PT92106B - Processo para a preparacao de sequencias de nucleotidos que exprimem a adenil-ciclase de "b.anthracis - Google Patents
Processo para a preparacao de sequencias de nucleotidos que exprimem a adenil-ciclase de "b.anthracis Download PDFInfo
- Publication number
- PT92106B PT92106B PT92106A PT9210689A PT92106B PT 92106 B PT92106 B PT 92106B PT 92106 A PT92106 A PT 92106A PT 9210689 A PT9210689 A PT 9210689A PT 92106 B PT92106 B PT 92106B
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- sequence
- adenyl cyclase
- anthracis
- adenyl
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 title claims abstract description 60
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 title claims abstract description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims abstract description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 6
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 abstract description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 7
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CTETYYAZBPJBHE-UHFFFAOYSA-N Haloprogin Chemical compound ClC1=CC(Cl)=C(OCC#CI)C=C1Cl CTETYYAZBPJBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001082628 Mus musculus H-2 class II histocompatibility antigen gamma chain Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 101150084863 cya gene Proteins 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- WJMFXQBNYLYADA-UHFFFAOYSA-N 1-(3,4-dihydroxyphenyl)-6,7-dihydroxy-1,2-dihydronaphthalene-2,3-dicarboxylic acid Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C=C(C(O)=O)C(C(=O)O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1 WJMFXQBNYLYADA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 206010058679 Skin oedema Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001648 edemagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000009602 toxicology test Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1225—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Bordetella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1278—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Bacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
PATENTE DE INVENÇÃO
NQ 92.106
NOME: INSTITUT PASTEUR, francês, com sede em 25-28, rue
Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, França
EPÍGRAFE:Processo para a preparação de sequências de nucleótidos que exprimem a adenil-ciclase de B. anthracis
INVENTORES: vincent Escuyer,
Edith Duflot Michele Mock,
Antoine Danchin,
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 42 da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883.
França, 25.10.1988, sob ο N9 88 13952 >' s
INSTITUT PASTEUR
Processo para a preparação de sequências de nucleótidos que exprimem a adenil-ciclase de B. anthracis
A presente invenção tem por objectivo sequências de nucleótidos que codificam para uma adenil-ciclase tal como a expressa pelo n3acillus anthracis. Diz igualmente respeito às proteínas que correspondem a esta adenil-ciclase e às suas aplicações biológicas.
B. anthracis é uma bactéria gram positiva fortemente patogénica para o homem e o animalo A sua virulência resulta da produção de uma escotoxina com três componentes e de uma cápsula de ácido poli-D-glutânico.
As tres proteínas consistem em um antigénio protector (PA) de 85 KDa, um factor letal (LF) de 83 KDa e um factor edematogénico (EF) de 89 KDa.
Estas proteínas não são tóxicas em si mesmas. Mas a sua interacção provoca duas respostas patológicas diferentes no animal.
Assim, a injecção de PA com LF provoca a morte enquanto a injecção intradérmica de PA com EF produz um edema da pele no porco da índia ou no coelho. 0 componente ,
EP que é dotado de uma actividade adenil-ciclase dependente da caimodulina, activador, eucariota, induz um aumento importante da concentração de cAMP intracelular (AMP cíclico). Sabe-se que uma outra bactéria patogénica, a saber Bordetella pertussis, produz igualmente uma adenil-ciclase tóxica, extracelular, activada pela caimodulina do hospedeiro. Como foi demonstrado por Mock e colab. (1), estas duas adenil-ciclase são, antigenicamente religadas ainda que sejam produzidas por organismos taxonomicamente totalmente distintos.
Os genes responsáveis pela expressão de PA,
LF e EP estão presentes no plasmídeo pXOl de B. anthracis.
A sua clonagem molecular e a sua expressão em Ξ. coli” foi referida por Vodkin e Leppla (2), para PA, Eobertson e Leppla (3) para LF e Tippetts e Robertson (4) para EP.
Mock e colab. (1) referiram igualmente um processo de clonagem e de expressão da edenil-ciclase de B. anthracis em E. coli. 0 processo geral de clonagem constitui o objectivo do pedido de patente de invenção francesa 87/10614 de 24 de Julho de 1987 em nome da requerente. Resumidamente, utiliza-se, de acordo com este processo, a interação adenil-ciclase/calmodulina que se traduz pela produção de cAMP. A clonagem do gene efectua-se em uma estirpe receptora deficiente em adenil-ciclase, comportando um plasmídeo que exprime elevados níveis de caimodulina.
Os genes que cooperam no processo de clonagem, a saber o que codifica para a adenil-ciclase e o que codifica para a caimodulina, são de origens diferentes.
Prosseguindo os seus trabalhos neste domínio, os inventores realizaram com êxito a determinação da sequên- 3 cia que comporta a informação pretendida para a expressão de pelo menos a parte activa de uma adenil-ciclase tal como a expressa pelo B. anthracis”.
Esta etapa permitiu definir a estrutura do gene, as suas particularidades assim como as suas eventuais semelhanças com outros genes. A condução destes trabalhos permitiu igualmente determinar a estrutura primária da toxina expressa e compará-la com a estrutura de toxinas semelhantes tais como as secregadas por exemplo pelo B. pertussis”.
