PT92106B

PT92106B - Processo para a preparacao de sequencias de nucleotidos que exprimem a adenil-ciclase de "b.anthracis

Info

Publication number: PT92106B
Application number: PT92106A
Authority: PT
Inventors: Vincent Escuyer; Edith Duflot; Michele Mock; Antoine Danchin
Original assignee: Pasteur Institut
Priority date: 1988-10-25
Filing date: 1989-10-25
Publication date: 1995-06-30
Also published as: PT92106A; JPH03502761A; DK152490A; EP0366550A1; FR2638090A1; FR2638090B1; DK152490D0; WO1990004637A1; CA2001508A1

Description

PATENTE DE INVENÇÃO

NQ 92.106

NOME: INSTITUT PASTEUR, francês, com sede em 25-28, rue

Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, França

EPÍGRAFE:Processo para a preparação de sequências de nucleótidos que exprimem a adenil-ciclase de B. anthracis

INVENTORES: vincent Escuyer,

Edith Duflot Michele Mock,

Antoine Danchin,

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 42 da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883.

França, 25.10.1988, sob ο N9 88 13952 >' s

INSTITUT PASTEUR

Processo para a preparação de sequências de nucleótidos que exprimem a adenil-ciclase de B. anthracis

A presente invenção tem por objectivo sequências de nucleótidos que codificam para uma adenil-ciclase tal como a expressa pelo ⁿ3acillus anthracis. Diz igualmente respeito às proteínas que correspondem a esta adenil-ciclase e às suas aplicações biológicas.

B. anthracis é uma bactéria gram positiva fortemente patogénica para o homem e o animal_o A sua virulência resulta da produção de uma escotoxina com três componentes e de uma cápsula de ácido poli-D-glutânico.

As tres proteínas consistem em um antigénio protector (PA) de 85 KDa, um factor letal (LF) de 83 KDa e um factor edematogénico (EF) de 89 KDa.

Estas proteínas não são tóxicas em si mesmas. Mas a sua interacção provoca duas respostas patológicas diferentes no animal.

Assim, a injecção de PA com LF provoca a morte enquanto a injecção intradérmica de PA com EF produz um edema da pele no porco da índia ou no coelho. 0 componente ,

EP que é dotado de uma actividade adenil-ciclase dependente da caimodulina, activador, eucariota, induz um aumento importante da concentração de cAMP intracelular (AMP cíclico). Sabe-se que uma outra bactéria patogénica, a saber Bordetella pertussis, produz igualmente uma adenil-ciclase tóxica, extracelular, activada pela caimodulina do hospedeiro. Como foi demonstrado por Mock e colab. (1), estas duas adenil-ciclase são, antigenicamente religadas ainda que sejam produzidas por organismos taxonomicamente totalmente distintos.

Os genes responsáveis pela expressão de PA,

LF e EP estão presentes no plasmídeo pXOl de B. anthracis.

A sua clonagem molecular e a sua expressão em Ξ. coli” foi referida por Vodkin e Leppla (2), para PA, Eobertson e Leppla (3) para LF e Tippetts e Robertson (4) para EP.

Mock e colab. (1) referiram igualmente um processo de clonagem e de expressão da edenil-ciclase de B. anthracis em E. coli. 0 processo geral de clonagem constitui o objectivo do pedido de patente de invenção francesa 87/10614 de 24 de Julho de 1987 em nome da requerente. Resumidamente, utiliza-se, de acordo com este processo, a interação adenil-ciclase/calmodulina que se traduz pela produção de cAMP. A clonagem do gene efectua-se em uma estirpe receptora deficiente em adenil-ciclase, comportando um plasmídeo que exprime elevados níveis de caimodulina.

Os genes que cooperam no processo de clonagem, a saber o que codifica para a adenil-ciclase e o que codifica para a caimodulina, são de origens diferentes.

Prosseguindo os seus trabalhos neste domínio, os inventores realizaram com êxito a determinação da sequên- 3 cia que comporta a informação pretendida para a expressão de pelo menos a parte activa de uma adenil-ciclase tal como a expressa pelo B. anthracis”.

Esta etapa permitiu definir a estrutura do gene, as suas particularidades assim como as suas eventuais semelhanças com outros genes. A condução destes trabalhos permitiu igualmente determinar a estrutura primária da toxina expressa e compará-la com a estrutura de toxinas semelhantes tais como as secregadas por exemplo pelo B. pertussis”.

