CN107072963B - 治疗性纳米粒子和相关的组合物、方法和系统 - Google Patents

Abstract

公开了适于递送感兴趣的生物活性剂的靶向亚50nm纳米颗粒，以及相关组合物、方法和系统，其改善治疗性纳米颗粒的制造、稳定性、功效和其它方面。

Description

治疗性纳米粒子和相关的组合物、方法和系统

政府权利相关声明

本发明是由政府资助在国立卫生研究院签署的合同号为No.HHSN261201300030C下完成的。因此，政府对本发明有一定权利。

序列表

本申请包含序列表，其已经以ASCII格式通过电子提交，并且通过引用以其整体并入本文。所述ASCII副本创建于2015年9月1日，命名为0269.13PCT_SL.txt，大小为9,822字节。

背景

向细胞、组织、器官和生物体中有效递送感兴趣的制剂在生物医药、成像和其他期望向预定的目标递送不同大小和尺寸的分子的领域已成为挑战。无论是用于病理检查、治疗性治疗还是基础生物学研究，几种方法是已知的并且用于递送各种类别的生物材料和生物分子，其通常与感兴趣的生物学和/或化学活性相关。随着适合用作化学或生物制剂(例如药物、生物制剂、治疗剂或成像剂)的分子数目的增加，已经证明适合与不同复杂性、尺寸和化学性质的化合物一起使用的递送系统的开发特别具有挑战性。

纳米颗粒是用作通过各种递送方法递送制剂的载体的结构。存在几种纳米颗粒递送系统，其利用一系列不同策略将制剂包装、运输和递送至特定靶标。然而，需要能够将治疗水平的药物递送至细胞和分子靶标以改善疾病治疗的纳米颗粒治疗剂(和制备此类纳米颗粒的方法)。

多核苷酸在医学中具有重要的治疗应用。多核苷酸可用于调节(增加或减少)负责特定疾病的基因的表达。基因沉默技术使用与靶核酸杂交并调节基因表达活性或功能例如转录或翻译的多核苷酸。重要的是，基因沉默剂是抑制与疾病相关的蛋白质的功能的传统小有机化合物的有希望的替代物。RNAseH、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和小发夹RNA(shRNA)是基因沉默化合物和通过基因沉默阻止蛋白形成的机制的实例。

持续需要能够特异性调节基因表达以改善疾病治疗的递送系统和治疗剂。

发明概述

本文提供了非病毒纳米颗粒和相关的组合物、方法和系统，其可用于携带和递送具有多种大小、尺寸和化学性质的范围广泛的分子，包括至预定的靶标。本领域技术人员一旦具有本公开内容，将能够在无需过度实验的情况下鉴定、制备和开发用于这些和其他用途的非病毒纳米颗粒。

在一个方面，本发明提供了用于将治疗剂、疫苗和/或诊断剂递送至期望的靶标的系统。当纳米颗粒用无菌水(例如在开发或制造药学上可接受的治疗性纳米颗粒的过程中)和用铯预处理的锂掺杂剂配制时，实现了显著的益处和意想不到的优点。这种显著的益处和意想不到的优点包括但不限于，纳米颗粒更稳定，包括增强纳米颗粒的可靠运输能力，在药物开发中使用所公开的纳米颗粒更灵活和高效，例如在多个地点制造，以及本领域技术人员显而易见的其它优点。

本文公开的组合物和方法证明了本发明的纳米颗粒成功容纳所选择的配体和载荷的灵活性。在一个实施方案中，纳米颗粒包含含有生物活性剂和任选的缩合剂的核心，所述生物活性剂包括例如药物、疫苗和/或诊断剂；基本上围绕所述核以形成表面活性剂包被的复合物的表面活性剂，其中所述表面活性剂具有小于约6.0单位的亲水亲油平衡(HLB)值；和非共价地粘附至并基本上围绕所述表面活性剂包被的复合物的壳，其中所述壳包含靶向部分(配体)，其中所述壳由包含用铯预处理的锂的阳离子剂形成。纳米颗粒的平均直径小于约50纳米(即亚50nm的颗粒)。

本文还公开了长度达约50个核苷酸并能够与酪蛋白激酶2(CK2)α的相应RNA核酸序列特异性杂交的DNA/RNA嵌合单链多核苷酸以及长度达约50个核苷酸并且能够与CK2α’的相应RNA序列特异性杂交的DNA/RNA嵌合单链多核苷酸，以及制备和使用包含不同序列的所述多核苷酸的组合(“混合物”)以减少或抑制CK2α和CK2α’的表达并抑制实体瘤的生长的方法。此类多核苷酸的非限制性实例包括针对CK2α的SEQ ID NO:8和针对CK2α’的SEQ IDNO:9。

本文还公开CK2靶向多核苷酸，其主链被修饰为将5’端起的2号位置取代为2’O-甲基化(2’O-Me)的RNA核苷酸。此类主链修饰的多核苷酸的非限制性实例提供于下表2中。

在本发明的另一方面，在肿瘤靶向亚50纳米胶囊中组合和掺入如此修饰的CK2靶向多核苷酸的混合物产生纳米颗粒的治疗组合物，其在施用于对象后显著减少或抑制肿瘤生长、肿瘤细胞增殖和/或炎症。

因此，在一方面，本发明提供了包含纳米颗粒的组合物，其中所述纳米颗粒包含：至少一种生物活性剂、HLB值小于6.0单位的表面活性剂、配体以及Li⁺和Cs⁺，其中：i)所述至少一种生物活性剂和表面活性剂形成表面活性剂胶束核心，ii)所述配体形成壳，和iii)所述纳米颗粒具有小于50纳米的平均直径。在一实施方案中，所述配体形成外壳。在另一实施方案中，使用无菌水制备所述纳米颗粒。

在仍另一实施方案中，所述至少一种生物活性剂是多核苷酸。在仍另一实施方案中，所述至少一种生物活性剂是质粒DNA。在仍然另一实施方案中，所述Li⁺用Cs⁺预处理。

在另一方面，本发明提供了用于将至少一种生物活性剂递送至靶的系统，所述系统包含被组装在纳米颗粒中以用于将至少一种生物活性剂递送至靶的至少一种生物活性剂、HLB值小于6.0单位的表面活性剂、配体和用Cs⁺预处理的Li⁺。在一实施方案中，所述生物活性剂是多核苷酸。在另一实施方案中，所述靶是哺乳动物体内的细胞。

在另一方面，本发明提供了向对象施用至少一种生物活性剂的方法，所述方法包括向对象施用包含根据本发明的纳米颗粒的组合物。

还是在另一方面，本发明提供了用于向对象施用至少一种生物活性剂的系统，所述系统包含组装在待施用至所述对象的纳米颗粒中的至少一种生物活性剂、HLB值小于6.0单位的表面活性剂、配体和用Cs⁺预处理的Li⁺。

在根据本发明的组合物的一实施方案中，i)：所述纳米颗粒包含多个多核苷酸，每个包含3’RNA部分和5’主要是DNA的部分，其中从每个多核苷酸的5’末端起的2号位置是2’-OMe修饰的RNA，其中所述多个多核苷酸对于所述纳米颗粒组合物平均大于约45％且小于约55％、大于约40％且小于约60％、或大于约30％且小于约70％的序列包含SEQ ID NO：8，并且所述多个多核苷酸的其余部分的序列包含SEQ ID NO：9，和ii)所述配体是靶向腱生蛋白受体的蛋白质。在另一个实施方案中，所述靶向腱生蛋白受体的配体是tenfibgen。

本文使用的短语“包含纳米颗粒的组合物”或类似短语是指，但不限于，剂量、样品、制剂、制造批次和包含本发明纳米颗粒的其它物质组合物。

在一方面，本发明提供包含3’RNA部分和5’主要是DNA的部分的多核苷酸，其中从5’端起的2号位置是2’-OMe修饰的RNA，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：11的多达约50个连续核苷酸，并且包含SEQ ID NO:8的至少8个连续核苷酸的一个部分。在另一实施方案中，所述多核苷酸长度为约20个核苷酸并且包含SEQ ID NO：8。

在另一方面，本发明提供包含3’RNA部分和5’主要是DNA的部分的多核苷酸，其中从5’端起的2号位置是2’-OMe修饰的RNA，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：12的多达约至少50个连续核苷酸，并且包含SEQ ID NO：9的至少8个连续核苷酸的一个部分。在另一个实施方案中，所述多核苷酸长度为约20个核苷酸并且包含SEQ ID NO：9。

在一方面，本发明提供用于治疗患者的方法，包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的组合物，其中所述患者已被诊断患有实体瘤癌症。

在另一方面，本发明提供了用于治疗诊断为患有实体瘤癌症的患者的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的根据本发明的组合物，其中所述纳米颗粒包含多个多核苷酸，其中所述多个多核苷酸中每个包含3’RNA部分和5’主要是DNA的部分，其中所述多个多核苷酸中每个的5’端起的2号位置是2’-OMe修饰的RNA，其中所述多个多核苷酸的序列包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO:9，其中包含含有SEQ ID NO：8的多核苷酸的纳米颗粒的百分比为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％，并且其余的纳米颗粒包含含有SEQ ID NO:9的多核苷酸，其中所述配体是靶向腱生蛋白受体的蛋白质。

在一实施方案中，基于来自一个或多个对象的肿瘤组织中测量的CK2α酶和CK2α’酶的相对水平来确定所述百分比，任选地与参考组织和/或细胞培养物中的CK2α和CK2α’酶的相对水平进行比较。在另一实施方案中，所述百分比为约50％的纳米颗粒包含SEQ IDNO：8而约50％包含SEQ ID NO：9。

在一方面，本发明提供了制备本发明的组合物的方法，所述方法包括：i)使生物活性剂与缩合剂复合以形成缩合的生物活性剂；ii)将所述缩合的生物活性剂分散至包含HLB小于6.0的表面活性剂的水混溶性溶剂中以形成表面活性剂胶束；iii)将配体吸附到所述表面活性剂胶束的外表面以形成配体稳定的颗粒(也称为配体颗粒)；和iv)将所述配体颗粒与用Cs⁺预处理的Li⁺和无菌水混合并温育以形成所述组合物。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然下面提供了实施或测试本发明的合适方法和材料，但是本领域技术人员将认识到，与本文所述的那些类似或等同的其他方法和材料可被用于本发明的实践或测试。此外，本文所述的材料、方法和实施例仅是说明性的，而不意在限制。

发明详述

纳米颗粒

在一方面，本发明提供用于将生物活性剂靶向递送至特定组织和细胞的稳定的纳米颗粒。本发明的纳米颗粒具有配体涂层或壳和小于50纳米的平均直径，使得能够递送生物活性剂载荷穿过身体的生物屏障和/或到达并且进入感兴趣的细胞或组织。

如本文所使用的，“亚50nm纳米颗粒”通常在纳米颗粒组合物的上下文中提及，其中所述纳米颗粒包含(i)包含生物活性剂和疏水表面活性剂的表面活性剂胶束，和(ii)包含配体且具有小于约50纳米的平均直径的壳。在某些实施方案中，根据本发明的组合物的纳米颗粒具有约5至约50纳米、约5至约40纳米、约5至约30纳米、约5至约20纳米、约10至40纳米、约10至30纳米或约10至20纳米的平均直径。

如本文所使用的，术语“壳”通常是指纳米颗粒的表壳或外壳，并且包括围绕核心表面活性剂胶束的外表面的至少一部分的层或涂层或冠(corona)。在一实施方案中，所述壳包含一个或多个配体。对于纳米颗粒的给定制剂或组合物(本文可互换使用)，掺入不足重量的配体一般将导致不均匀颗粒，例如表现为不规则药物聚集体或融合的胶束，而过量的配体一般将导致大团块或失去球形或立方形状，例如表现为通过例如TEM或AFM显微照片分析所确定的细长结构。本领域技术人员一旦获得本公开内容，就能够在不进行过度实验的情况下鉴定、制备和探索掺入本发明的纳米颗粒中的配体的用途。

在一方面，本发明提供包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含生物活性剂。技术人员将理解短语“包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含(某一特征、性质等)”表示组合物中的多个纳米颗粒包含所述特征、性质等。

在一实施方案中，使用无菌水制备所述纳米颗粒。术语“制备”、“合成”、“制作”、“制造”等诸如此类在本文中可互换使用。本文使用的短语“使用无菌水制备的纳米颗粒”是指用无菌水制备用于合成本发明纳米颗粒的盐接收溶液。技术人员将理解，在最终盐接收溶液的制备中的任何一个步骤或多个步骤中添加的无菌水的总体积占最终盐接收溶液的总水体积的至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。在本文中，“最终盐接收溶液”是指在添加配体稳定的(ligand-stabilized)纳米颗粒之前的溶液。在该框架内，可以使用其它等级的水，例如作为添加到盐接收溶液中的赋形剂的储液。应当理解，短语“使用无菌水制备的纳米颗粒”和“包含无菌水的盐接收溶液”考虑无菌水占最终盐接收溶液的总水体积的约80％至100％。在“使用无菌水制备的纳米颗粒”和“包含无菌水的盐接收溶液”的上下文中使用的“无菌水”是指其中以下金属的水平总和不超过约0.2ppm的水：铝、砷、钡、镉、铬、铜、铁、铅、锰、镍、铷、硫、钒和锌。在一实施方案中，“无菌水”是指其中以下金属的含量总和不超过约0.1ppm的水：铝、砷、钡、镉、铬、铜、铁、铅、锰、镍、铷、硫、钒和锌。在该框架中，每种金属的水平和金属的总和基于低至方法检测限(MDL)报告的结果。金属测试可根据可用的方法进行，例如美国环境保护局方法6010和6020。

在一些实施方案中，必须使用高纯度的水，例如无菌水，以满足药物产品的监管标准。在一些实施方案中，期望使用无菌水，以通过降低可以改变纳米颗粒特征的污染物水平来改善对纳米颗粒制造的控制，所述特征例如尺寸、形状、稳定性和功能性，如通过例如透射电子显微镜(TEM)或原子力显微镜(AFM)确定。在一些实施方案中，期望使用无菌水，以通过提供一致的基质来改善对纳米颗粒制造的控制，所述基质中可以添加例如赋形剂的成分以改善纳米颗粒特性，例如尺寸、形状、稳定性和功能性。普通技术人员还将理解，关于药物研究、开发和制造中的水的测试、分级和用途，例如由美国药典和类似组织制定的那些的方法和准则是可用的。

