JPH03502761A - バチルス・アンスラシスのアデニルシクラーゼを発現するヌクレオチド配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ふり三ユム己ユムビュＬジ堅ヱムづ土１１」ヌクレオチド配列 アデニルシクラーゼをコードするヌクレオチド配列に係る。

本発明は更に、このアデニルシクラーゼに対応するタンパク質及びその生物学的 適用に係る。

Ｂ、ａｎｔｈｒａｅｉｓはヒト及び動物に対して高い病原性を有するダラム陽性 菌である。そのビルレンスは、３成分外毒素及びポリーＯ−グルタミン酸の莢膜 の産生に起因する。

３種のタンパク質は、９５ｋＤａの防御抗Ｍ（Ｐ＾）、８３ｋＤａの致死因子（ ＬＦ）及び８９ｃｌＫａの浮腫形成因子（ＥＦ）から精成さ、れる。

これらのタンパク質はそれ自体は非毒性である。しかしながら、相互作用により 動物体内で２つの異なる病理応答を生じる。

例えばＰ＾をＬＦと共に注入すると死に至り、Ｐ＾をＥＦと共に皮肉注射すると １モルモット又はウサギの皮膚に？￥！腫が発生する。真核細胞活性化物質であ るカルモジュリンに依存他の病原Ｎ（即ち１ど１幻」ユ上Ｌ」ｌＬｕ互１ム、） も宿主のカルモジュリンにより活性化される細胞外の毒性アゾ三゛ルシクラーゼ を産生ずることは知られている０Ｍｏｃｋ他（１）が報告したように、これらの ２種のアデニルシクラーゼは系統的番こ全く異なる生物により産生されるにも拘 らず、抗原的番こ結びつけられる。

Ｐ＾、ＬＦ及びＥＦの発現に関与する遺伝子は、Ｂ、ａｎｔｈｒａｃｉｓのプラ スミドｐＸＱ１に存在する。大腸菌におけるこれらの遺伝子の分子クローニング 及び発現は、Ｐ＾につし）てはＶｏｄｋｉｎ及びＬｅｐｐｌａ（２）、ＬＦにつ いてはＲｏｈｅｒｔｓｏｎ及びしｅｐｐｌａ（３）、ＥＦについてはＴ！Ｉ）ｐ ｅｔｔｓ及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎにより報告されている。

Ｍｏｃｋ他（１）は更に、大腸菌におけるＢ、ａｎｔｈｒａｃｉｓのアデニルシ クラーゼのクローニング及び発現方法を報告している。

クローニングの一般方法は本願出願人名義の１９８７年７月２４日付は仏国特許 出願第８７７１０６１４号の主旨を精成している。

要約すると、この方法ではアデニルシクラーゼ−カルモジュリン相互作用を使用 し、即ちｅＡＭＰを産生させる。遺伝子のクローニングはアデニルシクラーゼを 欠失し且つ高レベルのカルモジュリンを発現するプラスミドを担持するレセプタ ー株で実施される。クローニングプロセスで協同する遺伝子、即ちアデニルシク ラーゼをコードする遺伝子とカルモジュリンをコードする遺伝子とは異なる起源 のものである。

この分野で研究を進めることにより、本発明者らはＬａｎｔｈｒａｃｉｓにより 発現されるようなアデニルシクラーゼの少なくとも活性部分の発現に必要な情報 を担持する配列を決定するに至った。

３：の段階で、遺伝子の構造、その特性及び他の遺伝子との間に類似性がある場 合は該類似性を規定することができた。この研究を進めることにより、発現され た毒素の一次構造を決定することができ、また、該毒素を例えばＬＰエニー発明 の目的はしたがって、Ｂ、ａｎｔｈｒａｃｉｓにより発現されるようなアデニル シクラーゼ活性を有するタンパク質をコードすることが可能な新規ヌクレオチド 配列を提供することである。

本発明の別の目的は、これらのタンパク質の（アデニルシクラーゼ活性に関する ）少なくとも活性部分を提供することである。

本発明の別の目的は、アデニルシクラーゼの免疫防御配列の全部又は一部を含む 分子ワクチンを提供することである。

本発明のヌクレオチド配列は、Ｂ、ａｎｔｈｒａｃｉｓにより発現されるような アデニルシクラーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列の少なくとも一部 により構成されることを特徴とする。

