JPS63500144A - ヒト因子８Ｒ（フオンウイルブランド因子）にｃＤＮＡを分子クロ−ン化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 不発明は、一般に所望のたん日生成物の組換えＩ）ＨＡが支配する合成に８ける 体造遺伝子クローニングの分野及びこの遺伝子の用途に関する。さらに詳しくは 、それは血液凝固因子）ＩＲｌその組換えＤＮＡが支配する合成並に凝固障害例 えげフォノ・ウィルブラフ）（ｗａ％Ｗｉｌ１ｇｂｒａｎｄ　）病の治療に８け るその用途に関する。

〔従来の技術〕 一般に組換えＤＮＡ技術は現在周知である。［メソッド−イン・エンチモロジ− （Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｓ　Ｅ＊ｔｙｍｏｌｏｇｙ月〔アカデミツク・プレス（Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　）　６５及び６８巻（１９７９）；１００及び １０１巻（１９８３）並にそこに引用された参考文献参照（これらのすべては本 明細誉において参考文献として引用する）、最も普通罠用いられている組換えＤ ＮＡ手法を表現している広範囲の技術的討論は、マニアチス（Ｍａ信ａｇｉａ　 ）ら「モレキュラー・クローニング（Ｍｏ１ａａｓｌａｒ　Ｃｌｏｓｉｎｇ）　 Ｊ　Ｃコールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ 　Ｉｆａｒｂａｒ　ＺｒｃＬ＆ｅｒａｔｏｙｙ　）　］　（１９８２）に見い出 される。種々のポリペプチドへコーディングする遺伝子は、組換えＤＮＡ媒体例 えば細菌性又はウィルス性のベクターにポリペプチドへコーディングするＤＮＡ フラグメントを組み入れ、そして適当な宿主を形質転換することによりクローン されつる。この宿主は、概してニジエリシア・コリ（Ｅａｃｋａｒｉｅｈｉａ　 ｅｅｌｉ）　（イー・コリ（Ｅ、ｅａｌｉ）〕細胞系であるが、所望の生成物に 応じて真核宿主が用いられつる。組換えベクターを組み入れたクローンは単離さ れ、そして生長されて大きなスケールで所望のポリペプチドを生成するのに用い られる。

数グループの研究者は、真核細胞から惰ＲＮＡの混合物を単離し、そして一連の ３種の酵素反応を用いて、このｍ　ＲＮＡ混合物に相補的な全遺伝子の二重鎖の ＤＮＡコピーを合成している。第一の反応において、　ｔｓｃＲＮＡは、ＥＮＡ が支配するＤＮＡポリメラーゼ（又逆転写酵素ともよげれる）により転写されて 、単一鎖相補性ＤＮＡ（ｇＤＮＡ　）を形成する。逆転写酵素は、５／−３／方 向にＤＮＡを合成し、プレカーサーとしてデオキシリボヌクレオシド５′−トリ ホスフエートを用いソシてテンプレート及びプライマー鎖の両刀を必壱とし、そ の後者は遊離の３１−ヒドロキシル下端？有すべきである。ｍＲＡ’Ａテンプレ ートの部分的なコピー又は完全なコピーの何れにせよ、逆転写酵素生成物は、し ばしばその３′宋端に短い部分的に二本鎖のヘアピン（「ループ」）？有する。

第二の反応において、これらの「ヘアピン・ループｊは、ＤＮＡポリメラーゼの プライマーとして慟〈、予め形成されたＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼの作用に ２いてテンプレートとして及びプライマーとしての両方を要求される。ＤＮＡポ リメラーゼは、遊離の３′−ヒドロキシル基を有するＤＮＡ錯の存在な必袋とし 、それに新しいヌクレオチドが加えられてＳ／−３／方向にｔ４を延長する。こ のような順序立った逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼ反応は、まだ一端にルー プを有する。このようにして形成された二本鎖のＤＮＡのループの噴点即ち「折 り曲げ点」ニ、実質的に一本鎖のセグメントである。第三の反応において、この 一本鎖のセグメントが、一本８に特異的なズクＶアーゼＳ１により開裂されて、 「鈍い′ｙＦ：端Ｑ」二本鎖ＤＮＡセグメントを生ずる。この一般的な方法は、 任意のｍＲＡ’Ａ混合物に適用可能であり、そしてブエル（ａｖａｉｇ　）ら［ ジエー、バイオロ、ケム（Ｊ、Ｂｉ・１゜いる。

得られた二本鎖ｃ　ＤＮＡ混合物（ｄａ−ｅＤＮＡ）は、用いられる特別な媒体 に少くとも一部依存して、多くの周知の技術の任意の一つにより、クローニング 媒体へそう人される。多くのそう人法が、かなり詳しく「メソッド・イン・エン チモロジイＪ６８．１６〜１８並にそこに引用された参考文献に討議されている 。

一度ＤＮＡセグメントがそう人されると、クローニング媒体が適当な宿主を形質 転換するのに用いられる。この技術の普通の形では、これらのクロー二／グ媒体 は宿主に抗生物質耐性の特徴を与える。このような宿主は。

一般に原核又は真核細胞である。一般にこの点で、僅かに少しばかりの形質転換 又はトランスフェクションされた宿主が、所望のｃ　ＤＮＡを含み、そしてすべ ての形質転換又はトランスフェクションされた宿主の合計が、遺伝子「ライブラ リー」を形成する。原則として、この方法により作られた全ｄ　ａ　−ｃ　ＤＮ Ａライブラリーは、原料として用いられる気ＲＮＡ混合物中に存在するコデイン グ情報の代表的なサンプルをもたらす。

もし適切なオリゴヌクレオチド配列が用、いられるならば、それを工下記の如く 問題のクローンを確認するのに用いられつる０個々の形質転換又はトランスフェ クションされた細胞は、ニトロセルロース戸紙上にコロニートシて生長する。こ れらのコロニーは分解され：解放された１）ＨＡは、−不鎖乞もたらし、次に加 熱後Ｅ紙に強く結合する。これらのシートは、問題の構造遺伝子に相補的なラベ ルされたオリゴヌクレオチドのプローブとインキュベーションされる。プローブ は、それが相補的なｅＤＮＡをハイブリッドし、ノ・イブリッドはオートラジオ グラフィにより確認される。所望のたん白について構造上の情報をすべて含む一 つ又は組合せのクローンを確認するために、対応″ｆるクローンが特徴ずけられ る６問題のたん白についてコーディングする核酸配列がｅ、ａされ、そして発現 ベクターに再そつ入される０発現ベクターは、特異的な原核又は真核コントロー ル要素〔クローンされたｄａ−ｃＤＮＡの有効な発現（転写及び翻訳）を行う〕 の調節的なコントロールの下にクローンされた遺伝子を置く。

従って、この一般的な技術は、少くとも一部のそのアミノ酸又ｔＸ　Ｄ　Ｎ　Ａ 配列が周知でありそしてオリゴヌクレオチドのプローブが利用しつるたん白にの み適用可能である。一般に上記のマニアチスら参照。

さらに最近では、問題のエンコードされたたん白に特異的な抗体により細菌性コ ロニーをプローブすることにより特異的なコロニーを確認する方法が、開発され ている。この方ｇ：は、生成たん白の合成を必要とするので、「発現ベクター」 クローニング媒体とともに用いられるに過ぎない。構造遺伝子は、たん白の発現 をコントロールする調節遺伝子配列に隣接したベクターにそう人される。細胞は 、ベクターにより又は化学的方法により分解され、セしてたん白は、特異的な抗 体及び像線システム例えば酵素イムノアッセイにより伎出される。この例を工、 ヤング（Ｙｏｓｎｇ）及びデービス（Ｄａｖｉａ）　ｒプロセ、ナツル、アカデ 、サイ（ＦｒｏＣ，Ｎａ　ｂ　ｌ　、Ａｃａｄ　、Ｓａ　ｉ　、　）　Ｕ、ＳＡ 、４８０．１１９４〜１１９８（１９８３）及びヤング及びデービス「サイエン ス（５ｃｉａ％Ｃ−）」１名＃７７８（１９８３）により記載されたラムダσ１ １１システムがある。

