DE3008648A1 - Plasmid puc9 und verfahren zum isolieren von plasmid puc9 aus streptomyces fradiae - Google Patents
Plasmid puc9 und verfahren zum isolieren von plasmid puc9 aus streptomyces fradiaeInfo
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Plasmid pUC9 und Verfahren zum Isolieren von Plasmid pUC9
aus Streptomyces fradiae
0300A7/0607
Beschreib u_H_,._;
Die Entwicklung von Plasmidvektoren für rskombinante DNS-Gentechnologie
bei Mikroorganismen ist bekannt. Eine ausführliche Zusammenfassung über die DNS-Porschung findet
sich in "Science", Band 196, April 1977»
Ähnliche DNS-Arbeiten sind derzeit bei industriell wichtigen Mikroorganismen der Gattung Streptomyces im Gange (vgl.
M.J. Bibb, J.M. Ward und D.A. Hopwood in "Nature", Band 274,
Seiten 398 bis 400 (1978) "Transformation of plasmid DNA
into Streptomyces at high frequency"). Obwohl in verschiedenen Streptomyceten Plasmid-DNS·en nachgewiesen wurden
(vgl. M.L.B. Huber und 0, Godfrey in "Can. J. Microbiol.", Band 24, Seiten 631 und 632 (1978) "A general method for
lysis of Streptomyces species"; H. Schrempf, H. Bujard, D.A.
Hopwood und W. Goebel in "J. Bacteriol.:ϊ, Band 121, Seiten
416 bis 421 (1975) "Isolation of covalently closed circular deoxy-ribonucleic acid from Streptomyces coelicolor A3(2)";
H. Umezawa in "Biomedicine", Band 26, Seiten 236 bis 249
(1977) "Microbial secondary metabolities with potential use in cancer treatment (Plasmid involvement in biosynthesis
and compounds)" und V.S. Malik in "J. Antibiotics", Band 30, Seiten 897 bis 899 (1977) "Preparative Method for the
isolation of super-coiled DNA from a chloramphenicol producing Streptomycete"), wurde lediglich ein Streptomyceten-Plasmid
physikalisch isoliert und ausführlich in der Literatur beschrieben (vgl. Schrempf aaO). Das Vorliegen anderer
Plasmide in der Gattung Streptomyces wurde aus den in den folgenden Veröffentlichungen veröffentlichten genetischen
Daten geschlossen:
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(1) H. Akagawa, M. Okanishi und H. Umezawa in "J. Gen.
Microbiol.", Band 90, Seiten 336 bis 346 (1975) "A plasmid involved in chloramphenicol production
in Streptomyces venezuelae: Evidence from genetic mapping";
(2) R.P. Freeman und D.A. Hopwood in "J. Gen. Microbiol.",
Band 106, Seiten 377 bis 381 (1978) "Unstable naturally
occurring resistance to antibiotics in Streptomyces";
(3) E.J. Friend, M. Warren und D.A. Hopwood in "J. Gen.
Microbiol.11, Band 106, Seiten 201 bis 206 (1978) "Genetic evidence for a plasmid controlling fertility
in an industrial strain of Streptomyces rimosus";
(4) D,A. Hopwood und H.M. Wright in "J. Gen. Microbiol.",
Band 79, Se-iten 331 bis 342 (1973) "A plasmid of
Streptomyces coelicolor carrying a chromosomal locus and its inter-specific transfer";
(5) K. Hotta, Y. Okami und H. Umezawa in "J. Antibiotics",
Band 30, Seiten 1146 bis 1149 (1977) "Elimination of the ability of a kanamycin-producing strain to
biosynthesize deoxystreptamine moiety by acriflavine";
(6) R. Kirby, L.F. Wright und D.A. Hopwood in "Nature",
Band 254, Seiten 265 bis 267 (1975) "Plasmiddetermined
antibiotic synthesis and resistance in Streptomyces coelicolox";
(7) R. Kirby und D.A. Hopwood in "J. Gem Microbiol.",
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BAD ORIGINAL
BAD ORIGINAL
Band 98, Seiten 239 bis 252 (1977) "Genetic determination
of methylenomycin synthesis by the SCPI plasmid of Streptomyces coelicolor A3(2)" und
(8) M. Okanishi, T. Ohta und H. Umezawa in "J. Antibiotics", Band 33, Seiten 45 bis 47 (1969) "Possible
control of formation of aerial mycelium and antibiotic production in Streptomyces by episomic factors".