在一实施方案中，使用的无菌水是药物级水。在另一实施方案中，使用无菌水制备药学上可接受的治疗性纳米颗粒。在本文中的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与对象的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在一实施方案中，无菌水也用于纳米颗粒制备过程中的其它步骤，例如用于组装盐接收溶液的任何试剂的溶液制备或所述纳米颗粒的一或多种组分在它们被加入盐接收溶液之前的制备。

在一实施方案中，纳米颗粒包含锂(Li⁺)和铯(Cs⁺)离子。在另一实施方案中，纳米颗粒包含已经用Cs⁺预处理的Li⁺。本文使用的短语“用Cs⁺预处理的Li⁺”和类似短语是指在将预混合或接触的Li⁺和Cs⁺离子与已经或将要用于制备盐接收溶液的无菌水体积接触之前使Li⁺和Cs⁺离子预混合或接触。预处理步骤中的Li⁺的浓度一般应为至少1M。在一实施方案中，浓度为2M。在一实施方案中，浓度为3M。在一实施方案中，浓度在3M和5M之间。在一实施方案中，浓度为4M。在一实施方案中，浓度为5M。在一实施方案中，在将Li⁺添加到用于形成纳米颗粒的盐接收液bath)之前用离子对Li⁺的预处理限于离子Cs⁺。在所述实施方案中，应理解，将预处理离子限制为Cs⁺预期特别排除添加到预混物中的其它离子，但不打算排除可能存在于用于用Cs⁺预处理Li⁺的水源中的其它离子。出于本文公开和预期的目的，Li⁺和Cs⁺离子的预混合或接触可容易地根据本领域技术人员已知的用于组合离子和类似分子的方法进行，包括简单地将期望浓度的离子在水中，例如，无菌水中混合。在一实施方案中，在50ml管中的无菌水中将约0.1μg/1ml的Cs⁺加入到约4M Li⁺，以重量计约2.5ppb Cs⁺：Li⁺，并旋转约2分钟。本领域技术人员将理解，可以常规地改变使用的Cs⁺：Li⁺的比例和/或在例如50ml管中的无菌水中的合并的离子的浓度，以操纵纳米颗粒的形态或稳定性或一些其他随后产生的特性。

在另一个实施方案中，Cs⁺与Li⁺以约0.1至约100十亿分率(ppb)之间的比例预混合。在另一个实施方案中，预混合比例为约0.1至约5ppb之间。在另一个实施方案中，预混合比例为约1至约4ppb之间。这些范围中的每一个包括那个范围内的子范围。例如，约1至约4ppb之间的范围包括：约1.2至约2.5ppb之间，以及约2至约4ppb之间等诸如此类。令人惊奇的是，对于使用无菌水制备的纳米颗粒，用与Li⁺预混合的Cs⁺配制的那些颗粒形成了期望的球形、长方体或椭圆形亚50纳米的纳米颗粒，而用在盐接收溶液中简单混合并且不预混合的Cs⁺和Li⁺配制的那些颗粒通常形成未卷绕的长棒状的不适合使用的组合物。本领域技术人员一旦获得本公开内容，将能够通过常规实验鉴定、制备和开发Cs⁺和Li⁺预混物用于靶向纳米颗粒的用途。

所公开的纳米颗粒提供模块化靶向组分，其可容易地针对给定靶例如给定组织或细胞靶被合成，而无需将靶向部分螯合、缀合或共价连接到纳米颗粒上的步骤。本领域技术人员将理解，通过基于预期靶合理选择靶向部分和本领域已知的方法和组合物，本发明的纳米颗粒能够将生物活性剂递送至预定的靶组织和细胞。

在一实施方案中，所述壳包含配体。本文使用的术语“配体”是指结合靶受体的物质。在一些实施方案中，配体包括蛋白质、肽、多肽、碳水化合物、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、抗体或生物相容性聚合物，或其片段，或小分子。在一实施方案中，用至少一种组织或细胞特异性配体包被亚50nm纳米颗粒。“包被的纳米颗粒”是指其中配体通过非共价缔合与核心表面活性剂胶束结合的纳米颗粒。本发明的纳米颗粒的配体选择的灵活性部分地通过不存在例如通过螯合、共轭或共价连接将配体连接到纳米颗粒的复杂步骤来实现，相反，采用直接吸附步骤将配体吸附到疏水胶束表面，随后在盐结晶溶液中稳定靶向颗粒。因此，例如，将配体吸附到核心表面活性剂胶束允许比其中配体与核心颗粒缀合或螯合的纳米颗粒更有效地掺入更大的配体。包括例如tenfibgen、透明质酸和合成聚合物例如PVP的多种配体可用作制备本发明的Cs⁺处理的纳米颗粒的配体。例如，包含PVP的颗粒将以类似于针对5.5kb质粒的配方J(下文实施例)制备，除了使用4μl的25kD PEI作为缩合剂，3.3μg的10kD PVP作为吸附到核心胶束的配体，并将接收液修改为1.5nM Mg²⁺和1.88nM Sr²⁺之外，所有其他离子相同。

在一实施方案中，配体靶向具有腱生蛋白受体的细胞。在另一实施方案中，配体是tenfibgen。

在仍然另一实施方案中，配体是透明质酸。

在一方面，本发明提供了将生物活性剂递送至靶或给对象施用生物活性剂的系统。在一实施方案中，所述系统包含至少一种生物活性剂例如多聚核苷酸、HLB值小于6.0单位的表面活性剂、配体以及Li⁺和Cs⁺，其待组装于亚50纳米纳米颗粒中，用于将至少一种生物活性剂递送至靶或给对象施用至少一种生物活性剂。本文所用的术语“系统”是指能将生物活性剂导入对象体内并改善其功效或性能的制剂或组合物。

在一实施方案中，本发明的纳米颗粒掺入一或多种用于调节基因表达的生物活性剂，以增加或减少特定基因产物(例如蛋白质或RNA)的产生。在另一实施方案中，所述一或多种生物活性剂参与例如RNaseH、RNAi和dsRNA酶作用机制，以及基于靶降解或靶占位的其它调节机制。

生物活性剂

本发明的Cs-处理的纳米颗粒可被用于携带和递送生物活性剂至靶组织和细胞。本文所用的短语“生物活性剂”是指当施用或递送至细胞、组织或生物体时模拟、改变或调节细胞、组织或生物体的一或多种生理学、生物化学、或病理过程的一或多种物质。优选地，改变或调节是医学上期望的改变或调节。更具体地讲，生物活性剂可以是目的为包括成像或监测或治疗或预防的用途的许多不同化合物或分子中的任何一种或多种，包括但不限于生物活性剂，例如寡核苷酸、多核苷酸、质粒DNA、任何基于核酸的分子包括但不限于DNA、RNA、siRNA、mRNA、miRNA、shRNA、适体、反义分子、或核酶以及蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、抗体或小分子。

不希望受理论束缚，生物活性剂选择的灵活性部分地通过形成纳米颗粒的核心的疏水-表面活性剂包被的胶束的分配和缩合特征来实现。技术人员可认识到这些特征对使用寡核苷酸、多核苷酸、质粒DNA、任何基于核酸的分子包括DNA、RNA、siRNA、miRNA、shRNA、适体、反义分子、核糖核酸酶、蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、抗体或其它载荷，更优选但不排他地，亲水性和/或负性或近中性电荷的载荷制备本发明的纳米颗粒是合适的和有功能的。本发明的纳米颗粒用于在不同制剂中掺入一系列生物活性剂的这种灵活性被展示，例如配制10.5kb质粒DNA和透明质酸纳米颗粒壳，获得22.7纳米平均直径和-6.4mev电荷，和配制6800道尔顿单链寡核苷酸和tenfibgen纳米颗粒壳，获得直径19.5纳米，电荷-5.8mev(参见实施例)。

因此，可以通过常规实验将其它不同的生物活性剂掺入铯预处理的纳米颗粒中。例如，小分子赤藓糖醇(MW，122)可通过类似于配方A(实施例)进行制备，除了无任何缩合剂的500μg的赤藓糖醇用8.75μg表面活性剂胶束化，用5.5mcgTBG包被，并雾化至用6.25nMMg²⁺和9.38nM Sr²⁺修饰的接收液中外，所有其它离子相同。所得纳米颗粒的直径约为25nm，表面电荷约为-12mev。

本文所用的短语“疏水性表面活性剂包被的”是指用于形成表面活性剂胶束的疏水性表面活性剂的包被或层，其包围至少一部分生物活性剂和任选的缩合剂。对于给定的制剂，不足的表面活性剂的掺入一般将导致不规则的药物聚合物，而过量的表面活性剂一般将导致表面活性剂球粒，如通过例如TEM或AFM显微照片分析所确定的。在某些实施方案中，生物活性剂是单链嵌合寡核苷酸。包括寡核苷酸的生物活性剂通常可用本领域熟知的技术制备，但也可从商业制造商那里获得。

在一实施方案中，生物活性剂是针对分子靶的多种生物活性剂。在另一实施方案中，生物活性剂包括具有不同分子靶和/或作用机制的两种或更多种生物活性剂的混合物。

在一些实施方案中，生物活性剂与阳离子缩合剂缩合，所述阳离子缩合剂包含聚乙烯亚胺、聚鸟氨酸、聚精氨酸、精胺或本领域公知的其它一或多种阳离子缩合剂。

“特异性杂交”和“互补”是用于指足够程度的互补性使得在本发明的多核苷酸和靶RNA分子之间发生稳定和特异性结合的术语。在本领域中应理解，多核苷酸的序列不需要与其可特异性杂交的靶RNA分子的序列100％互补。本领域普通技术人员将认识到，本文提供的化合物与靶核酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。如果(a)多核苷酸与靶RNA分子的结合干扰靶RNA分子的正常功能，和(b)具有足够的互补性使得多核苷酸与靶RNA分子的结合具有高选择性并且在期望的特异性结合条件下(即在进行体外测定的条件下或在用于体内测定或治疗用途的生理条件下)在很大程度上避免多核苷酸与非靶序列的非特异性结合，多核苷酸特异性杂交。设计充分互补以在本发明中有用的寡核苷酸的方法的实例和这样的设计技能在本领域技术人员的能力范围内。

术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”是指核糖核苷酸的聚合物。“靶RNA”是指可与本发明的充分互补的多核苷酸杂交的任何RNA。靶RNA可包括但不限于mRNA前体、miRNA前体、初级miRNA、mRNA、miRNA、小核或胞质非编码调节RNA、核糖体RNA、转移RNA、mRNA加工途径中任何阶段的hnRNA或线粒体RNA。“mRNA”或“信使RNA”是指编码一条或多条多肽链的氨基酸序列的单链RNA。在一实施方案中，本发明的靶mRNA指定细胞蛋白(例如核、细胞质、线粒体、跨膜或膜相关蛋白)的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的靶mRNA指定细胞外蛋白(例如细胞外基质蛋白或分泌蛋白)的氨基酸序列。术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸的聚合物。

术语“核酸分子”或“多核苷酸”是指任何含核酸的分子，包括但不限于单链、双链体或多链形式的超过1个核苷酸的DNA和/或RNA。该术语涵盖包括任何已知的DNA和RNA的碱基类似物的序列。术语“多核苷酸”还意在包括含有2’-脱氧-D-核糖或其修饰形式的多脱氧核糖核苷酸、RNA以及是嘌呤或嘧啶碱基、或修饰的嘌呤或嘧啶碱基或碱性核苷酸的N-糖苷或C-糖苷的任何其它类型的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸可编码调节或修饰染色质或其它多核苷酸的启动子区、操纵子区、结构区、终止区、其组合、或任何其它遗传相关材料。类似地，本文使用的术语“遗传(genetic)”是指能够修饰基因表达的任何材料。

术语“寡核苷酸”是指短长度的单链多核苷酸链。寡核苷酸长度一般小于200个残基(例如，在约8和100之间)。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。

如本文所用，“基因沉默”、“基因沉默分子”、“基因沉默化合物”以及诸如此类是指多核苷酸，其至少一部分和与其杂交的靶核酸至少部分互补。在某些实施方案中，基因沉默化合物调节(例如降低)靶核酸的表达或量。在某些实施方案中，基因沉默化合物改变靶前体mRNA的剪接，导致不同的剪接变体。在某些实施方案中，反义化合物调节一或多种不同靶蛋白的表达。本文考虑的基因沉默机制包括但不限于核糖核酸酶H机制、RNAi机制、剪接调节、翻译阻滞、改变RNA加工、抑制微小RNA功能和模拟微小RNA功能，以及阅读当前公开内容后技术人员可识别的其他机制。

术语“小干扰RNA”(“siRNA”)(本领域中也称为“短干扰RNA”)是指包含约10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)的能够指导或介导RNA干扰的RNA(或RNA类似物)。如本文所用，术语“RNA干扰”(“RNAi”)是指RNA的选择性细胞内降解。在一些实施方案中，生物活性剂是双链siRNA多核苷酸。

如本文所用，“表达”是指基因最终导致蛋白质的过程。表达包括但不限于转录、剪接、转录后修饰和翻译。

术语“基因”是指包含产生多肽、前体或RNA(例如rRNA、tRNA和其他ncRNA)所必需的编码序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可由全长编码序列或通过编码序列的任何部分编码，只要全长编码序列或片段的期望活性或功能特性(例如酶活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)被保留。

术语“基因表达”指的是通过基因的“转录”(即通过RNA聚合酶的酶促作用)将基因里编码的遗传信息转换为RNA(例如mRNA、rRNA基因、tRNA的或snRNA)的过程，并且对于编码蛋白质的基因，通过mRNA的“翻译”成为蛋白质。基因表达可在该过程的许多阶段被调节。“上调”或“活化”是指增加基因表达产物(即RNA或蛋白质)产生的调节，而“下调”或“抑制”是指减少产生的调节。涉及上调或下调的分子(例如转录因子)通常分别被称为“激活子”和“抑制子”。

术语“基因表达的抑制”是指本发明的多核苷酸与靶RNA杂交并提供所述基因的部分或完全功能丧失的条件。应当理解，多核苷酸不需要与其可特异性杂交的靶RNA序列100％互补。在某些实施方案中，，相对于不存在本发明的双功能嵌合单链多核苷酸时的基因表达水平，靶基因表达期待降低至少约10％、25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。本发明不限于抑制特定基因的表达。