有するタンパク質をコードする遺伝子とハイブリダイズすることが可能である。

本発明は更に、夫々Ｂ、ａｎｔｈｒａｃｉｓ＝　Ｂ、　ｅｒｔｕｓｓｉｓ−もし くはラット脳のアデニルシクラーゼ又はこのようなアデニルシクラーゼのフラグ メントに特異的な抗体との間で免疫複合体を形成することが可能なアデニルシク ラーゼ又はアデニルシクラーゼフラグメントの発現のための情報を担持すること を特徴とするヌクレオチド配列にも係る。

本発明は更に、場合により転写終結配列及び翻訳信号及び分泌信号をコードする ＤＮ＾配列の転写を調節することが可能なプロモーターと組み合わせて、上記配 列の１つを含む組換配列にも係る。

本発明は更に、転写の調節を可能にするプロモーター及びオペレーター、並びに 細胞周辺腔（グラム−）又は外部媒質へのタンパク質の分泌を可能にするシグナ ル配列との組み合わせとしての組換ヌクレオチド配列にも係る。

別の態様によると、本発明のヌクレオチド配列は、全体としてＢ、ａｎｔｈｒａ ｃｉｓのリエ遺伝子に対応する下記ヌクレオチド連ｆａ（１）： Ｃλ入ＴＴＩこ入入入入　ＴＣＧＣ入Ｃ丁ＴλＧ　入入入丁へＣ入ＣＡＴ　　入 丁入Ｇλ入入Ｔ入λ入こλ入ＣＣＴ入入ＴＣＣ入ＴＧＴＣ入b丁 ＋６０ ＣＧ′ｒＴｒ′ｒｃＴＴＴ　入ＧＣＧＴＴＴＴＣ７Ｔ入Ｔ’ｒλＴＴＴＴＧ　Ｃ λ【て１ｘシリシユ入　！為０にλＣＧＧＴＡ　ＴＴ八ＧλfＴＴ入！ 入ＴＧＣＣＣＣＣＣ入　Ｃ入ＴＧＴｒ％λＧ　丁入ＴλＴＧλ人テ入　ＡＧＴＴ λＧ人λλ五λＧＧＧＧＧ入ＴＴ？Ｇ入Ｇ入入入入Ｔ入入ＡＡＧＣＴＴ入ＴＡ？ 　１Ｇ入ＧＴＧＧＡＣ？　（ａＴｃＣＧ入デｚ入Ｃ入λ糺ＭンＸ１λＡＡＴ入入 入Ｔ入ＣＣ入ＴＣＣＣ’ＴＡＣＧ？ＧＧλＧＧＴＡＧＴ入Ｇ入ＴＡＴ’ｒ入入入 ＣλλＣλＴ入丁入ＧＣ入入λＴＧ入入ＣＴＧＧλＴＧＴＡＧ入ＴＣ又は配列（ １）の相補的ヌクレオチド連鎖を有する配列から形成されるプローブとハイブリ ダイズすることが可能である。

本発明の配列は、上記連鎖（Ｉ）を含むか又はこの連鎖の全部もしくは一部によ り構成されることを特徴とする。

リポソームとの結合部位の下流の配列は八−Ｔ含有量が特に高いことを特徴とす る。

自明のことながら、このような配列から作成される１０−ブがＢ、ａｎｔｈｒａ ｅｉｓにより分泌されるようなアデニルシクラーゼをコードする遺伝子の存在を 認識する能力に間して特徴的且つ明確な応答を与える限り、該当ヌクレオチド配 列の塩基は遺伝子中に見いだされる順次と異なる順序でもよく、及び／又はこれ らの塩基は場合によって置換されてもよい。