フォノ・ワイルブラント（ｇ６％Ｗｉｌｌａｂｒａ％ｄ）因子（マＷ！　又は因 子１・ＩＲ）は、循環器系の損傷領域への血小板の付着を仲介するのに助けにな る大きな接着性血漿砧たん白である。正常なりＲ’Ｆｆｋｋ能がないと、−次的 止血の［血小板プラグ）の形成に欠陥があり、そして出血の障害、７オン・ウィ ルブラント病が生ずる。ｑＷＦが因子ｋｌｃの担体として働き、そしてその能力 にＳいてその（因子ｊｌ（ＩＩ’の）循埴半減期乞延長させること乞、現任の証 拠が強く示唆している。その結果、ｖＶＦ　のレベルが極めて低い！ＩＡ者では 、たとえ彼等が正常な量の循環凝固因子ＶＩＣ（抗血友病因子）を生成する遺伝 的な能力を有していても、そのたん白のレベルが低下する。それ故、７オン・タ イルブラン病のひどい患者は、又古典的な血友病Ａにかかつている人と同様なや り方で適当なフィブリン沈着？発展さぐるのに困難を感じる。従って、ｖＷＦは 、通常の止血の最初及び後の段階の両方で、重４！な役割に包含される〔ホイヤ ー（＃ｏｙ＊ｒ）　ｒブラッド（Ｂｌｏｏｄ）Ｉ５８．１〜１３（１９８１）並 にチンマーマン（Ｚｉｎｙｎｅｒ−ｍａ＊　）　ラｒプログレス・イン愉ヘマト ロ’）　ＣＰｒｏｇｒａａａｉｓ　Ｈａｔｙｃａｔｏｌｏｇｙ　）　Ｊ　Ｅ、Ｂ 、ブラウン（Ｂｒｏｗｓ）Ｍ、Ｘ■巻、二ニー・ヨーク、クルン・アンド・スト ラットン（Ｇｒｘｓａａｓｄ　５ｔｒａｔｔｏ＊）、２７９〜３０９ページ参照 〕。

血漿に２いて、ｖＷＦ　は、２２５ｋｄのサブユニットの二量体から５０個より 多いこのサブユニットを含む重合体に及ぶ一連の自己凝集性荷造として循環する 〔レガ３９４６〜３９５５（１９８３）；ホイヤー及びシャイノ７　（５ｋａｔ ＊＊ｆｆ　）　「ブラッドｊ長、１０５６〜１０５９（１９８０）；ルゲリ（Ｒ ｖｇｇａｒｉ　）及びチンマーマン「ジエー、タリン、インペスト（Ｊ、ＣＯｘ 。

Ｉ％ｖａｓｔ、）Ｊ　６　５、１３１８〜１３２５（１９８０））。

最大の構造が！ＷＦの個有の止血の役割に最も重要であり（上記のチンマーマン らン、−万すべての大きさのオリゴマーは因子■Ｃの担体として同等に作用する 〔デービスら「スｔｆｆ７ブ、レス（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒａａ、）　Ｊ　２２．８ ７〜９３（１９８３））ことを、種々の研究の結果が証明した。豐ＷＦの複雑な 構造及びその二元的な止血の役割からみて、数タイプの７オン・ウィルプラント 病が記載され、そして固有のパターンがしばしば複雑であることは驚くにあたら ない（上述のチンマーマンラ）。

内皮細胞の因子■ｌＲ生合成は、血漿！ＷＦ　の主な源である。血漿中セして内 皮細胞培養培地中に見い出される２　２５　ｋｄのｗＲ’Ｊ’　ｆブユニットは 、２４０ｋｄ（Ｄ細胞内プロたん白ランカーサー（プロ＊ＷＦ）として先ず内皮 細胞培養に合成される〔ワグナ−（Ｗａμｍデ〕及びマーダ−（Ｍａｒｄ＊ｒ） 　ｒジェー、パイオル、ケム、Ｊ２５８．２０６５〜２０６７（１９８３）；リ ンチ（Ｌｙｓｃｈ）ら「プロセ、ナッル、アヵデ、サイ、Ｊ　８０．２７３８〜 ２７４２（１９８３））、プロｖＷＦは初め単量体として検出されようが、それ は恐らくジスルフィド結合形成により急速に二量体化する。プロｑＷ！　二量体 は、内皮細胞中のｖＷＦ遺伝子生成物の支配的な細胞内の形である。それらは、 それ以上自己で結合せず、そして分泌されない〔リンチら「ジュー。パイオル、 ケム、Ｊ　２５８．１２７５７〜１２７６０（１９８３））、Ｌがし、プロｖＷ Ｆ二量体は、サルフェートされた部分の添加並にプレカーサーに特異的な一つ以 上の配列の開裂を含む一連の翻訳後の修飾を行う、これらの出来＄は、２２５　 ｋｄ及び２６０　ｋｄのサブユニットの形成をもたらす。細胞からの分泌の直前 に、これら生成物の混合した二量体が結合して、血漿中に概して見い出される一 連のマＷ！多量体が形成される。

〔発明の概要〕

本発明は、ヒト因子〜ＩＲ又はそのフラグメントをエンコードしたＤＮＡ配列な 組み入れた複製可能な発現ベクター並にそれにより形質転換又はトランスフェク ションされた自己再生宿主細胞系を提供する。宿主系は、通常、原核例え汀イー ・コリ、ビー・ズブチリス（Ｊ、ａｗ６ｔ（Ｊｔａ）又は真核の細胞のものであ る。

ヒト因子ＭＲ又はそのフラグメントは、（ａｌ　適当な宿主細胞系にヒト因子■ Ｒ？エンコードしたＤＮＡ配列を発現しつる復製可能な発現ベクターを作り：（ ｂ）咳宿主系を形質転換して組換え宿主系が得られ；（ｃｌ該因子■Ｒエンコー ディングＤＮＡ配列の発現を行わせる条件下で止紐換え宿主系を維持してヒト因 子〜ＩＲｆｃん白を生成させ：（ｄｌ　該ヒト因子■Ｒたん白又はそのフラグメ ントを回収することよりなる方法により生成される。

好ましくは因子■Ｒエンコ°−ディング複製可能発現ベクターは、因子ｖＭＥ　 ｍＲＮＡを代表する二重鎖相補性ｎ５Ａ（ｔｔａ−ｃｗＡ）を製造し、そしてｄ 　ａ　−ａ　ＤＮＡを複製可能な発現ベクターへ組み入れることにより製造され る。ヒト因子■Ｂ？：回収する好ましい態様は、組換え宿主系にエリ発現されろ たん白と、因子〜ｌＲ１’ｌ異的な少くとも１種の結合たん白よりなる試薬組成 物とを反応させることよりなる。

本発明は、自己再生組換え宿主系に２けるヒト因子■Ｒのクロー７化法を提供し 、それは＋５１　ヒト〜ＩＲＫエンコーディングするｔｎＲＮＡが＃ｋＭされた ｍＲＮＡの不均一な混合物を用意し：Ｉｂ）　Ｍふ綿混合物に相補的なｄａ−ｅ ＤＮＡを製造し；ｌｃｌ　Ｍ、ｄａ−ｅＤＮＡをベクターに組み入れ：そして１ ｌｆｌ　該ｄａ−ｅｌ）ＨＡが組み入れられたベクターを確認することよりなる 。

他の１様に８いて、本発明は、ｄａ−ｅＤＮＡエンコーディング因子１１Ｒが適 当な自己再生組換え宿主系に８いてヒト因子Ｖｌ　−Ｒをエンコーディングする ＤＮＡ配列を発現しつる複製可能な発現ベクターにそう人され：ｂ、該宿止宿主 系質転換して組換え及び宿主系が得られ：Ｃ０該因子Ｖｉ−Ｒエンコーディング Ｉ）ＮＡ配列の発現を行う条件下で止紐換え宿主系を維持してヒト因子■−Ｒを 生成さぜ：そして ｄ、該ヒト因子Ｓｌｌ　−Ｒｔｔ確認する方法を提供する。

他の態様において本発明はそのポリヌクレオチドが実質的に ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＧＴＣＡＡＧＧＴＧ　ＧＡＴ　ＡＴＣＣＡＣＴＡＣ ＡＴＧ　ＴＡＣＴＣＣＡＴＴ　ＧＡＣ ＴＧＣＴＧＣＴＣＴ　ＣＣＧ　ＡＣノ ＣＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＴ　ＧＧＣ ＧＣＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＴＧＣＡＡ／ ＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡ ＧＩＣＴＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＴＡＡＡＧＧ（ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃ　。

ン　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＡＧＣＴＧＴ　ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＧＴＡ　ＧＡＧ ＣＴＧＣＣＡＧ　ＧＧＣＡＡＡ　ＴＧＴ　ＧＣＣＡＧＣＡＡＡ　ＧＣＣＣＡＴＣ ＡＡＣＧＡＴ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＣＣＡＧ　ＴＧＣＴＣＣＡ　ＣＧＧ　ＡＣ Ｇ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡＴＧ　ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＧＣＣＣＴＧＣＴＣＴ　ＧＴＴ　 ＧＴＧ　ＴＡＣＣＡＴ　ＧＡＧ　ＧＴＴ　ＣＴＣＡＡＴＡ　ＴＧＣＴＣＣＣＣＣ ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＴＧＣＡＧＣＡＡＧ　ＴＧＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣ ＣＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＴＣＴ ＴＧＴＧＣＣＣ’ＩＣＴＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＣである領域よりなるｃ　ＤＪ’／Ａを提供する。

別の慇様において、不発明はｔｌ　−ＢをエンコードするｃＤＮＡ’？：含むベ クター及びそれにより形質Ｅ　換される宿主細胞を提供する。

最後の態様において、本発明は特許請求の範囲第（２０）項のベクターよりなる ヒト因子１ｍ　−Ｅの二ンコーディング領域を含むＤＮＡフラグメントの同定及 び単離に有用なプローブを提供する。このようなプローブは、Ｘ’Ｆ４Ｂ遺伝子 の全長のコピー？含むｃ　ＤＮＡ　（次にクローンされそして適当なベクター系 で発現される）をバイブリド化によりｇＤＮＡの混合物から回収する手段として 有用である。