A presente invenção tem portanto por objectivo fornecer novas sequências de nucleótidos capazes de codificar para proteínas com actividade adenil-ciclase tal como a expressa pelo ”B. anthracis.
Tem igualmente por objectivo fornecer pelo menos a parte activa, em relação a uma actividade adenil-ciclase, destas proteínas.
A presente invenção tem, além disso, por objectivo fornecer vacinas moleculares comportando toda ou parte de sequências imunoprotectoras da adenil-ciclase.
A sequência de nucleótidos de acordo com a presente invenção caracteriza-se pelo facto de ser constituída por pelo menos uma parte de uma sequência qúe codifica para uma proteína com actividade adenil-ciclase tal como a expressa pelo B. anthracis.
Esta sequência é capaz de se hibridar com genes que codificam para uma proteína com actividade adenil-ciclase de ”B. anthracis.
A presente invenção diz igualmente respeito a uma sequência de nucleótidos caracterizada pelo facto de
- 4 ί comportar a informação para a expressão de uma adenil-ciclase, ou de fragmentos desta última capazes de formar um complexo imunológico com anticorpos dirigidos respectivamente contra uma adenil-ciclase de B. anthracis, de B. pertussis ou de cérebro de rato ou contra fragmentos de uma tal adenil-cilase.
A presente invenção diz igualmente respeito a uma sequência recombinante comportando uma das sequências definidas antes, eventualmente associada a um promotor capaz de controlar a transcrição da sequência de ADN que codifica para sequências de terminação da transcrição e para os sinais de tradução e de secreção.
Diz ainda igualmente respeito a uma sequência de nucleotidos recombinante, associada a um promotor e a um operador que permite controlar a transcrição e a uma sequência sinal que permite a secreção da proteína no espaço periplásmico (gram -) ou no meio exterior.
De acordo ainda com um outro aspecto, a sequência de nucleotidos de acordo com a presente invenção é capaz de se hibridar ccm uma saida Ibmsda a partir da sequência que apresenta o seguinte encadeamento de nucleotidos de fórmula I, que corresponde na sua totalidade ao gene cya » de B. anthracis:
GAATTCAAAATCGGACTTAGAAATACACATATAGAAATAAACAACCTAATCCATGTCACT
-400
CTACCCTTTTmACtAAATAAACCAAATCACTCTAAAAATCAACACCTCAACTTTATCA
ÀCTTAGAÀTCTCT3 TXTTXACTTTÀAATGCCTAGCTGl 11 TI TCIÀATCTTTCTATTTCT
-300 · · · · ·
AAAIATATrTAAATAJCAATTCTACCTCTCTCCCAAGACTTATAATTAATTTAAATAACA
-200
TTATATTTGTAAATAAAAITGTAATTTAACATGTAGAATAAAGAGÀTTTTTAGTTTTATT
AACAGGAIGAAAATCCATAAAAC CGT AAATGTGATTTCTAAATT AGTTT AAA ΑΤΛΑΑΑΑΑ • . -100 · ·
CAACCATTrCCTCAnAdTCACATCAATATCTAAATATCAACAACCCAAAÇÇ^CgmAA
GAATGACTAGAAATAAATTTATA£CTAATAAGTTTAGTATTKTATCCTmCAGTATTAC
TATTTCCTATATCCTCjCTCACAGGCTATAGKAGTAAATGCTATGAATGAACATTACACTG
100
AGAGTCATATTAAAACAAACCITAAAACTCAAAAAAATAAAACTGAAAAACAAAAATTTA
CO
AAGACAGTATTAATAACTTACTTIOkAACAGAATTTACCAATGAAACTrTAGATAAAATAC
200
AGCAGACACAAGACTTATTAAAAAAGATACCTAAGGATGTACTTCAAATTTATACTGAAT
TAGGAGGAGAAATCTATTTTACAGATATAGATTTAGTAGAACATAAGGAGTTrACAACATl
300
120
TAAGTGAAGAAGAGAAAAATAGTATGAATAGTAGAGGTGAAAAAGTTCCCTTTGCATCCÍ
400
140
CTTTIGTATITGAAAAGAAAAGGG AAACACCT AAA TI AATT ATAAAT ATCAAAG ATTATC
ICO
CAATTAATAGTGAACAAAGTAAAGAAGTATATTATCAAATTCGAAAGCGGATnCTCTn
SOO
110
ATATTATAAGTAAGGATAAATCTCTAGATCCAGAGTTTTTAAATTTAATTÀAGAGTTTA
GCGATGATAGTGATAGTACCGACCTTTTATTTAGTCAAAAATTTAAAGAGAAGCTAGAA
COO
320
TGAATAATAAAACTAXAGATATAAATTTTATAAAAGAAAATT7AACTGAATTTCAGCATG
700
240 .
CCmTCTTTAGCGTmCTTATTATTTTGCACCTGACCATAGAACGGTATTAGAGTTAT
2(0
ATG CC CCCGACATCTTTGAGT ATATGAAT AAGTTAGAAAAAGCGGGATTTC A&AAAATAA SOO
210
GTCAAAGTTTGAAGAAAGAAGGTGTGGAAAAAGATAGGATTGATGTGCTGAAAGGAGAAA
AAGCACTTAAAGCTrCAGGTTTAGTACCAGAACATGCAGATGCTTTTAAAAAAATTGCTA
SOO
GAGAATTAAATACATATATTCTTTTTAGGCCTGTTAÁTAAGTTàGCTACAAACCTTATTA 1000 .