术语“核苷”是指具有共价连接到核糖或脱氧核糖的嘌呤或嘧啶碱基的分子。示例性核苷包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷和胸苷。术语“核苷酸”是指具有一或多个以酯键连接到糖基的磷酸基团的核苷。示例性核苷酸包括核苷单磷酸、二磷酸和三磷酸。术语“多核苷酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，是指核苷酸的聚合物，并且在本发明的一个实施方案中，通过在糖基的5’和3’碳原子之间的磷酸二酯键连接在一起。

术语“核苷酸类似物”或“改变的核苷酸”或“修饰的核苷酸”是指较不常见的核苷酸，包括天然和非天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸类似物可在任何位置被修饰，以便改变核苷酸的某些化学性质，但保留核苷酸类似物执行其预期功能的能力。核苷酸类似物还可包含对核苷酸的糖部分的修饰。还可修饰核苷酸的磷酸基团，例如通过用硫(例如硫代磷酸酯)取代磷酸基团的一个或多个氧，或通过允许核苷酸执行其预期功能的其它取代。

为了用于制备本发明化合物的核苷结构亚单元，用于在这些核苷亚单元中掺入合适的核碱基包括嘌呤和嘧啶，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿苷和胸腺嘧啶，以及其它合成和天然核碱基，例如黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、氨基、巯基、硫代烷基、羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤。另外的嘌呤和嘧啶包括在美国专利号3,687,808，在Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，pages 858-859，Kroschwitz，J.I.，ed。John Wiley&Sons，1990，以及Englisch，et al.1991AngewandteChemie，International Edition 30：613，均通过引用并入本文。

“磷酸二酯”是指具有连接连续核苷酸的氧原子的多核苷酸。“硫代磷酸酯”是指这样的多核苷酸，其中通常连接两个连续核苷酸的氧原子已经被硫替代并且其抗细胞酶的降解。本发明的多核苷酸的核苷亚基通过来自包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、3’-(或-5’)脱氧-3-(或-5’)硫代-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、‘-(或-5’)脱氧次膦酸盐、硼烷磷酸盐、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或5’-)氨基磷酸酯、氢膦酸酯、硼烷磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯磷键的磷键连接。已经报道了核苷键的硫代磷酸酯修饰用于增加稳定性最低限度地影响沉默活性(2007Nat Rev Mol Cell Biol 8：23-6)。在一个实施方案中，包含PS/2-O-Me的主链在PO/2-O-Me似乎有限的情况下可能是有价值的。

术语“磷酸化”是指至少一个磷酸基团连接到化学(例如有机)化合物上。磷酸基团可通过例如以下反应连接到蛋白质或糖基上：游离羟基+磷酸→供体磷酸酯键。还旨在包括在本发明范围内的是磷酸基类似物，其与在自然界中发现的单磷酸，二磷酸或三磷酸基以相同或相似的方式起作用。在一个实施方案中，本文公开的嵌合多核苷酸包含外源5’磷酸化。在另一个实施方案中，本文公开的嵌合多核苷酸不包含外源5’磷酸化。术语“外源5’磷酸化”通常是指通过合成方法而不是天然生物过程进行的磷酸化。

“嵌合”是指但不限于这样的分子，其包含天然存在的RNA和DNA部分，或通过磷酸二酯、硫代磷酸酯和/或任何其它天然存在或合成的允许核苷酸或类似物保持他们的预期功能的连接相连的核苷酸类似物。所述寡核苷酸或多核苷酸可被称为具有至少两个片段。一个片段定义为从多核苷酸的3’末端开始的部分，并且是核糖核酸片段，并且应当包括至少约三个连续核糖核苷酸，并且第二片段被定义为在多核苷酸的5’末端结束的部分，并且是脱氧核糖核酸为主的部分，并且包含至少约6、7、8、9或10个脱氧核糖核苷酸，其中总共0、1、2或3个核糖核苷酸可被置于所述的至少约6、7、8、9或10个脱氧核糖核苷酸之间。在一个实施方案中，第二部分包含至少5个连续的脱氧核糖核苷酸。在一个实施方案中，从5’端开始的2号位置是2’-OMe修饰的RNA。

根据本发明的优选的单链嵌合多核苷酸优选包含约8至约50个核苷亚单位。在本发明的上下文中，应当理解，这包括具有8至50个核苷亚基的如上所述的非天然存在的寡聚体。更优选地，本发明的单链嵌合多核苷酸包含约15至约25个核苷亚基。因此，单链嵌合多核苷酸可长度为8个核苷酸，长度为9个核苷酸，长度为10个核苷酸，长度为11个核苷酸，长度为12个核苷酸，长度为13个核苷酸，长度为14个核苷酸，长度为15个核苷酸，长度为16个核苷酸，长度为17个核苷酸，长度为18个核苷酸，长度为19个核苷酸，长度为20个核苷酸，长度为21个核苷酸，长度为22个核苷酸，长度为23个核苷酸，长度为24个核苷酸，长度为25个核苷酸，长度为27个核苷酸，长度为28个核苷酸，长度为29个核苷酸，长度为30个核苷酸，长度为31个核苷酸，长度为32个核苷酸，长度为33个核苷酸，长度为34个核苷酸，长度为35个核苷酸，36个核苷酸长度为37个核苷酸，长度为38个核苷酸，长度为39个核苷酸，长度为40个核苷酸，长度为41个核苷酸，长度为42个核苷酸，长度为43个核苷酸，长度为44个核苷酸，长度为45个核苷酸，46个核苷酸长度为47个核苷酸，长度为48个核苷酸，长度为49个核苷酸，或长度为50个核苷酸。如将会被理解的，“核苷亚基”是通过寡核糖核苷酸中的磷键和通过寡核糖核苷中的非磷键合适地结合到相邻亚基上的核碱基和糖或糖替代物的组合。在本文中，术语“核苷亚基”与术语“核苷单元”或“核苷”互换使用。更优选地，本发明的嵌合寡聚核苷酸将具有通过天然存在的磷酸二酯键连接的核苷。

在某些实施方案中，生物活性剂是单链多核苷酸，并且多核苷酸是从标准优化siRNA技术获得的引导链。本文包括对常规siRNA序列选择的讨论。

由siRNA引导的靶RNA切割反应是高度序列特异性的。通常，含有与靶基因的核苷酸序列或核苷酸序列的一部分相同的核苷酸序列的siRNA对于抑制是优选的。然而，siRNA和靶基因之间的100％序列相同性不是实施本发明所必需的。因此，本发明具有能够耐受可能预期由于基因突变、株系多态性或进化分期的序列变异的优点。例如，还发现相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的siRNA序列对于抑制是有效的。或者，具有核苷酸类似物取代或插入的siRNA序列可有效抑制。

此外，并非siRNA的所有位置均等地贡献于靶识别。siRNA中心的错配是最关键的，基本上消除了靶RNA切割。相比之下，siRNA的3’核苷酸不显著地贡献于靶识别的特异性。特别是siRNA序列3’的残基，其与靶RNA互补(例如引导序列)，对于靶RNA切割不是关键的。

可通过本领域已知的序列比较和比对算法确定序列相同性。为了确定两个核酸序列(或两个氨基酸序列)的百分比相同性，为了最佳比较目的，对序列进行比对(例如可在第一序列或第二序列中引入缺口以优化比对)。然后比较相应核苷酸(或氨基酸)位置处的核苷酸(或氨基酸残基)。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的残基占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的相同性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即％同源性＝相同位置数目#/位置的总数#x 100)，任选地对所引入缺口数目和/或引入缺口的长度进行罚分。

序列的比较和两个序列之间百分比相同性的确定可使用数学算法来完成。在一实施方案中，在比对具有足够相同性而不是具有低相同性程度的部分的序列的某一部分上产生比对(即局部比对)。用于比较序列的局部比对算法的优选的非限制性实例是Karlin和Altschul((1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,modified as in Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77，通过引用并入本文。这样的算法被并入Altschul等人的BLAST程序(版本2.0)(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)，通过引用并入本文。

在另一实施方案中，通过引入适当的缺口来优化比对，并且在比对序列的长度上确定相同性百分比(即缺口比对)。为了获得用于比较目的的空缺比对，可使用GappedBLAST，如Altschul等((1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402)所描述的。在仍然另一实施方案中，通过引入适当的缺口来优化比对，并且在比对的序列的整个长度上测定相同性百分比(即全局比对)。用于序列的全局比对的数学算法的优选的非限制性实例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。这样的算法被并入ALIGN程序(版本2.0)中，其是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4。

优选在siRNA和靶基因的一部分之间有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的序列相同性。或者，siRNA可在功能上被定义为能够与靶基因转录物的一部分杂交的核苷酸序列(或寡核苷酸序列)(例如400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4,1mM EDTA，50℃或70℃杂交12-16小时；然后洗涤)。其它示例性杂交条件包括在70℃下在1×SSC或50℃下在1xSSC，50％甲酰胺中杂交，随后在70℃下在0.3xSSC中洗涤或在70℃下在4x SSC或50℃下在4xSSC，50％甲酰胺中杂交，然后在1×SSC中在67℃洗涤。预期长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度应该比杂交体的解链温度(Tm)低5-10℃，其中根据以下等式确定Tm。对于长度小于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T个碱基的#)+4(G+C个碱基的#)。对于在18和49个碱基对长度之间的杂交体，Tm((℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中的碱基数，[Na+]是杂交缓冲液中的钠离子浓度(1xSSC的[Na+]＝0.165M)。多核苷酸杂交的严格条件的其它示例提供于Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，chapters 9and 11,and Current Protocols in Molecular Biology，1995，FMAusubel et al.,eds.,John Wiley&Sons，Inc.，sections 2.10and 6.3-6.4，通过引用并入本文。相同核苷酸序列的长度可是至少约10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47或50个碱基。

治疗方法

在一方面，本发明提供了抑制实体瘤中酪蛋白激酶2表达的方法。本发明的方法包括施用靶向纳米颗粒递送多核苷酸至肿瘤，其中多核苷酸与酪蛋白激酶2核酸序列杂交并减少或抑制其表达。

在一方面，本发明提供调节实体瘤中酪蛋白激酶2的下游靶活性的方法。在一些实施方案中，酪蛋白激酶2的下游靶包括但不限于NF-_κB p65、Cdc37和AKT。本发明的方法包括施用靶向纳米颗粒递送多核苷酸至肿瘤，其中多核苷酸与酪蛋白激酶2核酸序列杂交，并降低或抑制下游靶的活性和/或酪蛋白激酶2活性的下游标记，包括例如Ki-67。

在另一方面，本发明提供减少实体瘤的大小或抑制或稳定对象中实体肿瘤生长的方法。本发明的方法包括施用靶向纳米颗粒递送多核苷酸至肿瘤，其中多核苷酸与酪蛋白激酶2核酸序列杂交并减少或抑制其表达。在某些实施方案中，将多核苷酸递送至肿瘤的靶向纳米颗粒导致实体瘤大小减小或实体瘤生长的稳定或抑制。

如本文所用，术语“对象”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、脊椎动物、啮齿动物等诸如此类，其将是特定治疗的接受体。术语“对象”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用。

在一些实施方案中，所述靶是体外生物系统，例如体外组织或细胞，并且所述方法包括使靶与本文所述的纳米颗粒接触。

在一实施方案中，用于结合到酪蛋白激酶2的寡核苷酸具有SEQ ID NO：8(对于靶向酪蛋白激酶2α)或SEQ ID NO：9(对于靶向酪蛋白激酶2α’)所示的序列。在根据本发明的纳米颗粒的组合物的一实施方案中，纳米颗粒包含多个多核苷酸，其中所述多个多核苷酸中包含SEQ ID NO：8的百分比为平均大于约1％且小于约100％，大于约30％且小于70％，大于约40％且小于约60％，大于约45％且小于约55％，大于约48％且小于约52％，大于约49％且小于约51％，或为约50％，且所述多个多核苷酸的其余部分包含SEQ ID NO：9。影响每种多核苷酸序列的百分比的因素包括，例如在制备纳米颗粒时掺入的每种多核苷酸的相对体积，或每种多核苷酸的相对包封百分比。组成组合物的多核苷酸可使用本领域已知的取样方法确定，例如杂交测定和功能性细胞测定。

在根据本发明的纳米颗粒的组合物的一实施方案中，纳米颗粒的混合物包含多核苷酸，其包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9。在根据本发明的纳米颗粒组合物的另一实施方案中，包含含有SEQ ID NO：8的多核苷酸的纳米颗粒的百分比为大约10％、大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％或大约90％，且包含多核苷酸的组合物的纳米颗粒的其余部分包含SEQ ID NO：9。

预期通过本发明的方法治疗的代表性肿瘤包括与某些癌症相关的肿瘤，包括但不限于乳腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌)、前列腺癌、结肠直肠癌、脑癌、食管癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、头颈癌、皮肤癌、鼻咽癌、脂肪肉瘤、上皮癌、肾细胞癌、胆囊腺癌、腮腺癌、卵巢癌、黑素瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤和子宫内膜肉瘤。

在一实施方案中，通过本发明的方法的治疗包括向诊断为患有实体瘤癌症的患者施用。本文所用的“实体瘤”是指由细胞增殖产生的异常大量的组织。实体瘤可在身体的任何部分产生，并且可以是良性的(非癌性)或恶性的(癌性)。除白血病之外的大多数类型的癌症可形成实体瘤。实体瘤包括但不限于腺癌、癌、血管瘤、脂肪肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤和肉瘤。短语“实体瘤”也可用于指诸如子宫内膜异位症的病症，即由细胞的不受控增殖引起的病症。

腱生蛋白(Tenascin)是一种大的糖蛋白，显示出在实体瘤的微环境中过表达(Brellier，et al.2011J Cell Molec Med 16:32-40)。在肿瘤细胞上发现腱生蛋白的受体，为通过使用具有腱生蛋白-定向的配体的治疗性纳米颗粒治疗实体瘤癌症的有吸引力的靶。在肿瘤细胞上发现的腱生蛋白受体的非限制性实例包括整联蛋白αV、α2、β1和β3。本领域技术人员，一旦获得本公开内容，将能够在无需过多的实验的情况下鉴定、制备和开发至实体肿瘤的腱生蛋白定向的配体纳米颗粒，用于将生物活性剂靶向和递送到实体肿瘤。这种腱生蛋白定向的配体的非限制性实例包括腱生蛋白-C、腱生蛋白-W及其片段，包括但不限于Tenfibgen。