A presente invenção tem portanto por objectivo fornecer novas sequências de nucleótidos capazes de codificar para proteínas com actividade adenil-ciclase tal como a expressa pelo ”B. anthracis.

Tem igualmente por objectivo fornecer pelo menos a parte activa, em relação a uma actividade adenil-ciclase, destas proteínas.

A presente invenção tem, além disso, por objectivo fornecer vacinas moleculares comportando toda ou parte de sequências imunoprotectoras da adenil-ciclase.

A sequência de nucleótidos de acordo com a presente invenção caracteriza-se pelo facto de ser constituída por pelo menos uma parte de uma sequência qúe codifica para uma proteína com actividade adenil-ciclase tal como a expressa pelo B. anthracis.

Esta sequência é capaz de se hibridar com genes que codificam para uma proteína com actividade adenil-ciclase de ”B. anthracis.

A presente invenção diz igualmente respeito a uma sequência de nucleótidos caracterizada pelo facto de

- 4 ί comportar a informação para a expressão de uma adenil-ciclase, ou de fragmentos desta última capazes de formar um complexo imunológico com anticorpos dirigidos respectivamente contra uma adenil-ciclase de B. anthracis, de B. pertussis ou de cérebro de rato ou contra fragmentos de uma tal adenil-cilase.

A presente invenção diz igualmente respeito a uma sequência recombinante comportando uma das sequências definidas antes, eventualmente associada a um promotor capaz de controlar a transcrição da sequência de ADN que codifica para sequências de terminação da transcrição e para os sinais de tradução e de secreção.

Diz ainda igualmente respeito a uma sequência de nucleotidos recombinante, associada a um promotor e a um operador que permite controlar a transcrição e a uma sequência sinal que permite a secreção da proteína no espaço periplásmico (gram -) ou no meio exterior.

De acordo ainda com um outro aspecto, a sequência de nucleotidos de acordo com a presente invenção é capaz de se hibridar ccm uma saida Ibmsda a partir da sequência que apresenta o seguinte encadeamento de nucleotidos de fórmula I, que corresponde na sua totalidade ao gene cya » de B. anthracis:

GAATTCAAAATCGGACTTAGAAATACACATATAGAAATAAACAACCTAATCCATGTCACT

-400

CTACCCTTTTmACtAAATAAACCAAATCACTCTAAAAATCAACACCTCAACTTTATCA

ÀCTTAGAÀTCTCT3 TXTTXACTTTÀAATGCCTAGCTGl 11 TI TCIÀATCTTTCTATTTCT

-300 · · · · ·

AAAIATATrTAAATAJCAATTCTACCTCTCTCCCAAGACTTATAATTAATTTAAATAACA

-200

TTATATTTGTAAATAAAAITGTAATTTAACATGTAGAATAAAGAGÀTTTTTAGTTTTATT

AACAGGAIGAAAATCCATAAAAC CGT AAATGTGATTTCTAAATT AGTTT AAA ΑΤΛΑΑΑΑΑ • . -100 · ·

CAACCATTrCCTCAnAdTCACATCAATATCTAAATATCAACAACCCAAAÇÇ^CgmAA

GAATGACTAGAAATAAATTTATA£CTAATAAGTTTAGTATTKTATCCTmCAGTATTAC

TATTTCCTATATCCTCjCTCACAGGCTATAGKAGTAAATGCTATGAATGAACATTACACTG

100

AGAGTCATATTAAAACAAACCITAAAACTCAAAAAAATAAAACTGAAAAACAAAAATTTA

CO

AAGACAGTATTAATAACTTACTTIOkAACAGAATTTACCAATGAAACTrTAGATAAAATAC

200

AGCAGACACAAGACTTATTAAAAAAGATACCTAAGGATGTACTTCAAATTTATACTGAAT

TAGGAGGAGAAATCTATTTTACAGATATAGATTTAGTAGAACATAAGGAGTTrACAACATl

300

120

TAAGTGAAGAAGAGAAAAATAGTATGAATAGTAGAGGTGAAAAAGTTCCCTTTGCATCCÍ

400

140

CTTTIGTATITGAAAAGAAAAGGG AAACACCT AAA TI AATT ATAAAT ATCAAAG ATTATC

ICO

CAATTAATAGTGAACAAAGTAAAGAAGTATATTATCAAATTCGAAAGCGGATnCTCTn

SOO

110

ATATTATAAGTAAGGATAAATCTCTAGATCCAGAGTTTTTAAATTTAATTÀAGAGTTTA

GCGATGATAGTGATAGTACCGACCTTTTATTTAGTCAAAAATTTAAAGAGAAGCTAGAA

COO

320

TGAATAATAAAACTAXAGATATAAATTTTATAAAAGAAAATT7AACTGAATTTCAGCATG

700

240 .