対応ＤＮＡの酵素的逆転写又は化学的合成により得られるような連鎖（１）のヌ クレオチド配列とハイブリダイズ可能な全ヌクレオチド配列も本発明の範囲に含 まれる。

本発明のヌクレオチド配列は更に、汎用遺伝暗号に従い、次のアミノ酸配列（■ ）： ＭＴＲＮＫＦ　工　ＰＮＫＦＳ　　エ　エ　５ＦＳＶＬ２０　　Ｌ　Ｆ　Ａ　Ｘ 　Ｓ　Ｓ　Ｓ　Ｑ　Ａ工Ｅ　Ｖ　）Ｊ　Ａ　Ｎ　Ｎ　Ｅ　ＨＹ　Ｔ２ＯＥＳＤＩ ＫＲＮＨＫＴＥＫＮＫＴＥＫＥＫＦ６０　　　ＫＤＳ　　工　ＮＮＬＶＫ’ｒＥ ＦＴＮＥＴｒ、ＤＫＩ８０　　　Ｑ　Ｑ　Ｔ　Ｑ　Ｄ　Ｌ　Ｌ　）ＣＫ　工ＰＫ ＤＶＬＥＩＹＳＥ１００　　Ｌ　Ｇ　Ｇ　Ｅ　Ｉ　Ｙ　Ｆ　Ｔ　Ｄ　よりＬＶＥ ＨＫＥＬＱＩ）１２０　　Ｌ　Ｓ　Ｅ　Ｅ　Ｅ　Ｋ　Ｎ　Ｓ　Ｍ　Ｎ　Ｓ　ＲＧ 　Ｅ　Ｋ　Ｖ　Ｐ　Ｆ　Ａ　５１４０　　ＲＦ　Ｖ　Ｆ　Ｅ　Ｋ　Ｋ　ＲＥ　Ｔ 　Ｐ　Ｋ　Ｌ　Ｘ　　Ｘ　Ｎ　Ｉ　　Ｋ　Ｄ　Ｙ１６０　Ａ　Ｘ　Ｎ　Ｓ　Ｅ　 Ｑ　Ｓ　Ｋ　Ｅ　Ｖ　Ｙ　Ｙ　Ｅ　Ｉ　Ｇ　Ｋ　Ｇ　Ｉ　Ｓ　Ｌ１８０ＤＩ　　 工５ＫＤＫＳＬＤＰＥＦＬＮＬ　工　ＫＳＬ２００　　Ｓ　Ｄ　Ｄ　Ｓ　Ｄ　Ｓ 　Ｓ　　Ｄ　Ｌ　Ｌ　Ｆ　Ｓ　Ｑ　Ｋ　Ｆ　Ｋ　Ｅ　Ｋ　１．Ｅ２２０ＬＮＮＫ Ｓ　　工　ＤＩＮＦＩＫＥＮＬＴＥＦＱＨ２４０ＡＦＳＬＡＦＳＹＹＦＡＰＤＨ ＲＴＶＬＥＬ２６０　　Ｙ　　Ａ　　Ｐ　　Ｄ　Ｍ　　Ｆ　　Ｅ　　Ｙ　　Ｍ　 Ｎ　　Ｋ　　Ｌ　Ｅ　　Ｋ　Ｇ　　Ｇ　　Ｆ　　Ｅ　　Ｋ　　工２８０　　Ｓ　 　Ｅ　　Ｓ　　Ｌ　　Ｋ　　Ｋ　　Ｅ　　Ｇ　　Ｖ　　Ｅ　　Ｋ　　Ｄ　ＲＩ　 　Ｄ　Ｖ　　Ｌ　Ｋ　Ｇ　　Ｅ３００　　Ｋ　Ａ　Ｌ　Ｋ　Ａ　Ｓ　Ｇ　Ｌ　Ｖ 　Ｐ　Ｅ　ＨＡ　Ｄ　入Ｆ　Ｋ　Ｋ　Ｉ　Ａ３２０ＲＥＬＮＴＹ工ＬＦＲＰＶＮ ＫＬＡＴ）ＪＬＩ３４０ＫＳＧＶ入ＴＫＧＬＮＶＨＧＫＳＳＤＷＧＰ３６０ＶＡ ＧＹ　　工　ＰＦＤＱＤＬＳＫＫＨＧＱＱＬＡ３８０　　Ｖ　Ｅ　Ｋ　Ｇ　