在一实施方案中，本发明的纳米颗粒组合物可用于治疗任何病症，其中抑制靶基因的表达可能有用。在另一实施方案中，组合物可用于治疗患有增殖性疾病的对象。“增殖性疾病”是指影响器官、腔或身体部分的任何一种或任何组合的任何人或动物疾病或紊乱，其特征在于细胞、细胞群或组织的单个或多个局部异常增殖，无论良性还是恶性。

术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等诸如此类意在表示在一个或多个场合施用治疗剂、疫苗或诊断剂，目的是获得或评估在对象中期待的药理学和/或生理学效果。就完全或部分地预防疾病或其症状而言，效果可是预防性的，和/或就完全治愈疾病和/或归因于疾病的不良反应(症状)而言，效果可是治疗性的。本文所用的“治疗”涵盖对对象的疾病的任何治疗，包括但不限于：(a)在可能易患但尚未诊断为患有疾病或病症的个体中预防疾病或病症的发生；(b)消除或抑制疾病(例如阻止其发展)；或(c)缓解疾病(例如减少或消除与疾病相关的症状)。

在另一方面，本发明提供长度最多约50个核苷酸的单链(ss)寡核苷酸，其包括SEQID NO：8的至少8个连续核苷酸的一部分，其中所述ss寡核苷酸抑制人酪蛋白激酶2α的表达。在另一方面，本发明提供长度最多约50个核苷酸的ss寡核苷酸，其包括SEQ ID NO：9的至少8个连续核苷酸的一部分，其中所述ss寡核苷酸抑制人酪蛋白激酶2α’基因的表达。

施用

本文描述了本发明的治疗性组合物的制剂及其随后的施用，并且可由本领域普通技术人员实施。一般而言，对于治疗，向需要治疗的患者提供根据本发明的组合物，剂量和新方案策略如本文别处所述。在本发明的一些实施方案中，基于患者的体重或表面积、年龄和所治疗的疾病或病症的严重程度中的一或多种来确定施用。

在一实施方案中，用纳米颗粒组合物治疗对象，所述纳米颗粒组合物例如包含多核苷酸，以相对于合适的对照而言足以减少、稳定或抑制靶基因表达的剂量/量治疗。在另一实施方案中，用单链多核苷酸以足以相对于合适的对照减少、稳定或抑制靶病变的剂量/量治疗对象。在另一实施方案中，生物活性剂(例如多核苷酸)的剂量等于或小于约20mg/kg体重，小于约10mg/kg体重，或小于约5mg/kg体重。在其它实施方案中，生物活性剂，例如单链嵌合多核苷酸，以小于约4mg/kg体重，小于约3mg/kg体重，小于约2mg/kg体重，小于约1mg/kg体重，小于约100μg/kg体重，小于约100纳克(ng)/kg体重，小于约10ng/kg体重，小于约1ng/kg体重，小于约100皮克/kg体重，小于约10pg/kg体重，小于约1pg/kg体重，小于约100飞克(fg)/kg体重，小于约10fg/kg体重，小于约1fg/kg体重，小于约100阿克(attogram，ag)/kg体重，小于约10ag/kg体重，或小于约1μg/kg体重进行递送。可基于例如对象的体表面积开发和使用类似的剂量范围。

治疗方案可持续一段时间，该时间段将根据特定疾病的性质、其严重程度和患者的总体状况而变化，并且可从每日一次延长至每30年一次。在治疗之后，可以监测患者他/她体内的状况的变化和疾病或紊乱状态的症状的缓解。生物活性剂的剂量可在患者对当前剂量水平没有显着反应的情况下增加，或者如果观察到疾病或紊乱的症状减轻，或者如果疾病或紊乱已被消融，则剂量可降低。

给药取决于待治疗的疾病病情的严重性和反应性，治疗过程持续数天至数月，或直到实现治愈或实现疾病或紊乱的减轻。最佳给药方案可例如根据患者体内生物活性剂累积的测量来计算。普通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可根据单个化合物的相对功效而变化，并且通常可基于例如在体外和体内动物模型中发现的有效的EC50来估计。可例如每天、每周、每月或每年一次或多次，或甚至每2-30年一次给予剂量。

在一些实施方案中，本发明的方法包括涉及将值、水平、特征、特性、性质等与“合适的对照”，在本文中可互换地称为“适当的对照”，进行比较的步骤。“合适的对照”或“适当的对照”是本领域普通技术人员熟悉的用于比较目的的任何对照或标准。在一个实施方案中，“合适的对照”或“适当的对照”是在施用本文所述的纳米颗粒组合物之前确定的值、水平、特征、特性、性质等。例如，可在将本发明的纳米颗粒的组合物引入细胞或生物体之前确定转录速率、mRNA水平、翻译速率、蛋白质水平、生物活性、病变尺寸、细胞特征或性质、基因型、表型等。在另一个实施方案中，“合适的对照”或“适当的对照”是在细胞或生物体例如对照或正常细胞或表现正常性状的生物体中确定的值、水平、特征、特性、性质等。在另一个实施方案中，“合适的对照”或“适当的对照”是预定义的值、水平、特征、特性、性质等。

在另一方面，本发明提供了治疗方法，其包括向有需要的对象中施用治疗有效量的根据本发明的纳米颗粒的制备的组合物中的生物活性剂。术语“治疗有效量”，例如生物活性剂，是指能够获得理想表型或进行理想治疗功能的量，例如稳定、减缓、减少、消除或预防疾病或紊乱(或这种疾病或紊乱的症状)。所需的确切量将根据已知的变量而变化，例如所用的生物活性剂、对象的状况和治疗方案的参数。因此，既不可能也不要求指定精确的“治疗有效量”。相反，适当的有效量可由本领域普通技术人员使用常规实验确定。

本发明的组合物可通过多种途径施用，这取决于是否期待局部或全身治疗以及待治疗的区域。施用可是局部(包括眼的、阴道、直肠、鼻内、经皮)、口服或胃肠外。肠胃外施用包括但不限于静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射、肿瘤内、或鞘内或心室内施用。不希望受理论束缚，颗粒(组合物)施用选择的灵活性部分地通过本发明组合物的高度稳定性的纳米颗粒的小尺寸和低表面电荷来实现，从而允许颗粒及其药物载荷穿越生物屏障和限制尺寸的结构，例如血流壁、淋巴管道和皮肤，以到达细胞和分子靶标。

本发明组合物的纳米颗粒的“低表面电荷”通常是指在约-20和约+4毫电子伏特(mev)之间的平均表面电荷，不过本领域技术人员将理解本发明的纳米颗粒具有平均在该范围之外的表面电荷仍然可以用于治疗目的，如果纳米颗粒保持其球形或椭圆形状、亚50纳米尺寸和结晶形式。

在一实施方案中，本发明提供了治疗对象中的疾病或紊乱的方法，其目的是获得期待的表型或进行期待的功能，例如稳定、减缓、减少或消除这种疾病或紊乱(或疾病或紊乱的症状)，例如但不限于增殖性疾病，例如但不限于癌症，包括在适于治疗疾病或紊乱的条件下向对象施用治疗有效量的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒包含胶束核心，所述胶束核心包含生物活性剂，所述生物活性剂包含SEQ ID NO：8和SEQ ID NO:9的混合物、HLB值小于或等于约6.0的表面活性剂、吸附到所述胶束核心并包含tenfibgen、Li⁺和Cs⁺并且具有小于约50纳米的平均直径的壳，其中所述纳米颗粒通过一种或多种上述途径施用。在另一个实施方案中，本发明的方法包括用Cs⁺预处理Li⁺。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸被引入的量可允许递送至少约1、5、10、50、100、500或5000个多核苷酸每靶细胞。

基于下面实施例中描述的工作，下面举例说明本发明的一些益处和优点。用无菌水和预先与Li⁺混合的Cs⁺制备的稳定的tenfibgen-壳亚50纳米纳米颗粒，并且包封寡核苷酸的混合物，其包含2R-修饰的抗CK2SEQ ID NO：8和SEQ ID NO:9，在30天时间内显著抑制小鼠中的肿瘤生长(下表3)。分析用混合物处理后的肿瘤还显示对Ki-67(细胞增殖的标志物)和NF-kB(炎症的标志物)的显著抑制。在相似的实验条件下，仅用纳米包封的2R-修饰的SEQ ID NO：8处理的小鼠显示肿瘤重量和NF-kB相对于对照的降低，但是变化不显著，并且治疗组的Ki-67指数相对于对照增加。类似地，仅用纳米包封的未修饰的寡核苷酸混合物(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO:6)处理的小鼠显示肿瘤重量增加，Ki-67和NF-kB的变化很小。

纳米颗粒的制备

可用于制备靶向亚50纳米颗粒的方法的以下描述仅意味着是代表性的，而不意味着限制。美国专利No.6,632,671、美国专利No.7,741,304和美国专利公开号No.2013/0267577，通过引用并入本文，公开了未修饰的纳米颗粒的制备。简言之，带负电荷的生物活性剂，例如待靶向和递送到例如肿瘤细胞的核酸，可与聚阳离子聚合物复合，以将其尺寸缩小或降低至约50nm或更小。许多不同的聚阳离子聚合物(也称为“缩合”试剂或蛋白质)可被使用并且是本领域公知的(Rolland 1998,Crit.Rev.Therapeutic Drug Carr.Syst.,15:143-198)。例如，足够的聚阳离子缩合蛋白可与带负电荷的载荷部分复合，以中和至少约75％(例如约80％、85％、90％、95％、99％或100％)的带负电荷的载荷部分，其对于核酸而言，可通过乙锭染料排除(示例见(1998，J.Controlled Release，53：289-99))来测量。简单地作为示例，125μg的10kD聚鸟氨酸可被用于缩合500μg的20-mer寡聚核苷酸，或87.5μg的精胺可被用于缩合250μg的14kD siRNA寡核苷酸。对于缺少负电荷或带正电荷的载荷部分，可能不需要缩合聚阳离子聚合物。

可通过首先使用适合于制备反相或反胶束的生物相容的、水不溶性表面活性剂体系将所述载荷部分分散到生物相容的、水混溶性溶剂中来包封复合或未复合的载荷部分的水溶液。合适的表面活性剂体系在制剂领域中是众所周知的两亲性材料，其实质上是疏水的，并且其特征在于亲水亲油平衡(HLB)小于约6，临界胶束浓度(CMC)小于约200μM，或临界填充直径大于1。在一些实施方案中，HLB小于约5。适用于制备反胶束的疏水表面活性剂和疏水性、水混溶性溶剂描述于Pashley&Karaman(2004，In Applied Colloid and SurfaceChemistry，John Wiley，pp.60-85)，Rosen(2004，in Surfactants and InterfacialPhenomena，John Wiley)，The Handbook of Industrial Surfactants(1993，Ash，ed.，Gower Pub)和Perry’s Chemical Engineer’s Handbook(1997，Perry&Green，7th Ed.，McGraw-Hill Professional)，通过引用并入本文。

在一些实施方案中，表面活性剂组分可是2,4,7,9-四甲基-5-癸炔-4,7-二醇(TM-二醇)、2,4,7,9-四甲基-5-癸炔-4,7-二醇(TM-二醇)，具有一个或多个炔二醇基团、鲸蜡醇或任何这些的任何组合的分子。在一些实施方案中，可使用包含食品或USP级油的水混溶性溶剂，例如DMSO、DMF、蓖麻油或其任何组合。在一个实施方案中，疏水性表面活性剂可是2,4,7,9-四甲基-5-癸炔-4,7-二醇(TM-二醇)或其制剂，例如SE-30(Air Products)，用于浓度高达表面活性剂胶束量的约0.5重量％，水混溶性溶剂可是DMSO。所选择的表面活性剂的浓度应当足以制备光学透明的纳米乳液，但是不会多到诱导聚集，因为聚集可以导致过大的纳米颗粒。

携带载荷部分的胶束(即表面活性剂胶束)可通过将一或多个靶向部分与纳米颗粒的水性稀释液混合而用肿瘤靶向部分(例如tenfibgen)包被。在一些实施方案中，靶向部分可以约1:500至约1:0.1的靶向部分与生物活性剂的比例(以重量计)与纳米颗粒混合，这取决于包括靶向部分以及纳米颗粒期待溶解或分解的速率因素。在一实施方案中，靶向部分与生物活性剂的重量比约为1:90(即1/90^th)。在一实施方案中，靶向部分与生物活性剂的重量比约为1:40。

纳米粒子配体可通过设计以增强最终纳米粒子功能的方法被修饰。作为非限制性示例，通过在用已知水平的重金属制备的饱和硫酸铵溶液中再沉淀蛋白质，包被配体可容易地用药学上可接受的重金属修饰。在通过离心回收金属修饰的包被配体之前，最快速地将大约0.1-1mg/ml的蛋白质配体溶液与饱和硫酸铵溶液以1:1的比例温育约4-36小时。超纯硫酸铵中的金属浓度范围可为例如1份/千-1份/1万亿。作为另一个非限制性示例，可使用含金属的硫酸铵从细胞培养物上清液中沉淀腱生蛋白多肽，使已知促进氧化应激反应的金属在纳米颗粒制备之前被吸附到包被配体上。

为了稳定配体吸附的纳米颗粒，包被有一或多种配体的纳米颗粒的水性悬浮液能够被混合到能与包被的纳米颗粒沉淀、结晶或离子电渗交换的金属离子的水溶液(即“稳定溶液”)中。可用于形成包被的纳米颗粒的溶质的代表性非限制性示例包括衍生自周期表中所列元素的离子物质。离子可被包括在水性稳定化组合物中，其范围为约例如0.1份/兆-约1摩尔(M)。应包括足够量的离子，使得包被的纳米颗粒与离子充分接触，但不会太多以致发生聚集，这可导致过大的纳米颗粒。

