CZ50398A3 - Přípravek nebo jeho konjugát obsahující fyziologicko-aktivní činidlo, transcytózní prostředek nebo zesilovač transkripce a jejich použití pro výrobu léků - Google Patents

Přípravek nebo jeho konjugát obsahující fyziologicko-aktivní činidlo, transcytózní prostředek nebo zesilovač transkripce a jejich použití pro výrobu léků Download PDF

Info

Publication number
CZ50398A3
CZ50398A3 CZ98503A CZ50398A CZ50398A3 CZ 50398 A3 CZ50398 A3 CZ 50398A3 CZ 98503 A CZ98503 A CZ 98503A CZ 50398 A CZ50398 A CZ 50398A CZ 50398 A3 CZ50398 A3 CZ 50398A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
albumin
conjugate
active agent
transcription
enhancer
Prior art date
Application number
CZ98503A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew Derek Sutton
Asrar Bari Malik
Chinnaswamy Tiruppathi
Richard Alan Johnson
Original Assignee
Andaris Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9606315.1A external-priority patent/GB9606315D0/en
Application filed by Andaris Limited filed Critical Andaris Limited
Publication of CZ50398A3 publication Critical patent/CZ50398A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

? . Přípravek nebo jeho'· kon jugát' obsahuj ící:\ fýziologicko-aktivní-- - / činidlo, transcytózní prostředek .nebo zesilovač.. transkripce Λ>. ? '.' jejich použ i Ví .. pro výrobu léků a 1 .--ipůrsfeb—psfíbáscáe=£ < í Τ-yCÍcnTtgTete^a^tarvrrtiaB-těiTrfdTa .· - :.,.- .·' · , .?<;·,<«, '’'·;· · .. ' ''·-·'.,
Vynález se týká dodávání léčiv. · Vynález souvisí zvláště, s transcýtózhími· prostředky , a zesilovači transkripce schopnými dodávání' a :z'Vyšováhí prostupnosti léčiv napříč endptelěn',' •epitelem a mezotelam obsahujíc ím receptor GPóQ.
Iiasj2iáadriÁ-Si^^
Pro většinu ’ léčiv podávaných .ihtraarteriáIně . .nebo. intraveňózně leží'' místo molekulární· aktivity ' na; vnějšku·· cévy.'.-'Pro léč-i.va -podávaná dýchacími ...cestami: .je-' '..místo aktivity normálně na' druhé straně buněčné stěny alveoláry, bronchio-láry nebo tracheálního epitelu. V obou. případech' se zde vyskytuje stěn.á endotelu nebo ..epitelu, která musí '..být překonána dříve, než začne léčivo účinkovat.
Pro malá lipofilňí. léčiva se, objevuje mezibuněčhá cesta...měci těsným spojením-.buněčných stěn. Avšak pro -hydroíi 1 ické léky ... . á.'pro větší makromolekulám! aktivní činidla jako . napří klad pepťidy, proteiny,' geny ' nebo jántimediáťořové nukleotidy jediná cesta skrze stěnu vede napříč buňkami. Toto 'přináší zvláštní problém pro intravenózně podávané léky, které máji extrémně krátký poločas rozpadu vzhledem k rychlé degradaci: nebo prvnímu pročišťujícímu '.průchodu játry.· Čas.ťo- jsou nezbytné velké dávky nebo infuze, aby se udržely léčebné ,ν<. .
• ΪΛ Č. Jí i.,· V · # ř-Λ· ·.. >;.0..τ».:
ζί · »·♦·.,< .·· i * ··./-* '* :.. · · .« ·*··/ :,i> ••Λ:.·'·'
'., »·'· ··; * ., · ·': ·' . *2 · · ’ ·ν' 0 ·’’ : *
3?i'_/»-2nr'··.··:·^,·' · ·'·♦·.·- · ·,··. ·λ.1 · ι
*.£?;·, A?’·Γ·'·. ' ·} ·» · · · -í . ·. ' ' lír:*'' · ‘ *· ť *é'· ♦'···£· ♦···'*·'*'* i·' »>··, ; »·;· *·
I 3--S 'Λ..
/ (·/ !' 5.. -'ij /;' - 5'·Χ*.Ί.- » , 4· .· ,** ί^ί’ΐΜί'-ϊ'^/ϊί'* ’
,.(1 :Vé.
5- takovýíný.ývyměšpyárÍxm-á': degradaci1 j Λ stavu .techniky, je. tedy evidentně -.'.'.potřeba . rychlejších?
není· zcela' systémech ·-.· hladiny v rovnováze evidentně
'.'mechanismů pro doručování léků!sk.Pze'^ ; b,'7'.1·
-ýyéky.ťly -.sečetně -/zhráyýl?s pec X'Ťrckýchj--^r.ěáep torů které;·, zprostředkovávají endocý tózňi5 ; jevy ; 1: kde se : ·.’ 11 ganda kb receptoru. váže a-potom je vtažená ďovni-tř-, ''žakomplexáyánavdoreceptoru ; -procesem podobným pinocy-tóze. ·..'.' .To; azhrnuje invaginaci buněčné membrány, do oblášti. komplexu ligándového . • receptoru a .pak? uvolněn i .Ligandu dá ·· buňky způsobem, . který.
znám. ' 0 ' četných- endočy tózri ích:' receptorových bylo zjištěno,' . b-že; · ' obsahuj í ..;L.DL·, - inzulín, / -epidermální růstový faktor.,.,, růstový.-faktor podobný inzulínu a tF'A~F'AI-I . < hybridní molekula'.)'·; . · ’
T-řanscy-tóza. způsobu je.' invaginaci -a měchýřkovi tý- útvar- okolo komplexu 1'i.ga'ndového receptoru * '.doprovázený 'tr.anščyto.ťickým průnikem· s' uvolněním ' zpětného;. · inváginační-ho'··) 'procesu' .v bazolatérálni·· membráně.' ,. .i.tlohóklopáln.í'.,, protilátky. k transferrinovému receptoru bylý. ' kánjujovány 's tdxiny, takže se, mohly podrobit transcy tóze napřič. ' buněčnou vystel kou mozkových krevních vlásečnicl ý;.Áý.šak. ve?.· stavu' ..techniky j.e trvalá potřeba Činidel schopných -dodávání, nebo. zvyšování průchodu léčiv tránscy tózními'?, 'přQštřéd.ní ky.; rece.ptorů skrz buněčné stěny - kromě) ' búněčňé';5-.výstě;Í'k'ý.’·'..mozkových krevn-í-dh . vlásečnic stejně jako '. např;. ;.en'dotelu;vaskul-ár-, -.álveo-lárn,ího· epitélu a peritoneálního mežotelu. ''' ; ? ' · '·····’·'
Receptor -. DF'60, také popisován jaká 'álbohďin, 'je 'jedním z několika albuminových vazebných proteinů zmiňovaných v literatuře Í-Schnitzer· and.Oh,'Ji Bi.ol. Chem. 269 · (8) :' 60726082 (1994)1. Další b zahrnují ' SF'ARC . ;':(.proteinoyě sérum, kyselé, bohaté na cystein)'*.· oešteonec ťin' nebo·' základy . : £' ^V·,’· ·' ' - ‘V ·/*’ <·' ’/ Λ*1’ /' /1- ' ’< ’’ ,~{·/·Λ ' .- \ '' .' ‘’ύ'ΛΑ . ·*.· . u. i .·;·. .v - 7 · y*.·,γ! . '. , · · ’ '<<>, · · A Λ
...tt·'.
·' · τ;\ ••/r.'*:···^ ;jt/v··· ’·.
’ .· \ ’,· ·> -X'· -'λ;'· . · ' ♦ · ·· ' ' * · ·’/.-♦ · · ·
-/ Míi· ?· '-· ·.··· ; .;··-»··ί*χΛί«··ν.·3 ; φ ’· j -·<···-· ♦·?’’ .<*’ ·,’ · membránového /proteinu /40, ;. GP3Q, ' oěsteonectin jsou. exIrátěLulárni jistou ''homolagii 'se,.' SPÁRC· tím,
SPARCových -pitotilátek,/.(Schnit:zer and Oh·,, Am.-<J-'· ' 'Ώίο/'νι'Ηα-’α /•.fěíoSv‘ 'i · í’ - .;·’.'f • · · « v « · ·' ·
I · ·· · • · · · ·' «· ··, '
GF18 .a GP60. SPARC /a proteiny ; GP60 se dělí o ie- vymezuje . použití··' anťiPhýsiól/263:
Hí 872-4-11379 (1992);.· ·---. GRÍ-B/a·.· GP3Ó -jsou- membránové gly.koproťeiny. nalézající, se v,·· různých druzích buněčných typů, ale převládají zejména v makrofágu (Schňitzér et al,. J. ,BIOL. Chem. 267‘: .24544-24553 (i9.92') ·. , GP19 á: GP30 . jsou takzvané' čistící' ' receptořy .
, způsobující odstraňování okysličených, glý-.kovaných '.nebo. . '-'uyédehých-.-f orém/albuminu prostřednictvím·· endocy tózy, a· tudíž '.'hrají roli. v álbuminovém/.kataboíismu pro široké množství ' .orgánů . £ Schni t.zér and 'Bravo, ď„-: Bio!·. Chem. --268· ( 10) :' 7.562-,7570..(1793)).. . . . . . ' . . .' ..'i'/.:···’','-·'/
V /.antrastu k GP18 á ,GP.30 bylo zjištěno u. rečěptoru GP6ó., /-že.'., j- I·1,
Λ ' .V ' -.· i ’ y·*.;
’*? >*-·/;
-.-jé/'.vyjádřen· výhradně jen v .(Schnitzeř, Am. J.- Physiolálvěolárním epitelu (Kim et al Med. , 151: A190 £1994)) a .'per I· toněá 1 n í m
International souvislém ’ endotelu vaskulár '.·''
Am. J. Resp.. and ,Crit.1' Cáretoho se usuzuje, že i vmezotelu (Gotloi.b and šhostak, Kidněy 47: '1274-1234 (1795)). GP60 je zvláště hojný.
v mik-roCěyn í.m endotelu a je pozoruhodně . nepřítomen v stěně ‘mozkových-' krevních vlásečnic;
kde- je 'pozorován malý.