Ｎ　 　Ｌ　Ｅ　Ｎ　　Ｋ　Ｋ　Ｓ　　Ｉ　　Ｔ　Ｅ　ＨＥ　Ｇ　　Ｅ　　工　Ｇ４０ ０　　Ｋ　Ｘ　　Ｐ　　Ｌ　Ｋ　　Ｌ　　Ｄ　ＨＬ　Ｒ工　ＥＥＬＫＥＮＧ　　 エ　エ４２０　　ＬＫＧＫＫＥＩＤＮＧＸＫＹＹＬＬＥＳＮＮ４４０　　ＱＶＹ ＥＦＲＩＳＤＥＮＮＥＶＱＹＫＴＫＥ４６０ＧＫ工ＴＶＬＧＥＫＦＮＷＲＮＩＥ ＶＭ入に４８０　　Ｎ　Ｖ　Ｅ　Ｇ　Ｖ　Ｌ　Ｋ　Ｐ　Ｌ　Ｔ　Ａ　Ｄ　Ｙ　Ｄ 　Ｌ　Ｆ　Ａ　Ｌ　Ａ　Ｐ５ＱＯ５ＬＴＥ　　工　ＫＫＱ　工　Ｐ　Ｑ　Ｋ　Ｅ 　Ｗ　Ｄ　Ｋ　Ｖ　Ｖ　）Ｊ　Ｔ５２０　　ＰＮＳＬＥＫＱＫＧＬＴＮＬＬ　工 　ＫＹＧ　工Ｅ５４０　　ＲＫ　Ｐ　Ｄ　Ｓ　Ｔ　Ｋ　Ｇ　Ｔ　Ｌ　Ｓ　Ｎ　Ｗ 　Ｑ　Ｋ　Ｑ　Ｍ　Ｌ　Ｄ　Ｒ５６０Ｌ　Ｎ　Ｅ　Ａ　Ｖ　Ｘ　Ｙ　Ｔ　Ｇ　Ｙ 　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｄ　Ｖ　Ｖ　Ｎ　Ｅ　Ｇ　Ｔ５ＥＩＯＥ　Ｑ　　Ｄ　Ｎ　Ｅ　Ｅ 　Ｆ　Ｐ　Ｅ　Ｋ　Ｄ　Ｎ　　Ｅ　　Ｉ　　Ｆ　　エ　エ　ＮＰＥ６００　　Ｇ 　　Ｅ　　Ｆ　　Ｉ　　Ｌ　Ｔ　Ｋ　Ｎ　讐　ＥＭＴＧＲＦ　　工　ＥＫＮ　　 工６２０　　Ｔ　Ｇ　Ｋ　Ｄ　Ｙ　Ｌ　Ｙ　Ｙ　Ｆ　Ｎ　ＲＳ　Ｙ　）Ｊ　Ｋ工 人ＰＧＮ６４０ＫＡＹ工Ｅ＄ＪＴＤＰＩＴＫ入に工ＮＴＩＰＴ６６０　　Ｓ　　 λ　ＥＦ　　工　ＫＮＬＳＳ　　工　ＲＲＳ　　Ｓ　　Ｎ　Ｖ　Ｇ　Ｖ　Ｙ６８ ０　　Ｋ　Ｄ　Ｓ　Ｇ　Ｄ　Ｋ　Ｄ　Ｅ　Ｆ　Ａ　Ｋ　Ｋ　Ｅ　Ｓ　Ｖ　Ｋ　Ｋ 　Ｉ　入Ｇ７００　　ＹＬＳＤＹＹＮＳＡＮＨＩＦＳＱＥＫＫＲＩＫ７２０　工 　Ｓ　工　ＦＲＧ　　工　ＱＡＹＮＥ　　工　ＥＮＶＬＫＳＫ７４０Ｑ工入ＰＥ ＹＫＮＹＦＱＹＬＫＥＲ工ＴＮＱ７６０　　ＶＱＬＬＬＴＨＱＫＳＮＩＥＦＫＬ ＬＹ４Ｑ７８０　　Ｌ　Ｎ　Ｆ　Ｔ　Ｅ　Ｎ　Ｅ　Ｔ　Ｄ　Ｎ　Ｆ　Ｅ　Ｖ　Ｆ 　Ｑ　Ｋ　Ｉ　Ｉ　Ｄ　Ｅ００　　Ｋ の少なくとも一部に対応する。

