の置換及び／又は
    付加及び／又は欠失による改変、及び／又はアシル化も
    しくはエステル化による遊離カルボキシル基の改変によ
    って生じるペプチド配列を含有する組換えポリペプチド
    であって、以下のアミノ酸配列を有するペプチド。 アミノ酸位置 アミノ酸位置 （ＮＨ2 末端） （ＣＯＯＨ末端） 12 QVPSPSMGRDIKVQFQSGGA 31 36 LYLLDGLRAQDDFSGWDINT 55 77 SFYSDWYQPACRKAGCQTYK 96 101 LTSELPGWLQANRHVKPTGS 120 175 KASDMWGPKEDPAWQRNDPL 194 211 CGNGKPSDLGGNNLPAKFLE 230 275 KPDLQRHWVPRPTPGPPQGA 294 77 SFYSDWYQPACGKAGCQTYK 96 276 PDLQRALGATPNTGPAPQGA 299
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