.al buminový. tok.' (Rousseau;·: et al, Methods inEnZymology 121:' 163 . <1986).)-. Bylo'· prokázáno, že polyklonální protilátky k endotelu GP60 se také vážou s alveolárním epitelem GP60 (Kim et al, supra). Receptor transcytóžního prostředníká
GP60 byl receptorů implikován do albuminu skrz špi-ts?l□ yé· ·.· £ť.· sne!o-ts 1 ovÉ bunéčné stěny '(Kins st 51/pr^.
Tirrupathi et al, Mo.leci.tlar biology of the· Cell 4 (Supp):
'.ϊ'όίύ' *.
λ · ..
^.ν*·-··' í1*!- ’··ϊ' ' ·,
• * 4.
,. ·' ·
' »·4 .4 '4 4. .
4 · « ·' .» «' · · 4 4
Λ 4· ·· β .
Ί · ·.
ϊ « -1-4 4· » · 4<>: : '4* 4 : >
- · 4/- , «ί*
Λίτ,Λ/^-
>;·\ •Ε .
<·.·;
•A 'V ·*·
A’· λ, .
8a, Abštract·Να.1964 ( 1993) ) 'ί ' !·. Π.
•V: ** ϊί.χΥ &<$· Λτ·
Aminoky sb 1 inová, 'sel·;vencě'·' GPdÓ / 'j e--známa' * ,zě stavu· •'•.téchniféyýj ' · (Ýamáuchi -ét. al/Biochem. Biophýs.·ResZCómm.-T46s:’·'1'485' (i 9.871 '····'<· ' '· ' · · ··/' ' · i1 · '· . ' ·· · · .·«·(·''.·.·..· „t. ií.'·.* J7 ·, ,-· ·’’.· '· v 5 1 -,Τ.:<'Λ\\ιη·
Podstata vynálezů' : ·.-' :· /T<řť/'-,/'':
Tento vynález poskytujetranscyt6žní/ prostředky,a zesilovače /transkripce schopné transportu' fyziologicko ~ aktivních' činidel ·' napříč/epi-telem,, endo.ťélem' /á. ;mez'o tělem . obsahujícím řeďepťoř .GP6Ú.. .Receptur , GP6Ó ' byl' implikován - do transcytózn í ho .'prostředníka receptorů.· albuminu , skrz buněčné stěny. Pomocí vynálezu transcy tózníprostředn í k rec.ep.tdru GPóO může být vyučit -pro přenos nejenom albuminu, .ale také fy.ziologiek.draktívriích činidel',· která · neprostupu j í přirozeně e.p.itelem,' ěndotělem .a' mě.zotelem přes systém GP60.
•Transcýtózní prostředky a , zěšilovačé transkripce vyy.nálezu.. zahrnují ' albumin, a 1 bublinové/ .j- f ragměnty··,·· anti-GP60 polyklonální á monokloná.lrií'·' ·:· · .přóti látky <- -anti-GPóO polyklonální a monok lonáln í . pro.ti 1 átkové fragmenty a GP&O peptidové f ragmenty', Dái.e··, zahrnují... /PDÍ, '-.'(proteinová disul f'idoyá izomeráza) .a je j i fragmenty (kážd.ý následující, odkaz, k fragmentům- .GPóO mfíče ·. být.(interpretován také jako odkaz·· k fragmentům. PD'I )i / Společným'/Tak torem / . můčě/. být '.motiv· ČGMC·'·. nacházející-'se v PDI, dá/to··.--alespoň' fragment' Ťí-aa z GPóO.. Pokud transcy ťóžn í = ' prostředek/ * nebo '. zesilovač. transkripce 'je, fragmentem peptidu-' GP6G, '- doporučuje se podávat, spolu s jinýmzesilovačem -transkripce albuminem· nebo· albummovy transcytózním prostředkem nebo ž .tohoto· /.vynálezu .jako např. m. . ..fřáigmén.tém·;./'.-'‘.'Vhodný· aibumincvý fragment 14, ;.2O a 32 kDa může .být vytvořen rozštěpením na */i. _ '“*· y Ιί'-ί/'.ί.Ύ ; *
‘.X / ·,ϊ.. ',
·.·--.r.· . ·· ·’ ·; · .·, ý-· ·* '9,ý .9·
'.··' 4 · · .·.,· .;· ·.*- ·'· .
Ύ*;♦;,>· / ·-.
' *·.·** ·'· Yf i \·*j.
- í ' ' ·
9999'· 9 9·· • · - * * ,· ‘Ϊ* Υ* ' ť T?’ ' v-íě X'i;
,. j'·/.···· ·,/··· meth ion -inové .'zbytky bromidu:kyahů 'a'., dále může být zmenšen redukcí '/sulfidových jmůštků. Anti-GP60 - pólyklohální a.' monok lonáln.í protilátkové fragmenty vhodné·, jako trahscytózni :. tohoto, vynálezů žaKrnUj-TíFab·'· Fábf yFCábíjůya FV' f ragmenty. --Up^édnóšfc.ňu j í'· sej •pepťidové'-. fragmenty ' -GP60· ‘ zahrnu jí c í peptid .. Τ3·118.,. který.· koresponduje s N-terminálními 18 aminokyselinami proteinu DP60. ' Ύ ‘Podlé.; -.'vynálezu, když výše uvedené:' sloučeniny -jsou kónjugovány .' k ? -fy ziologicko-aktivnímu činidlu, jsou -úvn.iťř. -.popSáný-7;jako třapsčýt.ózní· prostředky! když jsou společně· .podávány, ale ne konjugovány s f yziologicko-ak.tivň ím ' činidlem, Výše./ zmíněné sloučeniny jsou ·' popsány. -jakož . transcyťózni zesilovače transkripce . ůe výhodném, provedení' tránsčýťózní prostředky a zesilovače .transkripce- podle..
. .předloženého vynálezu jsou' uži tečné'.'pro' dodáván í ' léků . nebo.'· zvýšení průchodu fýziologic.ko-aktivních činidel ' skrz 'endotel'.' vaskulár,alveolár, epitelu -a peritoneálníhó-mežotelu.
Jak již , jeho název uvádí, protein GPóO má molekulovou hmotnost okolo 60 kDa., Po pečlivější analýze by Id objeveno, .prostředky a zesi lovače > -transkripce .podle . tohoti žaHřrňtF'»1? 'Fah·'- 'F^li’ TFCab/víáVa^FV' fránmentv. -Uhředm ; ku tečná' molekulová hmotnost pravděpodobné okolo kDa. Tento tohoto proteinu je' rozpor v. molekulové přípravě proteinu a.v se.'stavem techniky ' je zařazován (s výjimkou •y ./..v-!
hmotností ' je přisuzován rozdí lům v gelových podmínkách.· A.v.šak v.e shodě téhťo''.^protein v tomto dokumentu příkladu 1 níže) jako receptor DP60.
k J
Bylo objeveno, že transcytózní .prostředník receptorů může být 'využit pro transport nejenom albuminu, ale také pro Ohromný. .Počet terapeuticky důležitých 'fyziologicko—aktivních činidel, která přirozeně neprostupují epitelem, endotelem- a *07 0· ;7 0; 1> , 0 0 </
«... ; 1· u0-0;-ý^Y ^\·Γ. ÍZ <·. .?:ýcí.4’·
- ' Μ.Γ*. =.
77’«.' ·'·?.·_ ;.. ... ·.*.<·. ς’ ’ ·-. »·η .Αν-**» . -y · · :-i X j ' ·'.**** ί !-Λ »*ϊ>· -/ <',-.
,<4mez otel em‘ přeš/ systém GP60. ; ' Tud í 2 uvedený’ vynález? poskytuje^' q 7 . ·. -/.- . zdokonalenou metodu p,řo fy.ziQlogitKOŤr-ěklstiyrií/-přehós t napři//·., j; ; těch, které' mají ; .relativně vysokou y.molekulo volu hmotnost' .,· / ·. např. .50, 100,. 150 kDa nebo více skrz; buněčné stěny .ehdoťelLÍ. ..· 7//·/· vaskúi'ár/;'. (alVetíl^r,/ · ' 7 bronchiolár í tracheáln i ho’* epi'ťě-lcř'. --'/ a peritoneálního . mezotelu. Transcytózní prostředky a zesilovače transkripce schopné dodávání nebo zvětšování, průchodu . fiziologicko-aktivních činidel ., napříč, ěn.doteiem . .... . ' obsahujícím ,'GPé>0, epitelem. a mésóťelem zahrnuj í/albumin, 77 alhuminové·fragmenty, polykionální a mohoklohálhí· ahti-GPóO proti látkové fragmenty a peptidoýěy/fpa.gmen ty GP60‘./ Pokud /77,./ transcýtúznífri .prostředkem nebo zesilovačem transkripce‘ bude pep.tidóvý. ; fragment ' DP60, bude podáván raději společně.' s jiným tr.anscyťóžním prostřed kem nebo ' zesi lovačém.. transkripce podle tohoto vynálezu' jako např. albuminem nebo albuminovým fragmentem. _ ·, '
Albumin savců- je ve stavu techniky dobře znám a/je snadno dostupný. Užívaný albumin bude předbosťně ze stejného druhu savce jako pacient. Například bude·’-! i pacientem, člověk/jako transcytózní prostředek nebo zesilovač transkripce . bude nejlépe·' použito '. 1 idské a 1 bumihové ;'/sérum. Podobně pokud pacientem bude kůň.· nebo hovězí dobytek, bude použito koňského . nebo hovězího albuminového séra Pro jednotlivý' druh. /. ' ··.'·’
Metody pro vytváření albuminó.v-ých fragmentů jsou ve-stavu techniky dobře známy. Například’ štěpení albuminu a metioninových zbytků bromidem kyanu poskytuje výtěžky zvláště tří vyhovujících peptidů 14, 20 'al 32 kDa, které mohou být. dále zmenšeny., redukcí., disu 1 fidovýčh můstků na peptidy v rozmezí velikosti od 3,3 .až,20 kDa. Alternativně ,5 ,.’ — 7// ý< Jyi ’· · - i-.
1 7 ;· ·» . .4.4:474 '4:' ' <* ’· <» '· 4 .'’'· *·Χ ·»<ϊ£ΐ··' ,j< ,ν ·; *·v·'·.·’»’ '·· • •.•.,ϊ·/ 4,/44 .1
4/·.,'. . ·'.· *.· .
4, · 4 4 · ♦ ·.··-·, ?