この連鎖に示した文字は従来どおり次の意味を有する。

Ｄ　　　　アスパラギン酸 Ｅ　　　　　グルタミン酸 −トリプトファン Ｙ　　　　チロシン 本発明は更に、Ｂ、ａｎＬｈｒａｃｉｓにより合成されるような型のアデニルシ クラーゼ活性を有するタンパク質、及びこのタンパク質のペプチドフラグメント であって、汎用遺伝暗号に従い上記ヌクレオチド配列の１つに対応するフラグメ ントに係る。

本発明のタンパク質は、宿主細胞中で上記のようなヌクレオチド配列の発現を可 能にする調節成分の制御下に該配列を含む組換ベクターにより宿主細胞を形質転 換させ、形質転換した宿主細胞を適当な培地で培養し、タンパク質の分泌時にこ れらの細胞から又は直接培養培地からタンパク質を回収することにより得られる ようなタンパク質である。

本発明はより特定的には、汎用遺伝暗号に従いヌクレオチド配列（１）に対応し 且つ８００個のアミノ酸の連ｇ（ＩＩ）により表されるタンパク質に係る。この タンパク質は理論分子量Ｍｒ　＝　９２３８７を有する。他のグラム陽性生物の 細胞外タンパク質と同様に、アデニルシクラーゼは分泌時に除去されるシグナル 配列を有するより大きい前駆物質としてＬＢｊｈｒａｅｉｓにより合成されると 考えられる。配列の始点は２９位、又は３４位を占め得る。前駆物質の配列の除 去後の組成物全体は親水性タンパク質に対応する。塩基性残基及び疎水性アミノ 酸はシグナルペプチドの特徴としてＮ末端部分の近傍に位置する。特に他の生物 におけるアデニルシクラーゼの分泌を改良するために、このシグナル配列を他の シグナルペプチドに置き換えてもよい。

上記アデニルシクラーゼは、Ｌ」旦ｒｔｕｓｓｉｓ−により発現されるアデニル シクラーゼと同様に、システィン残基を含まず、これは真核細胞シクラーゼにお ける生化学的様相と対照的である。

８００アミノ酸のこの配列を検討した処、発明の詳細な説明の項に記載するよう に、１７０６個のアミノ酸のＢ、　ｅｒｔｕｓｓｉｓにより分泌されるアデニル シクラーゼと共通の領域を複数有することが判明した。

本発明の別の態様によると、アデニルシクラーゼ活性を有する本発明のタンパク 質はラット脳のアデニルシクラーゼの触媒サブユニット又はＢ、　ｅｒｔｕｓｓ ｉｓのアデニルシクラーゼに対する抗体との間で交差免疫反応を生じる。

本発明のタンパク質及び同様に化学的合成により得られるそのフラグメントは、 有利には高純度を有しており、常法にしたがってポリクローナル抗体を形成する ために使用される。

このようなポリクローナル抗体並びに上記タンパク質及びそのフラグメントを特 異的に認識することが可能なモノクローナル抗体も本発明の目的を構成する。

本発明のヌクレオチド配列は有利には先述したような本願出願人のクローニング 方法により得られる。適当な宿主細胞を形質転換させることが可能な発現及びク ローニング用組換ベクターも本発明の範囲に含まれる。これらのベクターは本発 明のヌクレオチド配列の少なくとも一部を、その発現を可能にする調節成分の制 御下に含む。形質転換した微生物の株も本発明の一部を構成する。これらの株は 上記ヌクレオチド配列の１つ又は上記のような組換ベクターを含む。

本発明は更に、ヌクレオチド配列、対応するタンパク質及びモノクローナル又は ポリクローナル抗体の生物学的適用にも係る。

これらの適用は、連鎖（１）の遺伝子内フラグメントからアデニルシクラーゼを 産生ずる遺伝子中で類似の配列を検出するためのプローブを作成することを含む 、このプローブ作成は、特にプローブとして使用可能な１本鎖を得るために２本 鎖を変性させる段階を含む。

本発明はしたがって、上記ヌクレオチド配列の少なくとも一部、より特定的には 細菌性アデニルシクラーゼにおけるカルモジュリンとの結合触媒部位、より特定 的にはこの部位の一部をコードする遺伝子内フラグメントを含むことを特徴とす る検出用プローブに係る。このようなフラグメントはカルモジュリンに依存する 活性を有するアデニルシクラーゼを発現する真核細胞遺伝子における対応部位の 相補的フラグメントであり、特に該当遺伝子のクローニング及び分析を容易にで きるという利点を有する。

プローブとして使用されるＤＮＡフラグメントは、必要な特異性及び安定なハイ ブリッドの形成を得るために十分な数のヌクレオチドを含む。

この検出型に適当なプローブは有利には、被験ＤＮＡを含有する調製物とハイブ リダイズした状態でプローブの認識を可能にする放射性元素（熱性プローブ）又 は他の任意の非放射性基（冷性プローブ）により標識される。

常法に従い、被験物質中に相補的配列が含まれる場合にプローブのヌクレオチド 配列と該相補的配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、細菌を 含む生物学的サンプル又は直接これらの細菌もしくはその核酸にこれらのプロー ブを接触させる。

例えばプロットハイブリダイゼーション法を使用することができる。この方法は 、アデニルシクラーゼを発現する細胞から予め得たＤＮＡを変性後、このＤＮＡ のアリコート量をニトロセルロース膜に重層する段階と、通常条件で各膜をプロ ーブにハイブリダイズさせる段階と、形成されたハイブリッドを常法により検出 する段階とを含む。