Das Plasmid pUC9 erhält man aus dem Mikroorganismus Streptomyces fradiae (DSM ). Dieses Plasmid erhält man aus
dem Mikroorganismus Streptomyces fradiae (DSM ) durch Züchten der Kultur auf einem geeigneten Medium, Fragmentieren
des Mycels, Inkubieren des fragmentierten Mycels, Ernten der Kultur nach einer geeigneten Zeit und anschließendes
Lysieren des Mycels. Aus dem erhaltenen Lysat läßt sich im wesentlichen reines Plasmid pUC9 isolieren. Eine
Empfindlichkeit gegenüber den verschiedensten Restriktionsendonukleasen sollte es auf einfache Weise Modifizierungen
zugänglich machen und an eine Reihe von Wirtvektorsystemen anpassen.
Das Plasmid pUC9 wird durch Standardkennzeichnungstests, z.B. sein Molekulargewicht von etwa 42,4 Megadalton und
die Anwesenheit von zwei Kopien pro Streptomyces-fradiae-(DSM )-Zelle, gekennzeichnet.
Das Plasmid pUC9 eignet sich als Klonungsvektor bei DNS-Arbeiten, bei welchen dem Plasmid die gewünschten Gene
einverleibt werden und dann eine Transformierung des Plasmids in einen geeigneten Wirt erfolgt.
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Wie bereits erwähnt, erhält man das Plasmid pUC9 aus Streptomyces
fradiae (NRRL 11446). Die biologisch reine Kultur ist in der Dauersammlung der Northern Regional Research
Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, unter der Hinterlegungsnummer NRRL 11446 hinterlegt.
Charakterisierung von Plasmid pUC9:
Molekulargewicht: etwa 42,4 Megadalton Anzahl Kopien pro Zelle: zwei
Empfindlichkeit gegenüber Restriktionsendonukleasen:
Das Plasmid pUC9 besitzt folgende Empfindlichkeitseigenschaften gegenüber Restriktionsendonukleasen:
Plasmidempfindlichkeitseigenschaften gegenüber Restriktionsendonukleasen
:
Spaltstellen Spaltstellen
Enzym Plasmid pUC9 Enzym Plasmid pUC9
BamHI Pst I Xba I
Diese Ergebnisse wurden durch Digerieren von pUC9-DNS in Gegenwart eines Überschusses an Restriktionsendonuklease
erhalten. Die Anzahl der Restriktionsstellen ergibt sich
aus der Anzahl der in 0,7- bzw. 1,0%igen Agarosegelen auflösbaren Fragmente.
pUC9 kann zur Schaffung rekombinanter Plasmide, die durch Transformation in Wirtbakterien eingefügt werden können,
| BgI | II | I | 5 |
| Hind | III | 2 | |
| Xho | >14 |
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herangezogen werden. Es ist bekannt, wie rekombinante Plasmide geschaffen werden können. Bei einem solchen Verfahren
erfolgt eine Spaltung des isolierten Vektorplasmids,
beispielsweise pUC9, an spezifischer (spezifischen) Stelle(n) mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease, beispielsweise
Hind III, Xba I und dergleichen. Das Plasmid, bei dem es sich um ein ringförmiges DNS-Molekül handelt, wird dabei durch
das Enzym, das die beiden DNS-Stränge an einer speziellen Stelle zerschneidet, in ein lineares DNS-Molekül überführt.