第１図を工、ｐＤＬ３４の？！１ｊ限地図の櫃略図である。

単純化のために、インサー）　ａＤＮＡＩｌｃｓける関連のある部位のみが示さ れている。「ＥｃｏＪ及び「０ｒｉＪｋ工、それぞれユニークなＥｅｏＲ１部位 並にｐＢＲ３２２ベクターの原点部ち複製の方向に関する。インサートは、クロ ーニングのＧＣ結合法によるＰａｔ１部位の側面にある。

ポリンーム生成プローブにより同定された元の９個のコロニーでは、全部が内ｉ ７’ｓｉ［８位の９面にある２５０ｈｐフラグメント並にＦａｔ１部位の右側の １６０＆アフラグメントへハイブリッドされる配列を有した。その内の８個は、 又内部Ｆａ１ｇ部位の側面にある２ｋｂ７ラグメ／トから作られたプローブにハ イブリッドする配列を有したが、これらのインサートのすべてに’ＬｐＤＬ３４ のそれよりもかなり小さかった。分析された２個の他のｃＤＮＡは％ｐＤＬ３４ のそれに大きさが等しい内部Ｐａｉ■部位の右方へ延在している配列を含んだ。

オリゴｄＴプローブは、５ａｃＴ部位の右方へ陰をつけた領域ヘハイブリツドし た（第２図参照）。

ｐｓＰ６４ヘサブクロー二ングするフラグメントを製造するために１．ＤＬ３４ はＳａｇ　ｌにより完了するまで消化され、次にＰａｔｌＫより部分的に消化さ れた。２．３ｋｈＦａｔ［−８ａａｌフラグメントを低融点アガロースゲルから 抽出し、そしてＰａｔｌ／５ａｅｌ消化ｐｓＰ６４ヘリゲートした。得られたプ ラスミドをｐ：５Ｐ６４−３４と名付けた。

第２図は１．Ｉ）Ｌ３４への０Ｐ−オリゴｄＴのハイブリド化を示す。

サウザ／・プロット（ａｏｓｔｈａｒｓ　ｋｌｏｔ　）を、２％アガロースゲル を用いて電気原動されたｐＤＬ３４の種々の制限消化物から製造した。レーン１ ．、Ｓ’Ｐ＆Ｉ（ベクター及びインサートの両刃に一つのｇＲ部位がある）：レ ーン２、Ｓａｃ　１　（インサートだけにｙｔａｔ部位がある）セしてＥｃ・Ｒ Ｉ（ベクターに認識部位がありインサートにはない）、成る変則な開裂が消化の 条件下で認められ、２種の追加の少量のＤＮＡが現れその中の１種はプローブに ハイブリッドした）：レーン３、ＰａｔＫ（認Ｒ部位はインサートの側面にあり 、インサート内に２個の部位がある）：レーン４、Ａｖａ　ｌ及びＥｅ・Ｒ１に より消化されたｐＢＲ３２２ＤＮＡ（分子の大きさのマーカーとして使用）、ｃ こで用いられたプローブは、ガンマ−”Ｐ　−ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチド キナーゼによりオリゴ（ｄＴ）＋ａを標識することにより製造された。ハイブリ ッド化は４ｘｓｓｃ及びＯ１１％ＳＤＳ中で３３℃であった。プローブは、第１ 図に示されるよう罠、Ｓａｅ　１　部位の右方ヘアＤＬ３４の部分へ特異的にハ イブリッドした。

第３図は、内皮細胞ＲＮＡへのｐＤＬ３４のフラグメントのハイブリッド化を示 す。

１０μｙの内皮細胞（レーン１及び２）又はｓｖｓ　。

細胞（レーン）全ＲＮＡを０．８％アガロースゲルを通して電気泳動しそしてニ トロセルロースに移した。ハイブリッド化は、ｐＤＬ３４のニック翻訳され且つ ゲル精製された約８００ｂｐＰｗ％Ｉフラグメントによる（第１図参照）、左の マーカーは、２８Ｓ及び１８５＋のｒＥＮＡの移動位置を示す、内皮細胞ＥＲＡ レーンのバンドの大きさは、デＲＮＡの移動に基いて９．５＆４　と測定された 。

第４図は、ウサギの網状赤血球溶解物のｐ：ｓｆ６４−３４から誘導された合成 ｗＲＮＡの翻訳を示す。

Ａ、翻訳反応物（５０μｔ）を３０℃で６０分間インキユベートシ、実施例に記 載した如く免疫性でんのために作製した。２ｐｔを還元条件下で１２．５％ポリ アクリルアミドゲル上で直接電気泳動した。レーンｌは、ｇａＲＮＡ無添加の反 応混合物である。レーン２を工、約５０μｙ／ｄの合成ｐｓＰ６４−３４ＲＮＡ ’ｌ含む反応混合物である。

図は、染色且乾燥されたゲルのフルオログラムラ示ス。

約１５　ｋｄ移動する王なバンドは、放射性グロビ／のバンクグラワントド、フ ルオログラフィック・エンハンサ−上の内生性グロビンの缶なり−マシー（（１ ’ｅｏ常αｊａｉｎ）ブルー染色により生ずる人為構造との組合せにより、不明 瞭である。左に示される分子の大きさのマーカーは、下から、アルファーラクト アルブミン、１４２００；大豆トリプシン阻害剤、２０，１００；）リブシノー ゲン、２４．０００；炭酸脱水酵素、２９．０００；グリ（！　＃　７　ルデヒ ドー３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、３６，０００；及び卵白、４５，００ ０である。

８、　１７２＊抗ｖ　Ｗ　Ｊ’によるｐｓＰ６４−３４から誘導された翻訳生成 物の免疫性でん並に昇′にに精製された血漿ｖＷＦによる抗体の予備インキュベ ーションの効果、　３００ｐｔｆ）翻訳混合物を３０℃且１時間ｓｏｐｇ／”ｌ のｐｓｐ６４−３４ＲＮＡとともにインキュベートシ、６０１１ｔを実験方法に 詳述するように免疫性でんのために作製した。電気泳動は、還元条件下の１２． ５％５ｌ）ｓポリアクリルアミドゲル上で行われた。レーア１は、ヒトのフィブ ロネクチンに対するウサギの抗血清、３μｔ、レーン２−５は、！ＷＦに対する ワサギ抗血消、３μｔ、示されている場合は、非常に精製された血漿ｇｗハエ、 ウサギ抗ｖＷＦとともに２時間予備インキュベートされ（レーン３．６５０ｎｆ ＊Ｖ７４．１３０　ｎ？’、　Ｉ／　−７５，２６ｓｆ）、そして得られた抗体 ・抗原混合物を翻訳反応物を免疫性でんするのに用いた。もし合成ＡＮＡが翻訳 反応物がら除去されたならば、ポリペプチドはウサギ抗νＷＦにより免疫性でん されなかった（データは示さない）０分子の大きさのマーカーは、ＷＪＡ図に示 したのと同じであった。

第５図は、翻訳生成物から誘導されたｐＳＰ６４−３４のモノクローナル抗νＷ ！免疫沈でんを示す。

ン訳混合物を、第４Ｂ区に示した如く、インキュベートし、免疫性でんにより作 りそして電気泳動した。免疫性でんに、以下の通りであった。

Ａ、レーン１、ウサギ抗、ＷＦ；レーン２−４、それぞれモノクローナル抗−ｖ ＷＦ抗体ＡＶＷ−３、ＡＶＷ−２及びＡ＄’Ｆ／−１、セしてＡＶＷ−１はポリ クローナル抗ｖＷＪ’により認識される２種の生な生成物と特に反応する。左に 示された分子の大きさのマーカーは、下から久の通りである。チトクロームｃ、 １ｚ、ｓｏｏ；大豆トリプシン阻害剤、２０．１００；）リプシノーゲン、２４ ．０００　；グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、３６． ０００゜ Ｂ、レーン１、ウサギ抗フィブロネクチン：レーン２、モノクローナル抗チログ ロブリン：レーン３−５、それぞれモノクローナル抗！ＷＦ抗体ＲＧ３２．２． ２及び５．５゜抗体２．２及び５．５　ｉ！第５Ａ図のＡＶＷ−１と同じ合成ペ プチドと反応する。分子の大きさのマーカーは、第４Ａ図と同一である。

Ｃ０レーン１、ウサギ抗νＷＦ：レーン２．９サギ抗フィブロネクチン；レー／ ３、モノクローナル抗チログロブリン；レーン４−７、モノクローナル抗！ＷＦ 　ＡＶＷ−Ｌ、２．２．５．５及びＴＧｌ、モノクローナルＴＧ１は、ポリクロ ーナル抗血清により認識される主な３０　ｋｄ生成物と小さな約１７　ｋｄ生成 物と特に反応するが、抗体ＡＶＷ−１，２，２及び５．２により認識される主な バンドとは反応しない、他のモノクローナル抗マＷＦであるＴＧ２は、同様なや り方で７’Ｇ１と反応した０分子の大きさのマーカーは、第４Ａ図と同じである 。