. .·ϊ·4 >'· η'? , . 1 4' · ' >1 ř 4' ,'·. 4'4/rv· ···· •W--/ k- Vy tvoření -a lbumi nových peptidov-ých , 'fragméhtíů;·;· ,m'ůže / být;
-použito štěpení proteázou.' ' · ' ý '' ;v ; 7;r
Jestliže: každý jednotlivý., a 1 -buminový fragment.·, jeúčinný-jako· . transdý.t.ůzhí.prostředek,.nebo; , zesilovač, transkripce, podle./· '.tohoto’’ vynálezu může .'bý:ť''sťánovén' 'ρόά ie\obýy;&í'é- sdřeéningdvé ' metody . popsané' níže-. Jak- je uvedeno v. příkladech-ňíže,. právě . byi.o' .demonstrováno., . že jak . hovězí tak' lidské, albumino.vé .
.sérum působící jako 'tran-scy.tózn í zesilovače, stimulu j í .pří jěm' fyzioldgicky-aktivnlha' činidla '2,5 .až 4.· krát /ád ' kontrolu.·. Polyklónální á ·moňoklonální anťi-GPóÚ protilátky mohou být ' 'vy tvořený/z řeceptoru GP60 - vyčištěného od. enďótěiuj épitelu,'·' nebo mézotelu..Jak bylo zmíněno· výše,’ éndotělové,' epitélové v. .'a mé.z'o-tělové bučky ,·' které .ěxprimu j í recépior. GPóOý .(záhrnúj í - ’ -endotel' .váskulár (-včetně kapilárního ·.. endotělu· (Ghineaet · ai,J. . ' Cel 1 Bidl-. 107: 231-239 . ( 1933 )) ářteriálnď endotel' (Si l.f 1 in ge.r-Birnbdím e't ál, J.Cellular 'F'hysi'ology. 149:/575-534.-(1991)), tepenný a žilní. endotel (Schnitzer/and Ohý/Am.·. c , J. Physiol ·. (1992),. -supra), epitel a 1-veolárn.í ' tkáně'· (Kim'et ' al, .supra) a mezotel peritonea (Gotioib and Shosťak, supra).
. ΒΡ6Ό,· může být. vyčištěn od epitélu, endot-élu á-'.mezo.telu podle metod známých'-'ze stavu techniky (viz např. Schnitzer and OK, 'J / Biól.· Chem. í19,94 supra), a' jak je popsáno .v-'pří kladu. 1 nížé. ?. ' ·.//'..' ;. ;· · /' .'U mýší ,'.; králíků'nebo koz se mohou objevit vznikající''' pólyklóňální /.protilátky proti 'čištěnému 'GP60 ' . nebo . pěptidovému fragmentu GP60 (jako napřu, peptid T311S zmiňovaný níže) podle způsobů známých ze stavu techniky. V
-příkladu 1' receptor GPóO byl eluován z prostředku SDS--PAGE k
-i/ intramušku1árně vstříknuto po :hání se stejným množstvím
44-, :’.·&<» ··£'*> ·.·' ,.·. ♦» « , .··* 4 .·,·>· ' ‘ 4 · · ’ \·: .; , -· ’ r;· ,'ό .»'.··’· 4 . Κ«.·'· . · ♦»'·.'···./
4 · 4 4 4’·- ··.; < · · · · ·>- ·:* ··.“** ·
- . . ',-L : ι· .»'·!.·.:-<·:·'·«ΐ · · · *-ί·i ίίΎ> -Ό~ , ' ·ξ ·;,· .- .? av-^ímv.!: ~
Υ'.,'. ·-·/-’Τ: :/::··../.^ ~ 8 - .. < Α hí;ζ· lúpiněha -Frbundóvaéad juVánsu·. ·/ Druhá '^'injekce·, ...by:l a-,,podána/po/; í ďvoú týdnech'»· Králíci by 1 i- -vy krváceni;·;’ 'do- /4/ . až ?ó /týdnů, pó ; druhé injekci ; a byla testována imunitní odpověď. .Antisé.rúm • IgG bylo· · poté/--vyčištěno ;a použiti / proteinové kolony A-Séj3harožy < ; ·'·/',; ;. /’ .' ’/ίο'.-A
Může se také objevit monakionální protil átkový. přípravek podle známých metod (Gaďing, J. Immunoí. Methods in; Ceilůiar Immúnology, p.352, Freemán Saň Francisco,' (1979 ) j . Napři k l ad. myším Balb/c bylo; intráperitoneálné' injektováno '50-150 jjg GF'60 nebo peptidového fragmentu GP60. Tři . až pět /dní- před,.· > fúzí - pozitivní. ..myši dostávají ·, větší/./ dávku ..an ti genu/ /50-150 j jjg GF'60- nebo ;f.řagmeri tu GFÓ&Oj'' . a ' potom: ió lig/ /in třávenůžně á ?' ‘ .intráperitoneálné > každý, den . 'áž -do odstranění /sleziny. SÍězinné buňky -', jsou fúzovány. . s ,'Sp2/0-Agl4 myelomovými buňkami v podstatě podle St. Grothet. al, J. Immúnology Methods 35: .1-21 (1980'). Kultivované supernatanty,. jsou scréenoyány metodou EL ISA zá použití . n é kon jugo váného GF‘60 nebo fragmentu GP60' jako antigenu. : Pozitivní,,kultury byly poté testovány imunoTluorescencí a Westernovým přenosem na DNA-tránsfektované komplementární • 'Λ ..· ? * ,* Λ' · '/· popsáno v Lutz et 109-124 (19BB). Na
COS-1 buňky,/ jak je áT, Ěxpěrimenťal' ; Cell: . Resěárčh: 175i měkkém, ágaru byly -dvakrát, klonovány.
hybridomy vylučuj í c í specif ické, .protilátky,. ,* Každý- hýbri dom může být adaptován na medium SFRI-4 neobsahující sérum. Přibližně ' 2x106 buněk by l.o/: :in jektováho. původním primárně imunizovaným myším Balb/c přo tvorbu ascitózní tekutiny.
třídy a podtřídy je provedeno za použití Kit. Obě SFRI . kul tivované supernatan ty a ascitózní tekutiny mohou být použity, jako zdroj, monakionální protilátky.
Zařazení do
Isotypingu
5· f:
. · * · · ί · · Ι »/. . · · ♦ • · ί » · '· · · .
jak již bylo popsáno, , -ahti-GPóO polýk lonáln í a-monoklonální ·’, protilátky . a-protilátkové, .fragmenty podle,tohoto vynálezu j jsou užitečné jako transcytózní prostředky - á zesilovače' transkripce' schopné , dodávání - nebo zvyšování, prostupnosti fy z i o1ogič kd-ák ti vn ích -'činidel napři č, endote lem, vepi te l em -á . mežotelem obsahujícím receptor GF'60. Anti-GF'60 proti.l átkóvé ' fragmenty užitečné jako transcytózní prostředky nebo zesilovače transkripce podle předloženého vynálezu zahrnují fragmenty .obsahující . vazebné domény jednoduchého (Fab) antigenu produkované štěpením- pápainu nebo fragmenty, F(ab’>£ produkované - limitovaným pepsinovým štěpením .(Olsson and Kaplan r ' lijethods ,ih Enzymology .92·; 3(1983)). Další vhodné fragmenty zahrnují Fab’ a . Fv. ··' Jestliže každý jednotlivý užitečný jako - transcytózní transkripce, může být štaiioven podle obvyklé metody screeniiígu popsané níže. V příkladě 3 níže- je prokázáno, .že··· podávání anti~GF6ó polýk loná ln.í čh .proti látek při 37 <’£ má za následek 1,6 až'2 násobné Zvýšen í příjmu fyziologicko-aktivního Činidla nad '.úroveň preimunní sérové.kontroly.
Podle' -tohoto vynálezu antirGP60 protilátky podané jiným živočichům než lidem jako např. myším a krysám jsou vhodné pouze pro krátkodobé . podávání (např. jednorázové dávkování) /zhledem k.dobře' známé nepříznivé imunitní odpovědi na cizí protilátky,. Avšak metody popsané ve stavu techniky mohou být použitypro tvorbu lidských monoklonálních protilátek ,k . receptoru GP60 k překonání problémů podávání myších monok l oríáin í ch protilátek lidem (Olsson and Kaplan, supra), a,tím umožnění.-dlouhodobého, nebo chronického podávání . vhodných protilátek. Kromě toho, myší protilátky podle proti látkový fragment je prostředek nebo' zesilovač
.. >
. ' Ý 7 -·λ- .5,· ’·/ V ' 'Λ ·*♦;.-.. ! -« « . '’ .1 ·· > ·.·, * <··,· · '«, ♦·' · .;·;*. ···..,· -£?
, -;·:.· ·' · - » ··. „ χ.·ΐς '·. f ·♦-..
r ť- ;·.·.Ί '·! · .·.* · ♦·.· ·’.ν uť-^V .'··/ |» ' -· 14 7'·' ί'έ»4 ·;' ·· .
·«' ;'6ί*:Λ ·«.*'·, > '-.-ι *'· ' > ··, .. :·!.· , ;
: předloženého'. /vynálezu- mohou být'':..'humárři'z'óváný^.VóhiměrTokóuý·': •nebo CDR ' transplantací. Z jištěná obl'ašť;.,,-.mý.ší'/probil'á(tky -je.; transplantována do 'pří slušné oblasti;.rproti látky l idské ·: ták, ·.' ;áby se , vyloučila . néb'o .omezila nepříznivá,' imunitní· .odpověď u ' : ' ·'/ ': ? ·‘ic .''=:·λ-·;Γ'Λ····-':' /:7 7 -/7Λ'/7 k;:.ýť pacienta.' ‘ · ; Peptidové fragmenty GP60 transcytěžní prostředky a jsou . také užitečné jako zesilovače transkripce podle předloženého vynálezu.. Obzvláště vhodné, peptidové fragmenty ,zahrnují prvních 18 aminokyselin. ; z ' N-teřminálního 'poiypep.tidu GP60: bylo zjištěno,' žeťýťo aminokyseliny jsou' /přinejmenším - /80% · homologn. í · k protaženému hovězímu/hormonu : .. vazebnou/ /membránou hormonu štítné' .žlázy '(T3)/ vázající ho protein.. Takové peptidové. fragmenty 0P60. mohou být- vyrobeny podle jakéhokoliv známého enzymatického nebo fyzikální ho postupu- včetně proteolý tické degradace.'/ /Alternativně peptidové- fragmenty GPóO mohou ; být vyrobeny synteticky.· Jak . je uvedeno v příkladu 5 ní že·, syntetický, N-terminál ní .Peptid ÍT3118) z peptidu GPč>'0' odpovídající prvním, l'8 zby·,tkám. může. být vyroben jednofázovou syntézou. Tento peptid, fungující jako agonista.transcytózního prostředku, stimuloval abšořbci lidského albuminu Skrát nad' kontrolu. * · '' '.'.'·
Metody· , pro konjugaci. transcytózních prostředků·' //.podle předloženého' vynálezu k fyziaiogič.kó-ak tivn.imu,; činid.luábudóu snadno patrné odborníkovi znalému stavu techniky ,á zahrnuj í ale nejsou 'tím vyčerpány, ýglutáraldehydovou konjugaci zahrnující tvoření Schiffovy. báze, carbodiimidovou. reakci mezi ' proteiny a kyseTinami karboxylOvými, aktivaci anhydridové kyseliny léků obsahujících. ,. amin- doprovázenou carbodiimidovou , ..vazbou, ^..'aktivaci···. /primárních ..léků,· obsahujících amin s 3-(2-pyridy1ditio) Přopionan-N•'♦•i-' !··♦ ·τ .ι·»^ ; 4, ,..- 44* <
.·.'··'-v />·*:
••♦•r;· ‘«'V-;-.