Eine andere Nicht-Vektor-DNS wird mit demselben Enzym in ähnlicher Weise gespalten. Beim Vermischen des linearen
Vektors oder von Teilen desselben mit Nicht-Vektor-DNS'en, können sich ihre einsträngigen oder stumpfen Enden miteinander
paaren und in Gegenwart eines als Polynukleotidligase bekannten zweiten Enzyms unter Bildung eines einzigen DNS-Rings
kovalent vereinigen.
Die geschilderten Maßnahmen können auch zum Einbau einer bestimmten DNS-Länge aus einem höheren Tier in pUC9 herangezogen
werden. So kann beispielsweise die DNS, die bei Fröschen für eine Ribosomen-RNS-Codierung verantwortlich
ist, mit der gespaltenen pUC9-DNS gemischt werden. Die erhaltenen ringförmigen DNS-Moleküle bestehen aus PlasmidpUC9
mit einer eingefügten Länge Frosch-rDNS.
Die unter Verwendung von pUC9 erhaltenen, ein gewünschtes
genetisches Element enthaltenden rekombinierten Plasmide können zu Abdruckzwecken in einen Wirtsorganismus eingeschleust
werden. Beispiele für wertvolle Gene, die in der geschilderten Weise in Wirtsorganismen eingeschleust werden
können, sind Gene mit Somatostatin-, Rattenproinsulin- und Proteasencodierung.
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Ά-
Der Nutzen des Plasmids pUC9 beruht auf seiner Fähigkeit zur Wirkung als Plasmidvektor bei industriell bedeutenden
Mikroorganismen, z.B. Streptomyces. So erhält man durch
Klonung einer genetischen Information aus Streptomyces in pUC9 eine Möglichkeit zur Steigerung industriell wertvoller
Produkte aus diesen Organismen, z.B. von Antibiotika.
Dieser Versuch ist dem Konzept einer Klonung von Genen für Antibiotikumproduktion in das gut charakterisierte Escherichia-coli-K-12-Wirt/Vektor-System
vergleichbar. Das E.-coli-System hat den Nachteil, daß Gene aus einigen gram-positiven
Organismen, z.B. Bacillus, in dem gram-negativen E.-coli-Wirt nicht gut abklatschbar sind (do not express well).
In gleicher Weise verbleiben Plasmide aus gram-negativen Organismen nicht in gram-positiven Wirten, so daß in grampositiven Wirten gram-negative genetische Information entweder
schlecht oder überhaupt nicht abgeklatscht (expressed) wird. Dies veranschaulicht klar und deutlich den Vorteil
eines gram-positiven Wirt/Vektor-Systems und den Nutzen von Plasmid pUC9 in einem solchen System.
In der Regel erfordert die Verwendung eines Wirt/Vektor-Systems
zur Herstellung eines für den Wirt fremden Produkts die Einschleusung von Genen für den gesamten biosynthetischen
Weg des Produkts in den neuen Wirt. Wie bereits ausgeführt, kann dies zu Problemen beim genetischen Abklatsch
(genetic expression) führen. Ferner können auch neue und/ oder verstärkte Probleme bei der Züchtung der Mikroorganismen
und bei der Extraktion und Reinigung des Produkts auftreten. Ein vielleicht brauchbarerer Versuch besteht darin,
einen Plasmidvektor, z.B. pUC9, in einen normalerweise das Produkt liefernden Wirt einzuschleusen und auf das
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Plasmid die Gene für die Biosynthese des Produkts zu klonen. Zumindest sollten sich dadurch die Probleme bei der Züchtung
und Produktextraktion und -reinigung auf ein Mindestmaß senken lassen. Darüber hinaus dürfte es bei diesem KIonungssystem
nicht erforderlich sein, sämtliche Gene des Biosyntheseweges zu klonen und zu verstärken, vielmehr dürfte
es lediglich erforderlich sein, Steuergene (regulatory genes) oder Gene mit Codierung für die Geschwindigkeit der
Produktbiosynthese begrenzende Enzyme zu klonen. Da das Plasmid pUC9 ein Streptomycetenplasmid darstellt, ist es in
dieser Hinsicht für die Gattung Streptomyces ideal geeignet. Da ferner das Plasmid pUC9 ein Plasmid aus einem gram-positiven
Organismus darstellt, kann es in einer Reihe anderer Mikroorganismen, z.B. Bacillus, Arthrobacter und dergleichen,
als Vektor dienen.