サチン法によるレプリカハイブリダイゼーション法を使用することもできる。こ の方法は、ＤＮＡの制限酵素処理後に形成されるＤＮＡフラグメントをアガロー スゲル電気泳動により分離する段階と、アルカリ変性後に適当な膜に移す段階と 、通常条件でプローブにハイブリダイズさせる段階とを含む、　ＤＮＡを予め発 現させることは必ずしも必要ではない、ＤＮＡをプローブに接触できれば十分で ある。

本発明はしたがって、アデニルシクラーゼをコードする遺伝子中で類似配列を迅 速且つ高特異性で検出することが可能なツールを提供するものであり、その結果 、これらのアデニルシクラーゼの起源及び作用方法を調査することができる。

ヌクレオチドプローブの使用に基づく上記検出方法を実施するためには、所定量 の本発明のヌクレオチドプローブと、有利な要素として、検出すべき配列とプロ ーブとの間のハイブリダイゼーション反応の形成に夫々適する媒質と、有利な要 素として、ハイブリダイゼーション反応時にヌクレオチド配列とプローブとの間 に形成されるハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする試薬とを含む装 置又はキットを使用すると有利である。

本発明は更に、特に特異的抗血清、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体 の製造のための、上記タンパク質の免疫学的適用にも係る。ポリクローナル抗体 は常法に従い、タンパク質を動物に注入し、抗血清の回収、次いで抗血清から例 えばアフィニティクロマトグラフィーにより抗体を回収することにより形成され る。

モノクローナル抗体は通常通り、本発明のタンパク質により予め免疫された動物 の牌細胞にミエローマ細胞を融合することにより形成される。

防御抗原の不在下にアデニルシクラーゼを用いて毒物試験を行った処、毒性がな いことが立証された。

例えば宿主のアデニルシクラーゼを消費する望ましくない免疫反応を生じないと いう条件で、これらのタンパク質の免疫防御配列の全部又は一部をワクチンの製 造に使用することができる。

本発明はしたがって、ヒト及び動物でＢ、ａｎｔｈｒａｃｉｓ及びその毒性効果 により生じる感染を予防することが可能な分子ワクチンに係り、該ワクチンは上 記タンパク質をベースとし、医薬ビヒクルを含む。

形成された抗体はＢ、ａｎｔｈｒａｃｉｓのアデニルシクラーゼに対して特異的 であり、Ｂ、　ｅｒｔｕｓｓｉｓ工のアデニルシクラーゼとの間に交差免疫反応 を生じるので、本発明は有利なＲ様によるとＢ、ａｎｔｈｒａｃｉｓ及び７Σリ エにより生じる感染に対する二重ワクチンを提供する。

以下、Ｂ、ａｎｔｈｒａｃｉｓのアデニルシクラーゼの遺伝子をクローニング及 び配列決定するために使用した材料及び方法を非限定的に示す。

以下の記載には第１図及び第２図を引用するが、第１図はＢ、ａｎｔｈｒａｃ　 ｉｓの吋工遺伝子を担持する約３．８ｋｂのＤＮ＾フラグメントの制限地図、第 ２図はＢ、ａｎｔｈｒａｃｉｓ（上段）及びしと■ｔｕｓｓｉｓ（下段）のアデ ニルシクラーゼのアミノ酸配列を示す。

形質転換には大腸菌株ＴＰ６１０（５）、トランスフェクションには大腸菌株Ｊ Ｍ１０５（６）を使用した。

使用した組換体プラスミドｐ）４８＾８８１２はＢ、ａｎｔｈｒａｃｉｓのアデ ニルシクラーゼの決定基を担持する３、８ｋｂのＥｃｏＲＶ−Ｐｓ工■フラグメ ントを含むｐＵＣ８の誘導体である（１）、　ＥｃｏＲＶ−Ｐｓｔ　ｌ制限フラ グメントを第１図に示す。

組換体プラスミドｐＭＭ＾８８１２は、大腸菌ｃｙａ−株のシクラーゼ欠失に対 する相補性作用を生じ、この作用はカルモジ５リンにより活性化される。

ｂ）培　　　び　　　　　； 培養はＭｉｌｌｅｒの高濃度ＬＢ培地（７）で行った。アンピシリンを使用する 場合は、１０ｏＩＩｙ／ｚ１の割合で加えた。制限酵素ＤＮＡ　Ｔ４リガーゼ及 びＰｏｌｌｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、並びにＵＳＢＣ から市販されているＤＮＡ　ＴＴ改質ポリメラーゼ（Ｓ！ｑｕ−ｅｎａｙｅ）を 使用した。　ＤＮＡ配列決定のブライマー及びｄＡＴＰ”として使用したオリゴ デオキシリボヌクレオチドは夫々Ｐｈａｒｖａ社及びＡｍｅｒｓｈａｍ社から市 販されているようなものである。