AAAGTGGTCTGGCTACAAAGGGATTGAATGTTCATCGAAAGAGTTCGGÁTTGGGGCCCTC
3(0
TACCTCCATACATACCATTTGATCAACATTrATCTAACAAGCATCCTCAACAATTAGCTC
1100
310
TCGAGAAAGGAAATTTAGAAAATAAAAAATCAATTACAGAGCATGAAGCTGAAATAGGTA
400
AAATACCATTAAAGTTAGACCATTTAAGAATAGAAGAGTTAAAGGAAAATGGGATAATTT
1200
420
TCAAGGGTAAAKaAGAAATTGATAATGGTAAAAAATATTATTTCTTAGAATCGAATAATC
1300
440
AGCTATATGAATTTAGAATTAGCGATGAAAACAACGAAGTACAATACAAGACAAAAGAAG
4(0
CTAAAATTACTCTTTTAGGGGAAAAATTCAATTGGACAAATATAGAACTGATGGCTAAAA
1400
4S0 . .
ATCTAGAAGGGGTCTTGAAGCCGTTAACAGCTGACTATGATTXATTTGCACTTCCCCCAA
500
CTTTAACAGAAATAAAAAAACAAATACCACAAAAAGAATGGGATAAAGTAGTTAACACCC
1500
530
CAAATTCATrAGAAAAGCAAAAAGGTCTTACTAATrTATTCArrAAATATGGAATTGACA κοο
540
CGAAACCGCATTCAACTAAGGGAA.CTTTATCAàATTGGCAAAAACAAATCCTTCATCCTT
5<0 . - .
TGAATGAAGCAGTCAAATATACAGGATATACAGGGGGGGA1GTCGTTAACCATCGCACAC
1700
580 ..
AGCAAGATAATGAAGAGTTTCCTGAAAAAGATAACCAAÀTTTTTATAATTAATCCAGAAC <00 .
GTGAATTrATATTAACTAAAAATTGGGAGATGACAGGTAGATTTATAGAAAAAAACATTA
1800 <20
CGGGAAAAGATTATTTATATTATmAACCGTTCTTATAATAAAATAGCTCCTGGTAATA
1)00 <40
AAGCTTATATrCAGTGGACTCATCCGATrACAAAAGCCAAAATAAATACCATCCCTACGT «0
CACCAGAGTrTATAAAAAACTrATCCAGTATCACWlGXTCTrCAAATCTAGGAGTTTATA
2000 <80
AAGATAGTGGCGACAAAGACGAATTrCCAAAAAAAGAAAGCCTGAAAAAAATTCCAGGAT
700 .
ATTTGTCAGACTATTACAATTCAGCAAATCATATJmTCTCAGGAAAAAAKGCGTAAAA
2100
720 '
TATCAATATTTCGTGGAATCCAAGCCTATAATGAAATTGAAAATGTTCTAKAATCTAAAC
2200
740
AAATAGCACCACAATACAAAAATTATTrrCAATATTXAAAGCAAACGATTACCAATCAAC
7<0 .
TTCAATTGCTTCTAACACATCAAAAA TCTAATATTG AATTTAAATTATTCTATAAAC AA7
2300
780 .
TAAACTTTACAGAAAàTGAAACGGATAATTTTGAGGTCTTCCÀAAAAATTATTCATGAAJ
800
AATAAATATATATAATTGrrrTTCTGAÀAATTCATCATTTTAAAGAAGACACTAGGAAT·.
2400
AAATAGATGTATTCAATAGrrATAGTAATGGICTTGTATGGACATACCGCTrATACTTTÍ
2500
CGAGGTAGTAGATATTAAACAACATATAGCAAATGAACTGGATGTAGATC
ou o encadeamento dos nucleótidos complementares da sequência de fórmula I.
Sequências de acordo com a presente invenção caracterizam-se pelo facto de compreenderem o encadeamento de fórmula I definido antes ou pelo facto de serem constituídas por todo ou parte deste encadeamento.
A sequência a jusante do sítio de ligação aos ribossomas caracteriza-se pelo facto de ser particularmente rica em A-T.
E evidente que as bases da sequência de nucleotidos considerada podem estar em uma ordem diferente da encontrada nos genes e/ou que estas bases podem ser, eventualmente, substituídas, desde que uma sonda elaborada a partir de uma tal sequência dê uma resposta caracteristica e não equívoca quanto à capacidade de reconhecer a presença de genes que codificam para uma adenil-ciclase tal como a segregada por 3, anthracis.
Qualquer sequência de nucleotido3 hibridável com o encadeamento de fórmula I, tal como a obtida pela trans crição enzimática inversa do ARN correspondente ou ainda pela síntese química, entra igualmente no quadro da presente invenção.