. *Λ ♦.-·· /
- ♦ · · · i.
» · i · .
• ·-, « 4.4 4 ·„
4 .g ♦ '···' , * ’· .44 44 > 4 · I r ' ·· 44
4 «, I •4 4 'I ··♦* ··
Z W4. -v· činidlo může před loženého car bod i i mi dění
-sukcinimidylovým . ; ; anhy.driďem' - doprovázenou'. *; spojením S čýsteinovými '' skupinami 9' prdteinft, spojení 'sáctíáridovýphV.? alkoholů.s proteiny za použití chloridu kyhuridu a konjugaci':,' me z iami n y a hy d r ox y1ový m i , s ku. p i n am i přes , b i spe r o x i d ac i.' :9/ 19 NápříklácT aminasačHářidavá: '' složka1' Ťýžióiogickar-akítivrí Ϊ Piti/ ' 'činidla,.1 může být- ..oxidována působením per jódátu; sodného; c a přímo1 připojena., s .lyzinovými' zbytky, na transc-ýťožní . prostředek předloženého vynálezu prostřednictvím,-SchiŤŤóvy bázové '.formace 'podie. metody popsané v. Hurwiťz' eť al', CancérPes, 35:1175-1181 (1975).· Alternativně Ťyziól.o.gic.ko-aktivríí být nápojeho na,-9 transcytažní prostředek podle vynálezu . pomocí ' vazby zprostředkované aminové .skupiny -k aktivním. kářbóiiýl óvým/' skupinám na transčytóznim prostředku nebo k aminoálkýldvě.· .skupině podle'1 metody popsané , v Hurwitz et al , Int.J. Cancér ' 21;747-755 .·.·’(1978 - Ty zi ol tígickofak tiyri í ? činidlo' může’..bý ttaké vázáno.na transcyťózní prostředek podle, předloženého.
.'.vynálezu pomocí- křížové vazby aminocukřu aktivní složky . a aminových skupin transcytózního prostředku s glutaraldéhydem podle' metody popsané v.Bel lés-Isles et al , Br.J.Cancer 4Ϊ :841-842 (1980)..
Dalěími vhodnými. .· kohjugačními místy· pro konjugaci ' fyžídlogicko-aktivních činidel k jednomu z transcy tózních .
. prostředků podle- - předloženého vynálezu mohou být běžně stanoveny pokusně,' Například transcy tózn í prostředek, podlé předloženého.' vynálezu může být označen Ťluoresceinem nebo' 125j před nebo po konjugaci s takovým fyzíologicko-aktivním. Činidlem j.ako je např, inzulín. Po konjugaci a označení sčrééningpvá zkčíuěka, ‘jak je popsána v příkladech níže, může být použita ke stanovení absorbce éndotelových. buněk,' . ·? /
’..Λ ί .' , •-Λ*' '>
Z-.·** ·ί « · | -·Μ 4 ·♦:*.· ...» -*·'·. :-·..·· ' • « · '· ’ ,♦%···.;··.·· ;·» ·.···< * „*' ···.·..-, /*; .· : · ·?νι «ΛΑ '*Λ*>ί·* fj.· fe · ♦ · 9 9 .Λ 4» ..
?·. Λ < ; > ř ř* ·.
.· , 1 · ' .) ·:. ,
Λ*?* ·'·· · < ;·'·Γ .· 1 Λ»,* <#·? *>*·'
Ί ί ι L λ··.ι epite 1 ového. 5 buněčného průtoku:, jakéhokoliv-' možného aktivního .. konjugátu. Běžná odborníkovi stanovit,: které : před 1 o žen é tYó'. vý ri á lež li transcy tóze. poté, co průtoku'; nebo méždtelového .kjbuněčňéhó·./.^ .
t ransc ý t ó z η í ho ..p ros t ř ed ku. -,.7-- screeningová ' zkouška umožňuje .'· transcytózníf? rošt řeď k-ýý podlé’; .
< si 7 udržuji -dch 0 byly konjugo.vány na konkrétním místě.
fyziologicko-aktivním činidlem. Taková zkouška. . je také užitečná pro běžný screening možných' albuminových . fragmentů;' proti látkových fragmentů antifGPóO a pěpťidóvých fragmentů GP60 ke stanovení toho', které 'jsou ’: vhodné' pro 'póLíŽití ' jako·' transcytózní prostředky . a / zesilovače transkripce·podle tohoto Vynálezu.. . ........ J
Konjugace fyz i'ol ogic ko-aktivn í.ch '.činidel ·;&.. tránsčyt.ózním prostředkem- podle tohoto vynálezu je ; zvláště vhodná pro intravěnózní. dodávání' léků .nízké mó.lekLilářri ťb hmotnosti, . které jinak maj í 'extrémně krátký poločas ,roz.pa'du'..sěra, -nebo, peptidoyých léků, jež jsou rychle ' degradovány .v - krevním( oběhu nebo odstraněny prvním vylučovacím yipřflchqďěíaTjáťrý;. j' Samozřejmě tam, kde fyziologicko-aktivní. . činidlo ', je konvalentně' konjugovánó na jednoho z transcytózních prostředků podle- předloženého vynálezu-,·' řezlďuáih-í aktívita‘ terapeutického- Činidla musí být odhadnuta, po kohjugáči. Techniky pro ' - ž jištěn í. aktivity: terapeutického, činidla vjsqú.ý dobře zavedeny ve stavu techniky. a mnohá: léčiv bylo/úspéšriě : kon.jugováno a. byla jim z.achqvána podstatná‘.aktivita;-·.'. Například literatura Jpopi.sUje kqn jugátýT mězi re.ceptqřoyými' liganďy nebo jejich fragmenty a léky k podpoře transcytózy napříč výstelkou mozkových krevních vlásečnic. Fukta/et: ;aí,' Pharm. Research. ' 11 (12) : 1681/ ' ( 19945 \ popisLi j i.· /; kon jugaci peroxidázy z kořenů ředkviček ' (HRP).' k inzulínu,., která' •7 ''Φ Λ ·····'».·’·. ··.,-.·· * ' 4.·' ·'·'.· · 4 :44,.·' ·>-.:·♦·; 4· ·’4' '· · 4 44.4-.. ··· 4 4
4.>’·4. Ϊ7 · ·*.?;.//'-? ·-· · ..·?
···»' ’·4 ' / 7 ··’!'.· ·.·
- ;ι;
.<^ί . ' -i' .
umožňuje' ‘HRP , proj í t, skrz, . výsteiku . mozkových .křeýňíchyj·:..
.vláséčnic. Výzkumníci pokračovali : v ''tvorbě.·'' (fragmentů.ýyjy.;.' inzulínů, které, bylý šcre.enovány pro jejich schopnost vázat .·: se ..na- inzulínoyý^./řécepťor^y .(. kultivaci, hovězích. \mozkovýchý.y '/' mikrocévních endótělóvých buněk'.· ' Pótidbně (další tráříscýYózrií';?;'?';''/J systémy , dovolují průchod 'protilátek spojených léky včetně, mezi jinými, protilátku metotrexát transferinový receptor (Friden et al, Proč. Nati.. Acad. ,Sci.(
USA 88:4.771 (1991 )):·. a protilátku polylyžin zácílenoú na receptor epidermálního růstového faktoru (Chen et aí, FEBS Lett.338:167 (1994))ý. ( y Yy
Ve ' srovnání š ťřansoytózními ' prostředky transcytózní zesilovače transkripce tohoto' vynálezu nejsou '.konjítgováný s- aktivními' zacílenou na k f yzi o1o g ič ko - ak tivηí mu korezidence v ( epitelu, receptor .GP60 jednoho transkripce podle tohoto činidlu. Bylo.·: ,-.zjištěno,, že endotelu a mezotelu obsahujícím.z transcytózních . zesilovačů vynálezu a f ýz iol ogicko-ak ti vn í hó.
činidla je dostatečná ke zvýšení absorbce a průchodu' činidla napříč buněčnou ..stěnou.· .Aniž by si přály bý t , svázány s teorií', transcytúzní zesilovače transkripce podle předloženého vynálezu'' očividně spouštějí transcytózri í mechanismus, prostředníka GP60, a tím. stimulují zvýšenou abšorbci, . korězidentn.ích makromolekul včetně terapeutických, činidel. '' ·
Abšařbce nebo průchodfyzíologicko-akiivhích činidel do nebo.
a mezotel mohou být indukovány nebo transcytózních zesilovačů transkripce nebo v kombinaci.
Skrz epitel, endotel zvýšeny jakýmkoliv z podle tohoto vynálezu buď samotným Například pokusy'níže demonstrují, že peptid GP60. T3118, jako agon.ista zastupující transcytózní prostředek, zvýšil ' 7 '?· i'. ;V · . e f’ ·ζ7 V· *'< '‘i“ í\
7--x·;-i· *·: 2·- -te 'ϊ \· -7 ·· · 4.4 ' •4 4. .- .» « « » ,w.T.