Ｃ）ヌクレオ　ドの　１の １零値ベクターＮｉ３ｍｐ１９（８）でサブクローンを使用した。

一方向欠失を形成するために、サイクロンシステム（１８１社）を使用した。

ヌクレオチド配列は、Ｐｏ１Ｉｋを使用する場合はジデオキシヌクレオチドチェ ーンターミネーション法（９）により、５ａｑｕｅｎａｓｅを使用する場合は変 形ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（１０）により決定した 。

ｐＭＭＡ８８１２のＢ、ａｎｔｈｒ栓迂のＤＮ＾挿入ヌクレオチド配列を決定し た。

第１図のフラグメントは２４００ｂｐのオーブンリーディングフレームしか含ま ない。該オーブンリーディングフレームは終結コドンＴＡＡの翻訳開始部位とみ なされる部位から延びる８００コドンを含む。

開始＾ＴＧコドンとみなされるコドンは、リポソームＲＮ＾］、６Ｓの３°ＯＨ に相補的な配列ＣＧＡにＧを有するリポソーム（ＲＢＳ）結合部位型の部位に先 導される。

オーブンリーディングフレームの完全なヌクレオチド配列を第２図に示す、　Ｒ ＢＳ部位の下流の配列は特に＾−■含有量が高いことが認められる。翻訳された アミノ酸配列は上記連鎖■に対応する。

第２図に提案した切断部位は、アデニルシクラーゼのＮ末端残基に関する情報に より立証されよう、上述のように、アデニルシクラーゼは分泌時に除去されるシ グナル配列を有するより大きい前駆物質としてＢ、ａｎｔｈｒａｃｉｓにより合 成されると考えられる。前駆物質を処理すると、Ｍｒ＝　８９２６１の成熟タン パク質が得られる。

ｄ）　Ｂ、ａｎｔｈｒａｃｉｓ　　びＢ、　ｅｒｔｕｓｓｉｓのア“ニルシ　− −ゼの二ｎ瀘！ロ虹漱− 第２図には、Ｂ、ａｎｔｈｒａｃｉｓのアデニルシクラーゼのポリペプチドの完 全配列（上段）と、Ｂ、　ｅｒｔｕｓｓｉｓ工のアデニルシクラーゼのＮ末端ポ リペプチド配列（下段）とを示した。

アステリスクは同一アミノ酸を示し、十字印は同一化学分類のアミノ酸を示す。

これらの配列を比較すると、これらの配列は異なる集合に含まれるが、多少なり とも類似部分を有することが明らかである。

特に、中心部分のＢ、ａｎｔｈｒａｃｉｓの酵素、Ｎ末端部分のＬと工遵す１伽 ユの酵素に位置する約４００アミノ酸の領域に類似性が認められる。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ欠失実験によると、Ｂ、　ｅｒｔｕｓｓｉｓ工のアデニルシク ラーゼのＮ末端の４５０アミノ酸の配列はカルモジュリンにより活性化される触 媒領域に対応し、したがって、３００位のアミノ酸から６８３位のアミノ酸まで の領域でＢ、ａｎｔｈｒａｅｉｓのアデニルシクラーゼの触媒中心を認識するこ とができる。

最も大きな類似性は（３４２位から３６５位の）２４アミノ酸のペプチドに対応 する。この配列は、ヌクレオチドに対して親和性を有するタンパク質中にしばし ば存在する５つのｇｌｙ残基と核配列Ｇ　−−−ＧＫＳ（ＬＪ？互１」互１ｉ− では＾ＫＳ）とを含む。