第６図は、９１）Ｌ３４の３′末端の配列を示す。

Ａ／１３惧ｐｔｓヘサブクローンされたｐ　ＤＬ　３４　ｅＤＮＡの配列は、ア マ−ジャム（Ａｍａｒｚｈａｍ　）ジデオキシ配列試薬並に供給者により示唆さ れた標準のやり万により、すｙガー（Ｓａ％ｇａｙ）ら［プロシ、ナツル、アカ デ、サイ。

ＵＳＡ、７４．５４６３〜５４６７（１９７７）］（７）７ｉｉ法によって行わ れた０代表的なポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）が、アンダーラインさ れる。ＡＡＴＡＡＡから１８　ｈｐ下方のオリゴｄＴ結合領域が正確に１８　ｄ Ａ残基を含み、それは逆転写を開始するのに用いられろプライマーと同じ長さで あることに注意したい、各読み取りフレーム中の予惣されたアミノ酸配列は、第 一の末端コドン（−）が達するツで示される。アンダーラインされた配列は、血 漿ｗＷＦのＣ末端について報告されたそれと正確に一致する。

不明細書に２いて用いられるとき、「ヒト因子■Ｒ」は、ヒト血漿本来の因子■ Ｒと同じく正常の血液縦置を開始させる舵力を有する生物活性型の、細胞又は無 細胞来貢系により生成されるヒト因子ＸＩＲ（フオｙ・ウィルプラント因子）を 意味する。

因子−ＩＲの異った対立形質は、自然に存在する。これらの相違は、同一の生物 学的機能のたん白にコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列中の一つ以上の相 違により、％値付けられる。さらに１他の翻訳後の修飾と同じくグリコ的し−シ ョンの位置及び度合が変化し、そしてたん白が生成される宿主及び環境の性質に 、成る程度依存する。単−又は複数のアミノ酸の置換、排除、付加を有するアナ ローブを生成できる０本来のヒト因子■Ｒの生物学的に活性な性質を保持するヒ ト因子ＶＭＲｆ）誘導体を生ずるすべてのこのような対立形質の変化、修飾及び アナローブは、本発明の範囲内に含まれる。

本明細薔に開示された組換えベクター及び方法は、広い範囲の原核及び真核生物 をカバーする宿主細胞で用いられるのに適している。一般に、勿論、原核生物が ＤＮＡ配列のクローニング基にベクターの構成に好ましい。例えば、イー−コリ に１２菌株ＨＢＩＯ１（ＡＴＣＣ第３３６９４号）が、特に好ましい。勿論、他 の微生物の菌株も用いられる。宿主細胞又は系と両立しつるものから誘導される 複製及びコントロール配列を含むベクターが、これらの宿主と関連して用いられ る。ベクターは、形質転換された細胞に表現型選択をもたらしつる特性とととも に、元来、覆製の元を有している。例えげ、イー・コリは、アンピリシリン及び テトラサイクリン耐性の遺伝子を含むベクターｐＥＥ３２２により形質転換され るしポリバー（Ｅｏｌｉ＊ａｒ）ら、ジー：／　（Ｇ＃ｌＩ＃）、２．９５（１ ９７７））。

これらの抗住物質耐性遺伝子は、形質転換された細胞を確認する手段をもたらす 。発現ベクターは、又それ自身のたん白の発現にベクターにより用いられるコン トロール要素を含む、イー・コリの外来のＤＮＡ配列の発現に用いられる普通の 原核コントロール要素は、バクテリオファージラムダのｐＥ及びｐＬプロモータ ーと同じく、イー・コリのＢ−ガラクトシダーゼ及びトリプトファン（ｔデル） オペロンから誘導されるプロモーター及び調節配列ケ含む、これらの要素の組合 せも又用いられている（例えば、ｔｒｐプロモーターとラクトースオペレーター との融合物であるＴＡＣ）、他のプロモーターも見い出されそして用いられ、そ れらのヌクレオチド配列に関する詳細４発表されて、研究＠はそれらを機能的に 組合ぜそして働かすことができる。

宿主細胞は、種々の化学的組成を有するヒト因子Ｖ１７？たん白を製造する。生 成されたたん白は、その第一のアミノ酸としてメチオニンを有する（構造遺伝子 の始めに元来存在するか又は構造遺伝子のセグメントの前にそう人されるＡＴＧ 開始シグナルコドンにより存在する）。

たん白は、又細胞内又は細胞外で開裂し、たん白のアミノ末端で天然に見い出さ れるアミノ酸を生ずる。たん白は、そのシグナルポリペプチド又は従来のシグナ ルポリペプチド以外の共役たん白の何れかとともに生成され、共役物のシグナル ポリペプチドは細胞内又は細胞外の環境で特異的に開裂可能である。最後に、因 子■Ｒは、すべての無関係なポリペブチ゛ドを開裂する必要なしに、成熟した形 で＠接発現により生成される。これは、生物学的活性に要求される任意の翻訳後 の修飾を含む。

組換え宿主細胞とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構成されたベクターにより形質 転換された細胞である０本明細書で規定されるように、因子〜ＩＲは、その形質 転換の結果として生成される。因子■Ｒ４Ｘ、「組換え因子〜ＩＲ」と呼ばれる 細胞により生成される。

組換え及びスクリーニング手法 下記の方法は、不発明の方法で有用な特定の試薬を製造する、多くの元号に確立 された方法の成るものに過ぎない、メツセンジャーＲＮＡ（講ＲＮＡ）混合物を 侍るための一般的な方法は、チャーブワイン（Ｃｈｉｒｇｖｉｓ　）ら「バイオ ケミストリー（Ｅｉｏｃｈａｔｎｔａｔｒｙ）　Ｊ　１８．５２９４（１９７９ ）に開示されているような方法により、組織サンプルから抽出物を製造するか又 は所望のたん白を生成する細胞を培養し、そして組織サンプルから抽出するか又 は所望のたん白を生成する細胞を培養し、セして惰ＲＮＡを抽出することである 。ｍＡＮＡは、オリゴ＜ｄＴ）セルロース又はポリＣＵ）セファロースのクロマ トグラフィ次にｍ　Ｅ　Ｎ　Ａ濃縮画分を含むポリ（Ａ）の溶離により、ポリ（ Ａ　）　ｔｍ　ＲＮＡ含有物質について濃ｌｉＡされろ。

上述のｃｐｓ　ＲＮＡ瀝縮画分ケ含む両分を含むボＩＪ（Ａ）Ｇｉ、逆転写酵素 を用いて一本輪相補性ｃ　ＤＮＡ　（ｍ　ｓ　−ｃＤＮＡ）を合成するのに用い られる。ＤＮＡ合成の結果、ヘアピン・ループがＤＮＡの３′末端に形成され、 それは第二の鎖ＤＮＡ合成を開始する。適切な条件下では、このヘアピン・ルー プは、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドトリホスフェートの存在下第二の鎖 の合成を行うのに用いられる。

得られた二重ｇｅＤＮＡｃｄｓ−ａＤＮＡ）は、多くの周知の技術の任意の一つ により、発現ベクターへそう人される。一般に、方法などは、マニアチス、上述 及び「メソッド・イン・エンチモロジーＪ６５及び６８　巻（１９８０）、１０ ０及び１０１巻（１９８３）に見い出せる。一般に、ベクターは、少くとも１種 の制限エンドヌクレアーゼ（少くとも２個のプラント又は柴集性の末端を生成す る）により線状にされる。ｄａ−ｃＤＮＡは、ベクターそう入部位とリゲートさ れるか又は情合される。

もし実質的な細胞壁物質を含む原核細胞又は他の細胞が用いられるならば、発現 ベクターによる形質転換の最も普通の方法は、コーエン（Ｃｏｋｅ％）、Ｒ，Ｎ 、ら「ブロク。

ナツル、アカデ、サイ、ＵＳＡＪ６９．２１１０（１９７２）により記載された 塩化力ルシワム予備処理である。もし細胞壁バリヤーのない細胞が宿主細胞とし て用いられるならば、トランスフェクションは、クラノーム（ＧｒａｈａＪ及ヒ バ／・デル・ニブ（Ｖａｎ　ｄげｐ；ｂＬｒウイロロシ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　 ）　Ｊ　６２．４５６　（１９７３）により記載されたりん酸カルシウム化でん 法により行われる。細胞にＤＮＡを導入する他の方法例えば核注入又は原形質体 融合もう１く用いらすＬる。生物は次に選択媒体で培養され、そして発現ベクタ ーがエンコードしたたん白が生成される。