A sequência de nucleótidos de acordo com a presente invenção corresponde ainda, de acordo com o código genético universal, a pelo menos uma parte da seguinte sequência de fórmula II em aminoácidos;
- 9 II a
XTXKXFlPIt
LFAZSSSOAtl tlDJXXMKXT
XDtlMMLVKT
OOTODLLCX I lccxiyftpi
LSEttKMSMM trvrtxKAtT
A1MSXO3XXV
OJJSXDXSLD
SOO5DSSDLL rrsixsrsvL
CVNANMEKTT
CKMKTEKCKF tFTFXTLDXI fxdvlxiyse
DLVrMXELOD
SKCtKVFFAS
PKLJIKIF, DY
YYXICXGISL
P2FLNL1*XSL rsoxrxtxLc /
II b
aso z. | X | H | X | s | X | 0 | X |
340 A | F | s | L | A | f | s | T |
2(0 Y | A | F | D | K | •X | X | X |
aio s | I | s | L | X | X | X | G |
300 X | A | L | X | A | S | c | V |
320 X | X | L | M | T | T | 1 | L |
240 X | s | G | V | A | r | X | G |
310 V | A | C | Y | X | F | r- | 0 |
310 V | X | X | G | K | u | c | r |
400 X | 2 | F | L | X | L. | α | K- |
420 L | X | G | X | X | X | 2 | D |
440 0 | V | Y | X | F | X | J | S |
450 G | X | I | T | V | L | G | X |
400 N | V | t | G | V | L | X | F |
riKtKLTC
F AFDXXTV
HXLIXCG F
X X 0 X 1 0 V V
FtXAOAFX kfvwxiat
M VMCXSSG
DLSXXMCO
KS I Y X R E G
XZEXLXXK
CKKYYLLE
XWRXVOYX
FHWXN1XV
YADYOLFA r ο ι
L X L
X X I
X C X
X 2 A
R L 2
W C F
L A
X 1 G
G 2 1
S Ν N
Τ X X
Κ A X
L A F
500 $ L Y X 2 X X 0 2 FOXXWOXVVHT
Ρ Μ 8 L X I Ο
Α X Ρ Ο S 7 I
L Ν I λ V X 7
X Ο Ο Η Ε X Ρ
C I Ρ X L Τ X
C X Ο 7 L 7
Α Α 7 X I W 7
S Α C Ρ ϊ X Μ
X D S C Ο X D
L S Ο 7 7 Η
I S X Ρ X C I
Ο I Α Ρ ί 7 X
V ο L L L Τ Η
L Ν F 7 X Ν Ε
II c
X G V 7 Μ L L
C 7 L S Ν W 0
C 7 7 C C Ο
Ρ Ζ X Ο Η I 1
Κ W Κ Μ 7 C X
Ρ « Α S 7 Α
Λ Ρ X 7 X Α X
X. S S X Α Α S ί Ρ Α X X X S
S Α Η Η I Ρ S
Ο Α 7 Μ X I Κ
Α 7 Γ Ο 7 L X
Ο X S Η I X Γ
Ο Η Ρ I V Ρ t X 7 6 I Κ
X 0 Μ L Ο Α
V V Ν Η C 7
Ρ I *1 Α Ρ · Ε
Ρ X Ε X Α 1
Κ X Α Ρ C Ν
I Μ 7 J Ρ 7
Η V C V 7
V X X 1 Α C
I X X Α X
Α V L X S Κ
I Α X 7 Ν Ο
X L L 7 X Ο
Ο Κ X X Ο X
Κ ··· ~
sentara os
D
Ξ
A
R
N
C
Q
G
H
I
L
K
M
P
P s
T w
Y
V
As letras indicadas neste encadeamento apreseguintes significados convencionais:
Ácido aspãrtico
Ácido glutâmico
Alanina
Arginina
Asparagina
Cisteína
Glutamina
Glicina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Penilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
A presente invenção diz além disso respeito a uma proteína com actividade adenil-ciclase do tipo da sin- 13 tetizada pelo B. anthracis, assim como os fragmentos peptídicos desta proteína, correspondendo de acordo com o código genético universal a uma das sequências de nucleótidos referidas antes.
A proteína de acordo com a presente invenção é tal como obtida mediante transformação de células hospedeiras por meio de um vector recombinante comportando uma sequência de nucleótidos como definida antes sob o controlo de elementos de regulação que permitem a expressão da referida sequência na célula hospedeira cultivada em um meio apropriado de células hospedeiras transformadas e recuperação da proteína a partir destas células ou directamente a partir do meio de cultura logo que ela é segregada.
A presente invenção diz mais especialmente respeito a uma proteína correspondente, de acordo com o código genético universal, à sequência de nucleótidos de fórmula I e que é representada pelo encadeamento de fórmula II de 800 aminoácidos. Esta proteína possui um peso molecular teórico M de 92 387. Como outras proteínas extracelulares de organismos gram positivos, a adenil-ciclase aparece sintetizada pelo B. anthracis sob a forma de um enor me precussor cuja sequência sinal ê eliminada quando da secreção. 0 início da sequência sinal deverá ocupar a posição 29 ou poderá ocupar a posição 34. A composição global depois da eliminação da sequência do precussor corresponde a uma proteína hidrófila. Resíduos básicos assim como aminoácidos hidrófobos estão próximos da parte N-terminal como características de um péptido sinal. Pode-se substituir este enca- 14 L, deamento sinal por outros péptidos sinais, em particular para melhorar a secreção da adenil-ciclase em outros organismos.