２つの他の領域は類似性がより小さい、即ち４８７位から５０１位の間の領域と ５７３位から５９４位の間の領域である。

・このアミノ酸配列の調査結果によると、Ｂ、ａｎｔｈｒａｅｉｓのアデニルシ クラーゼは機能的領域で組織化されることが判明した。

分子は次の少なくとも３つの機能を備え得る。

１−真核細胞との相互作用、この特性はまず感受性細胞に固定され、その後、ア デニルシクラーゼと反応する防御高原（Ｐ＾）を介して発揮される。

２−インターナリゼーション、 ３−カルモジュリンへの固定及びシクラーゼの活性化。

分子の中心部分（３５０位から３９０位の領域）はカルモジュリンに依存性の領 域に割り当てられる。

１１又１ １）　Ｍｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　１９８８．６４．２７７−２８４゜ ２）　Ｖｏｄｋｉｎ　ｅｔ　Ｌｅｐｐｌａ、　Ｃｅ１ｌ　１９８３．３４：６９ ３−６９７゜３）　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ　ａｔ　Ｌｅｐｐｌａ、　Ｇｅｎｅ　１ ９８６．４４ニア１−７８゜４）　Ｔｉｐｐｅｔｔｓ　ｅｔ　Ｒｏｂｅｒｔｓｏ ｎ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｂａｃｔ、　＝９８８．　ｖｏｌ　７０．　ｎ”　５゜２２ ６３−２２６６゜ ５）　Ｈｅｄｅｇａａｒｄ　ａｔ　Ｄａｎｃｈｉｎ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇ ｅｎ、　２０１　（１９８５）、　３Ｂ−４２゜６）　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｆ’ｅ ｒｒｏｎ　ａｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　３３　（１９８５）、　１０３−１１９゜ ７）　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１ ９７２゜８）　Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ａｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　２６　（１９８ ３）、　１０１−１０６゜９）　Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　（１９７７）、　５４６３− ５４６７゜ １０）　Ｔａｂｏｒ　ａｔ　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４（１９８７）　、　４７６７−４７７１ 　。

ＦＩＧＵＲε　２Ａ Ｆｌ（：ＬＩＲＥ　　２Ｂ ＦＩＧＬＩＲＥ　　２Ｃ 国際調査報告 国際調査報告 ＦＲ８９００５５６

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓにより発現されるようなアデニルシクラーゼ活性を 有するタンパク質をコードする配列の少なくとも一部により構成されることを特 徴とするヌクレオチド配列。
2. ２．Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのアデニルシクラーゼをコードする遺伝子とハイブ リダイズすることが可能であることを特徴とするヌクレオチド配列。
3. ３．Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓもしくはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのアデニルシクラ ーゼ又はこのようなアデニルシクラーゼのフラグメントに夫々特異的な抗体との 間で免疫複合体を形成することが可能なアデニルシクラーゼ又はアデニルシクラ ーゼフラグメントを発現するための情報を担持することを特徴とする請求項１又 は２に記載の配列。
4. ４．場合により配列の転写を調節することが可能なプロモーター、及び転写終結 信号をコードするＤＮＡ配列との組み合わせとして、請求項１から３のいずれか 一項に記載の配列を含むことを特徴とする組換ヌクレオチド配列。
5. ５．転写の調節を可能にするプロモーター及びオペレーター、並びに細胞周辺腔 （グラムー）又は外部媒質へのタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列との 組み合わせとしての組換ヌクレオチド配列。
6. ６．次のヌクレオチド連鎖（Ｉ）： 【配列があります】 又は配列（Ｉ）の相補的連鎖を有する配列から形成されるプローブとハイブリダ イズすることが可能であることを特徴とするヌクレオチド配列。
7. ７．請求項６に記載の連鎖（Ｉ）の少なくとも一部を含むことを特徴とするＢ． ａｎｔｈｒａｃｉｓにより発現されるようなアデニルシクラーゼの少なくとも一 部の発現に対応する遺伝情報を担持するヌクレオチド配列。
8. ８．次のアミノ酸配列（ＩＩ）： 【配列があります】 の少なくと一部の発現に対応する情報を担持することを特徴とするヌクレオチド 配列。
9. ９．Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓにより発現される型のアミノ酸活性を有するタンパ ク質、及び汎用遺伝暗号に従い、請求項１から８のいずれか一項に記載のヌクレ オチド配列に対応するそのペプチドフラグメント。
10. １０．請求項８に記載のアミノ酸配列ＩＩに対応する請求項９に記載のタンパク 質。
11. １１．Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのアデニルシクラーゼとの類似性に関して、３４ ２位から３６５位の間の領域に高い類似性を有しており、４８７位から５０１位 の間の領域及び５７３位から５９４位の間の領域に弱い類似性を有することを特 徴とする請求項９又は１０に記載のタンパク質。
12. １２．Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのアデニルシクラーゼの触媒中心に対応する請求 項８に記載の連鎖ＩＩにおける３００位から６８３位の間の領域、又はカルモジ ュリンに依存性の領域に対応する連鎖ＩＩの３５０位から３９０間の領域により 構成されるか又は該領域を含むタンパク質。
13. １３．ラット脳のアデニルシクラーゼ又はＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのアデニルシ クラーゼに対する抗体との間で交差免疫反応を生