Streptomyces fradiae (DSM ) läßt sich in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen züchten.
Die Züchtung kann beispielsweise in einem Nährmedium mit einem assimilierbaren Kohlenhydrat als Kohlenstoffquelle,
einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiwdföartigen oder -haltigen Material als Stickstoffquelle
wachsen gelassen werden. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten
sind Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte
Stickstoffquellen sind Maiseinweichflüssigkeit,
Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl,
Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Casein, Fischmehl, Destillationsfeststoffe,
Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle und dergleichen. Zweckmäßigerweise werden
Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen
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-/I/I·
verwendet. Spurenmetalle, wie Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, brauchen nicht zugesetzt zu werden,
da als Bestandteile des Mediums vor seiner Sterilisierung Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile verwendet
werden.
Das beimpfte Medium kann bei jeder Temperatur, bei der ein akzeptables Wachstum des Mikroorganismus möglich ist, beispielsweise
bei einer Temperatur zwischen etwa 18° und 50°, vorzugsweise zwischen etwa 20° und 370C, inkubiert werden.
Üblicherweise erreicht man ein optimales Wachstum des Mikroorganismus in etwa 3 bis 15 Tagen. Das Medium bleibt während
des Wachstumszyklus üblicherweise sauer. Der End-pH-Wert hängt teilweise von den gegebenenfalls vorhandenen Puffern
und teilweise vom Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums ab.
Wenn das Wachstum bzw. die Züchtung in großen Kesseln und Tanks durchgeführt wird, bedient man sich vorzugsweise der
vegetativen Form und nicht der Sporenform des Mikroorganismus zum Beimpfen, um eine deutliche Verzögerung des Mikroorganismuswachstums
und eine darauf zurückzuführende ineffiziente Ausnutzung der Vorrichtung zu vermeiden.
Folglich ist es zweckmäßig, in einer Nährbrühe durch Beimpfen derselben mit einem aliquoten Teil aus einem Boden/
Flüssiger N2-Agarpfropfen oder einer geneigten Kultur ein
vegetatives Inokulat zu schaffen. Wenn ein junges, aktives, vegetatives Inokulat gebildet ist, wird es aseptisch in
große Gefäße oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Inokulat erzeugt wird, kann aus demselben oder
einem anderen (als es zur Züchtung der Mikroorganismen verwendet wird) Medium bestehen, solange nur ein gutes
Mikroorganismuswachstum gewährleistet ist.
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Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben, bedeuten sämtliche
Prozentangaben "Gew.-%" und sämtliche Verhältnisangaben bei Lösungsmittelgemischen "Volumenangaben".
Beispiel
Isolierung des Plasmids pUC9 aus einer biologisch reinen
Kultur von Streptomyces fradiae (DSM ):
10 ml eines Mediums mit 1% Glucose, 0,4% Pepton, 0,4% Hefeextrakt,
0,05% MgSO4.7H2O, 0,2% KH2PO4 und 0,4% K2HPO4 werden
mit den Sporen einer biologisch reinen Kultur von Streptomyces fradiae (DSM ) beimpft.
Das Medium war vorher in einem 50 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben sterilisiert worden. Nach der Beimpf ung wird der
Kolben etwa 24 bis 36 h auf einem mit 100 bis 250 Upm umlaufenden
Drehrüttler bei einer Temperatur von 320C inkubiert.