Verificar-se-á que a adenil-ciclase antes referida, como a expressa pelo B. anthracis, não contém resíduos císteína, o que contrasta com as observações bioquímicas efectuadas sobre as ciclases eucariotas.
estudo desta sequência de 800 aminoácidos mostra que ela apresenta várias regiões comuns com a adenil-ciclase secregada pela B. pertussis de 1706 aminoácidos, tal como desenvolvida na parte da descrição ilustrando mais pormenorizadamente a presente invenção.
De acordo com um outro aspecto da presente invenção, a proteína da presente invenção com actividade adenil-ciclase dá lugar a uma reacção imunológica cruzada com anticorpos dirigidos contra sub-unidades catalíticas da adenil-ciclase de cerebro de rato ou ainda contra a adenil-ciclase de B. pertussis.
A proteína de acordo com a presente invenção e os seus fragmentos, que se podem obter igualmente mediante síntese química, apresentam com vantagem um grau de pureza elevado e são utilizados para formar, de acordo com técnicas clássicas, anticorpos policlonais.
Tais anticorpos policlonais, assim como os anticorpos monoclonais capazes de reconhecer especificamente a proteína referida antes e os seus fragmentos fazem igualmente parte da presente invenção.
Sequências de nucleótidos de acordo com a presente invenção obtêm-se com vantagem de acordo com o pro- 15 cesso de clonagem da requerente evocado antes. Os vectores recombinantes de expressão e de clonagem capazes de transformar uma célula hospedeira apropriada entram igualmente no quadro da presente invenção. Estes vectores comportam pelo menos uma parte de uma sequência de nucleótidos de acor do com a presente invenção sob o controlo de elementos de regulação que permitem a sua expressão. As estirpes de microrganismos transformadas fazem igualmente parte da presente invenção. Estas estirpes comportam uma das sequências de nucleótidos definidas antes ou ainda um vector recombinante tal como definido anteriormente.
A presente invenção diz igualmente respeito às aplicações biológicas das sequências de nucleótidos, das proteínas correspondentes e dos anticorpos monoclonais ou policlonais.
Estas aplicações compreendem a elaboração, a partir de fragmentos intragénicos do encadeamento de fórmula I, de sondas para a detecção de sequências semelhantes nos genes que produzem adenil-ciclases. Esta elaboração compreende, particularmente, a desnaturação das sequências de dupla cadeia para se obter uma sequência de cadeia simples como sonda.
A presente invenção diz, portanto, respeito a sondas de detecção caracterizadas pelo facto de comportarem pelo menos uma parte de uma sequência de nucleótidos definida antes, mais especialmente um fragmento intragênico que codifica para o sítio catalítico da ligação com a calmodulina ou de maneira suficientemente específica para uma parte deste sítio, nas adenil-ciclases bacterianas. Tais
fragmentos, complementares dos sítios correspondentes nos genes de eucariotas que exprimem a adenil-ciclase com actividade dependente da calmodulina, apresentam em particular a vantagem de facilitar a clonagem e a análise dos génes em questão.
fragmento de ADN utilizado como sonda comporta um número de nucleótidos suficiente para obter a especificidade requerida e a formação de um híbrido estável.
Sondas apropriadas para este tipo de detecção são marcadas, com vantagem, por um elemento radioactivo (sondas quentes) ou qualquer outro grupo não radioactivo (sondas frias) permitindo o reconhecimento da sonda no estado hibridado com a preparação comportando o ADN a estudar.
De acordo com as técnicas clássicas, fazem-se contactar estas sondas com uma amostra biológica compor tando bactérias, ou directamente com estas bactérias ou os seus ácidos nucleicos, em condições que permitam a hibridação eventual da sequência de nucleótidos da sonda com uma sequência complementar, eventualmente contida no produto testado.
Pode-se, por exemplo, utilizar o método de hibridação sobre manchas. Este método comportar, depois da desnaturação do ADN previamente obtido a partir de células que exprimem a adenil-ciclase, o depósito de uma quantidade alíquota deste ADN sobre membranas de nitrocelulose, a hibridação de cada membrana nas condições usuais com a sonda e detecção, de maneira clássica, do híbrido formado.
Pode-se igualmente utilizar um método de hibridação sobre réplica, de acordo com a técnica de Southern.
Este método compreende a separação electroforética em gel de agorese dos fragmentos de ADNs produzidos após tratamento dos ADNs com enzimas de restrição, transferência após desnaturação alcalina sobre membranas apropriadas e a sua hibridação com uma sonda nas condições usuais. Nem sempre ê necessário proceder à expressão prévia do ADN. Ê suficiente que o ADN seja acessível à sonda.
A presente invenção fornece assim instrumentos que permitem detectar rapidamente, com uma grande especialidade, sequências similares nos genes que codificam para adenil-ciclases, o que permite estudar a origem e o modo de acção destas adenil-ciclases.
Para a realização dos métodos de detecção considerados antes baseados na utilização de sondas nucleotidicas, recorre-se, com vantagem a estojos ou conjuntos comportando:
- uma determinada quantidade de uma sonda nucleótidica de acordo cora a presente invenção,
- com vantagem, um meio apropriado respectivamente para a formação de uma reacção de hibridação entre a sequência a detectar e a sonda,
- com vantagem, reagentes que permitam a detecção dos complexos de hibridação formados entre a sequência de nucleotidos e a sonda quando da reacção de hibridação.