因子〜ＩＨの遺伝子の一部又はすべてを含むクローンは、因子ｖｌＲゲノムの一 部又は全てに対する特異的な放射標識をされたオリゴヌクレオチドにより確認さ れる。これらのオリゴヌクレオチドのプローブは、”Ｐ−デオキシヌクレオチド トリホスフェートの存在下のポリソーム単離ポリＡ　ＲＮＡのオリゴ（ｄ７’） ＋ｓプライムｅｈ写により、又はニック１訳により生成される。このようなりロ ーンは、その場のコロニー・ハイブリッド化、ノウザン・プロッティング及びす ９ザン・プロツテングを用いて恢出される。これらの万εは、上述のマニアチス に記載されている。

因子ＸＩ　Ｈの全配列を営むクローンは、因子Ｓ’ＭＲたん白の一部又はすべて に対する特異的な抗体を用いて確認される。これは、ｄ　ｓ　−ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ が、そう入部位に隣接する適切な調節核酸配列を含むベクターへそう人されるこ とを要求する。これらの調節配列は、ベクターへそう人されたこれらのｄδ−ｃ 　Ｄ　Ｎ　Ａ分子の転写及び翻訳を開始する。調節配列に関して正しく位置した 因子５ｆＩＲｅＤＮＡ配列を含むこれらのクローンは、因子〜ＩＲたん白の一部 又は全′［を合成する。

又、非発現性クローン系に３いて、因子ＶＩＲｃＤＮＡを含むクローンは、推足 されたｅＤＮＡの生体外転写により確認される。得られたｍ　ＲＮ　Ａは、生体 外で、ウサギの網状赤血球、コムギの胚又はツメガエル（Ｘａｎｏｐｓａｌσ− ｖｉｍ　）の卵母細胞の翻訳系へ翻訳される。得られる因子〜ＩＲたん白生成は 、因子■Ｒへ特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いて翻訳混合 物の上澄み液の免疫沈でんにより決定される。

不発明を実施するのに有用な菌株の寄託下記の菌株の生物学的に縄粋な培養の寄 託は、１９８５年４月２５日にジ・アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクシ ョン（ｔｈｅ　Ａｔｐｈａｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ＣＣ５１ｔｓｒ　Ｃｏ１１ｍ −６１ｉｏ悴）、１２３０１、バークローン・ドライブ（Ｐａｒ−ｋＬａｖｎ　 Ｄｒｉｖｅ）、ロックビル（ＥｏｅｋｖｉＨａ）、メリーランドになされ、示さ れる入手番号は、成功した真正のテスト後につけられ、その上必要な料金は支払 われた。この培養物の入手は、３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，１，１４並に３５　Ｕ、Ｆ；、 Ｃ−１２２の下で長官によりそれにふされしいと決定された人に、特許出願の係 稿中になされうろ。公共への該培養物の入手のすべての制限は、出願に基く特許 の付与により必ず除かれ、セして践培養物はサンプルの提供をめる最も最近の要 求から少くとも５年間そして成る場合には寄託の日から少くとも３０年間、永久 に利用される。

培養物が生育不能になるか又は不注意で損われると、それは同一の分類掌上の記 載の生育甲の培養物により置換ｐＤＬ３４　５３１０９ 〔実旌例〕 細胞及び細胞培養条件 死亡間もないヒトのヘン静脈内皮細胞を、マイケル・ギンブロン（Ｍｉｅｈａａ ｌ　Ｇｉｍｈｒｏｓａ）博士〔プリンガム・アンド・ワイメンズ・ホスピタル（ Ｂｒｉ＊ｇｈａｍ　ａｓｄｗｏ引：ｗａ　ｆｉｎす１ｔａｌ　）、ボストン〕の 研究室から得た。

細胞を、前述の如く生長させた〔す／チら、１９８３、上述〕、轡に、それらは ２０％コウシ鹿清及び１５０％ｔ／ゴの内皮細胞生長因子を補給されたメジウム ＣＭａｄｔ％惧）１９９甲のヒトフィブロネクチンのマトリックスに接種された 。さらに、１００　ｓｆ７’Ｌｌの硫僚ヘパリンを培養媒体へ添加した〔ソーン トン（Ｔｈｏｒ％ｔｏ％）ら、「サイエンス」２２２．６２３〜６２５（１９８ ３））、細胞は、パッセージ２〜２００間で用いられた。ＭＢ−メチオニンによ る代謝標識を前述の如く行った（す／チら、１９８３、内皮紹胞を、ＲＮＡ又は ポリソームの生成を含む実験のためローラー瓶中で生長させた。全細胞ＲＮＡを チャーブウィンら〔「バイオケミストリーＪ　１８．５２９４−５２９９（１９ ７９）］のグアニジニ９ムイソチオシアナート法により単離し、そしてポリＡ含 有ＥＲＡはポリＵ−セファデックスのクロマトグラフィにより精製された。全Ｒ ＮＡを、記述〔アロニ（Ａｌｏｓｉ　）及びアタルジ（Ａｔ　ｔａｒｄｉ　）　 ｒジエー６モル、パイオル（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉａｌ、）　Ｊ　５５．２７１〜２７６（１９７１））Ｌ、たように、シュク ロース勾配の速度沈降により大きさ分別をし、２８：Ｓ　ｒＲＮＡの中心部より 早く沈降する物質を集めた。ｖＷＩ’％異性ボリ異性ボリンシムビｏ（Ｓｈａｐ ｉｒｍ）及ヒヤング（ｙｅ％％ｇ）〔「ジュー。パイオル、ケム、」２５６．１ ４９５〜１９４６（１９８１））の一般的な方法により１％ノニデット（Ｎｏｎ ｉｄｇｔ）　Ｐ　−４０により製造した内皮細胞溶解物から免疫単離された。顕 著な変化は、たん臼Ａ−セファロース免疫単離カラムを通過直前に、ポリソーム ・抗体混合物がグリシン不活性化ＣＭＢｙ−セファロースのカラムを通過するこ とであった。この段階は、さもなければたん白Ａ−セファロースに非特異的に留 金する’ｅｌＪ質を除去するのに助けとなる。　、ｗｙ特異性ポリス含有ＲＮＡ は、オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィによるたん白Ａ・セファロースカ ラムの溶離液から単離された。

ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ構築及びプローブ・ラベリングｅ　Ｄ　ＩＪ　Ａ　”）イブラリ −は、上述のマニアチスらＫより記述された詳しい方法を用いて、ＧＣ付着法に より２８ｓより大きい全ＲＮＡがら単離されたボＩＪ　Ａ含有ＥＮＡから、ＢＲ ３２２に２いて製造された。第一の鎖ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａは、オリゴ（ｄｒ）ｕ　フ ライマー［二ニー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｓｇｌａｓｄ　Ｂ ｉｏｌａｂａ　）　］及びヒトの骨髄芽球ウィルス逆転写酵素〔ライフ・サイエ ンスズ（ＬｉｆｅＳｃｉ−％Ｃ＃＃）、セント・ビータースブルグ、フロリダ〕 を用いて、ポリＵ−セファデックスを選択したＲＮＡから合成された。ＲＮＡを 次にアルカリ性加水分解により除き、そして第二の〇ＤＮＡを、ヘアピン・ルー プ・プライミング次にイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメントに より合成した。逆転写酵素との追加のインキュベーションを用いて、より大きな 第二の鎖の長さとした。ヘアピン・ループを８１ヌクレアーゼにより除去し、そ して末端をＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメントにより修復した。

１０〜１５残基のオリゴｄＣテールを末端トランスフェラーゼにより加え、ａＤ ＮＡをオリゴｄＧ−テールｐＢＲ３２２ヘアニールした。約６０．０００種の独 立した組換え細菌のａ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ライブラリーを次に構築した。

このライブラリーをスクリーンするプローブを合成するために、内皮細胞からの ポリソーム画分を作り、そしてモノ特異性ワサギ抗ｗＷＦＩｔＧとともにインキ ュベートした。抗体結合ポリソームを次にたん白Ａ・セファロースのイムノアフ イニティクロマトグラフィにより精製した。ポリス含有ＲＮＡを、精製したポリ ソームがら単離し、セし千オリゴｄＴプライマー並に４種のアルファ″Ｐデオキ シヌクレオチドトリホスフェート（４０Ｃｔ７’＋＋ａモル）の存在下５０　ｓ Ｍで逆転写した。平均のプローブの長さは、約３００　ｈｐであった。他のｕｐ 標１ｔｎｙＡプローブは、ＤＮＡポリメラーゼＩｉＣよるニック翻訳、又はポリ ヌクレオチドキナーゼによる５′本端標識（マニアチスら、上述）により製造さ れた。約５Ｘ１０’個の細胞の免疫単離されたＲＮＡから、２　Ｘ　１０’　ｃ ｐｗｓの逆転写物が合成された。

その場のコロニー・ハイブリッド化、ノヮザン及びサウザ／・プロッティングが 、上述のマニアチスらにより記載された如く行われた。このプローブによる３、 ０００個のコロニーの最初のスクリーンに２いて、９個が特異的にハイブリッド していることが分った。選択されたコロニーからｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをさらに分析し て、それらがすべて交叉ハイブリッドし、そして制限酵素及び分子ハイブリッド 分析により現足されるように共通の末端を有することが分った（第１図参照）。