Nach beendeter Inkubierung wird 0,5 ml der Kultur in 10 ml des in einem 50 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben
befindlichen Mediums der angegebenen Zusammensetzung, das 0,5 bis 2,0% (G/V) Glycin enthält, überführt. Durch den GIycinzusatz
wird das anschließende Lysieren der Zellen erleichtert. Die Glycinmenge im Medium kann im Hinblick darauf,
daß das anschließende Lysieren der Zellen erleichtert werden soll, routinemäßig eingestellt werden. Danach wird der
Kolben nochmals 24 bis 36 h lang bei einer Temperatur von 32°C auf dem Drehrüttler inkubiert. Nach Beendigung der
Inkubation wird das Mycel durch Zentrifugieren mit niedriger Geschwindigkeit (beispielsweise 15 min lang bei einer
Temperatur von 4°C mit 6000 χ g) von der Brühe abgetrennt. Danach wird die überstehende Flüssigkeit von dem Mycelpellet
abgegossen.
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Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen, während das Pellet in 1,5 ml eines isotonischen Puffers, z.B. TES-Puffer
(0,03m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 0,OO5m-Äthylendiamintetraessigsäure
und 0,05m-NaCl; pH-Wert: 8,0) mit 20% (W/V) Saccharose, resuspendiert. Danach werden
0,3 ml eines 5 mg/ml Lysozyms und 0,15 ml einer 1 mg/ml RNase in demselben Puffer zugegeben, worauf das Gemisch
unter gelegentlichem Durchmischen 30 min lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert wird. Nach Zugabe von 0,6 ml
O,25m-Äthylendiamintetraessigsäure (pH-Wert: 8,0) wird das Gemisch 15 min lang bei einer Temperatur von 370C inkubiert.
Danach wird 0,3 ml einer 5 mg/ml Pronase zugesetzt und das Ganze 10 min lang bei einer Temperatur von 37°C
inkubiert. Schließlich wird die Zellensuspension durch Zusatz von 3,0 ml einer 2%igen Sarkosyllösung in TES-Puffer
und 20- bis 30-minütiges Inkubieren des Gemischs bei einer Temperatur von 37°C lysiert. Das Lysat wird dann
einer Scherkraft unterworfen, indem es 5- bis 10mal durch eine nadelfreie 50 ml fassende Wegwerfspritze laufen gelassen
wird.
Das erhaltene Rohlysat wird dann mit einem Salz, z.B. Cäsiumchlorid
(bevorzugt) oder Cäsiumsulfat, und dem einschiebenden (intercalating) Farbstoff Äthidiumbromid gemischt,
wobei eine Lösung einer Dichte von 1,550 erhalten wird. Diese Lösung wird bis zum Gleichgewicht bei
145000 χ g (isopyknisches Dichtegradientenzentrifugia-en)
zentrifugiert. Die kovalent geschlossene ringförmige Plasmid-DNS wird dann im Zentrifugenrohr bei Belichtung mit
langwelligem Ultraviolett (320 nm) als schwacher fluoreszierender Streifen unter dem intensiv fluoreszierenden
Streifen der linearen Chromosomen- und Plasmid-DNS'en
sichtbar.
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Zur Kennzeichnung wird kovalent geschlossene ringförmige
Plasmid-DNS dargestellt, indem sie von den isopyknischen Gradienten entfernt, das Äthidbmbromid durch zwei Behandlungen
mit einem Drittel Volumen Isopropanol extrahiert und schließlich die wäßrige Phase gegen einen geeigneten
Puffer, beispielsweise 0,1 X SSC-Puffer (0,015m-NaCl,
0,0015111-Na3C6H5O7^H2O, pH-Wert: 7,4), dialysiert
wird. Hierbei erhält man im wesentlichen reines Plasmid pUC9.