在一个实施方案中，稳定(或结晶或接收)溶液可包含约10毫摩尔(mM)Ca²⁺和约126mM Li⁺。如果在稳定溶液中使用超纯试剂，可加入非常少量(例如小于约1mM)的离子如Ba、Fe、Mg、Sr、Pb和Zn以优化包被的纳米颗粒的稳定性。在一个实施方案中，当用无菌水制备纳米颗粒时，用2.5ppb的CS⁺预处理126mM的Li⁺以提高稳定性。在一个实施方案中，稳定溶液包括10mM Ca²⁺、126mM Li⁺(与2.5ppb Cs⁺预混合)、0.042mM Ba²⁺与14nM Sr²⁺、6.25nM Mg^{2 +}(全部超纯，全部使用无菌水制备成储备溶液，除了Sr²⁺和Mg²⁺是用实验室级水制备的，所有金属作为氯化物盐使用，总液体积约30ml)。系统的灵活性由显示高水平的细胞摄取的纳米颗粒证实，其在比本文所述的低约10倍锂水平下合成(数据未显示)。技术人员将理解，多种抗衡离子可与稳定溶液中的这些金属一起使用，例如氯化物、硫酸盐和硝酸盐。

关于盐和金属所使用的术语“超纯”是指大约或大于99％纯度或可获得的最高纯度的盐和金属。技术人员将理解，超纯盐和金属通常是可商购的，并且如果需要，改变这种超纯材料中的含量对纳米颗粒制剂的改变影响可在没有过度实验的情况下解决，例如通过调节在之前使用的制剂中的其他盐和金属的底线水平。降低制剂中钡的水平可例如抵消氯化钙二水合物中杂质水平的增加，以保持配制的纳米颗粒的尺寸、形状和/或功能。如本文所用，“实验室级”盐和金属是指不是超纯的盐和金属。为了保持给定制剂线系列的纳米颗粒尺寸、形状和/或功能的一致性，建议使实验室级盐和金属的使用最小化，例如小于25％、20％、15％、10％、或5％加入到最终的盐接收溶液中的盐和金属的总重量。

在一个实施方案中，铯(Cs)-预处理的锂纳米颗粒包括与未用Cs预处理的纳米颗粒不同的多晶型形式。这种不同通过例如下表1中呈现的Cs和非CS纳米颗粒的熔点和FTIR光谱的实质性差异来证明。如本文所用，术语“多晶型物”和“多晶型形式”是指化合物或复合物的固体晶体有序形式。

可通过结晶产生感兴趣的化合物例如纳米颗粒的一或多种固体形式。一或多种固态形式也可通过化学物质与不同客体分子(即不是晶格的主要组分的组分)共结晶而产生。一或多种固体形式也可通过将元素或元素-组合物包含在超分子组装中或添加新元素或元素-组合物以产生新的超分子组装。

在结晶的现象中是成核和生长的过程。晶体成核是从液体、过饱和溶液、饱和蒸气或非晶相形成有序固相。生长是由分子在现有表面上的沉积引起的晶体的增大。成核可通过“种子”晶体的存在来诱导。存在一些固体颗粒以提供催化效果并降低形成新相的能量势垒。晶体可起源于例如作为成核位点的异物(例如容器壁上的杂质或划痕)的微小痕迹。成核也可通过外部或非化学手段促进，例如搅拌结晶环境，或通过施加起始表面和物理能，例如可以通过将超小纳米级胶束雾化成盐溶液的过程观察。

实际上，化合物(例如纳米颗粒)的多晶型和新型形式在制药领域中是已知的影响例如化合物的溶解度、稳定性、流动性、断裂性和压缩性(Knapman,K.2000Modern DrugDiscovery 3：53-58)。因此，发现纳米颗粒药物的新的多晶型物或高度相关的结构形式可提供多种优势。

可使用熟知的技术来检测、辨识、分类和表征多晶型物，例如但不限于差示扫描量热法(DSC)、热重量分析法(TGA)、X射线粉末衍射法(XRPD)、单晶X射线粉末衍射法、振动光谱法、溶解量热法、固体核磁共振(NMR)、红外(IR)光谱、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、拉曼光谱、热台光学显微镜、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、电子晶体学和定量分析、粒度分析(PSA)、表面积分析、溶解度和溶解速率。

如本文所用，关于最初以图形形式(例如XRPD、IR、FTIR、拉曼和NMR光谱)产生的光谱或数据，并且除非另有说明，术语“峰”是指峰或其它特殊特征，本领域技术人员将认识到不归因于背景噪声。由于峰值检测中的机器和/或算法变化性，可能发生解释或读取峰定位的一些有限差异。

虽然不希望受理论束缚，但下表1中给出的材料科学数据表明添加痕量的铯(以元素组合物的形式，即铯处理的锂)，与非铯纳米颗粒相比令人惊讶地引起本发明的纳米颗粒的熔点和FTIR光谱的显著变化。熔点的变化暗示与物理状态变化相对应的新的多晶型形式。表1中呈现的数据将测量的熔点变化与纳米颗粒稳定性的增加联系起来，通过改进的运输性能和延长的伯顿衍生的体外释放时间体现。

如本文其他地方所讨论的，用铯处理的锂制备的纳米颗粒在尺寸和形状(低于50nm球体、立方体或椭球体)方面形成合适的纳米颗粒，而与在盐接收液中与锂简单混合的用铯配制的纳米颗粒。这支持了引入元素组合物即铯处理的锂而不是简单地添加铯的观察，其诱导上述熔点的显著变化和伴随的改进的稳定性。

在一个实施方案中，具有疏水胶束核、配体壳和包封的生物活性剂的经Cs预处理的锂亚50纳米纳米颗粒包含超分子组装的新型多晶型形式(在本文中称为Cs多晶型纳米颗粒)，其表观分子重量大于10,000道尔顿、大于20,000道尔顿或大于30,000道尔顿。技术人员可通过标准方法，例如超高分辨率水性尺寸排阻色谱法(ultra high resolutionaqueous size exclusion chromatography)，使用例如Yarra 3u SEC-2000，30cm×7.8mm柱和UV检测以及0.3M NaCl在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7)中的流动相来确定表观分子重量。

在一个实施方案中，铯和锂的元素组合产生可以在水性环境中形成、使用和/或储存的Cs多晶型纳米颗粒。

在另一个实施方案中，Cs多晶型纳米颗粒的配体壳包含tenfibgen。仍然在另一个实施方案中，Cs多晶型纳米颗粒的配体壳包含透明质酸。

具有低表面电荷，优选尽可能接近中性或甚至微负性电荷和/或具有紧凑或大致球形、长方体或椭球形形状的纳米颗粒例证了优化的稳定性。另外，可包括能够提高纳米颗粒的稳定性的任何其它组分作为稳定溶液的一部分，使得纳米颗粒的最终平均直径在约例如5-50nm的范围内。在某些实施方案中，根据本发明的组合物的纳米颗粒具有约5至约50纳米、约5至约40纳米、约5至约30纳米或约5至约20纳米的平均直径。

可通过参数的常规变化来操作颗粒尺寸，包括例如在盐接收溶液中结晶后的温育时间的长度。在一实施方案中，通过原子力显微镜(AFM)测量纳米颗粒。在另一实施方案中，通过透射电子显微镜(TEM)测量纳米颗粒。在另一实施方案中，通过动态光散射(DLS)测量纳米颗粒。在另一实施方案中，通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量纳米颗粒。在另一实施方案中，通过本领域已知的方法在干燥状态下测量纳米颗粒。除非另有说明，平均直径在本文中表示为在干燥状态下测量的纳米颗粒的长轴和短轴的平均值。通常，具有大于约约10：1、约5：1或约3：1的平均长-短-尺寸比的纳米颗粒的制剂或组合物不适用于本文预期的用途。

对于尺寸更一致的纳米颗粒，纳米颗粒可任选地通过喷嘴雾化成接收溶液。雾化应当足以施加剪切力，该剪切力能够分解絮凝聚集体而没有如此大的力以诱导硬聚集体。本领域技术人员将理解，特定的喷嘴直径将导致适于将纳米颗粒雾化成合适且一致尺寸的进料压力范围。在一实施方案中，当进料压力小于约10psi时，约250微米或更小的喷嘴直径产生合适的纳米颗粒。

稳定的纳米颗粒可在不同的时间和温度下温育，这取决于终端使用中颗粒溶解或拆解所需或期望的时间。温育时间可为约8小时至约7天。在一些实施方案中，将纳米颗粒在圆底管中在4℃下标称旋转温育36至48小时。不希望受理论束缚，较长的温育时间导致较高的结晶，其增加颗粒的尺寸和稳定性。在稳定溶液中雾化和/或温育纳米颗粒之后，可过滤、离心和/或干燥纳米颗粒以获得包含单个的和离散的亚50nm纳米颗粒的组合物。在一个实施方案中，将纳米颗粒在20,000xg、4℃下离心2小时，并通过0.2μm过滤器无菌过滤。所得纳米颗粒可在约-20℃下冷冻或干燥并重新配制用于以后使用。被制备为嵌合多核苷酸的序列任选地丙基封闭3’末端。

在一个实施方案中，在没有聚乙二醇(PEG)和一般用于稳定纳米颗粒的类似物质的情况下制备纳米颗粒。在另一个实施方案中，可使用本领域已知的标准方法将纳米颗粒冻干并以较低、相同或较高的浓度重悬。

尽管已经参照多个实施方案具体展示和描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本文公开的各种实施方案进行形式和细节的改变，并且本文公开的各种实施方案不旨在限制权利要求的范围。

将在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例同样不旨在限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例

实施例1-靶向治疗性纳米颗粒的制剂。

包含不同载荷和靶向部分的示例性纳米颗粒如下产生。

配方A：在2mL锥形管中，加入500μg针对CK2的嵌合寡聚(SEQ ID NO：5)多核苷酸(磷酸二酯3’和丙基封端的2’-OMe RNA嵌合体、“LCK-6”(美国专利号7,741304，通过引用整体并入本文))到无菌水中(HPLC级，Fisher)以1mg/ml的浓度短暂涡旋，然后与200μg的10kD聚鸟氨酸(Sigma)复合，并使用水不溶性表面活性剂体系(TM-二醇共混物(SE-30，AirProduct)将其分散在150μl的无菌水中，10μg在10μgDMSO中。在用水混溶性溶剂(DMSO)乳化之后，通过加入150μl的DMSO，涡旋，随后置于浴超声发生器(bath sonicator)中5分钟，然后倒置复合物并通过加入700μl的PBS稀释。

通过加入5.5μg通过Aukhill等(J.Biol.Chem.，268：2542-53(1993))方法制备的腱生蛋白的重组纤维蛋白原片段(TBG)来包被(非共价地)所得的疏水胶束，将其如本文所述进行修改，置于浴超声发生器中15分钟，转移至5ml聚丙烯管中，用PBS稀释至3ml，然后使用具有小于约10psi的进料压力的约250μm直径孔口的手动致动器，将其雾化入主要含有Li⁺(126mM Li⁺(将Li⁺与2.5ppb Cs⁺预混合)、10mM Ca²⁺、0.042mM Ba²⁺具有14nM Sr²⁺、6.25nMMg²⁺(全部超纯，全部使用无菌水制备成储备溶液，除了用实验室级水制备的Sr²⁺和Mg²⁺，所有金属都用作氯化物盐，总浴体积约30ml)的无菌水的盐接收溶液中。总反应体积为36ml。在用于制备稳定溶液的无菌水中测试的以下金属的水平被确定为总和小于百万分之0.1：铝、砷、钡、镉、铬、铜、铁、铅、锰、镍、铷、硫、钒和锌。

预混合步骤包括在50ml管中的无菌水中加入约0.1μg/1ml的Cs⁺到约4M Li中，约重量计2.5ppm Cs⁺到Li⁺，并旋转约2分钟。在冷室温育(4℃)在40ml圆底管中标称旋转48小时后，其进一步稳定在盐溶液中包被的胶束，通过在4℃下以20,000xg离心2h回收亚50nm的纳米颗粒并在PBS+10％乳糖醇(浓度为1μg/μl)中重悬，转移到2ml锥形中，并在4℃下以最大速度离心5分钟，将沉淀重悬在PBS/10％乳糖醇进行洗涤，通过0.2μm过滤器除菌，并在-20℃下冷冻。

在本实施例中描述的所有制剂中，将少量(1％的包被重量)的叙利亚仓鼠IgG“掺入”配体包被，以能够通过抗叙利亚仓鼠抗体对纳米颗粒的摄取进行免疫检测。平均颗粒尺寸小于50nm，通过轻敲式原子力显微镜(tapping mode atomic force microscopy)，使用在云母片上干燥的1e^(-27)g/ml样品的椭圆直径进行测量。平均颗粒尺寸表示为测量的纳米颗粒的长轴和短轴的平均值。AFM测量进一步由TEM负染色支持，其中将1ng/ml悬浮液点在碳网上。NIH Image J用于计算平均粒径。最典型地，平均颗粒尺寸的范围为约8纳米至约30纳米。配方A通过TEM测量具有16±2.3nm的平均粒径，通过Zetasizer 4动态光散射装置在20伏的电势下测量的表面电荷为-2.4±2.3mev，在1mM KCl，2μg/ml中测量之间具有2分钟暂停。

基于腱生蛋白的配体：腱生蛋白与癌症活动有关也特别与平滑肌细胞有关；此外，已经鉴定了腱生蛋白的肽结构域，例如在美国专利号No.6,124,260中，并且是本领域已知的。在一实施方案中，适用于本发明的腱生蛋白是智人(H.Sapiens)腱生蛋白C，Genbank登录号NM_002160。此外，腱生蛋白肽和用于与特定细胞类型粘附的结构域以及腱生蛋白的功能和结构方面，已经被公开并且是本领域已知的，例如Aukhill等1993J Biol Chem 268:2542-2553。腱生蛋白和/或其任何结构域适合作为本发明的配体。在一个实施例中，腱生蛋白的纤维蛋白原片段(在本文中也被称作腱生蛋白C或tenfibgen或TBG的Fbg-L域；在本发明的一个实施例中使用tenfibgen的核苷酸序列如下(atgattggactcctgtaccccttccccaaggactgctcccaagcaatgctgaatggagacacgacctctggcctctacaccatttatctgaatggtgataaggctcaggcgctggaagtcttctgtgacatgacctctgatgggggtggatggattgtgttcctgagacgcaaaaacggacgcgagaacttctaccaaaactggaaggcatatgctgctggatttggggaccgcagagaagaattctggcttgggctggacaacctgaacaaaatcacagcccaggggcagtacgagctccgggtggacctgcgggaccatggggagacagcctttgctgtctatgacaagttcagcgtgggagatgccaagactcgctacaagctgaaggtggaggggtacagtgggacagcaggtgactccatggcctaccacaatggcagatccttctccacctttgacaaggacacagattcagccatcaccaactgtgctctgtcctacaaaggggctttctggtacaggaactgtcaccgtgtcaacctgatggggagatatggggacaataaccacagtcagggcgttaactggttccactggaagggccacgaacactcaatccagtttgctgagatgaagctgagaccaagcaacttcagaaatcttgaaggcaggcgtaagcgggcataa)(SEQ ID NO：10))用作配体。腱生蛋白，其亚结构域或任何其他生物相容性聚合物配体可通过本领域已知的方法或技术人员可以容易地适应的方法表达或产生。为说明目的，下面提供生产TBG的方法。