I ; 4 4 ' ‘ 4 ' ·. 4 u 4 · 1 · . 4 47*7' ·#’Tf: -v ·>·;'· v - '4. . < 4 4'·.-·, · · ·”·.· ·:.'.· i ·ι.; . 4- 7-,444-4 ·, 4 4444- 4. 44··^. 4< ,·*.>· . 4 Λ·? XX ·'* ’/4. 4 ‘ .· 4 . * ' ’ ·'·?·<•ft2’ · γ Ί
4· ·> · -7,’ ' ··. >V·· .· ’ .· ... .r : yv c-v·'-·
X 714'
7yv > < 7y. V 7.
i ΓΛ 'ť· '; ’v h V - < -*r τ jlábsorbci· : lidského albuminu .·· -Skr.áty' hady kontrolu. Vý,,;ďái'š;ím. - :77 . pokusu .podle předloženého vynálezu,-'. dodávání : aktivních:- X'-7'ý/· .činidel může .'být' 'úspěšně.· dosaženo7. ./kďy-2. jeden kon: júgáťů- ·'·< ;;.··'· .střaněcy.tózníeh i prostředků ďiS kut ováný;' ·,, , v.ý.ěe je pcdáy.án, , ,-// společně s jedním . riebo více. transcytózn i mi1 .''zě.siů óváč i1 ·,.':7'<:;: transkripce podle tohoto vynálezu'.·- 7 · '· -'..·.;· l/on jugáty tranščytóznch - 7 prostředků a . ' 7-kompozite ' transcytózních zesilovačů transkripce (včetně aktivního., činidla) podle ' tohoto .' vynálezu mohou .· být podávány .· s farmaceuticko přijatelným.nosičem nebo prostředníkem,napři; farmaceuticko přijatelnou! organickou'. nebe .anorjgahičkóu .
substancí vhodnou pro aplikaci,(.' která nereaguje-Škodíivé -.· s·konjugátem nebo kompozicí. 'Vhodné, jfármaceutičko. přija,tělně·.,',látky, zahrnu j i ,.'ale nejsou omezeny na, 'vodu, slanéyroz toky ·,. alkohol, ' rostlinné · .-oleje, polyetylénové ol e je,. .žel atiriu, .·<-'. - / laktózu, am-ylózu, stearán hořčí ku,·..' talék,·'.kysel igú,·,' křemičitou, viskózrií parafín,' ; parfémováný ''ϊ'· .pleji,'/?'., monogl yceridy 7 a. ďiglyceřidý mastných ' kyselínjX · éstěrý-k.1 ·' petroetralových mastných kyselin,'' hydroxymětylce-l'uló.zu, ..' . póly viny 1'pyrol idon, atd. Farmaceutické preparáty mohou být sterilizovány a,, pokud je to' žádoucí, míchány s pomocný mi činidly · např. lůbrikanty, konzérváčn i mi·'' 7. prosťřédky, , , r 7 ' j . .. . ' j 7. ,/ '.7 * ,-J' Vjňí.T;-?'f stabi 1 izátory, smáčedly, emul gátorý·,. solemi pro . bvrivněn i osmotického tlaku, '· puf ry,.·. ·. barvivý,- kořeněnými'· . a/nebo aromatickými substancemi,':- ' které . .. nereaguj íý -7 škodlivě 5 konjugáty. Pro parenterálni podávání zvláště /vhodnými preparáty jsou roztoky, raději oleje -nebo vodné roztoky, stejně tak suspenze, emulze nebó· implantáty včetně /ěýpků. Ampulky jsou vhodné ' jako., jednotlivé ,·:(dávky.X/Firb enterá/Thí ' podávání jsou zvláště vhodhými preparáty tablety, dražé nebo •f/y ·< 1 '” :. ; ’·· ., ' ·’^\ ’ ,?
·:··..; ..ΦΦ - : - .ι . ·φ ·. - ’’ .
I .· ·♦.··.· «·’ ’. 4 Μ Φ φ * ··' · *. Φ · · .·</ • i’· | ·/ '· .'·'··♦ ··’·.· ·; ' · ' ·♦’ /· ··. ?·· · · · φ·!·; ©·.··,··*♦·>·'./····:· . ** •φ. v -O-?1' -- -· * φφ«·'·. ;·«.
-φφ-:· Φ;·γ
9. sYiV'· ·- &.· ν · • >-· ;··,χ kapsler-'';k:těré.· mají za./riosně.pdjivdtáiek· a/nebo* kái^tíóhi/dr.át ,· ·.
: nosičem -je nejlépe? laktóza/a/nébo kukuřičný .Škrab-Yá/nebo 9/ bramborový Škrob.. Sirup;,. .tinktura neboi podobné mohou /být. použitý; /tam, ' kde.. jě 'ušito’,sladidla.; ?.Trvale/.yóinéýkcínip.cjz-lce .· móhou; býV ? při pravováhý^VČe triŠ-úf^j.' 'kde áktíýrii kompbriéhť j j ě s chráněn· -diferentně v 1 degradujícím . obalem i např. mikroopouzdřeníni,, mnohovrstevnatým obalem, atd. '
Podávání konjugátu nebo kompozice obsahující jedno nebo více ·' fyziologicko-aktivních , činidel' a -jeden; nebo ' více;
. ťranscýtóznich prostředků nebo zesilovačů transkripceúpodle .. ' tohoto vynálezu'.se; může vyskytnout 'podle, jakékoliv metody .·'.· známé, ze-stavu techniký?včetně in jekce ?nébo pulmúriáln ími ' dýchacími; cestami.··. Injekce je zvláště vhodná- pro podávání do \· .vaskulár.a peritonea, zatímco pulmonální dýchací ceétý jsou vhodné pro -podávání do alveol. Vhodné přípravky pro - pulmonální ' podání · zahrnují jeden nebo v-ícé z transcytózních zesilovačů transkripce' podle '.předloženého' výnlezu 'přim.íŠedé k -fyziologicko - aktivnímu.1· činidlu. Alternativně ·· vhodné přípravky pro pulmonální podávání zahrnují transcytózní prostředek konjugováný k 'činidlu. Například přípravky mohou být vytvořeny v ' rozprašovacím zařízení . jako např. v. proudovém, rozprašovači? Acořn or DeVilbiss.,, v·. němž činidlo '·'· 'áitranšcytózní zesilovač·;' transkripce nebo- transcýtúzní' prostředek . jsou..přítomny- ' .jako· vodný roztok v zásobníku.
rozprašovače. . .-/Alternativně ·· ve ...výhodnějším zpracování pro pulmonální podávání je přípravek vylučován ze suchéhopráškového inhálátorového (DPI) zařízení. Zařízení DPI- jsou in U.
popsána v Sutton et ál
08/487, 420.. a v W0-9809814.
přípravek do mikročástic o velikosti od
S. Patent Application' No. Vyžadují·' sprejově vysušený až 5 jim, které
O;;9/9 '*.-7-999 f <·. * -T, , ·/.· . i. ťT · -./i .»·>?· »i .*-'· • · 9ř + » · - »· . · ·. *, - ♦ ·'·''· - > · · * ·' f.· . ••r r'7 ♦···.♦, 9, ·;·»»♦. ·-.;··· · */♦ ’»ν·7 ' · · < '· ·;
··. ·.& //:/
,.--¾ .J ,^·.·'·ΰί--- C * ••j<
ζ/t ·' .<
> jsou/up/ednostbovány pro’ al véoiárh í jpehéťraci/Tý ./7 \ .konkrétně/· /transcytóžhí' ·' zesil ovač transkripce; něbd ~ ' třáošcytózňí .'. prostředek podle tohoto vynálezu ' nebo jejich-·; „směsy-^nej l,'ép(ě/v-· koncentraci// asi 20%χ jbmó tn·..Zob, ji. ,//,e/pauž i fa/? ·- pr'of••ýšprějóvé' sušen-í. preparát, který dá' být'.’r'ozp'řáěb'ý'án.,/''' mÚŽe .obsahovat substance jiné než transcy tózn.í zesilovače transkripce nebo transcytůzní prostředky. a rozpouštědla nebo kapalné nosiče. -Například /vodní fá-ze - může- obsahovat' 1-202 .'hmotni vodou rozpustných hyrofyličkých sloučenin jako ‘např/ cukry,· polymery a s.tabi 1 izártory,. např, .polývinýl.ový aíkohíbl' , .'( F’VA ) i pplyvinylový py rol i don . '(PVP).,. pPlyetyléňbv.ý.j /g ty kol·.. (PEG), želatinu, ' kyselinu .polýglutamovou -’a; ;pol ysachařibý 'jakó/ěkrob, dextran, agar, xantin,- a pod'. Podobné , vodní fáze . mohou být . použity jako ' nosná-' kapalina, '< v', níž:, konečný mikrosf érický · produkt je rozptýlen- před' použitím. Ěmulgátorý mohou být použity (0,1 aŽ-5 2 hraotn. ) .včetně větěiny fyziologicko - při jate.lnýčh emuígátorů· např; . vaječný lecitin ? nebo lecitin sojových bobfl, nebo syntetické' lecitiny jaké např. .nasycené syntetické. lecitiny napři dimýstroyl fosfatidyloholin, . dipalmitoyl , fosfatidylchólin nebo disťearoyl fosfatidyIcholin ' nebo nenasycené' syntetické' lecitiny jako . ďioleyl ·. fbsfatidýcholin,,- nebo. dilinoleyl·.· /fos.f atildychol ih. Ěmulgátorý také ·. zahrnu j í ’surf.ak-t arity jakci ' např. volné . mastné 'kyseliny, estery mastných kyselin, s poí ýal ky lenovými-, - sloučeninami . napři ,.glykol a polyoxyetylénóvý glykól, étery s polyalkylenovými gly.koly, estery •poíyoxyalkylovaným sorbitaném, alkalické soli '.mastných kyselin, glýeeřol—polyoxyety lén ři-cínóleat,. homót· a kopolyméry polyalkylenových glykolů, polyetoxylovaný polyoxypropy lenový mastných ajkoholfi mastných kyselin , ···!? :' ''··. :'fy·!.*!'*·· 'fct-C t d* e 7 t€' Ϊ T^WlKbl ,,· '·/ /-::-..--0-0 f ,-:=:, -Tz-ftťíí-éf c-»l· o. tře< ř t (c< o J Λ^ΧΒηΙ aZy.J:ctí.'<i<:..·««',” c' * ««w·· ·
- '17ricinový olej: Štějpě jako / hýdrogenóýáný / derivát, 7' ětěřýi á·.’.· estery šacharózý nebo., j iné'karbbhýďrátý:, ’ •‘ s mastnými. · ,7ky se-lí námi ,· „„mastnými/.,. Ialkoholy .tyto ·..;*,·jsou.,·ť , .·' *- ' ’ .’ · '·· ..—. Λ -'· ..-ϊ· j,·ύ ; , .·) ji . ί ·*'·.·. ' 1 ·> /i. / ·. · .· í l ibovolně?, i^qlýoxýal k'y lováný, , mono-.2 ,'di- ' .,/a , trigl yčendy • nasycených /;h'ébO/'thěhasýčěnýc^,7/‘másťhýc'h'-./:.'kýšělíh·/ glyceridů.