Maßnahmen zur Kennzsichnung und Isolierung von pUC9i
Die Größe des Plasmids pUC9 wird durch Sedimentation in
neutralen und alkalischen Saccharosegradienten unter Verwendung einer internen Marker-Plasmid-DNS eines Molekulargewichts
von etwa 28,0 Megadalton und einem entsprechenden Sedimentationswert von etwa 58S bestimmt. Aus den neutralen
Saccharosegradienten ergibt sich ein Sedimentationswert für pUC9 von 70S. Das Molekulargewicht des Plasmids
pUC9 errechnet sich aus den Gleichungen nach Hudson und Mitarbeitern (vgl. B. Hudson, D.A. Clayton und J. Vinograd
in "Complex mitochondrial DNA", Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 33, Seiten 435 bis 442 (1968)). Dieses
Molekulargewicht stimmt gut mit dem aus den alkalischen Saccharosegradienten geschätzten Molekulargewicht überein.
Die prozentuale Plasmid-DNS in Streptomyces fradiae (DSM
) wird durch Markieren der Kultur mit [Methyl-^H]-thymidin,
Herstellen von Rohlysaten und Zentrifugieren der Lysate in Cäsiumchlorid/Äthidiumbromid-Dichtegradienten
ermittelt. Die Gradienten werden fraktioniert, worauf eine Isotopenzählung erfolgt. Die prozentuale Radioakti-
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vitat im Plasmidstreifen dient zur Ermittlung der Menge
der Plasmid-DNS und zur Berechnung der Plasmid-Kopienzahl
(R. Radioff, W. Bauer und J. Vinograd (1967) 11A dye-buoyant
density method for detection and isolation of closed circular duplex DNA: The closed circular DNA in HeLa cells"
in «Proc. Nat. Acad. Sei. USA", Band 57, Seiten 1514 bis 1520).
Restrilfctionsendonuklease-Verdauung und Agarosegelelektrophorese:
Als Restriktionsendonukleasen werden Handelsprodukte verwendet. Die Enzymverdauungspräparate werden entsprechend
den Vorschriften des jeweiligen Herstellers zubereitet, wobei mindestens ein zweifacher Überschuß an Endonuklease
verwendet wird.
Die verdauten Proben werden auf 0,7- bis 1#ige Agar ο segele
appliziert und 2 h lang bei konstanter Spannung von 10 bis 15 V/cm Gelhöhe einer Elektrophorese unterworfen (vgl.
P.A. Sharp, J. Sugden und J. Sambrook in "Biochemistry", Band 12, Seiten 3055 bis 3063 (1973) "Detection of two
restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.11).
Die Molekulargewichte der Restriktionsfragmente werden, bezogen auf die Standardwanderungsmuster von
mit dem Enzym EcoRI verdauter Bakteriophagen-lambda-DNS,
bestimmt (vgl. R.B. Helling, H.M. Goodman und H.V. Boyer
in "J. Virology", Band 14, Seiten 1235 bis 1244 (1974)
"Analysis of endonuclease R.EcoRI fragments of DNA from
lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel
electrophoresis").
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Claims (4)
1. Im wesentlichen reines Plasmid pUC9, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 42,4 I-Iegadalton
und die folgenden Empfindlichkeitswerte gegenüber den folgenden Restriktionsendonukleasen: Bamlll
>1O; Pst I >15; Xba I 2; BgI II 5; Hind III 2; und Xho I
>14.
2. Verfahren zum Isolieren von im wesentlichen reinem Plasmid pUC9 aus Streptomyces fradiae (DSH ), dadurch
gekennzeichnet, daß man
(a) Streptomyces fradiae (DSH ) auf einem für Streptomyces
fradiae geeigneten Kulturmedium bis zu einem ausreichenden Mycelwachstum wachsen läßt;
(b) das Hycel fragmentiert;
(c) das fragmentierte Mycel in einem geeigneten Kulturmedium
(vgl. Stufe (a)) inkubiert;
(d) die Kultur nach einer geeigneten Zeit erntet;
(e) das geerntete Hycel lysiert und
(f) aus dem Lysat im wesentlichen reines Plasmid pUC9
isoliert,
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
man Streptomyces fradiae (DSM ) etwa 24 bis 36 h lang bei einer Temperatur von 320C in einem Nährmedium
züchtet♦
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4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das fragmentierte Mycel in einem Glycin enthaltenden
Kulturmedium züchtet.
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