ａＤＮＡ間の強いホモロジーは、免疫単離されたポリソームから生成したプロー ブは、完全ではないとしても、主として均一であることを示唆した。これらの最 初の単縫物の甲の最大の２−４ｋｂインサートであるｐＤＬ３４の制限地図は、 第１図に示される。

すべてのこれらのクローンに８ける共通の末端の存在は、それが逆転写の最初の 部位そして恐ら（ｍ　ＲＮＡのボＩＪ　ＪテールのＤＮＡ補体を含むことを示唆 した。この可能性を調べるために　！ＩＰ−オリゴ（ｄＴ）＋ｓをサウザン・プ ロットに不動化されたｐＤＬ３４ヘハイブリッドした（第２図）。これらの結果 から、ユニークなハイブリッド化部位が、ＤＬ３４に瑛出されることが分る。単 一の３．９ｋｂバンドがＳｐｋ　ｌ消化物に検出された（レーン１）。

ｐＢＲ３２２ベクターにｓＶＴるのと同じく、ｐＤＬ３４インサート内に単一の ｓｐｈ　１認微部位が存在する（第１図の地図に示される）、プローブは、イン サートに存在するＳｐｋ１部位の右でフラグメントにハイブリッドした。２棟の ＤＮＡのフラグメントが、酵素Ｓａｇ　Ｉ　（インサートを切断）及びｐｌｅａ 　ＲＩ　（ベクターを切断）によりｐＤＬ３４の消化により生成した。レーン２ に示されるように、プローブは、３．７ｋｂ　フラグメント即ちＳａｇ１部位の 右側の配列へハイブリッドした。レーン３は、ｐＤＬ３４のｐｍｔ１ｍ化物を含 み、セしてオリゴｄＴのハイブリッド化は認められなかった。Ｐｓｔｌ消化は、 無処理のｐＥＲ３２２ベクターのバックボーンと同じくインサートから３個のＤ ＮＡフラグメントを生成した。他の実験に８いて、クローンされたインサートの 右末端においてＰ＃ｔｇにより発生した小さな（１６０ｈｐ）制限７ラグメ／ト は、サワザン移動に用いられる条件下でニトロセルロースに結合できなかった。

それ故、アＤＬ３４のオリゴｄＴ超合領域は、Ｓａｇ　１部位とクローンされた インサートの末端の間の約５０６゜領域に位置する（又第６図参照）、この領域 は、すべての最初に単離されたクローンに検出された。この現象は、逆転写の方 向が、第１図に示されたように、オリゴｄＴハイブリッドフラグメ／トから左で あることを示唆している。それは又ｃ　Ｄ　Ａ／　Ａ内の読み取りフレームの配 向を示唆し、セしてｐＤＬ３４がそのテンブレー）　ｖｓｃ　ＲＮ　Ａの３′末 端の補体と思われることを暗示している。

ｖＷＦ　ｅＤＮＡクローンとしてのｐＤＬ３４のＮ認ｐＤＬ３４が大きな内皮細 胞結合ｖｎ　Ｅ　Ａ’　Ａから誘導されたかどうかを確めるために、プローブか 、そのインサートのｓ　ｏ　ｏ　ｈｐ内部Ｐ！饗璽フラグメントのニック翻訳に より作られた（第１図）。”Ｐ１９１．ＤＮＡを次に内皮細胞及び５ｖｓｏ細胞 （ｆＷＦを発現しない確立したヒト細胞系として）からの全ＲＮＡを含むノヮザ ン・プロットへハイブリッドした。第３図に示されるように、約９．５＆＆の単 一のバンドが、内皮細胞ＲＮＡにより検出され、そして５Ｖ８０ＲＮＡではハン ドは認められなかった。従って、ｐＤＬ３４は、大きな明らかに内皮細胞特異性 ＲＮＡと同−源である。

アＤＬ３４は、それが部分的なりＷＦ　ａＤＮＡクローンであるということと一 致する性質を有するか、この可能性の直接的な証明は、問題を生じた。ｑＷＦの 完全なアミノ酸配列は公開されていす、そしてｐＤＬ３４がたん白のＣ末端な示 すように思われるからである。ＤＮＡ及びたん白配列を比較することにより、そ の確認な決足することは、容易にでさることではないだろう。しかし、多数のｖ ＷＦのモノクローナル抗体が入手出来た〔フルチャー（Ｆ％Ｅｉｔｈｅｒ　）及 びチンマーマン「ブロス、ナツル、アカデ、サイ、ＵＳＡＪ７９．１６４８〜１ ６５２（１９８２）；及びシュレフ（Ｓｃｋｗｌｌａｋ　）ら「ジエー。

タリフ。インペスト（Ｊ、Ｃ１１ｓ、ｌ５ｖａａｔ、）　Ｊ　７３　＋　４２１ 〜４２８（１９８４））、それ故、ｐＤＬ　３４へのハイブリッド化により精製 された内皮日胞ｍ　ＲＮ　Ａの生体外翻訳並にそれにともなう翻訳生成物のモノ クローナル抗！ＷＦ免疫単離を、ｐＤＬ　３４の確認の合理的な証明とすること は可能なように思えた。ｐＤＬ３４は、その合成がポリクローナル抗ｖＷＦとの その前の選択を観求するプローブにより元来確認されたので、その確認の証明は 、！Ｗ！モノクローナル抗体による独立した免疫単離を必要として、ｐＤＬ　３ ４がポリクローナル抗血清を得るのに用いられる！ＷＦに存在する不純物をエン コードするすべての可能性を排除するだろう、主として制限されたｖＷＦ　ｍＲ ＮＡの入手性のために、内皮細胞Ａ含有ＲＮＡＫよるパイロット翻訳研究に２け るｖＲ’Ｆ翻訳生成安の確認は、可能ではなかった。この供給問題を排除する努 力に２いて、ＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼが用いられて、クローナルＳＰ６プロ モーター配列のｐＤＬ３４テンプレートをそう人した夕゛ウンストリームから合 成ｍ　ＲＮ　Ａを生成した〔メルト７（ＭｅＮｏｎ　）ら、「ヌクレイツク・ア シツヅ・レス（Ｎ５ｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｇｓ、）Ｊ１２．７０３５〜７ ０５６（１９８４））、２．４ｋｈｐＤＬ３４インサートは、全長のｖＷＦ　ａ ＤＮＡの予想された大きさより小さいのでＳＰ６生成合成ｎ＊　ＲＮ　Ａは、恐 らくその５′末端で、先端を切られているだろう。天然のνＷＦ開始コドンと同 じくすべての特異的々リボンーム結合配列を欠くことが予想されよう。それ故、 もし合成ＥＲＡが翻訳のためのテンプレートとして働くならば、たん白金酸の開 始は、１個以上の偶然のダウンストリームメチオニンコドンで生ずる必要がある だろう。

所望のプラスミドを生成するために、２．３　ｋｂ　Ｐａｔｌ−Ｓａｔ　ｌ　７ ラグメントの形のｐＤＬ３４　ｅＤＮＡインサートの本体は、オリゴｄＴＷ３合 生成物からのセンス転写について予想された配向を用いて５，５Ｐ６４のポリリ ンカーにそう人された（第１及び２図参照）、２．３＆＆合成ｘＲＮＡ　を次に 生体外でＳＰ６ポリメラーゼにより生成させた。このＲＮＡを１８−メチオニ／ を含むウサギの綿状赤血球溶解物へ加えた。

生体外翻訳混合物を、免疫単離のために、１％ノニデツ）？−４０，０，１％ナ トリウムドデシルサルフェート（ｓｎｓ　）及び２００％／Ｍｌのアプロチニン を含む２０ｍＭ　）リス、ｐＨ８，０，１５Ｍ　ＮａＣＬへ２０倍希釈によす作 った。フェニルメチルスルホニルフルオリドを５０　ｐｆ／ｍまで加えた。希釈 された反応混合物を、４℃で２〜４時間正常のウサギ血清によりそして４℃で１ 時間たん白波−セファロースにより予め吸収させた。モノクローナル抗体が用い られたとき、マワスＩＣＩＧ〔キャペル（Ｃａアｐａｌ　）　）に対するウサギ 抗血清がたん白波−セファロースの添加より４時間前に加えられた。生体外翻訳 生成物のＳＤＳゲル電気泳動は、レエムリＣＬａｅｍｔ％ｌイ）〔「不イチュア （Ｎａ１ｓｒｅ）、２２７．６４０〜６５５（１９７０））により記述されたよ うに、４％ポリアクリルアミドのスタッキング・ゲルを■する１２．５％ポリア クリルアミドのランニング・ゲル中で行われた。第４Ａ図に示されるように、合 成は入手しうるＲＮＡの童及び質を考えて、比較的無効であったが、数種の分割 されたポリペプチドの翻訳は、先端を切られた合成％　Ｒ／Ｖ　Ａにより行われ た。このような翻訳反応混合物が、コントロール表してワサギ抗フィブロネクチ ン抗体を用いる、市販されているモノ特異性ワサギ抗ｖＷ！抗体による免疫沈で んＫかけられろとき、一連の約１５〜３０＆＆のポリペプチドが、後者により特 異的に沈でんした。抗フィブロネクチン抗体によりどんなバンドも沈でんしなか った。＊ＷＦ抗血清とのこれらポリペプチドの反応は、非常に′ｆＲ製されたｖ 　Ｗ　Ｆによる抗血清の予備インキュベーションにより、容易に阻害される（第 ４Ｂ図）、これらのポリペプチドの電気泳動の移動の速度は、恐らく翻訳後の修 飾の度合の関数として、異った翻訳反応に２（・て傷かに変化した。しかし主な 分割された物質の相対的移動速度及び強度は、一定であった。