CCmTCTTTAGCGTmCTTATTATTTTGCACCTGACCATAGAACGGTATTAGAGTTAT

2(0

ATG CC CCCGACATCTTTGAGT ATATGAAT AAGTTAGAAAAAGCGGGATTTC A&AAAATAA SOO

210

GTCAAAGTTTGAAGAAAGAAGGTGTGGAAAAAGATAGGATTGATGTGCTGAAAGGAGAAA

AAGCACTTAAAGCTrCAGGTTTAGTACCAGAACATGCAGATGCTTTTAAAAAAATTGCTA

SOO

GAGAATTAAATACATATATTCTTTTTAGGCCTGTTAÁTAAGTTàGCTACAAACCTTATTA 1000 .

AAAGTGGTCTGGCTACAAAGGGATTGAATGTTCATCGAAAGAGTTCGGÁTTGGGGCCCTC

3(0

TACCTCCATACATACCATTTGATCAACATTrATCTAACAAGCATCCTCAACAATTAGCTC

1100

310

TCGAGAAAGGAAATTTAGAAAATAAAAAATCAATTACAGAGCATGAAGCTGAAATAGGTA

400

AAATACCATTAAAGTTAGACCATTTAAGAATAGAAGAGTTAAAGGAAAATGGGATAATTT

1200

420

TCAAGGGTAAAKaAGAAATTGATAATGGTAAAAAATATTATTTCTTAGAATCGAATAATC

1300

440

AGCTATATGAATTTAGAATTAGCGATGAAAACAACGAAGTACAATACAAGACAAAAGAAG

4(0

CTAAAATTACTCTTTTAGGGGAAAAATTCAATTGGACAAATATAGAACTGATGGCTAAAA

1400

4S0 . .

ATCTAGAAGGGGTCTTGAAGCCGTTAACAGCTGACTATGATTXATTTGCACTTCCCCCAA

500

CTTTAACAGAAATAAAAAAACAAATACCACAAAAAGAATGGGATAAAGTAGTTAACACCC

1500

530

CAAATTCATrAGAAAAGCAAAAAGGTCTTACTAATrTATTCArrAAATATGGAATTGACA κοο

540

CGAAACCGCATTCAACTAAGGGAA.CTTTATCAàATTGGCAAAAACAAATCCTTCATCCTT

5<0 . - .

TGAATGAAGCAGTCAAATATACAGGATATACAGGGGGGGA1GTCGTTAACCATCGCACAC

1700

580 ..

AGCAAGATAATGAAGAGTTTCCTGAAAAAGATAACCAAÀTTTTTATAATTAATCCAGAAC <00 .

GTGAATTrATATTAACTAAAAATTGGGAGATGACAGGTAGATTTATAGAAAAAAACATTA

1800 <20

CGGGAAAAGATTATTTATATTATmAACCGTTCTTATAATAAAATAGCTCCTGGTAATA

1)00 <40

AAGCTTATATrCAGTGGACTCATCCGATrACAAAAGCCAAAATAAATACCATCCCTACGT «0

CACCAGAGTrTATAAAAAACTrATCCAGTATCACWlGXTCTrCAAATCTAGGAGTTTATA

2000 <80

AAGATAGTGGCGACAAAGACGAATTrCCAAAAAAAGAAAGCCTGAAAAAAATTCCAGGAT

700 .

ATTTGTCAGACTATTACAATTCAGCAAATCATATJmTCTCAGGAAAAAAKGCGTAAAA

2100

720 '

TATCAATATTTCGTGGAATCCAAGCCTATAATGAAATTGAAAATGTTCTAKAATCTAAAC

2200

740

AAATAGCACCACAATACAAAAATTATTrrCAATATTXAAAGCAAACGATTACCAATCAAC

7<0 .

TTCAATTGCTTCTAACACATCAAAAA TCTAATATTG AATTTAAATTATTCTATAAAC AA7

2300

780 .

TAAACTTTACAGAAAàTGAAACGGATAATTTTGAGGTCTTCCÀAAAAATTATTCATGAAJ

800

AATAAATATATATAATTGrrrTTCTGAÀAATTCATCATTTTAAAGAAGACACTAGGAAT·.