’ '-' > /’ ' t > ../ --. ' ’· 7- . ' ,'·?/·. v ’ ·η.-.ο Λ'·-!;··
-. nebo .sojového·, oleje a ..sachar.Ůzy . ; . .·... \
--J i · - é -., * * · · f ΐ »· -v·.’ ‘ · · '' \ · a · ,· -i ; * v ' ' f . - >' r ·:··.·; i ‘ '
Přísady: mohou být- vpraveny do ,.stěny mik-rosfěř, . aby..
ι, i ..:/ ·:’.. ;.j!i-' y-ϊ /·,.- 'Τ’*,' r’ . ., ' '-/. .i·:·...· '.’.·'' ' Z-t')' >/// modifikovaly takové fyzikální. '(vlastnosti’, jako jsou' např. . - .· ·//. I..:··-» -a .... -H. ' / / ’ ' '.· ’ ·.'···>···.·'·.-·.'' ·; ·- dispeysibilitál , elasticita' a...,· špermeabilita. . .vody/'Mezi i i./1 ·; . ; · '·, -1-,,/. ;/' sójový olej a užitečně.,· ..přísady '· - I -i · .·,. ř, ...,.-.1. , ' . » patří sloučeniny které/ mohou • hydrof obovaťk,: stěnu tak, , -. aby zmenšila.: /.permeabi 1 itu; vódý.jj
... . , ·, _7.’.*,·v. ·· '<·.> - /. ·-·.,;; ;. ·. ;. ·.· ' y ' '/?. · ;’ h v..·: ..
„•tuků, .. .vosků a . .uhlovodíků vysoké i móiekulárňí 'hmotnosti..:. Přísadami, ,· .' které\· , vy lěpšu ji ', dispersibili,ťo : ; mikrosfěř v in jek to.vaném tekutém nosiči,. js.ou ; tako.vé^ _ amf.ipaťic,l<é ' » ·«. ť'. -'·< *-'ϊ •Λ-Π.Μ -:, , sloučeniny, .jáko fósfolipidy·, /ty také zVyšuj t voďopropusthost ; ; ' S'< ·«?·.. 'íy·' ?·’·> .''•ί. ‘•..♦«'V’ ' ·. y/yn »/ , ř, < ,».·.* · Λ.. j Λ, a- stupeft.; bicděgradace’; < Přísady., které . zvyšuj í „ elasticitu . . 1 - v / ... .- '.f ··.·/· . -··..· ; ·, .··..· .'i'·, ·’ '· ,. · ·· I i., . .‘,.
stěnyzahrnu ji (ťakóvé· '-plas ticizéřýjako'.'my řiš tát' izopřopylu'.
·/' < t, ,·· . .*·'·. ‘,-7 ' ·«· ··: '·*· : ' ί· Λ V -? 4 . ·. S !, ’ \ .*.· ' '·;· * ' .
a pod··. Jinošství . .pří sad, '· jež?.-mák ?bý t-:' vpraveno, do stěny .. jé:
.·»···* » ’ * .:,1. · .*·» '/.,. 1 v... .< · '(,;.?< j J t,j:
velmi . variabilní a., závisí n'a potřebách. . Při/ některých 1 .·. , ř ,·. ·;.· ... i k 1 ,£· t · 1' ύ , -' .. j': , « 1 . ' \ t ři; ;> -i ;; ý ff·'»·. ‘ . .· *..· « .aplikacích není použito ... vůbec žádné,; přísady,· ' v. jiných:.
i- ' 1’ « v J J L'y j·· . y : · f ..?t ý , j· -- -i , ' > · ť .-· , ί.·,/· .· i ’· '·. V i, případech se .. množství' Přísad může. ' přiblížit , až- ke 20, 7.. ' .' ; . .. ? '/.''/')..· . J /'.······· . i a ;
hmotnosti stěny.
Roztok /obsahu j ťc í jeden nebo více / transcy tózn i ch.,; zesi lovačů transkripce .../nebo . tránscýtózníčh' prostředků..· , podle předloženého· . vynálezu ..a.. přísadu,, -10-11/.... jaká, je, rozprášen, a rozptýlen jakoukoliv vhodnou metodou, jejíž výsledky v oddělených mikrosférách nebo mikrokapslích jsou qd 2 do 5 jj.m jak je zmíněno výše. Zde. používaný termín mikrokapěle, označuje duté částice, které obklopují prostor,, jehož vnitřek je vyplněn plynem- nebo: párou, ale ne žádnými pevnými ♦ ··, · ·-· ·
..*·- «··'. ··· • v · ./ · • ft 9 · · · .'·.« ,·· * .
. ·'♦· ·, ’ .
·-> » ··* «' .♦ · · Ί .
ř ».· ·-. ·' <>· ·: -v ' látkami. '·., .. : . .- .
Rozprašování .tvoři.' áeřóšol' 'ťránscý tózn í ho. prostředků- . nebo . 1 Přípravků. . zesilovače ’ ' transkripce .například ...vehnáním . ,př.í přáv-XuLpod^. 11 a kem ·. skrz .-.á 1'espóň·. j edén, otvor nebo... p.ouž'i t í'm odstředivého rozprašovače v/: kómořě s ' teplým ' vzduchem nebo1' .jiným inertním plynem. -Komora by měla být dostatečně-velká,..·· aby největší ejektované kapky nedopadly na stěny, před . vysušením. Plyn' nebo pára v komoře je vyčištěný' (ne j lépe .. sterilní a bez pyrogenu.) a . ne toxický,' když je podáván' do
.. krevního oběhu- v dávkách provázených podáváním, používaných ' mikrokapslí. Velikost · odpařování kapaliny. -z . přípravku 'by ? i měla býť dostatečně vysoká, aby. vytvoříía duté .mikrokapsle. ale ne tak . vyéoká, : 'aby . mikrokápsle ' praskaly.· Velikost ' odpařování může·' být · · kontrolována ·· pomocí ·, změny průtokové;.· rychlosti plynu,, koncentrací· transcytóžníhé prostředku nebo; zesilovače' transkripce v přípravku, druhem, kápálnéhó; nosiče/’ a přítokovou rychlostí . roztoku·.a·,, .'což je důležitější, 'tépl.btóú plynu, který, přijde do kontaktu š- '.'· aerosolem.. Napři klad albumin nebo albuminový fragment ve..vodě v koncentraci odj . 15 až 20 ií a přívod .plynu teplého,.nejméně, asi' 100 <’C,. raději...:, alespoň 110 °C je dostatečný pro zajištění dutého' prostorů a teplota 'může -být vysoká až 250 ‘-'C, -aniž bý . kapsle., prask ly, ' ' □kálo .180 až' 240 <’Ci lépe však ok lo 210 až -230 '<>Č á. ně.l jěpeů . teplota ok.lo -.220 ' <’C' je optimální .- ..Od té chví ieVteplota '.’· plynů·, který-se setkal s 'aerosolem,- ‘'bude-·.záviset: také' na . . rychlosti, jakou jé .aerosol dodáván auh.a kapalném obsahu přípravku, výstupní teplota může být- kontrolována tak, aby .. se v komoře zajistila, adekvátní teplota. Výstupní teplota je „yha.do.á. .ad. · 4.0. .až.. .1.5.0.'· ,.<’C.. i Kanťrol.a ;.-proůdó.vé.. rych-losíti-jé'.; x užitečná při kontrole jiných parametrů jako napři počtu
19• 4 . 4
4 * .
. ‘ »· ς · · 4 · 4 ·· • > y···,· 44* 4.4 . a-44'41 .Λ?.4-1 <'4 '«-4. ' r:' ',£7.44·,· λ·,4 . Λ ·ί
4'4'
4.\ .4 ,,! '4 4- ;
/Az ·ΛΛ*\
Λΐζ·.·ρ „ς.-ί,-ΛΪ,-Λ.' κ·:·ί <' ’.·.
lovače 'transkripce. F'ro, použití. y^ϊη^βΙΔΙΟΓον^ záíji žérií □částice, mohou, bý-t·'.’při praveny s ’ obvyklým' věhitu lem,k jákt)-'' celých dutých částic. ... ·, -.·.,· -v.·.·;· 5 · ?. >g;> i/.-,
Mikročástice ./mohou obsahovat ', přinejmenším 50; 7, výhodněji· :
7 nebo .80 ť,g a nejvýhodněji 90 ' X- hrnotn. tranšóy tózhí ho? · zesilovače. ' _ ....... ....... . .
mikročástice.
je laktózá nébo glukóza. Množství ,.f yziologicko-ák tivního činidla bude vybráno s ohledem na jeho . druh a. akti;vi tů, ..na ' způsob podání a na jiné faktory .známé odborníkům ? ze stavu., techniky. Pomocí příkladu; 'počet podahých - částic- může.', být takový,, aby. dodával 100 mg/den «--1 antítripsinu nebo .0, 1 mg •akťivníhp, činid 1 á ' např. .· běkíomětažohú. .ýpalěi ·.. možná fyziolpgicko-aktivní Činidla, která'gmohóu.· být podávána přes; mikročástice·' jsou' uvedena níže'. ' :. ..gg · ·....··;' 'Další., pokus' podlé tohoto .'.vynálezu ·. je . .společné·-spr.ějbvé ‘ sušení/ . ;· fyziblogicko-aktivního- .činidla s, ťránscytózním zeši 1 ováčénr transkripce, .· tak, . .) aby' usnadni 1 yi stabi1 ižá.ci aktivního .-Činidla. ./během, .vytváření’,, '··-plnění· .· ga,': :gČQ'ž'/ 'je. nejdůležitější',· během působení ' na .álýěolárhi výstelku'.’