A presente invenção diz igualmente respeito às aplicações imunológicas das proteínas definidas antes mais especialmente para a elaboração de anti-soros específicos assim como de anticorpos policlonais e monoclonais.
Os anticorpos policlonais obtêm-se de acordo com as técnicas clássicas mediante injecção da proteína a animais, recuperação dos anti-soros, depois dos anticorpos a partir dos anti-soros por exemplo mediante cromatografia de afinidade.
Os anticorpos monoclonais são produzidos pela maneira habitual mediante fusão de células de mielomas com células de figado de animais previamente imunizados com a ajuda das proteínas de acordo com a presente invenção.
Os ensaios de toxicologia realizados com a adenil-ciclase na ausência do antigénio protector demonstraram a sua ausência de toxicidade.
Utiliza-se, com vantagem, a totalidade ou parte das sequências imunoprotectoras destas proteínas para a elaboração de vacinas com a condição de não dar lugar a reacções imunitárias indesejáveis pondo em jogo, por exemplo, a adenil-ciclase do hospedeiro.
A presente invenção diz igualmente respeito a vacinas moleculares capazes de prevenir as infecções provocadas pelo B, anthracis e os seus efeitos tóxicos no homem e no animal, sendo estas vacinas à base das proteínas definidas antes, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
Como os anticcrpcs formados contra a adenil-ciclase de B. anthracis dão lugar a uma reacção imunológica cruzada com a adenil-ciclase de B. pertussis’1, a presente invenção fornece, com vantagem, uma dupla vacina contra as infecções provocadas por B. anthracis e B> pertussis.
Indica-se a seguir, como exemplo não limitativo, os materiais e os métodos utilizados para a clonagem
e sequenciação do gene da adenil-ciclase de B. anthracis.
As figuras 1 e 2 a que se faz referência representam:
- a figura 1, o mapa de restrição de um fragmento de ADN de cerca de 3,8 kb comportando o gene cya de B, anthracis, e
- a figura 2, as sequências de aminoácidos das adenil-ciclases de B. anthracis (linha superior) e de B. pertussis (linha inferior).
a) Estirpes bacterianas e plasmídeos
Utilizam-se as seguintes estirpes de E. coli para a transformação TP61O (5) θ para a transferência JM1O5 (6).
plasmideo recombinante utilizado pMMA8812 ê um derivado do pUC8 contendo um fragmento EcoRV-PstI de 3,8 kb comportando as determinantes para a adenil-ciclase de B. anthracis (1). 0 fragmento de restrição EcoRV-PstI está representado na figura 1.
plasmídeo recombinante pMMA8812 exerce uma acção de complementação, activada pela calmodulina, face à deficiência em ciclase de uma estirpe de E. coli cyaí
b) Meios e reagentes químicos.
Realizam-se culturas em meios LB ricos de Miller (7). A ampicilina, quando utilizada, é adicionada à razão de 100 microgramas por ml. Utilizam-se enzimas de restrição ADN T4 ligase e PolIK (Boehringer-Mannheim) e a ADN T7-polimerase modificada (Sequenciação) comercializada por USBG. Os oligodesoxi-ribonucleotidos utilizados como ϊ
pares de iniciação na sequenciação do ADN por um lado e do dATP por outro lado são comercializados respectivamente por Pharma e por Amersham.
c) Análise da sequência de nucleótidos.
Utilizam-se sub-clones no vector de cadeia simples M13mpl9 (8). Para se obter eliminações unidereccionais, recorre-3e ao sistema ciclone (IBI).
A sequência de nucleótidos é determinada de acordo com o método de terminação de cadeia didesoxinucleotido (9) quando se utiliza PolIK ou de acordo com um método de terminação de cadeia didesoxinucleotido modificada, quando se utiliza a sequenase (10).
Determinou-se a sequência de nucleótidos da inserção do ADN de B. anthracis de pMMA8812.
fragmento da figura 1 apenas comporta um quadro aberto de leitura de 2400 pb. Bste último contém 800 códãos que vão do sítio considerado como sendo o sítio de iniciação da tradução até ao códão de terminação TAA.
códão considerado como códão ATG de início é precedido por um sítio, do tipo dos sítios de ligação aos ribossomas (RBS), cuja sequência GGAGG é complementar do 3*OH do ARN ribossomal 16S.
A sequência completa de nucleótidos do quadro aberto de leitura está representada na figura 2. Verifica-se que a sequência a jusante do sítio RBS ê particularmente rica em A-T. A sequência de aminoácidos traduzida corresponde ao encadeamento de fórmula II definido antes.
sítio de clivagem proposto na figura 2 de- 21 ve ser confirmado pelos dados respeitantes ao resíduo N-terminal da adenil-ciclase. Como se indicou antes, a adenil-ciclase é verosimilmente sintetizada por B. anthracis sob a forma de um precursor maior cuja sequência sinal é eliminada quando da secreção. 0 tratamento do precursor deverá conduzir a uma proteína madura de 89261.
d) Comparação das estruturas primárias das adenil-ciclases de B. anthracis e de B. pertussis.