2400

AAATAGATGTATTCAATAGrrATAGTAATGGICTTGTATGGACATACCGCTrATACTTTÍ

2500

CGAGGTAGTAGATATTAAACAACATATAGCAAATGAACTGGATGTAGATC

ou o encadeamento dos nucleótidos complementares da sequência de fórmula I.

Sequências de acordo com a presente invenção caracterizam-se pelo facto de compreenderem o encadeamento de fórmula I definido antes ou pelo facto de serem constituídas por todo ou parte deste encadeamento.

A sequência a jusante do sítio de ligação aos ribossomas caracteriza-se pelo facto de ser particularmente rica em A-T.

E evidente que as bases da sequência de nucleotidos considerada podem estar em uma ordem diferente da encontrada nos genes e/ou que estas bases podem ser, eventualmente, substituídas, desde que uma sonda elaborada a partir de uma tal sequência dê uma resposta caracteristica e não equívoca quanto à capacidade de reconhecer a presença de genes que codificam para uma adenil-ciclase tal como a segregada por 3, anthracis.

Qualquer sequência de nucleotido3 hibridável com o encadeamento de fórmula I, tal como a obtida pela trans crição enzimática inversa do ARN correspondente ou ainda pela síntese química, entra igualmente no quadro da presente invenção.

A sequência de nucleótidos de acordo com a presente invenção corresponde ainda, de acordo com o código genético universal, a pelo menos uma parte da seguinte sequência de fórmula II em aminoácidos;

- 9 II a

XTXKXFlPIt

LFAZSSSOAtl tlDJXXMKXT

XDtlMMLVKT

OOTODLLCX I lccxiyftpi

LSEttKMSMM trvrtxKAtT

A1MSXO3XXV

OJJSXDXSLD

SOO5DSSDLL rrsixsrsvL

CVNANMEKTT

CKMKTEKCKF tFTFXTLDXI fxdvlxiyse

DLVrMXELOD

SKCtKVFFAS

PKLJIKIF, DY

YYXICXGISL

P2FLNL1*XSL rsoxrxtxLc /

II b

aso z.	X	H	X	s	X	0	X
340 A	F	s	L	A	f	s	T
2(0 Y	A	F	D	K	•X	X	X
aio s	I	s	L	X	X	X	G
300 X	A	L	X	A	S	c	V
320 X	X	L	M	T	T	1	L
240 X	s	G	V	A	r	X	G
310 V	A	C	Y	X	F	r-	0
310 V	X	X	G	K	u	c	r
400 X	2	F	L	X	L.	α	K-
420 L	X	G	X	X	X	2	D
440 0	V	Y	X	F	X	J	S
450 G	X	I	T	V	L	G	X
400 N	V	t	G	V	L	X	F

riKtKLTC

F AFDXXTV

HXLIXCG F

X X 0 X 1 0 V V

FtXAOAFX kfvwxiat

M VMCXSSG

DLSXXMCO

KS I Y X R E G

XZEXLXXK

CKKYYLLE

XWRXVOYX

FHWXN1XV

YADYOLFA r ο ι

L X L

X X I

X C X

X 2 A

R L 2

W C F

L A

X 1 G

G 2 1

S Ν N

Τ X X

Κ A X

L A F

500 $ L Y X 2 X X 0 2 FOXXWOXVVHT

Ρ Μ 8 L X I Ο

Α X Ρ Ο S 7 I

L Ν I λ V X 7

X Ο Ο Η Ε X Ρ

C I Ρ X L Τ X

C X Ο 7 L 7

Α Α 7 X I W 7

S Α C Ρ ϊ X Μ

X D S C Ο X D

L S Ο 7 7 Η

I S X Ρ X C I

Ο I Α Ρ ί 7 X

V ο L L L Τ Η

L Ν F 7 X Ν Ε

II c

X G V 7 Μ L L

C 7 L S Ν W 0

C 7 7 C C Ο

Ρ Ζ X Ο Η I 1

Κ W Κ Μ 7 C X

Ρ « Α S 7 Α

Λ Ρ X 7 X Α X

X. S S X Α Α S ί Ρ Α X X X S

S Α Η Η I Ρ S

Ο Α 7 Μ X I Κ

Α 7 Γ Ο 7 L X

Ο X S Η I X Γ

Ο Η Ρ I V Ρ t X 7 6 I Κ

X 0 Μ L Ο Α

V V Ν Η C 7

Ρ I *1 Α Ρ · Ε

Ρ X Ε X Α 1

Κ X Α Ρ C Ν

I Μ 7 J Ρ 7

Η V C V 7

V X X 1 Α C

I X X Α X

Α V L X S Κ

I Α X 7 Ν Ο

X L L 7 X Ο

Ο Κ X X Ο X

Κ ··· ~

sentara os

D

Ξ

A

R

N

C

Q

G

H

I

L

K

M

P

P s

T w

Y

V

As letras indicadas neste encadeamento apreseguintes significados convencionais:

Ácido aspãrtico

Ácido glutâmico

Alanina

Arginina

Asparagina

Cisteína

Glutamina

Glicina

Histidina

Isoleucina

Leucina

Lisina

Metionina

Penilalanina

Prolina

Serina

Treonina

Triptofano

Tirosina

Valina

A presente invenção diz além disso respeito a uma proteína com actividade adenil-ciclase do tipo da sin- 13 tetizada pelo B. anthracis, assim como os fragmentos peptídicos desta proteína, correspondendo de acordo com o código genético universal a uma das sequências de nucleótidos referidas antes.

A proteína de acordo com a presente invenção é tal como obtida mediante transformação de células hospedeiras por meio de um vector recombinante comportando uma sequência de nucleótidos como definida antes sob o controlo de elementos de regulação que permitem a expressão da referida sequência na célula hospedeira cultivada em um meio apropriado de células hospedeiras transformadas e recuperação da proteína a partir destas células ou directamente a partir do meio de cultura logo que ela é segregada.

A presente invenção diz mais especialmente respeito a uma proteína correspondente, de acordo com o código genético universal, à sequência de nucleótidos de fórmula I e que é representada pelo encadeamento de fórmula II de 800 aminoácidos. Esta proteína possui um peso molecular teórico M de 92 387. Como outras proteínas extracelulares de organismos gram positivos, a adenil-ciclase aparece sintetizada pelo B. anthracis sob a forma de um enor me precussor cuja sequência sinal ê eliminada quando da secreção. 0 início da sequência sinal deverá ocupar a posição 29 ou poderá ocupar a posição 34. A composição global depois da eliminação da sequência do precussor corresponde a uma proteína hidrófila. Resíduos básicos assim como aminoácidos hidrófobos estão próximos da parte N-terminal como características de um péptido sinal. Pode-se substituir este enca- 14 L, deamento sinal por outros péptidos sinais, em particular para melhorar a secreção da adenil-ciclase em outros organismos.

Verificar-se-á que a adenil-ciclase antes referida, como a expressa pelo B. anthracis, não contém resíduos císteína, o que contrasta com as observações bioquímicas efectuadas sobre as ciclases eucariotas.

estudo desta sequência de 800 aminoácidos mostra que ela apresenta várias regiões comuns com a adenil-ciclase secregada pela B. pertussis de 1706 aminoácidos, tal como desenvolvida na parte da descrição ilustrando mais pormenorizadamente a presente invenção.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, a proteína da presente invenção com actividade adenil-ciclase dá lugar a uma reacção imunológica cruzada com anticorpos dirigidos contra sub-unidades catalíticas da adenil-ciclase de cerebro de rato ou ainda contra a adenil-ciclase de B. pertussis.

A proteína de acordo com a presente invenção e os seus fragmentos, que se podem obter igualmente mediante síntese química, apresentam com vantagem um grau de pureza elevado e são utilizados para formar, de acordo com técnicas clássicas, anticorpos policlonais.

Tais anticorpos policlonais, assim como os anticorpos monoclonais capazes de reconhecer especificamente a proteína referida antes e os seus fragmentos fazem igualmente parte da presente invenção.

Sequências de nucleótidos de acordo com a presente invenção obtêm-se com vantagem de acordo com o pro- 15 cesso de clonagem da requerente evocado antes. Os vectores recombinantes de expressão e de clonagem capazes de transformar uma célula hospedeira apropriada entram igualmente no quadro da presente invenção. Estes vectores comportam pelo menos uma parte de uma sequência de nucleótidos de acor do com a presente invenção sob o controlo de elementos de regulação que permitem a sua expressão. As estirpes de microrganismos transformadas fazem igualmente parte da presente invenção. Estas estirpes comportam uma das sequências de nucleótidos definidas antes ou ainda um vector recombinante tal como definido anteriormente.

A presente invenção diz igualmente respeito às aplicações biológicas das sequências de nucleótidos, das proteínas correspondentes e dos anticorpos monoclonais ou policlonais.