V tomto prostředí může být intenzivní proteolytická aktivita. V tomto nebo jiném, pokusů aktivní činidlo může být kovalentně vázáno na trahscytózní prostředek přes štěpné vazby před sprejovým sušením.,,Jen to pokus představuje metodu přěhošLi· aktivního. . činidla z'e,/za řízenigáž g db 'krevního, oběhu : a eventuálně k :' cílům uvnitř těla. Vytváření částic o optimální .aerodynamické .vel i kosti '.znamená, že fyzikální” prostřéděk dodává aktivní činidlo na-místo absorpce. Jednou uložený, v alveolách molekulární prostředek, potom chrání a usnadňuje průchod do- krevního ,oběhu přes prostředníka GP60 transcý tužní ho' systému a již·; jednou ; v krevním oběhu může dále zvětšit cirkulační poločas -a dokonce zaměřit
... ,1 Λ *’·. \ *Γ> A. ' ', i '-·. .··'% · « -Ί V·. >'/ ·»'*’ ♦ ·' v; v »·.· ·. Γ<,-· -*.··,' · ' ·· • · · · -····..·’.* . · .«.··; ♦ · • · . ·.',.·· ^ · · · . . 4 .-···♦
·.·.·«./ » · · · · ·««*.· ···· • V·/ ’ · ···<’· ’· >'·,·♦' ·< · '· ··.* ·./ « · · · « «« 99 • 1' * i >< _t i, · iakií/itu >ČÍnidia- rtá i určitá’ místa, -u ihíčhž· bylo-;;zjištěho, že.
r-,'í-ir—ι ί-£ι i ň V ift-ař-rt i-í'4-/-t íA f~2C'jk Ti V} Í4»zA/4 τι A \ j a í-irn A · iar Hn n/T rSíri í^cá.. S cXřSi i ’
GPÓO. Vhodné.' Vazebné.· .těóbnq-lpgié·· jsou dále WCFfí-9317713- popisuje '/senzitivní
Obsahu j’í i receptor diskutovány.i výše, ešterá.zu-, yáz,éb ,kysel iny / .':pol.y.hy'di^o/xy lpýé./;Ýa.kO.ýá, •tec.Kripl-Qgié^ 'použitá 'při· idéri vatizaci- transcýtďžníhó.' prostředku ’ před', sprejovým / sušením umožňuje vytvoření kóvalénťníha': nosného systému pro dodávání. aktivních- činidel do systémových vaskulár. Toto využívá potenciál transcytóžních prostředků k tomu, aby pronikly'. do aiveóly a -.,ki . přenosu áktivních činidel nad dlouhotrvající.. periodu, zatímco chrání potenciálně- nestabilní . ucelené, jednotky . -: . γ, /i-//; ·,, ’. .--,//.,/
Ačkoliv f-yziol-ógicko-aktivn í činidlo ' použité, v před loženém vynálezu může být' vsáknuto -'dovnitř, nebo jinak ' spojeno s- mikročásticemi- pó·· jejich' ‘vytvoření-, je . přednostně sloučeno š /transcytózním prostředkem · nebo.' zesi lóv.ačem transkripce. Mikročástice mohou být -alespoň' zčásti / obaleny hýďrofobním nebo ve vodě nerozpustným materiálem, . nápř.'/ mastnou kyselinou, tak', aby zdržel rychlost rozpuštění á -a.bý chránil proti hydroskopick.ému růstu.
Metody a vybavení pro s-prejové sušení . a tvorbu'mikročástic např. pro použití v suchém prášném inhalátorovém zařízení jsou podrobněji popsány v · .W0-A-96'09814 . a v U.S.Patent Application No. 08/487, 420,' jejichž. obsahy.· jsou ,·uvedeny/ pomocí odkazů v tomto dokumentu. ·... . /
Optimální : '.proporce léku -k transcytóznímu . . zesilovač-i transkripce ' v přípravku pro pulmonální podávání může být stanoveno podle jakékoliv vhodríé metody. V prostředí in vitro, co nej lepší využití přípravku; způsobuje .použití epitělových-' monovrštev ·. primárhích. ; \-/lídských ' ,'hěbo’ imortalizovaných lidských epitelových buněk, vyrostlých jako vf·'< .. V,>··>·-, .i <·· ·. ’ ► »’>/·» í*-. ’·*♦,' · · '·:· -,*;·',^·.'·
-«.·»« ···’'-’/ ‘ « .··«*>.·-'· ····.·,/ ·’,:·,;
’.ϊ /( i
- -21 r\ý .·ίΧ» ” ,^ί- ·ί; , monovrstvy. na pórovitých filtrech tak,; .ják.-'to; popsáno/;'/ :'v příkladech níže.··.' Kombinace- ié.ku a- ' zesilovače 'tráoskri-.péeýy ,, . potom můžou být aplikovány do vyšší komáry. transWeí o.véhó/; / · proudového ,, systému, / jak, . je .. také popsánoý ní že. Průtokové .?/ý rychlosti léku nebo ' genu k' dolní yrštvě fjšéu stanoveny,’/ · použitím buď označkované. stopovací'· látky· nebo imunologické.;.··,; zkoušky. Optimální .přípravek ' .je definován -jako jediná ; ; průkazná maximální rychlost á stupeň průchodu ' napříč .’ . omezující monovrstvou.
Alternativní způsob co nej lepšího využití přípravku' vyžaduje ;' provedení ,stanovení. průchodu /lékii, -'který je. předmě/temf.-/ zkoumání, z plic do krve v prostředí in vivo.- Existuji dobře; : popsané studie :krysy, vepře, a ovce (Patton et al, Journal of. · Contralled ;.Řélease . 28:79 (19.94),·' Folkěssón ýét.. alAčtá.','Physiol.. Sčand. 147':'73 (Γ993), .-.Sch'reier et. ;ál., ;'Pharm',. pesi..·1 i: 1056 (1994).) , tyto studie ., popisu j í . metody/v.kapáváhí/.rtebo ; aerosolóvání' léčivého přípravku-db.průdušní-de-·/;á. průdušinek··'/ a posuzování objevení sě léku' v. krvi 'pomocí..'· '' imunologické . zkoušky nebo fármakologieké aktivity. CO'nej lepší využití by mohla způsobit série zvířecích preparátů'užívaných'od.1išnými proporcemi léku'· a používáním zesilovače transkripce, optimální'přípravek by bý1-definován- nejvýhodnější plochou · Půd křivkou, '. která' vyrovnává .žádaný,'. , fařmakologický diagram . pro lék. Například od lék může být jednoduše požadováno, aby; prokázal' maximální, biologi-c-kóu /dostupnost., nebo alternativně. :. aby prokázal protrahovanou nebo trvalou uvolněnou křivku.
Pro každý případ je pravděpodobné, že. se budou lišit . požadavky pro., hladinu žési1ovače -transkripce Zač l eněného do přípravku. /Pro /'léky· vyžadující 'maximálnťdostupnosť bude· žádoucí, aby používaly maximální hladinu zesilovače 11 .#·* <.U·. ·· · '
Γ*. 5 -.ίΙ'-τ’ΛΪ*.
• a..
ς>7' *·· >44 '••χ· ., ..,,.-,-4-4--. »» , · ·, »·;'.· * · 4 *'... 5; 4 · 4- · 4 ·.' 4 ' « ; 4 : · *4u
I*-.'' ··*./'.'» /4.4444 4.-- 444.4'., 4 , .4.·.·. 4
44·*; ;·4 · ·.
·’, ’,·· .4*4 ‘ 4
4ft;/·.*.44·,.
ί!:;/'
7.
Γ\ •·£;ϊ transkripce. a/nebo zesilo.ýač-. hejvyšší aktivační .efekt na-' '.
; :t rané k(ř-i p c e - p ř o k a z u j í C í recept□ ru ': GF:60i. Pro. 1 éký vyžadující: delší dobu,' , podání (ha přič -, plícemi, by ,bylo /ž-ádpuCďv/ja^ < dolní yhiadihy.^ -.Zesi'lovače..· třanskc.ýpče' ;
a/nebo zesilovače transkripce, ; ‘v'kteřě prtíkázdjjrf’· dolní aktivační potenciál na transcytůzriím rěceptoru GP60.·· ( ·
Sí la“ -..zesi lovače transkripce' nebo . transcy.iózn í ho. prostředku . může být definována mírou, kterou : transcytózní prostředek' dané .-stopovací látky může být, zvětšen, přítomností, ligandové. receptorové .vazby GF60·, proti látkové nebo· mimetické,’. nad.
- hlád.iriů''transcytóžn-ihó prostředku'; .za nepřítomnosti.·.ligagdy..
(Sí la . zesilovací ho činidla'., může být.' také -.trochu . záyišlána 'léku'. ( . Zvýšení, . absorpce ' signální ho -.znaku ' se . ' může- (.'lišit;',' v závislosti' na (' druhu . signální hór ··. znaku .·;;.«·'( transcy tózn ího zesilovače transkripce.. V tabulce ní že 'je -.přehled signálních · zriakůi zesilovačů transkripce,- '. buněčného/systému ; a',( stupně zvýšení' nad., kontrolu dosažené·, -při -různých ; signálu i c h( 'znacích/ buněčných 'systémů a pokusném typu. .Používané zkratky.;- . . .
'
12SJ.--IgG HSA BSA ‘
FI-TC-Insulin GP60 Ab T3118 jódem· značený hovězí albumin .
}2s jódem značený imunoglóbu-1 in G lidský albumin ' ' /-,.. / .
hovězí albumin' ' / '·: i fluoresceinem značený inzulín ahti-GPóú polýklonální protilátka /-.
syntetický peptiď· odvozený ' z N-termináln ich'· 13 .zbytků GF60
f ·'·'· ·Α,'.·.· ¢.
fr */·| ϊΐ, -
· ·> «ί. -·* ··“’ ,- ♦'•Π * · > «Η ·.?.