−％　ｆ）　ｖ　Ｗ　Ｆ　Ｋ対する３０種のモノクローナル抗体を、次にこれら と生体外絨訳生ｆｆｔ′＠との反応性につ−・てスクリーニングした。強い特異 的な反応が、これらの内４種について見られた（第５図）０弱（・反応は、これ らの３種について見られた（図示せず）０強く反応したモノクローナル抗体が、 本来のマＷＦ（第５Ａ及び５Ｂ図に２ける抗体２．２．５．５、Ａｖｗ−ｘ”） 及びトリプシン処理νＷＦ（第５Ｃ図の抗体ｒａｌ）を認識したことは、江意丁 べきである。逆に、スクリーニングされた３０種のモノクローナルの内１６種は 、逮元され且変注されたｖＦＦを認識したが、これらの内のどれも、用いられた 条件下で生体外翻訳生成物と強く反応しなかった。これは、関係のある１種以上 のエピトープが、たん白フラグメ／トに２けるそれらの発生にもかで・わらず、 それらの本来の構造を認めうろことを教示している。モノクローナル抗！ＷＦ抗 体の不均一なコレクションのあるものによるこれら生体外で生成したポリペプチ ドの認識は、ｐＤＬ３４を真正のｖＦＦ　ｅＤＮＡクローンとして証明し、第３ 図に２いてνＷＦ　ｍＲＮＡとして確認した９、５ｋｈ愼ＥＮＡとして立証した 。

ｐＤＬ３４の３′領域のＤＮＡ配列は、第６図に示される。３桟の可能性のある 欣み取りフレームのそれぞれにストップブト／があり、それはクローナルインサ ートの３′末鴻が、翻訳されていない領域であることを示している。予想された アミノ酸配列は、出会う第一のストップコドンまでの３種の読み取りフレームの それぞれに示される。最長のオープン読み取りフレームの最後の１０個のアミノ 酸はアンダーラインされ、そして血漿ｔ　Ｗ　ＦのＣ末端よりなるとして最近記 載されたデカペプチドに正確に対応する〔タタニ（Ｔａｔａ％ぜ）ら、１９８４ 、アブストラクト、［すｑユｖ−シヨｙ（Ｃｓｒｇｔ！ａｉ＠５）Ｊ７０゜厘− ２１０）、この発見は、さらにｖＷＦ　ｅＤＮＡクローンとしてのｐＤＬ　３４ の［ｇＫ役立ち、そしてブロマＷＦに２けるプレカーサー特異性アミノ酸配列が 、血漿たん白のＮ末端から延長していることを示す。

ｐＤＬ３４のオリゴ（ｄｒ）粘合部位は、１８　ｄＡ残基そして直ちにライブラ リー構成中に合成される１　２　ｄｃｚが続くものとして考えられる。ヘキサヌ クレオチドＡＡＴＡＡＡは、Ａｍのランの１８個の塩基アップストリームに位置 する。これは、検出されたｄＡ域（ｖＷＦｖａＲＮＡのポリ（Ａ）テールの一部 である）に関して、適切な距離での〔フイツジエラルド（Ｆｉｔｔｇ−デａｌｄ 　）及びシェンク（５ｈａｎｋ　）　「セｐｙ　（Ｃａｌυ」２４，２５１〜２ ６０゜１９８１１％徴的なポリ（Ａ）付加配列〔ブロードフート（Ｐｒｏｓｄｆ ＊ｏｔ）及びブラヮニー（Ｂｒｏｖ＊１ａａ）　［ネイチュアＪ２６３　．２１ １〜２１４．１９７６］である。従って、ＣｄＡ＞Ｉａは！ＷＦ愼ＲＮＡのポリ （、ｉ）テールの一部を表すことが出来、この場合、３′未翻訳領域は、２００ ＆ｐ以下延長するだろう。しかし、ａＤＮＡライブラリーの初めのプライマーは オリゴ（ｄＴ）ｔｉであったので、（ｄＡ）１１はｖＷＦ　ｍＲＮＡの３′未翻 訳領域に位置するプライマーの内部補体を表すことも出来る。

ｖＷＦ　ｍＲＮＡの適切な長さとして観察された９、５　ｋ　ｋについて考える ために、血漿！ＷＦの最小のコーディング単位が５．４ｋｂであると考えなけれ ばならない。しかし糖たん白は、不連続な５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動により正確に大きさを計ることが難しく、２２５＆＆より大きい曾Ｗ！サブ ユニットの計漬ｊが数多く報告されている。特に、レガツ（Ｌｇａｔ　）ら〔「 ジエー・パイオル・ケム」２４８．３９４６〜３９５５（１９７３））は、血ｔ ＩＷＦサブユニットの大きさが２５０　ｋｄ　であることを示唆して２つ、彼等 は、たん白が２１００個のアミノ酸を含むことを予測した。同様に、プローｖＷ Ｆは、分泌されたサブユニットより５０ｋｈ大きいと考えられる（ワーグナー及 びマーダー、　１９８３）。

それ故、約７．６＆＆のｍ　ＲＮ　Ａ配列がブロー！ＷＦをエンコードするのに 必要とされよう、ここで決められたＡＡＴＡＡＡ配列が本当にポリ（Ａ）付加シ グナルであるならば、１．７＆４０ｗ　ＲＮ　Ａは、まだアサインされない。

大きな３′未翻訳領域は原核ｍ　ＲＮ　Ａに一般的であるが、我々はこの大きさ の５′未翻訳領域について報告されているのを卸らない０例えば、ヒト因子ＶＩ Ｃ餌ＲＮＡの３′及び５′未翻訳領域は、それぞれ１．８及び０．２＆＆を含む 。

従って、たん白は、大きな最近まだ認識されていないプレカーサーとして合成さ れるか：又は％　ＲＮ　Ａがホルムアルデヒドアガロースゲル甲な異常に移動す るが：及び／又はｖＷＦ　ｍＲＮＡが異常な広い５′禾翻訳領域を有する。

全長のｃＤＮＡクローンの確認を証拠立てるための無傷のｍ　ＲＮ　Ａを生成す るＳＦ３系の利点は、既に立証さ。

れた〔トール（Ｔｏｏｌｍ）ら、「不イチュア」３１２．３４２〜３４７．１９ ８４）。そこに開示されているように％部分的なａ　Ｄ　ＮＡクローンが同様に 用いられる。

このやり方が、成るたん白のＮ末端をエンコードする、ＤＮＡクローンの８ｉ認 に最も有用であることは、予想されるだろう。このようなｃＤＮＡは、天然の開 始コドン並に恐らくリポソーム結合部位の存在のために、一層容易に翻訳された ｍ　ＲＮ　Ａを生成するものと予想されろ。

しかし、ｐＤＬ３４は、ＤＮＡ配列情報により示されるように、！Ｗｌ’のＣ末 端を含む（纂５図）、従ってｒｄｌＮＡの天然の５′末端は、その生体外翻訳の 要件ではなかった。

光分ではないが、ｐＤＬ３４の生体外翻訳の程度は、本発明にとり過当であった 。同様に、新しく合成されたたん白の折り曲げの熱力学的考察から、無傷のたん 白のＮ−末端部分を欠く翻訳生成物が、本来の配座をとらないことが予想される 。しかし、全馴訳生成物のゲル上で確認される全ての合成ｍ　／？　Ａ’　Ａが 支配するポリペプチドは、本来のたん白について培養されたポリクローナル血清 により有効に免疫沈でんされた。又、反応するモノクローナル抗体は、本来のた ん白に存在するエピトープを認識する。たん白の末端が一般に内部の配列よりも 抗原的であるので、Ｃ末端の存在が抗体認祿を助けることは可能である［クオル タ−（Ｗａｉｔｅｒ）ら、「ブロセ、ナッル。

アカデ、サイ、ｖｓＡ」７７．５１９７〜５２００．１９８０；ラーナー（Ｌａ ｒｎｇｒ）ら「セル」２３．３０９〜１０．１９８１］。しかし杭管ＷＦモノク ローナルはこれらの翻訳生成物の１個より多いサブセットを認識し、そして凝集 物に３いてもそうであり、それらの活性は１個より多い明確な領域からのエピト ープに対するように思われる。従ってポリペプチドのあるものは、真正のＣ末端 を含まないことができ、内部エピトープに対する抗体により免疫沈でんした。