Tenfibgen(TBG)制备：对于所有TBG配方，除非另有说明，TBG通过修改后的Aukhil的方法制备(J Biol Chem(268)：2542-2553(1993))，即通过用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、1.0mM EDTA、0.1M NaCl、0.2mg/ml溶菌酶、0.1％Triton X-100、0.1mM PMSF，pH 8.0)洗涤不溶性沉淀一次，从细菌裂解物中被分离并重折叠从细菌裂解物中分离并重折叠TBG，所述裂解缓冲液包含2M尿素，并重悬浮于4M GuCL、5mM DTT的0.02M Tris-HCl，pH8.0中。进一步离心后，将澄清的TBG溶液用2M胍-HCl、20mM Tris-HCl，pH8.0稀释，使最终的OD280为约1，并逐滴滴入约10倍稀释在N₂鼓泡的20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、0.5M精氨酸-HCl在室温搅拌过夜温育(4℃)。在用20mM Tris-HCl，pH 8.0透析渗滤后，浓度降低约4-5倍，并用0.45μM过滤，在20mM Tris-HCl，pH 8.0的肝素琼脂糖凝胶上进行最后纯化，通过洗脱使NaCl浓度至0.6M。通过将pH10.5Tenfibgen施加至用20mM NaH₂CO³、0.2M NaCl，pH＝10.5平衡的Q Fast Flow树脂，在阴离子交换层析步骤中去除内毒素，然后在最终0.2um过滤之前用H₃PO₄再调节pH至7。在治疗性肿瘤靶向制剂中，TBG在含有250ppb As⁺³、25ppm Se⁺⁴、2.5ppm Hg⁺²和25ppm Mo⁺⁵的超纯40％硫酸铵中再沉淀约16小时。

配方B：如配方A所述产生包被有TBG的亚50nm的纳米颗粒，除了将6.3mcg的TBG加入到500mcg的2R-修饰的嵌合寡核苷酸(SEQ ID NO：8)中，与125mcg的10kD聚鸟氨酸(Sigma)缩合。当产生这些纳米颗粒时，将TBG包被的胶束雾化到配方A的盐接收溶液中，除了以下改变的浓度：4.5nM Sr²⁺，2.25nM Mg²⁺。平均粒径小于50nm(17.8±3.1nm)，通过使用点样到碳网格上的1ng/ml样品的椭圆直径的负染色TEM测量的，表面电荷为-7.7±4.2mev，通过在20伏电位下的Zetasizer 4动态光散射装置在2μg/ml的1mM KCl中、测量之间具有2分钟的暂停测量的。

配方C：如配方A所述产生包被有TBG的亚50nm的纳米颗粒，除了将2.6mcg的TBG加入250mcg的嵌段寡核苷酸(SEQ ID No：5和6，重量1：1)中并使用7.5μg表面活性剂胶束化。当产生这些纳米颗粒时，将TBG包被的胶束雾化到以下改变了浓度的配方A的盐接收溶液中：3.75nM Sr²⁺，4.68nM Mg²⁺。平均粒径小于50nm(17.8±1.5nm)，通过使用点样到碳网格上的1ng/ml样品的椭圆直径的负染色TEM测量的，表面电荷为-12.3±3.5mev，通过在20伏电位下的Zetasizer 4动态光散射装置在2μg/ml的1mM KCl中、测量之间具有2分钟的暂停测量的。

配方D：如配方C所述产生用TBG包被的亚50nm的纳米颗粒，除了寡核苷酸混合物由SEQ ID NO：5和7(重量1:1)组成。平均粒径小于50nm(17±1.6nm)，通过使用点样到碳网格上的1ng/ml样品的椭圆直径的负染色TEM测量的，表面电荷为-7.1±5.4mev，通过在20伏电位下的Zetasizer 4动态光散射装置在2μg/ml的1mM KCl中、测量之间具有2分钟的暂停测量的。

配方E：如配方A所述产生包被TBG的亚50nm的纳米颗粒，除了将3.1mcg的TBG加入到250mcg的2R-修饰的嵌合寡核苷酸(SEQ ID NO：8和9，重量1:1)中，与62.5mcg的10kD聚鸟氨酸(Sigma)缩合并使用7.5μg TM-二醇进行胶束化。当产生这些纳米颗粒时，将TBG包被的胶束雾化到以下改变了浓度的配方A的盐接收溶液中：2.5nM Sr²⁺，0.25nM Mg²⁺。平均粒径小于50nm(19.5±1.5nm)，通过使用点样到碳网格上的1ng/ml样品的椭圆直径的负染色TEM测量的，表面电荷为-5.8±3.9mev，通过在20伏电位下的Zetasizer 4动态光散射装置在2μg/ml的1mM KCl中、测量之间具有2分钟的暂停测量的。通过ICP-AES评估锂含量为5.39ngLi⁺/μg寡核苷酸。(注意，对于类似的制剂，通过更敏感的ICP-MS方法测量292pg/μg寡核苷酸的锂含量)。

配方F：如配方A所述产生包被有TBG的亚50nm的对照纳米颗粒，除了将6.3mcg的TBG加入到500mcg的2R-修饰的嵌合寡核苷酸(抗凝血因子VII，如Akinc，et al.2008NatBiotechnol 26：5(561-9))，与125mcg的10kD多聚鸟氨酸(polyornthine)(Sigma)缩合，并使用5μgTM-二醇进行胶束化。当产生这些纳米颗粒时，将TBG包被的胶束雾化到以下改变了浓度的配方A的盐接收溶液中：1.17nM Sr²⁺，4.68nM Mg²⁺。平均粒径小于50nm(24.7±3nm)，通过使用点样到碳网格上的1ng/ml样品的椭圆直径的负染色TEM测量的，表面电荷为-7.6±2.4mev，通过在20伏电位下的Zetasizer 4动态光散射装置在2mM/ml的1mM KCl中、测量之间具有2分钟的暂停测量的。

配方G：如配方A所述产生包被有TBG的亚50nm的纳米纳米颗粒，除了稳定溶液包含非无菌的实验室级水并且氯化锂原料没有用铯或任何其它离子预处理。在用于制备稳定溶液的水中测试的以下金属的含量总计为约0.9ppm：铝、砷、钡、镉、铬、铜、铁、铅、锰、镍、铷、硫、钒和锌。在PBS+10％乳糖醇中离心后，将纳米颗粒重悬。平均粒径小于50nm(21.8±4nm)，通过使用点样到碳网格上的1ng/ml样品的椭圆直径的负染色TEM测量，表面电荷为-9.6±3.8mev，通过在20伏电位下的Zetasizer 4动态光散射装置在2μg/ml的1mM KCl中、测量之间具有2分钟的暂停测量的。

配方H：使用相同的LCK寡核苷酸，如配方A中所述产生用TBG包被的亚50nm的纳米颗粒。当产生这些纳米颗粒时，将TBG包被的胶束雾化到基于硝酸锂而不是氯化锂的配方A的盐接收溶液中，并且改变下列浓度：7.5nM Sr²⁺，5.0nM Mg²⁺。平均粒径小于50nm(21.5±2nm)，通过使用点样到的碳网格上的1ng/ml样品的椭圆直径的负染色TEM测量的，表面电荷为-12.4±4mev，通过在20伏的电位下的Zetasizer 4动态光散射装置在2μg/ml的1mM KCl中、测量之间具有2分钟的暂停测量的。

配方I：如配方G中所述产生20kD MW透明质酸(重悬于HPLC水中的透明质酸钠粉末，Lifecore Biomedical，Lha，低分子量透明质酸)包被的亚50nm的纳米颗粒，除了使用3.1mcg的HA(代替TBG)加入到首先与19.4μg的25kDa聚乙烯亚胺(一种分枝的阳离子聚合物)(PEI；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)复合的125mcg的质粒DNA(pVivoβgal，Invivogen Corp.，10.5kb)(取代寡核苷酸)，然后用6.25ug的TM-二醇胶束化。当产生这些纳米颗粒时，将Lha包被的胶束雾化到配方G的盐接收溶液中，改变以下浓度和添加量：2nMSr²⁺、0.5nM Mg²⁺、0.54μMBi²⁺并加入0.40mM Ni²⁺(超纯，基于40ml总体积)。平均粒径小于50nm(20.4±2)，通过使用点样到的碳网格上的1ng/ml样品的椭圆直径的负染色TEM测量，平均表面电荷为-8.1±4.7mev，通过在20伏的电位下的Zetasizer 4动态光散射装置在2μg/ml的1mM KCl中、测量之间具有2分钟的暂停测量的。

配方J：如配方A所述产生用20kD MW透明质酸(重悬于HPLC水中的透明质酸钠粉末，Lifecore Biomedical，Lha，低分子量透明质酸)包被的亚50nm的纳米颗粒，除了使用3.1mcg的HA(代替TBG)加入到首先与19.4μg的25kDa聚乙烯亚胺(一种分枝的阳离子聚合物)(PEI；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)复合的125mcg的质粒DNA(pVivoβgal，Invivogen Corp.，10.5kb)(取代寡核苷酸)，然后用6.25μg的TM-二醇胶束化。当产生这些纳米颗粒时，将Lha包被的胶束雾化到配方A的盐接收溶液中，改变以下列浓度和添加量：2nM Sr²⁺、0.5nM Mg²⁺、0.54uM Bi²⁺并加入0.40mM Ni²⁺(超纯，基于40ml总体积)。平均粒径小于50nm(22.7±5nm)，通过使用点样到碳网格上的1ng/ml样品的椭圆直径的负染色TEM测量的，平均表面电荷-6.4±4.2mev，通过在20伏电位下的Zetasizer 4动态光散射装置在2mM/ml的1mM KCl中、测量之间具有2分钟的暂停测量的。已经通过ICP在相似的制剂中测量了8.1-13.1ng/μg的质粒的Li⁺含量(数据未显示)。

通过常规表征和TEM，发现配方I和J的质粒s50颗粒在物理性质和可比较的TEM方面与配方A-H的TBG包被的寡核苷酸颗粒相似。例如，不管核酸载荷，通过改进的Burton方法(Kren，et al.2009JCI 119：2086-99)确定的本文所述的配方的纳米颗粒包封产率大于95％(数据未显示)。包含寡核苷酸生物活性剂和蛋白质外壳的纳米颗粒与包含质粒DNA生物活性剂和碳水化合物外壳的纳米颗粒之间的性质的相似性证明了纳米颗粒制剂工艺的灵活性和所得纳米颗粒组合物容纳不同的生物活性剂、聚合物和配体部分。

实施例2-铯修饰的锂离子在纳米颗粒合成中提高稳定性。

除了有效之外，纳米颗粒剂型必须符合来自监管的和其他部门的药物制造和产品要求的要求。例如，纳米颗粒的物理稳定性是其监管批准、影响配方、制造和储存流程的关键组成部分。已经令人惊讶地发现，当在无菌水中操作时，将铯痕量添加入纳米颗粒合成中导致改善的物理稳定性，通过提高的运输性能和伯顿衍生的稳定性测量表明。

非常意外地，已经发现，在将接收溶液组装成配体稳定的胶束前，加入铯预处理的2.5ppb的锂，其浓度四倍于携带寡核苷酸或质粒DNA的纳米颗粒，可作为液体制剂-4℃的空运运输。这些观察结果总结在表1中。在这些空运测试中，通过冻干、运输来浓缩纳米颗粒悬浮液，并且随后在空运挑战后通过TEM显微镜检查返回后的颗粒直径的变化。在TEM中，本发明的纳米颗粒表现为包围在可见但较差折射电晕中的立方或分形超分子组装体，其包含靶向配体(数据未显示)。例如，需要20mg/ml的悬浮液浓度以在低功率(1mW)动态光散射(DLS)中获得纳米颗粒(直径大小为约25纳米)的光散射数据(即检测)。相比之下，在相似DLS条件下，在铯处理的锂盐接收溶液中温育之前，当在尺寸上类似地小(直径28nm，表1)时，配体包被的胶束在浓度约为1mg/ml时容易被检测到，表明在温育/稳定步骤期间发生了纳米颗粒超分子组装的显著变化(数据未显示)。

在运输和对照样品中，通过在NIH图像J中的图像分析来定量粒径，作为拟合到来自TEM显微照片的粒子的椭圆形轴的平均值。结果总结在表1中以显示对于携带寡核苷酸的未修饰的铯制剂(配方G)，平均粒径从对照制剂到以3mg/ml空运的相同制剂增加了161％。运输后还观察到围绕着小平面双折射颗粒的蛋白质电晕的伴随的损失(数据未显示)。相比之下，类似的铯修饰制剂(配方A)在4mg/ml保持形状和电晕(表1，数据未显示)。

对携带市售的报道基因质粒并用透明质酸包被的一对制剂进行相同的分析，得到相似的结果。对于配方J，在接收浴中用铯预处理的锂制备的颗粒可以增加8倍的浓度(2对0.25mg/ml)运输，相对于不用铯预处理制备的配方I颗粒直径增加小于15％。在具有增加的运输浓度的非铯预处理的颗粒中也观察到配体电晕的损失(数据未显示)。用硝酸锂而不是氯化锂制备的配方H所示的运输浓度的改进表明，可在纳米颗粒合成中使用多种锂盐。在将铯和锂加入到盐接收溶液中之前预混合产生了合适的球体或立方体超小(LTE 50nm干直径)形态的纳米颗粒，铯和锂未混合加入盐接收溶液中不产生(数据未示出)。