Estas aplicações compreendem a elaboração, a partir de fragmentos intragénicos do encadeamento de fórmula I, de sondas para a detecção de sequências semelhantes nos genes que produzem adenil-ciclases. Esta elaboração compreende, particularmente, a desnaturação das sequências de dupla cadeia para se obter uma sequência de cadeia simples como sonda.

A presente invenção diz, portanto, respeito a sondas de detecção caracterizadas pelo facto de comportarem pelo menos uma parte de uma sequência de nucleótidos definida antes, mais especialmente um fragmento intragênico que codifica para o sítio catalítico da ligação com a calmodulina ou de maneira suficientemente específica para uma parte deste sítio, nas adenil-ciclases bacterianas. Tais

fragmentos, complementares dos sítios correspondentes nos genes de eucariotas que exprimem a adenil-ciclase com actividade dependente da calmodulina, apresentam em particular a vantagem de facilitar a clonagem e a análise dos génes em questão.

fragmento de ADN utilizado como sonda comporta um número de nucleótidos suficiente para obter a especificidade requerida e a formação de um híbrido estável.

Sondas apropriadas para este tipo de detecção são marcadas, com vantagem, por um elemento radioactivo (sondas quentes) ou qualquer outro grupo não radioactivo (sondas frias) permitindo o reconhecimento da sonda no estado hibridado com a preparação comportando o ADN a estudar.

De acordo com as técnicas clássicas, fazem-se contactar estas sondas com uma amostra biológica compor tando bactérias, ou directamente com estas bactérias ou os seus ácidos nucleicos, em condições que permitam a hibridação eventual da sequência de nucleótidos da sonda com uma sequência complementar, eventualmente contida no produto testado.

Pode-se, por exemplo, utilizar o método de hibridação sobre manchas. Este método comportar, depois da desnaturação do ADN previamente obtido a partir de células que exprimem a adenil-ciclase, o depósito de uma quantidade alíquota deste ADN sobre membranas de nitrocelulose, a hibridação de cada membrana nas condições usuais com a sonda e detecção, de maneira clássica, do híbrido formado.

Pode-se igualmente utilizar um método de hibridação sobre réplica, de acordo com a técnica de Southern.

Este método compreende a separação electroforética em gel de agorese dos fragmentos de ADNs produzidos após tratamento dos ADNs com enzimas de restrição, transferência após desnaturação alcalina sobre membranas apropriadas e a sua hibridação com uma sonda nas condições usuais. Nem sempre ê necessário proceder à expressão prévia do ADN. Ê suficiente que o ADN seja acessível à sonda.

A presente invenção fornece assim instrumentos que permitem detectar rapidamente, com uma grande especialidade, sequências similares nos genes que codificam para adenil-ciclases, o que permite estudar a origem e o modo de acção destas adenil-ciclases.

Para a realização dos métodos de detecção considerados antes baseados na utilização de sondas nucleotidicas, recorre-se, com vantagem a estojos ou conjuntos comportando:

- uma determinada quantidade de uma sonda nucleótidica de acordo cora a presente invenção,

- com vantagem, um meio apropriado respectivamente para a formação de uma reacção de hibridação entre a sequência a detectar e a sonda,

- com vantagem, reagentes que permitam a detecção dos complexos de hibridação formados entre a sequência de nucleotidos e a sonda quando da reacção de hibridação.

A presente invenção diz igualmente respeito às aplicações imunológicas das proteínas definidas antes mais especialmente para a elaboração de anti-soros específicos assim como de anticorpos policlonais e monoclonais.

Os anticorpos policlonais obtêm-se de acordo com as técnicas clássicas mediante injecção da proteína a animais, recuperação dos anti-soros, depois dos anticorpos a partir dos anti-soros por exemplo mediante cromatografia de afinidade.

Os anticorpos monoclonais são produzidos pela maneira habitual mediante fusão de células de mielomas com células de figado de animais previamente imunizados com a ajuda das proteínas de acordo com a presente invenção.

Os ensaios de toxicologia realizados com a adenil-ciclase na ausência do antigénio protector demonstraram a sua ausência de toxicidade.

Utiliza-se, com vantagem, a totalidade ou parte das sequências imunoprotectoras destas proteínas para a elaboração de vacinas com a condição de não dar lugar a reacções imunitárias indesejáveis pondo em jogo, por exemplo, a adenil-ciclase do hospedeiro.