Representou-se na figura 2, a sequência completa do polipeptido da adenil-ciclase de B, anthracis (linha superior) e a sequência polipeptídica N-terminal da adenil-ciclase de B. pertussis (linha inferior).
Os asteriscos indicam os aminoácidos iguais e as cruzes os aminoácidos da mesma classe química.
A comparação destas sequências mostra que elas são, no seu conjunto, diferentes mas que apresentam partes de maior ou menor semelhança.
Verifica-se, em particular, uma semelhança no domínio de cerca de 400 aminoácidos situado na enzima de B. anthracis na parte central e na de B. pertussis na parte N-terminal.
Experiências de eliminação in vitro demons traram que a sequência de 450 aminoácidos da extremidade N-terminal da adenil-ciclase de B. pertussis corresponde ao domínio catalítico activado pela calmodulina, o que leva a reconhecer o centro catalítico da adenil-ciclase de B. anthracis na região que vai do aminoácido na posição 300 ao aminoácido na posição 683.
A semelhança mais importante corresponde ao péptido de 24 aminoácidos (da posição 342 à posição 365). Esta sequência contém cinco resíduos gli e a sequência núcleo G --- GKS (AKS na B. pertussis) que se encontra quase sempre nas proteínas tendo uma afinidade para os nucleotidos.
Duas outras regiões apresentam uma semelhança menor. Correspondem aos domínios que se estendem das posições 487 a 501, por um lado, e 573 a 594, por outro lado.
De acordo com os resultados dos estudos efectuados sobre esta sequência de aminoácidos, a adenil-ciclase de B. anthracis aparece organizada em domínios funcionais.
Pelo menos três funções podem ser atribuídas à molécula, a saber:
1- interacção com células eucariotas. Esta propriedade exerce-se por intermédio do antigénio protector (PA) que se fixa logo de início às células sensíveis, interactuando depois com a adenil-ciclase,
2- a internalização,
3- a fixação à calmodulina e a activação da ciclase.
A parte central da molécula (região compreendida entre as posições 350 a 390) ê atribuída ao domínio dependente da calmodulina.
1)
2)
Mock e colab.,
Vodkin Leppla,
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Gene 1988, 64, 277 - 284
Cell 1983, 34: 693 - 697
3) Robertson Leppla, Gene 1986, 44: 71 - 78
4) Tippetts Robertson, J. of Bact. 1988, vol 70, n’ 5, 2263 - 2266
5) Hedegaard Danchin, ”iiol. Gen. Gen. 201 (1985), 38 - 42
6) Yanisch-Perron colab., Gene 33 (1985), 103 - 119
7) ftíiller, Cold Spring harbor, NY, 1972
8) Norrander colab., Gene 26 (1983), 101 - 106
9) Sanger colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463 - 5467
10) Tabor Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 4767 - 4771
Claims (6)
- REIVINDICAÇÕES1.- Processo para a clonagem de uma sequência de nucleotidos, caracterizado pelo facto de se promover a interacção de adenil-ciclase de B. anthracis com caimodulina numa estirpe receptora deficiente em adenil-ciclase, comportando um plasmídeo que exprime de cima para baixo níveis de caimodulina, codificando os genes respectivamente para a adenil-ciclase e para a caimodulina sendo de origem diferente, o que permite a clonagem de uma sequência constituída por pelo menos uma parte de uma sequência que codifica para uma proteína com actividade de adenil-ciclase tal como expressa por B. anthracis .
- 2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de conduzir ã clonagem de uma sequência de capaz de se hibridar com genes que codificam para uma ciase de B, anthracis.nucleótidos adenil-ci
- 3.- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a sequência de nucleótidos clonada comportar a informação para a expressão de uma adenil-ciclase, ou de fragmentos desta última capazes de formar um complexo imunolõgico com anticorpos dirigidos respectivamente contra uma adenil-ciclase deB. anthracis ou de B. pertussis, ou contra fragmentos de uma tal adenil-ciclase.
- 4. - Processo para a preparação de uma sequência de nucleotidos recombinante, sendo a referida sequência constituída por pelo menos uma parte de uma sequência que codifica para uma proteína com actividade de adenil-ciclase tal como expressa porB. anthracis, caracterizado pelo facto de se associar uma sequência do tipo da obtida pelo processo de acordo com uma das rejL vindicações 1 a 3 com um promotor capaz de controlar a transcrição da sequência e com uma sequência de ADN que codifica para sinais de terminação de transcrição.
- 5. - Processo para a preparação de uma sequência de nucleotidos recombinante, sendo a referida sequência constituída por pelo menos uma parte de uma sequência que codifica para uma proy-26teína com actividade de adenil-ciclase tal como expressa porB. anthracis, caracterizado pelo facto de se associar uma sequência de nucleótidos do tipo da obtida pelo processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 com um promotor e um operador que permitem controlar a transcrição, e com uma sequência de sinal que permite a secreção da proteína no espaço periplásmico (gram-) ou no meio exterior.