最後に、この鉦明の方法は、たん白に対する抗体が入手されそしてたん白の配列 の情報がない場合に、あるｃＤＮＡ　クローニング生成物の確認をめるのに、一 般的に応用しうろことを立証する。

このような状態は、多くの大きなたん白にとりｎ常ではなく、そして荷にある細 胞表面抗原の研究には普通である。

次に生体外で転写されしかも翻訳されるクローンされたフラグメントが、それに 向けられるモノクローナル抗体と反応する能力を保持するという観察は、モノク ローナル抗体のエピトープをエンコードしたＤＮＡフラグメントの好都合なライ ブラリーを開発する手段を提供する。

本明細書で用いられるとき抗原決定部位と同義である工ビトーブは、抗体分子の 抗原色合部位と行異的に反応ｔ７うる抗原の領域である。

ＦＩＧ、［ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ｌ　Ｉｔ　雪　箇　■　− 嗜　・ ＦＩＧ、５Ａ ＦＩＧ、５８　ＦＩＧ、５Ｃ ＧＡＣＡＴＣＡＡＣＧＡＴ　ＧＴＧ　Ｃ声Ｇ　ＧＡＣＣ−ＧＷ：＝ｌ：ＴＣＣＴ ＧＣＴＧＣＴＣτＣＣＧ＾Ｃ＾ＣＧＧ２印１１ｅ　ＺＳｎ　２Ｓｐ　ｖａｌ　ｇ ｌｎ　８５０　ｇｌｎ　ｃｙｓ　ｓｅｒ　ｃｙｓ　ｃｙｓ　ｓｅｒ　ｐｒｏ　ｔ ｈｒ　ｙｇ２葡 ＴＧＣＡＧＣＡＡＧ　ＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＧＴＧＣ ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＴ□　３４８ ＧＧＣＣτＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡ＋ＡＧτにＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣτＣＴＣＣＡ ＴＧＴＴＧＴＧＣ７ＣＴＴＧＴＧ口こＣτＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＣ△３ユ〕Ｌ九 ΔＧＧＣＴＧ＾ＧＣＴこＴＴ＾ＴＣτＯＣ＾Ａ＾＾＾＾＾＾＾＾ＡＡＡ＾Ａ＾Ａ ＡＣｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃ 手続補正書（方式） ％式％ １事件の表示 ＰＣＴ／１Ｊｓ８６１０１０５１、 発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　メロイ　ラボラトリーズ　インコーホレーテッド昭和６２年８月２５日 ６、補正の対象 ７、補正の内容 別紙の通り。明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし）。

に） 国際調査報告 １″Ｉ−ａ１″″ａ−＾’−’−””　ＰＣ丁／ＵＳ８６１０１０５１１ｍｅｌ Ｒｍ＋４Ｒａｌ＾ｅｅ１１ｅＪｂａｆｉＮ＠、ＰＣＴ／ＩＪＳ８６１０１０Ｓ＋

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（ａ）ヒトの内皮細胞培養からの全細胞ＲＮＡの抽出により得られしかも 大きさ分別により濃縮されたヒト因子ＶＩＩＩＲ　ｍＲＮＡの不均一な混合物を 用意し；（ｂ）トリの骨髄芽球ウイルス逆転写酵素及びオリゴ（ｄＴ）■プライ マーよりなる混合物中で該濃縮ｍＲＮＡを接触させてｃＤＮＡの第一の鎖を形成 し；アルカリ条件下でＲＮＡを加水分解しそしてヘアピン・ループ・プライミン グ及びイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなサブユニント が支配する合成によりｃＤＮＡの第二の鎖を形成することにより該濃縮混合物に 相補性のｄｓ−ｃＤＮＡを製造し； （ｃ）該ｄｓ−ｃＤＮＡをベクターに組み入れ；そして（ｄ）ｄｓ−ｃＤＮＡフ ラグメントの生体外転写及び翻訳並に免疫学的なＶＩＩＩ−Ｒ翻訳生成物の検出 により該ｄｓ−ｃＤＮＡが組み入れられたベクターを確認する ことよりなる自己再生組換え宿主系におけるヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒ又はそのフラ グメントをクローンする方法。 （２）該粒度分別が、ポリ（Ｕ）−セフアデツクスへの吸着後２８Ｓ　ｒＲＮＡ ピークのコントロール部分が回収されるよりも早（沈降する沈降速度超遠心分離 及び材料により行われる請求の範囲第（１）項記載の方法。 （３）該ｄｓ−ｃＤＮＡが、オリゴＣをつけたｄｓ−ｃＤＮＡをオリゴ（ｄＧ） をつけたｐＢＲ３２２によりアニールすることによりベクターに組み入れられる 請求の範囲第（１）又は（２）項記載の方法。 （４）該ｄｓ−ｃＤＮＡが、適当な自己再生組換え宿主系においてＤＮＡ配列エ ンコードヒト因子ＶＩＩＩＲを発現しうる複製可能な発現ベクターへ組み入れら れ；ｂ．該宿主系を形質転換して組換え及び宿主が得られ；ｃ．該因子ＶＩＩＩ ＲエンコードＤＮＡ配列の発現を許す条件下で該組換え宿主系を維持してヒト因 子ＶＩＩＩ−Ｒを生成させ；そして ｄ．該ヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒを確認する請求の範囲第（１）〜（３）項の何れか 一つの項記載の方法。 （５）発現ベクターがバクテリオファージ又はプラスミドである請求の範囲第（ ４）項記載の方法。 （６）バクテリオフアージかラムダｇｔ１０又はラムダｇｔ１１であるか又はプ ラスミドがｐＢＲ３２２である請求の範囲第（４）又は（５）項記載の方法。 （７）該ヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒの確認が、組換え宿主により発現されるたん白と 、因子ＶＩＩＩ−Ｒに特異的な少くとも１種の結合たん白よりなる試薬組成物と を反応させ、そしてそれから任意の検出可能なレスポンスを観察することよりな る請求の範囲第（４）項記載の方法。 （８）結合たん白かポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である請求の範 囲第（７）項記載の方法。 （９）抗体が、検出可能なレスポンスをもたらすのに有効な物質とともに存在す る請求の範囲第（８）項記載の方法。 （１０）試薬組成物が、ヒト因子ＶＩＩＩＲに特異的である一次抗体並に一次抗 体に特異的な二次抗体よりなる請求の範囲第（７）項記載の方法。 （１１）一次及び二次抗体がともにポリクローナルである請求の範囲第（１０） 項記載の方法。 （１２）二次抗体が、検出可能なレスポンスをもたらすのに有効な物質とともに 存在する請求の範囲第（１０）又は（１１）項記載の方法。 （１３）検出可能なレスポンスをもたらすのに有効な物質が、アイソトープ又は 非アイソトープ標識よりなる請求の範囲第（９）又は（１２）項記載の方法。 （１４）物質が、酵素、その基質並に検出可能なレスポンスをもたらす酵素及び その基質の相互反応に特異的に応答する試薬よりなる請求の範囲第（１３）項記 載の方法。 （１５）酵素がペルオキシダーゼであり、基質が過酸化物でありそして試薬がレ ドツクス色原体である請求の範囲第（１４）項記載の方法。 （１６）ヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒに対し免疫学的に反応しうるポリペプチドの無細 胞たん白合成系における合成を支配しうるｍＲＮＡをコピーすることにより形成 されたｃＤＮＡ。 （１７）そのポリヌクレオチド配列が実質的に【配列があります】であるヒト因 子ＶＩＩＩ−Ｒのカルボキシ末端領域をエンコードする請求の範囲第（１６）項 記載のｃＤＮＡ。 （１８）そのポリヌクレオチド配列が実質的にＧＡＧＴＧＣ【配列があります】 である請求の範囲第（１６）項又は（１７）項記載のｃＤＮＡ。 （１９）がいｃＤＮＡが、大きさで約９．５ｋｂ、７．６ｋｂ、５．４ｋｂ、２ ．４ｋｂのＤＮＡよりなる群から選はれる請求の範囲第（１６）〜（１８）項の 何れか一つの項記載のｃＤＮＡ。 （２０）組換え型で請求の範囲第（１６）〜（１９）項の何れか一つの項記載の ｃＤＮＡよりなるクローニング又は発現ベクター。 （２１）該ベクターがｐＤＬ３４である請求の範囲第（２０）項記載のベクター 。 （２２）請求の範囲第（２０）又は（２１）項記載のベクターにより形質転換さ れた宿主細胞。 （２３）Ａ７ＣＣ５３１０９の確認特徴を有する請求の範囲第（２２）項記載の 宿主細胞。 （３４）エビトープをエンコードするＤＮＡを用意し；該ＤＮＡをベクターに組 み入れ； 生体外で該ＤＮＡを転写且翻訳し； そしてモノクローナル抗体との反応により該翻訳のエビトープを確認する ことよりなる抗原のエビトープをエンコードするＤＮＡのクローンしたフラグメ ントを確認する方法。 （２５）該抗原がヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒである特許請求の範囲第（２５）項記載 の方法。