A presente invenção diz igualmente respeito a vacinas moleculares capazes de prevenir as infecções provocadas pelo B, anthracis e os seus efeitos tóxicos no homem e no animal, sendo estas vacinas à base das proteínas definidas antes, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Como os anticcrpcs formados contra a adenil-ciclase de B. anthracis dão lugar a uma reacção imunológica cruzada com a adenil-ciclase de B. pertussis’¹, a presente invenção fornece, com vantagem, uma dupla vacina contra as infecções provocadas por B. anthracis e B> pertussis.

Indica-se a seguir, como exemplo não limitativo, os materiais e os métodos utilizados para a clonagem

e sequenciação do gene da adenil-ciclase de B. anthracis.

As figuras 1 e 2 a que se faz referência representam:

- a figura 1, o mapa de restrição de um fragmento de ADN de cerca de 3,8 kb comportando o gene cya de B, anthracis, e

- a figura 2, as sequências de aminoácidos das adenil-ciclases de B. anthracis (linha superior) e de B. pertussis (linha inferior).

a) Estirpes bacterianas e plasmídeos

Utilizam-se as seguintes estirpes de E. coli para a transformação TP61O (5) θ para a transferência JM1O5 (6).

plasmideo recombinante utilizado pMMA8812 ê um derivado do pUC8 contendo um fragmento EcoRV-PstI de 3,8 kb comportando as determinantes para a adenil-ciclase de B. anthracis (1). 0 fragmento de restrição EcoRV-PstI está representado na figura 1.

plasmídeo recombinante pMMA8812 exerce uma acção de complementação, activada pela calmodulina, face à deficiência em ciclase de uma estirpe de E. coli cyaí

b) Meios e reagentes químicos.

Realizam-se culturas em meios LB ricos de Miller (7). A ampicilina, quando utilizada, é adicionada à razão de 100 microgramas por ml. Utilizam-se enzimas de restrição ADN T4 ligase e PolIK (Boehringer-Mannheim) e a ADN T7-polimerase modificada (Sequenciação) comercializada por USBG. Os oligodesoxi-ribonucleotidos utilizados como ϊ

pares de iniciação na sequenciação do ADN por um lado e do dATP por outro lado são comercializados respectivamente por Pharma e por Amersham.

c) Análise da sequência de nucleótidos.

Utilizam-se sub-clones no vector de cadeia simples M13mpl9 (8). Para se obter eliminações unidereccionais, recorre-3e ao sistema ciclone (IBI).

A sequência de nucleótidos é determinada de acordo com o método de terminação de cadeia didesoxinucleotido (9) quando se utiliza PolIK ou de acordo com um método de terminação de cadeia didesoxinucleotido modificada, quando se utiliza a sequenase (10).

Determinou-se a sequência de nucleótidos da inserção do ADN de B. anthracis de pMMA8812.

fragmento da figura 1 apenas comporta um quadro aberto de leitura de 2400 pb. Bste último contém 800 códãos que vão do sítio considerado como sendo o sítio de iniciação da tradução até ao códão de terminação TAA.

códão considerado como códão ATG de início é precedido por um sítio, do tipo dos sítios de ligação aos ribossomas (RBS), cuja sequência GGAGG é complementar do 3*OH do ARN ribossomal 16S.

A sequência completa de nucleótidos do quadro aberto de leitura está representada na figura 2. Verifica-se que a sequência a jusante do sítio RBS ê particularmente rica em A-T. A sequência de aminoácidos traduzida corresponde ao encadeamento de fórmula II definido antes.

sítio de clivagem proposto na figura 2 de- 21 ve ser confirmado pelos dados respeitantes ao resíduo N-terminal da adenil-ciclase. Como se indicou antes, a adenil-ciclase é verosimilmente sintetizada por B. anthracis sob a forma de um precursor maior cuja sequência sinal é eliminada quando da secreção. 0 tratamento do precursor deverá conduzir a uma proteína madura de 89261.

d) Comparação das estruturas primárias das adenil-ciclases de B. anthracis e de B. pertussis.

Representou-se na figura 2, a sequência completa do polipeptido da adenil-ciclase de B, anthracis (linha superior) e a sequência polipeptídica N-terminal da adenil-ciclase de B. pertussis (linha inferior).

Os asteriscos indicam os aminoácidos iguais e as cruzes os aminoácidos da mesma classe química.

A comparação destas sequências mostra que elas são, no seu conjunto, diferentes mas que apresentam partes de maior ou menor semelhança.

Verifica-se, em particular, uma semelhança no domínio de cerca de 400 aminoácidos situado na enzima de B. anthracis na parte central e na de B. pertussis na parte N-terminal.