- 6.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações1 a 5, caracterizado pelo facto de a sequência de nucleótidos ser capaz de se hibridar com uma sonda formada a partir da sequência que apresenta o seguinte encadeamento de nucleótidos de fórmula
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8813952A FR2638090B1 (fr) | 1988-10-25 | 1988-10-25 | Sequences de nucleotides exprimant l'adenyl cyclase de b. anthracis, proteines ayant l'activite de cette adenyl cyclase et applications biologiques |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PT92106A PT92106A (pt) | 1990-04-30 |
PT92106B true PT92106B (pt) | 1995-06-30 |
Family
ID=9371268
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PT92106A PT92106B (pt) | 1988-10-25 | 1989-10-25 | Processo para a preparacao de sequencias de nucleotidos que exprimem a adenil-ciclase de "b.anthracis |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0366550A1 (pt) |
JP (1) | JPH03502761A (pt) |
CA (1) | CA2001508A1 (pt) |
DK (1) | DK152490A (pt) |
FR (1) | FR2638090B1 (pt) |
PT (1) | PT92106B (pt) |
WO (1) | WO1990004637A1 (pt) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5244902A (en) * | 1989-08-21 | 1993-09-14 | Beth Israel Hospital Association | Topical application of spiperone or derivatives thereof for treatment of pathological conditions associated with immune responses |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2606789B1 (fr) * | 1986-11-17 | 1991-05-31 | Pasteur Institut | Preparations d'adenylate cyclase purifiees, procede d'obtention de ces preparations et leurs applications biologiques |
-
1988
- 1988-10-25 FR FR8813952A patent/FR2638090B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-10-25 PT PT92106A patent/PT92106B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 WO PCT/FR1989/000556 patent/WO1990004637A1/fr unknown
- 1989-10-25 EP EP89402949A patent/EP0366550A1/fr not_active Withdrawn
- 1989-10-25 JP JP1511657A patent/JPH03502761A/ja active Pending
- 1989-10-25 CA CA002001508A patent/CA2001508A1/fr not_active Abandoned
-
1990
- 1990-06-22 DK DK152490A patent/DK152490A/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PT92106A (pt) | 1990-04-30 |
JPH03502761A (ja) | 1991-06-27 |
DK152490A (da) | 1990-08-20 |
EP0366550A1 (fr) | 1990-05-02 |
FR2638090A1 (fr) | 1990-04-27 |
FR2638090B1 (fr) | 1993-10-15 |
DK152490D0 (da) | 1990-06-22 |
WO1990004637A1 (fr) | 1990-05-03 |
CA2001508A1 (fr) | 1990-04-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4283872B2 (ja) | 微生物蛋白質と、この蛋白質を産生する微生物と、該蛋白質のワクチンおよび結核検出での利用 | |
Wu et al. | Identification of dipeptide repeats and a cell wall sorting signal in the fimbriae‐associated adhesin, Fap1, of Streptococcus parasanguis | |
JP2685442B2 (ja) | ボルデテラ・パータツシス染色体DNAのEcoRIフラグメント | |
JPH06504446A (ja) | 肺炎球菌タンパクの構造遺伝子 | |
EP0571420B1 (en) | Mycobacterium polypeptides and nucleic acids encoding them for diagnosis and control of tuberculosis | |
EP0322533B1 (en) | Bordetella pertussis toxin with altered toxicity | |
MXPA01006427A (es) | Nuevos antigenos de estreptococos. | |
EA006232B1 (ru) | Стрептококковые антигены | |
JP2004507217A (ja) | リステリア菌ゲノム、ポリペプチドおよびその使用 | |
US5980909A (en) | Epitopic regions of pneumococcal surface protein A | |
CZ280743B6 (cs) | Imunogen proti lymské boreliose savců | |
CA2116261A1 (en) | Epitopic regions of pneumococcal surface protein a | |
Boyle et al. | Characterization of a gene coding for a type IIo bacterial IgG-binding protein | |
EP0500736B1 (en) | Recombinant vaccine for porcine pleuropneumonia | |
JPH08509371A (ja) | ライム病の予防及び治療のためのOspC抗原ワクチンの免疫原性製剤及びかかる抗原の調製のための組換え方法 | |
US5965141A (en) | Epitopic regions of pneumococcal surface protein a | |
US5679768A (en) | Epitopic regions of pneumococcal surface protein A | |
AU743165B2 (en) | Live attenuated bacteria of the species Actinobacillus pleuropneumoniae | |
Calva et al. | Campylobacter jejuni chromosomal sequences that hybridize to Vibrio cholerae and Escherichia coli | |
PT92106B (pt) | Processo para a preparacao de sequencias de nucleotidos que exprimem a adenil-ciclase de "b.anthracis | |
Kolberg et al. | Monoclonal antibodies that recognize a common pneumococcal protein with similarities to streptococcal group A surface glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase | |
JPH022357A (ja) | ヘモフィルス・インフルエンゼb型主外層膜蛋白質抗原の製造方法および組成物 | |
WO1994020536A1 (en) | Methods, compositions, and kits for diagnosing lyme disease | |
EP0573435B1 (en) | Acellular vaccine | |
WO1997023626A1 (en) | Helicobacter pylori oxidoreductase enzymes and their uses |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM3A | Annulment or lapse |
Free format text: LAPSE DUE TO NON-PAYMENT OF FEES Effective date: 19960630 |