表1.有+无铯修饰的粒子和运输稳定性

注释：*＝p<0.5，1)在0.1ng/ml下通过负染色TEM在x271,000下干燥后测量粒径作为平均椭圆直径。表示为平均值±SE，每次分析15-20次测量。在运输研究中使用之前，证实批次具有大量体外细胞摄取进入在3-D培养物中生长的肿瘤细胞。2)通过使用比色、改进的Burton测定获得的标准曲线结合DNA掺入测量体外释放。释放被报告为从稍后的时间点插入的时间点，其中平均Burton产率围绕100％。3)从由差示扫描量热法(DSC)产生的热分析图鉴定热转变。将悬浮液干燥以产生用于分析的粉末，并且在卷曲的铝盘中以20℃/min从室温扫描1-2mg至约400℃。缩写，gt，玻璃化转变；et吸热；vs，非常小。4)TM-二醇是未配制的疏水性表面活性剂，并提供用于分析参考。配体包被的胶束是根据配方E配制的胶束，但在盐接收溶液中温育之前进行扫描。5)透明质酸包被的配体颗粒是与运输样品类似的制剂，但包含8.5kb报告基因质粒而不是10.5kb报告质粒。6)在这种形式的测定中约120小时后，在标准曲线中颜色开始降解，这里迫使测定过早终止。7)使用配备有ATR附件、中红外源作为激发源和DTGS检测器的Perkin Elmer Spectrum 65记录FTIR光谱。以4cm^-1的分辨率在32次扫描中获取光谱。悬浮液样品在4℃下用3:1(v/v)的异丁基：异戊醇提取以除去残留的表面活性剂并蒸发，干燥的粉末递送用于分析。缩写，v，非常；s，小；md，中等；str，强；brd，宽。

在接收溶液组装之前用铯预处理锂对颗粒稳定性的影响通过检查用于体外释放的制剂进一步研究。体外释放与颗粒降解基于修改的比色Burton测定法(Kren，et al。2009JCI 119:2086-99)相结合进行评估。在该测定中，将颗粒在56℃下在1M NaOH中温育过夜，而不是6M NaOH。然后中和纳米颗粒，并加入Burton试剂以在与释放的DNA反应时产生蓝色信号。百分产率相对于来自标准曲线的理论值表示，使得接近100％产率，因为纳米颗粒被完全降解以释放其内含物。然后将体外释放表示为从围绕100％产率的时间点内插的终点。因此，体外释放时间是纳米颗粒对降解的抗性的量度，并且其在Cs-预处理后的增加对应于观察到的针对寡核苷酸和质粒系列Cs-处理的与非CS-处理的纳米颗粒的运输稳定性的增加(表1体外释放时间；Cs vs.非Cs寡核苷酸，104小时vs.62小时；Cs vs.非Cs质粒DNA，>120小时vs.117小时)。

为了研究纳米颗粒组合物的差异如何可在物理(释放)和功能(运输)水平上影响本发明的纳米颗粒，对具有寡核苷酸和质粒的纳米颗粒的干燥和粉碎的粉末的热曲线通过在约25℃至约400℃的范围内以10℃/分钟的差示扫描量热法(总结于上表1中)测量其可能的特征转变的变化。在多次运行中，在非C修饰的配方G中观察到在158℃有小转变，随后强的宽的吸热(172-200℃)在180℃具有最低点，而观察到C修饰的配方A仅有一个在275℃下的强吸热，表明形态状态的变化。类似地，对于具有8.5kb报道基因质粒的透明质酸纳米颗粒，在非C修饰的化合物(代表配方I)中，在158℃下有小转变，随后强且宽的吸热(172-227)在178℃具有最低点，与C修饰的化合物相比，其中观察到在150℃下具有非常小的转变(代表配方J)，在193℃、206℃和227℃观察到强烈、非常尖锐的吸热，再次表明形态状态的变化。相比之下，稀释剂(PBS+10％乳糖醇，非还原糖)的扫描在约160℃显示非常小的转变，在186℃显示强的尖锐吸热，其中以约310℃的中心附近降解吸热。所有纳米颗粒化合物显示这种吸热以307-313℃为中心。在雾化和随后在主要锂盐溶液(“配体包被的胶束”)中温育之前，TBG包被的胶束的热扫描显示具有以约100℃为中心的峰(98,105℃)的宽吸热。观察到该热谱图与在铯处理的锂溶液中温育后的纳米颗粒显著不同，这支持了铯处理的锂溶液随时间赋予稳定的胶束和纳米颗粒顺序和重排以产生独特的超分子组装的说法。

通过FTIR光谱进一步研究了将铯预处理的锂引入稳定浴中的化合物差异。从600-4000cm^-1读取非C配方G和含C配方A的FTIR光谱。基于从组分和文库扫描得到的峰分配，胶囊扫描通常表征为在3300附近的宽的密集带，代表水在3390cm^-1的O-H伸缩振动，带的集合归因于表面活性剂(4：在约2956-2832cm^-1，3：在约1449-1260cm^-1)，以及在约1100-1100cm^-1处的强的密集带归因于的Li-O和Li-OH的振动。铯预处理的稳定浴观察到的主要峰差异(配方G vs.配方A)为：1)在约1647cm^-1处的宽峰变窄成在约1740、1640处的峰；2)在约2952-2839将可能的表面活性剂衍生的四联体改编成约2952-2853的三联体；和3)水振动带从约3329变化到3377cm^-1。

就吸光度变化而言，铯预处理导致吸水率的大小降低大于50％，这与在重组的胶囊组装内捕获的水量的可能的减少一致。值得注意的是，疏水性表面活性剂在该区域中没有吸光度。在最接近锂区域的约1260和795cm^-1处，可归因于表面活性剂的带的吸光度增加也大于50％，表明组装的这些关键成分之间的相互作用可能的变化。在将配体包被的胶束雾化到包含铯处理的锂的接收浴中之后，在停止反应之前，这些组分紧密接触数小时。

热转变和IR光谱的显著变化是结晶化合物、药物化合物和纳米级超分子组装体的多晶型变化的重要指标，已知它们以不同的形态状态经历重要的物理和功能的变化。不希望受理论束缚，与未修饰的纳米颗粒相比，C修饰的纳米颗粒的形态状态的指示差异(表1)潜在地提供了改善的运输稳定性和扩展的伯顿衍生观察C-修饰纳米颗粒的的体外稳定性的重要机制。

该实施例显示本发明的纳米颗粒实质上增加了不同的载荷和纳米颗粒多晶型物的运输浓度和伯顿衍生的稳定性。

实施例3-修饰的嵌合多核苷酸混合物在小鼠肿瘤模型中表现出令人惊讶的功效。

包含TBG配体和抗CK2嵌合多核苷酸生物活性剂的铯修饰的纳米颗粒涉及操纵肿瘤和肿瘤间质细胞中的酪蛋白激酶2alpha(Csnk2a1)和酪蛋白激酶2alpha’(Csnk2a2)蛋白的水平，由于在纳米颗粒递送系统中的TBG配体将颗粒和寡核苷酸载荷导向两种组织类型。酪蛋白激酶2(CK2)是由肿瘤细胞过度驱动以促进多个途径的存活的普遍存在的酶，并且在应激和肿瘤的条件下在细胞核中积累。在细胞凋亡之前CK2从核区间穿出，并且在肿瘤死亡之前肿瘤细胞不能维持核CK2。通常在免疫受损小鼠(异种移植模型)中生长的人肿瘤中评价肿瘤治疗剂。如下表2中概述的，在用结合Ago2和RNAseH的双功能寡核苷酸靶向的基因区域中(美国专利公开号2013/0267577，通过引用整体并入本文)，在人类和小鼠之间可以存在多达3个错配(hu Csnk2a1和mu Csnk2a2之间3个)。与阴影不匹配的hu Csnk2a1通过阴影和粗体下划线、轮廓字型或超大字母显示。

当将单核苷酸修饰掺入本文所述的单链寡核苷酸设计(SEQ ID NO：8)，以及涉及针对Csnk2a2的新型单链寡核苷酸设计(SEQ ID NO：9)，并且将这些单链寡核苷酸结合在TBG包被的s50颗粒中以形成CK2抗癌治疗性混合物，在荷瘤小鼠中实现了肿瘤生长、细胞增殖和炎症的抑制方面的效果显著。2R主链修饰由将单核苷酸--2位的DNA核苷酸从5’-末端改变为2’-O-甲基修饰的RNA核苷酸组成。这些寡核苷酸中的所有主链键是磷酸二酯。在该实验中，还进行了努力以评估错配的类似鼠靶区域的影响。下表2描述了本实施例中使用或提及的序列：

表2序列

注释：1)所有核苷酸键是磷酸二酯。2)DNA靶序列中的斜体＝相应的嵌合药物寡核苷酸的3’末端中的2’O-甲基RNA区。3)与Hu Csnk2a1的错配用阴影标记，包含带阴影的下划线、方框或超大下划线字母。4)对于寡核苷酸和修饰的寡核苷酸，大写表示DNA，小写表示RNA，所有RNA核苷酸都是2’O-Me修饰的。

使用两种裸鼠系(FoxN、Balb/CaNCR(BN))和一种肿瘤系(FaDu，下咽部)，在小鼠中皮内接种在50％基底胶(Matrigel)中的2e⁶(FoxN)或2e⁵(BN)肿瘤细胞，7天后开始皮下治疗。开始治疗时的平均肿瘤大小为约69-86cu mm。5只小鼠的组以10μg/kg每周两次进行处理。在一些情况下，在治疗约10天后，处死来自处理组的2只小鼠。在处理30天后(D30)，处死每组剩余的3-5只动物，称重残余的活肿瘤。

为了评估分子变化，通过显微镜检查从每只小鼠的活肿瘤区域的冷冻切片测定Ki-67和p65NF-kB水平，并且使用NIH Image J将其定量为针对背景对照阈值的信号面积分数。从活肿瘤切片收集重复的代表性区域代表所有D30小鼠。Ki-67是肿瘤增殖速率的常见临床指标，表示为活细胞核面积的分数或百分比，p65NF-kB是炎症中的主要信号传导和调节蛋白，是CK2的重要下游靶标。NF-kB异常活化，NF-kB的抑制诱导细胞死亡，抑制头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的肿瘤发生(Yu，et al.2006Cancer Research 66:6722-6731)。因此，本领域技术人员了解肿瘤模型中的抗CK2策略的效力，并且许多结果可根据抗NF-kB活性来理解。在细胞生物学方面，p65NF-kB(类似于CK2)在炎症条件和胁迫条件下定位于细胞核，并且随着炎症的减少而细胞质的或较少可检测的。表3总结了三种分析的处理和结果。

表3在小鼠Fadu肿瘤模型中开始处理后30天的结果

注释：1)N＝每组3只小鼠，除了具有5只的huMix。2)数值报告为平均值±SE。3)*＝p<0.05，Student’s t检验。4)#＝p<0.05，Student T检验，对整个BN对照池显着，0.66±0.11g。5)如实施例1中所列且描述的TBG纳米包封序列的配方编号。

值得注意的是，尽管实验组的寡核苷酸组分之间存在有限的差异，但TBG包封的2RhuMix寡核苷酸是唯一在所有三类肿瘤重量、细胞增殖(Ki-67)和炎症指数(NF-kB)相对于对照，在开始处理后30天(表2、E3实验、配方E)均显著降低的。包封的单核苷酸2R修饰(E1实验，配方B)和包封的huMix方法(E2实验，配方C)在处理后30天都不显示肿瘤重量的显著降低。实际上，相对于对照，huMix处理组(配方C)显示肿瘤重量显著增加34％。相反，用纳米包封的2RhuMix(配方E)处理的小鼠的肿瘤显示相对于合并的BN对照肿瘤的肿瘤重量显著降低56％，这对应于细胞增殖和炎症指数(约73％Ki-67指数、-99.7％p65NF-kB信号分数、p<0.05)的大幅度和显著降低。没有其他处理组显示细胞增殖指数和p65NF-kB信号相对于对照的显著降低，远小于那两种测量和肿瘤重量。E2实验中的muMix处理显示NF-kB信号面积分数与对照相比显著降低59.7％，但是伴随着肿瘤重量相对于对照的26.2％的增加，这是明显不期望的结果。另外值得注意的是，在E3实验中，在2R huMix群组相对于对照中p65NF-kB信号显著减少(99.7％)，而在E2实验中的huMix群组中p65NF-kB信号几乎没有变化，其中与鼠序列的错配等于2RhuMix的那些(上表2)。

通过显微镜评估E3实验中小鼠的CK2α和CK2α’蛋白水平的变化。与收缩、增殖和炎症指数的显著降低一致，在处理的小鼠的活肿瘤切片中观察到CK2α和CK2α’信号水平(分别为-52％和-45％)相对于对照的显着减少(p<0.05)(数据未示出)。在实验E1和E2中的所有其他处理中没有观察到CK2α和CK2α’信号分数的显著变化。

应注意，E3实验中的处理小鼠在30天观察期期间没有显示显著的体重减轻或不良反应(数据未显示)。总之，观察到的结果显示，寡核苷酸主链和序列中有限修饰的组合导致荷瘤小鼠中表型和分子标记物的显著和令人惊讶的变化。

实施例4-修饰的嵌合多核苷酸混合物在侵略性异种移植小鼠肿瘤模型中显示出 令人惊讶的功效。

调查在寡核苷酸主链和序列有限的修改，以及纳米颗粒的铯修改的效果，在另一种模型，检查包括人肿瘤细胞系(UM-SCC-47，来自HPV-(+)舌组织)的异种移植肿瘤模型和NIH远交无胸腺裸鼠。在该实验中，裸鼠皮下接种2e⁶细胞并保持两周，在开始每日100μg/kgSQ处理之前肿瘤生长至60-80cu.mm.。在处理14天后收集肿瘤，并以类似于上述FaDu实验进行检查。结果总结于下表4中。