Experiências de eliminação in vitro demons traram que a sequência de 450 aminoácidos da extremidade N-terminal da adenil-ciclase de B. pertussis corresponde ao domínio catalítico activado pela calmodulina, o que leva a reconhecer o centro catalítico da adenil-ciclase de B. anthracis na região que vai do aminoácido na posição 300 ao aminoácido na posição 683.

A semelhança mais importante corresponde ao péptido de 24 aminoácidos (da posição 342 à posição 365). Esta sequência contém cinco resíduos gli e a sequência núcleo G --- GKS (AKS na B. pertussis) que se encontra quase sempre nas proteínas tendo uma afinidade para os nucleotidos.

Duas outras regiões apresentam uma semelhança menor. Correspondem aos domínios que se estendem das posições 487 a 501, por um lado, e 573 a 594, por outro lado.

De acordo com os resultados dos estudos efectuados sobre esta sequência de aminoácidos, a adenil-ciclase de B. anthracis aparece organizada em domínios funcionais.

Pelo menos três funções podem ser atribuídas à molécula, a saber:

1- interacção com células eucariotas. Esta propriedade exerce-se por intermédio do antigénio protector (PA) que se fixa logo de início às células sensíveis, interactuando depois com a adenil-ciclase,

2- a internalização,

3- a fixação à calmodulina e a activação da ciclase.

A parte central da molécula (região compreendida entre as posições 350 a 390) ê atribuída ao domínio dependente da calmodulina.

1)

2)

Mock e colab.,

Vodkin Leppla,

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Gene 1988, 64, 277 - 284

Cell 1983, 34: 693 - 697

3) Robertson Leppla, Gene 1986, 44: 71 - 78

4) Tippetts Robertson, J. of Bact. 1988, vol 70, n’ 5, 2263 - 2266

5) Hedegaard Danchin, ”iiol. Gen. Gen. 201 (1985), 38 - 42

6) Yanisch-Perron colab., Gene 33 (1985), 103 - 119

7) ftíiller, Cold Spring harbor, NY, 1972

8) Norrander colab., Gene 26 (1983), 101 - 106

9) Sanger colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463 - 5467

10) Tabor Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 4767 - 4771

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a clonagem de uma sequência de nucleotidos, caracterizado pelo facto de se promover a interacção de adenil-ciclase de B. anthracis com caimodulina numa estirpe receptora deficiente em adenil-ciclase, comportando um plasmídeo que exprime de cima para baixo níveis de caimodulina, codificando os genes respectivamente para a adenil-ciclase e para a caimodulina sendo de origem diferente, o que permite a clonagem de uma sequência constituída por pelo menos uma parte de uma sequência que codifica para uma proteína com actividade de adenil-ciclase tal como expressa por B. anthracis .
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de conduzir ã clonagem de uma sequência de capaz de se hibridar com genes que codificam para uma ciase de B, anthracis.

nucleótidos adenil-ci
3.- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a sequência de nucleótidos clonada comportar a informação para a expressão de uma adenil-ciclase, ou de fragmentos desta última capazes de formar um complexo imunolõgico com anticorpos dirigidos respectivamente contra uma adenil-ciclase de

B. anthracis ou de B. pertussis, ou contra fragmentos de uma tal adenil-ciclase.
4. - Processo para a preparação de uma sequência de nucleotidos recombinante, sendo a referida sequência constituída por pelo menos uma parte de uma sequência que codifica para uma proteína com actividade de adenil-ciclase tal como expressa por

B. anthracis, caracterizado pelo facto de se associar uma sequência do tipo da obtida pelo processo de acordo com uma das rejL vindicações 1 a 3 com um promotor capaz de controlar a transcrição da sequência e com uma sequência de ADN que codifica para sinais de terminação de transcrição.
5. - Processo para a preparação de uma sequência de nucleotidos recombinante, sendo a referida sequência constituída por pelo menos uma parte de uma sequência que codifica para uma proy

-26teína com actividade de adenil-ciclase tal como expressa por

B. anthracis, caracterizado pelo facto de se associar uma sequência de nucleótidos do tipo da obtida pelo processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 com um promotor e um operador que permitem controlar a transcrição, e com uma sequência de sinal que permite a secreção da proteína no espaço periplásmico (gram-) ou no meio exterior.
6.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

1 a 5, caracterizado pelo facto de a sequência de nucleótidos ser capaz de se hibridar com uma sonda formada a partir da sequência que apresenta o seguinte encadeamento de nucleótidos de fórmula