在该实施例中，类似于实施例3并使用相同的方法，Cs-修饰的、TBG包被的2RhuMix寡核苷酸在所有三类的肿瘤重量、细胞增殖(Ki-67)和炎症指数(p65NF-kB)与对照在开始处理后14天(而不是30天)相比大幅降低(表4，配方E)。另外的对照，即具有对照寡核苷酸和糖类载体的Cs-修饰的纳米颗粒，被引入以说明非特异性介入应激对肿瘤生长应答的负面影响。在小鼠和细胞系的这种组合中，观察到肿瘤立即转移到淋巴结，并且在每只小鼠中严重侵袭腹膜腔，除去用配方E处理的那些(数据未显示)。因此，肿瘤重量报告为原发性肿瘤与腹膜延伸和主要淋巴结的组合。总之，实施例3和4显示了2R修饰和Csnk2a1和Csnk2a2序列的新组合跨越不同肿瘤系和小鼠模型的有利功效。

表4.在异种移植物UM-SCC-47肿瘤模型中开始治疗14天后的结果

注释：1)N＝每组3只小鼠。2)数值报告为平均值±SE。3)*＝p<0.05，Student T检验，4)在实施例1中所列和所述的纳米包被序列的配方编号。5)肿瘤负荷报道为原发性肿瘤与腹膜延伸、臂、下颌和腹股沟淋巴结的累积重量。均匀地对原发和GI肿瘤取样进行显微镜检查。6)另外的纳米包被的对照寡核苷酸的序列是抗凝血因子VII，来自Akinc，等2008NatBiotechnol 26(5):561-9。7)含有赤藓糖醇的C-修饰的纳米颗粒制剂被包括并且类似于配方A被制备，除了没有任何缩合剂的500μg赤藓糖醇用8.75μg的表面活性剂胶束化，用5.5mcg的TBG包被并雾化到用6.25nM的Mg²⁺和9.38nM的Sr²⁺修饰的接收浴中，所有其他离子相同。粒径为24±2nm，表面电荷为-12±7.8mev。

序列

CK2α(智人染色体20，GRCh38初级组装；NCBI参考序列：NC_000020.11；70.52kb区域从碱基473322到543838；Intl Hu Genome Seq Consort；2004Nature 431(7011):931-945)

CK2α’基因(智人染色体16，GRCh38初级组装；NCBI参考序列：NC_000016.10；39.97kb区域，从碱基58157907到58197878；Martin，et al.2004Nature 432(7011):988-994)

NM_001896；CK2α’基因mRNA序列的cDNA序列；智人酪蛋白激酶2，α’多肽(CSNK2A2)，mRNA(2008年3月17日)(SEQ ID NO：11)

NM_177560；CK2α的mRNA序列的cDNA序列；智人酪蛋白激酶2，α1多肽(CSNK2A1)，转录变体3，mRNA(2008年3月12日)(SEQ ID NO：12)

序列表

<110> 吉倪塞思公司

<120> 治疗性纳米粒子和相关的组合物、方法和系统

<130> 0269.13/PCT

<140>

<141>

<150> 62/045,519

<151> 2014-09-03

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

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atgattggac tcctgtaccc cttccccaag gactgctccc aagcaatgct gaatggagac 60

acgacctctg gcctctacac catttatctg aatggtgata aggctcaggc gctggaagtc 120

ttctgtgaca tgacctctga tgggggtgga tggattgtgt tcctgagacg caaaaacgga 180

cgcgagaact tctaccaaaa ctggaaggca tatgctgctg gatttgggga ccgcagagaa 240

gaattctggc ttgggctgga caacctgaac aaaatcacag cccaggggca gtacgagctc 300

cgggtggacc tgcgggacca tggggagaca gcctttgctg tctatgacaa gttcagcgtg 360

ggagatgcca agactcgcta caagctgaag gtggaggggt acagtgggac agcaggtgac 420

tccatggcct accacaatgg cagatccttc tccacctttg acaaggacac agattcagcc 480

atcaccaact gtgctctgtc ctacaaaggg gctttctggt acaggaactg tcaccgtgtc 540

aacctgatgg ggagatatgg ggacaataac cacagtcagg gcgttaactg gttccactgg 600

aagggccacg aacactcaat ccagtttgct gagatgaagc tgagaccaag caacttcaga 660

aatcttgaag gcaggcgtaa gcgggcataa 690

<210> 11

<211> 1674

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

gcggccgccc gccgccgcgc tcctcctcct cctcctccag cgcccggcgg cccgctgcct 60

cctccgcccg acgccccgcg tcccccgccg cgccgccgcc gccaccctct gcgccccgcg 120

ccgccccccg gtcccgcccg ccatgcccgg cccggccgcg ggcagcaggg cccgggtcta 180

cgccgaggtg aacagtctga ggagccgcga gtactgggac tacgaggctc acgtcccgag 240

ctggggtaat caagatgatt accaactggt tcgaaaactt ggtcggggaa aatatagtga 300

agtatttgag gccattaata tcaccaacaa tgagagagtg gttgtaaaaa tcctgaagcc 360

agtgaagaaa aagaagataa aacgagaggt taagattctg gagaaccttc gtggtggaac 420

aaatatcatt aagctgattg acactgtaaa ggaccccgtg tcaaagacac cagctttggt 480

atttgaatat atcaataata cagattttaa gcaactctac cagatcctga cagactttga 540

tatccggttt tatatgtatg aactacttaa agctctggat tactgccaca gcaagggaat 600

catgcacagg gatgtgaaac ctcacaatgt catgatagat caccaacaga aaaagctgcg 660

actgatagat tggggtctgg cagaattcta tcatcctgct caggagtaca atgttcgtgt 720

agcctcaagg tacttcaagg gaccagagct cctcgtggac tatcagatgt atgattatag 780

cttggacatg tggagtttgg gctgtatgtt agcaagcatg atctttcgaa gggaaccatt 840

cttccatgga caggacaact atgaccagct tgttcgcatt gccaaggttc tgggtacaga 900

agaactgtat gggtatctga agaagtatca catagaccta gatccacact tcaacgatat 960

cctgggacaa cattcacgga aacgctggga aaactttatc catagtgaga acagacacct 1020

tgtcagccct gaggccctag atcttctgga caaacttctg cgatacgacc atcaacagag 1080

actgactgcc aaagaggcca tggagcaccc atacttctac cctgtggtga aggagcagtc 1140

ccagccttgt gcagacaatg ctgtgctttc cagtggtctc acggcagcac gatgaagact 1200

ggaaagcgac gggtctgttg cggttctccc acttttccat aagcagaaca agaaccaaat 1260

caaacgtctt aacgcgtata gagagatcac gttccgtgag cagacacaaa acggtggcag 1320

gtttggcgag cacgaactag accaagcgaa gggcagccca ccaccgtata tcaaacctca 1380

cttccgaatg taaaaggctc acttgccttt ggcttcctgt tgacttcttc ccgacccaga 1440

aagcatgggg aatgtgaagg gtatgcagaa tgttgttggt tactgttgct ccccgagccc 1500

ctcaactcgt cccgtggccg cctgtttttc cagcaaacca cgctaactag ctgaccacag 1560

actccacagt ggggggacgg gcgcagtatg tggcatggcg gcagttacat attattattt 1620

taaaagtata tattattgaa taaaaggttt taaaagaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1674

<210> 12

<211> 2522

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

cccgcctcct ggtaggaggg ggtttccgct tccggcagca gcggctgcag cctcgctctg 60

gtccctgcgg ctggcggccg agccgtgtgt ctcctcctcc atcgccgcca tattgtctgt 120

gtgagcagag gggagagcgg ccgccgccgc tgccgcttcc accacagaaa tcaagatgac 180

taccagctgg ttcgaaaatt aggccgaggt aaatacagtg aagtatttga agccatcaac 240

atcacaaata atgaaaaagt tgttgttaaa attctcaagc cagtaaaaaa gaagaaaatt 300

aagcgtgaaa taaagatttt ggagaatttg agaggaggtc ccaacatcat cacactggca 360

gacattgtaa aagaccctgt gtcacgaacc cccgccttgg tttttgaaca cgtaaacaac 420

acagacttca agcaattgta ccagacgtta acagactatg atattcgatt ttacatgtat 480

gagattctga aggccctgga ttattgtcac agcatgggaa ttatgcacag agatgtcaag 540

ccccataatg tcatgattga tcatgagcac agaaagctac gactaataga ctggggtttg 600

gctgagtttt atcatcctgg ccaagaatat aatgtccgag ttgcttcccg atacttcaaa 660

ggtcctgagc tacttgtaga ctatcagatg tacgattata gtttggatat gtggagtttg 720

ggttgtatgc tggcaagtat gatctttcgg aaggagccat ttttccatgg acatgacaat 780

tatgatcagt tggtgaggat agccaaggtt ctggggacag aagatttata tgactatatt 840

gacaaataca acattgaatt agatccacgt ttcaatgata tcttgggcag acactctcga 900

aagcgatggg aacgctttgt ccacagtgaa aatcagcacc ttgtcagccc tgaggccttg 960

gatttcctgg acaaactgct gcgatatgac caccagtcac ggcttactgc aagagaggca 1020

atggagcacc cctatttcta cactgttgtg aaggaccagg ctcgaatggg ttcatctagc 1080

atgccagggg gcagtacgcc cgtcagcagc gccaatatga tgtcagggat ttcttcagtg 1140

ccaacccctt caccccttgg acctctggca ggctcaccag tgattgctgc tgccaacccc 1200

cttgggatgc ctgttccagc tgccgctggc gctcagcagt aacggcccta tctgtctcct 1260

gatgcctgag cagaggtggg ggagtccacc ctctccttga tgcagcttgc gcctggcggg 1320

gaggggtgaa acacttcaga agcaccgtgt ctgaaccgtt gcttgtggat ttatagtagt 1380

tcagtcataa aaaaaaaatt ataataggct gattttcttt tttctttttt tttttaactc 1440

gaacttttca taactcaggg gattccctga aaaattacct gcaggtggaa tatttcatgg 1500

acaaattttt ttttctcccc tcccaaattt agttcctcat cacaaaagaa caaagataaa 1560

ccagcctcaa tcccggctgc tgcatttagg tggagacttc ttcccattcc caccattgtt 1620

cctccaccgt cccacacttt agggggttgg tatctcgtgc tcttctccag agattacaaa 1680

aatgtagctt ctcaggggag gcaggaagaa aggaaggaag gaaagaagga agggaggacc 1740

caatctatag gagcagtgga ctgcttgctg gtcgcttaca tcactttact ccataagcgc 1800

ttcagtgggg ttatcctagt ggctcttgtg gaagtgtgtc ttagttacat caagatgttg 1860

aaaatctacc caaaatgcag acagatacta aaaacttctg ttcagtaaga atcatgtctt 1920

actgatctaa ccctaaatcc aactcattta tacttttatt tttagttcag tttaaaatgt 1980

tgataccttc cctcccaggc tccttacctt ggtcttttcc ctgttcatct cccaacatgc 2040

tgtgctccat agctggtagg agagggaagg caaaatcttt cttagttttc tttgtcttgg 2100

ccattttgaa ttcatttagt tactgggcat aacttactgc tttttacaaa agaaacaaac 2160

attgtctgta caggtttcat gctagagcta atgggagatg tggccacact gacttccatt 2220

ttaagctttc taccttcttt tcctccgacc gtccccttcc ctcacatgcc atccagtgag 2280

aagacctgct cctcagtctt gtaaatgtat cttgagaggt aggagcagag ccactatctc 2340

cattgaagct gaaatggtag acctgtaatt gtgggaaaac tataaactct cttgttacag 2400

ccccgccacc ccttgctgtg tgtatatata taatactttg tccttcatat gtgaaagatc 2460

cagtgttgga attctttggt gtaaataaac gtttggtttt atttatcaaa aaaaaaaaaa 2520

aa 2522

Claims (8)

1.包含纳米颗粒的组合物，其中所述纳米颗粒包含：至少一种生物活性剂、HLB值小于6.0单位的表面活性剂、配体以及Li⁺和Cs⁺，其中：

i)所述至少一种生物活性剂是多核苷酸或质粒DNA，且所述生物活性剂基本上被所述表面活性剂围绕以形成表面活性剂胶束核心；

ii)所述配体包含多肽或碳水化合物，其形成基本上包被所述表面活性剂胶束核心的壳；

iii)所述壳包含用Cs⁺预处理的Li⁺；和

iv)所述纳米颗粒具有小于约50纳米的平均直径，以及相对于具有包含a)无Cs⁺的Li⁺或b)Li⁺未用Cs⁺预处理的Li⁺和Cs⁺混合物的壳的纳米颗粒，具有增加的稳定性。

2.权利要求1的组合物，其中所述纳米颗粒具有约-20和约+4毫电子伏特之间的表面电荷。

3.权利要求1的组合物，其中所述纳米颗粒使用无菌水制备。

4.权利要求1的组合物，其中：

i)所述至少一种生物活性剂包含多个多核苷酸，每个多核苷酸包含3’RNA部分和5’主要是DNA的部分，其中每个多核苷酸的5’末端起的2号位置是2’-OMe修饰的RNA，其中所述多个多核苷酸中多于40％且少于60％包含SEQ ID NO：8的序列，并且所述多个多核苷酸中的其余包含SEQ ID NO：9的序列，和

ii)所述配体是靶向腱生蛋白受体的蛋白质。

5.权利要求4的组合物，其中所述蛋白质是tenfibgen。

6.向对象施用至少一种生物活性剂的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求1的组合物。

7.权利要求1的组合物在制备用于治疗患有实体瘤癌症的患者的药物中的用途，其中

i)所述至少一种生物活性剂包含多个多核苷酸，每个多核苷酸包含3’RNA部分和5’主要是DNA的部分，其中每个多核苷酸的5’末端起的2号位置是2’-OMe修饰的RNA，其中所述多个多核苷酸中多于40％且少于60％包含SEQ ID NO：8的序列，并且所述多个多核苷酸中的其余包含SEQ ID NO：9的序列，和

ii)所述配体是靶向腱生蛋白受体的蛋白质。

8.一种制备权利要求1的组合物的方法，所述方法包括：

i)使至少一种生物活性剂与缩合剂复合以形成缩合的生物活性剂；

ii)将所述缩合的生物活性剂分散至包含HLB小于6.0的表面活性剂的水混溶性溶剂中以形成表面活性剂胶束；

iii)将配体吸附到所述表面活性剂胶束的外表面以形成配体颗粒；和

iv)将所述配体颗粒与用Cs⁺预处理的Li⁺和无菌水混合并温育以形成所述组合物。