'signální .... znak . ' '' ' e ·.’ zesilovač//·· transkripce / buněčný :týp · .; ; ·' .násobek zvětšení
GP60 Ab. . hovězí/ěndotelov.ý.·/ · .. •/průtok,’’/ '·.'-?../..·,?./9./ ? v// 1 ,'fe .· i1.’·•’ν- ϊΆ
kŽE I-BSA. . GP60 Ab , hovězí/endotelový/ • průtok · CY J-.U : Λ- ' ·'
anti^BSA iRsi-igG. . BSA . hovězí/endotelový/ ' průtok ' • 1,5. -99-:
FITC~ inzulín HSA' /' lidšký/ěnddtelPVý//.·''.·průtok . . ý 9··'.' ./'-2,5/
FÍTC- inzulín DSA ''. . · ? krysí/endotelový/ - / průtok'.· '' ·-; · ,· - .·- '9-4.'/'./,
iRE-I-BSA·.-: BSA/T3118 hověz í,/endotel ová/ 9 : absorpce /..9.9 9'·'
-Fy ž i ρ 1 ogic ko-'a.k ti νηϊπκ .čin i d lem,- ij sou·: zmíněný' I'ěkyi9.k téré: zahrnuj í. molekuly kyseliny, nukleindvé/':/a.; léčivé ..peptidy a proteiny. Fyziologičko-ák-tivni ' /čini.ďlb“j/ '0' j.ě// //zde.’ v dokumentu zaměnitelně používáno·.-‘s. · lékem'.”·, ./'-aktivním”·, aktivním- činidlem” a terapeutickým . ..Uéky, .ktepě/by. .měly.
pros.pěch rychlejších transcytů:
napříč endotelem a épitelem, .. zahrnují 'luteinizační.?'- -.hormon./1 íLH),/ chorogonadotropin, siňové peptidy inteřf erón, r.ůžhé' limf.okiny' jako např.. '. inter leukiny/.(.-Iii.,Ι ΙΊ ‘ IV, //V, VI a' VII) '.a · faktory stimi lu jící, kolonie. ' i' ' .; '9 . - // 9/9'·. Další vhodné léky pro použití podle předloženého vynálezu zahrnují: hormon uvolňující růstový faktor, faktor uvolňující kortikotropin, hormon, uvolňující - luteinizační hormon .(LnRH), sómatqstátin, ; kalcitóňin,· - hdrmd.h/uvol ňů„iící tyreotropin, peptid příbuzný kalcitóninovému, genu (CGRP),
V ,£/·*'· ·ίίΐ·, ’,ζ'. /.2αΪ·*'5*£· ·· • . ·Λ. .’’ ?·’ .-’ /*·:·· V : '«
- ' ’·, Υ'·- '.···.·'· ··
Υ?ύί'.·Υ,Μ.;'>ς -·. · » ’· “'*Α· ' 4··'1··. '··,··.*)', * » ' '· '· '· .· · ·''· ·· · *····'· ♦··’; J
R ·:· ·· .·' ' : .·-'* · ·· ? . .. · · ' · - -Ύ ♦'.·> ' e ,· ·' '« ·'*', . 5< Λ» “+ ''’ k :jΥ.>.
.γ-ΐϊ^ύ γ.'·'• Λ Λ4 . · 7’ j
YY proteiny .· jako , např. hydro lázy, izómérázy·, enzymy ;záhrhQjíci· ťransferázy·.,,' '· prótéázy, Íí'gážy,·· . oxidoréduktážý, ,< .ésteřážý a fosfá.tázý, a- rážné'·- růqtoýé a néurotropqif aktořý
TYJakoj' j např. · sómatůmed-iny :epidermální . růstové Yýáfcťoryv ,..=. ;.v··';··''·;.··. '!;·'''·/··' '·' / ' /' · -w ·.?/··:’·*·'-· i.: Τ' 6·? Ž<>·Y 'j7 ·.'.· '···'<'.?· ; · ' y · <a·/·'..7·.7·?'·.;
.:ugastroný nervový růstoýý'-f aktor' (NGF) ^''cxTiárrtť' néurótřqprí í''. ''faktor'. (CNTF), ·'* odvozený mozkový neurót ropní. ' faktor ( BDNFjj .
. .. odvozený' gliový neurotropní faktor.·: - (GDNF)·,'· epidermálni ....
růstový .faktor (EGF), fibrobíastový- růstový faktor (FGF), , ý.inzul inu, podobný růstový, faktor, . nádorový . nekrózní faktor.\ .
, (TNF j a- ; transformuj ící růstový' faktoř . (TGF.) „.Další. léky.'.-i·· ,Ž zahrnu jí-.endogenní ; .qpiqidt· agonisty:. jafccr např.. encěfaliny , a endorfiny, hormony'hypotalamu- jako např.·· gonadolibeřin, melonol.íberin·,', somatostatin, tyreóliberih, , a .neuroténsTn',. ’ ádenohypofyzáiřiΪ. hormony jako .
kóřtikoťr.ópin, . lipotropin,, melanotropin, 'lutřopin., ty reoťropih ,·, prolaktin a. somatqťropin, neurohypofyzáln í hormony,.-... kalcitrapní . (tyreálni ·)... ..hormony jako · paraty,rin. · á kalči.tonin, tymické faktory jako týmozih, tymópoietin cirkulující tymický faktor a tymický humorální faktor, pankreatické hormony, jako inzulín, glukagón a somatostatin, trávicí hormony jako gastrin,' eholecystokinin, sekrétin, gastrioké inhibiční .polypeptidy,. ,vázointestinální peptid- á· motilin, ovářiálhí ' horminy · '.jako relaxin,· '· yážoák.ťiyn.í ’i tkáňové hóřmony. jako angiotenzín a bradykinin a. umělé'nebó .'j. nepravé peptidy. jako def eróxamin’ a LHRH analogy jako . buserelini .deslorelin, gonadarelin goserélin, histrelin',' leuprolelin, nafarelin nebo triptorelin.
vynález obecně popsán, bude snazší pochopit které- ' jsou. uvedeny pra. .iluS.tr.áci » ..
melánóstatin, •substanci P
Tím, 2e byl následujíc í.
Příklady, nejsou zamýšleny jako vyčerpávající,
5‘.
,Λ*· '· ♦· · · ·' * · · « *
Λ ‘ · · · .* ' ,-,,'252
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: ‘ .;. . '2-.2 ··'’·
Rášt endoteiových a epitelových mdfiovrstev . : '
Hovězí pulmonáíni .mikrocévni endotelové 'buňky., (BPMVEC) a (BRAEC) hovězí pulmonální, tepenné endotelové buňky, byly, ' izolovány a kultivovány podle popsaných, metod <Del-VěccHio
et, al, Γη Vitro. Cell; Dev'. , Bídl ;, 2SA: 71.1-^715 (19921 i.;; Endotelové buňky byly běžně kultivovány- š DMEM -dbsahujídím 20 . 2 FBS„. 2 Pro izolaci plazmátickýth membrán ' .· endoteiových:. buněk byly kultivovány ve -válcové nádobě.'o; 850 cm5.lůd každé/ válcové nádoby „.bylo. přidáno zavedena směs vzdušného COs válcové ínkubátorové' nádoby rostly 10 až 12 dní.
Primární krysí alveplární izo-l.ovány metodami popsaný •75 ro-1 kultivačního média·./byla i Buňky, patent - byly. přeneseny der . při. 37<’C a byly ponechány, aby' epitelové buňky/’, (ÁEC) byly . v (lhal ' et .áív/2.Am. J. -Ehýš-iol. 257:C528-C536 (1989). Buňky byly kultivovány' každý 2. 'nebol 4. den v .DMEM obsahujícím. 102 FBS, v tomto čase.prokázaly typ II nebo typ I samostatně buňkám podobný -fenotyp.''FenótyPl'' byl,' přezkoušen, metodami . popsanými ' v. Uhal- et áÍ,--;Am.-2'Jý . Physiol... SuppI . 261 :110-117 (1991>. · ./-ýd/ýi/ll/l,
Endotelavá -buněčná membránová izoi ace i = · .,- . ' 1, :
Endotelové buňky vypěstované ve válcových nádobách; byly -2x promyty fyziologickým roztokem tlumeným fosfátem. Buňky bylý', seškrábnuty z válcových nádob a suspendovány y pufrú A (20 mM HEPES/Tris, 0, 15 M NaCl, 0,1 mM PMSF při . pH 7, 41 á. 2;·: •promyty centrifugací při 700 xg za 10 minut. Buňky získané.
•;,v?«··..-ť »♦··.
0 .· · 0
t.*a . '· < •’ίΛ.. , / ' 0 0)0 ·” ?i / ·- .·'/. e v · 0 * 0 · · · · ,
0'0 0 0‘ · ' '*'····· .· ,·0 77 0-. '<·»·'. Λ; : 0' 0ýř 0.: 9' . .<· ·- ,-.··· λ u Si.
V·'-' l f' ·«· ‘ V? r ' z :
... 7·. */ .
Λ· <0 '.· / í •V .. ·:ϊ*· ·' ·'!
? * '-* ti ♦ “ ζ;. ·6: - až. Β /. 1 νά 1 C o v ýt h. 'nádob ; byl ý / suspendovány /'· Ά ;: á //homogenižováfii' zá .roližiťí/ppl:ýtranového . v 75 .ml/pufru homo.géhizátořu ý po 1 minutu při plné rychlosti j . .Hórnogériát byl ' céntri.f ugován i/'.-;p'ř-i,./;3000.Λ:..x'gj ./pój;/dobu .7-...-10,/, minut,;.//;éupét/rtatartt/..byi/^sěbrtán,-; '////// .-// 7 ,./.// '/zl.,·.7;--/// /7/7.7///:--:/.-./.-//../ -// ?a'· cen tri,f ugován ' při 40 000' >:g po 7dObu ; 60 minut. ' Získaná '' , ./pěietka· byla- poté suspendována v,.-, / pufru A / a’·,. znovu , cen tři fugo vána při 40 000 .xg. za./. 60 . minut. . .Roslední membránová, 'pe.letka byla suspendována v malém ob jemu-.'puf ru .-/ A/obsahu jí c ím . '0,2 mM EDTA' -a/byla' stanovena, proteinová ,77 ’ koncentrace . (Lowry. eť . ai, 3.Biol. Chem. 193:265-27.5 / ///'(i951-)i ..... Byly zjištěný ..'/plazmáťic.ké, -.. 'membránové ..signálně ,;,.'///· značené enzymatické aktivity -a vzorek byl úložen do —70 !'-’C až do; další ho pbužití. 7 / , .77 · . Lřgabdoký I přenos .·
Éndo-telové buněčné membrány bylý 'přéinkúboy.ány š í'mM PSMF :a--0,5' mM EDTA' na 20 minut při- , 22 °C a.potom rozpuštěny . smícháním 5 1,5 obj. rozpustného
SEiS, '2 Z fi-mérkaptoetanolu,
- bromofenolové modři pH 6,Éi)„ .Směs ha .30| minut. -Rozpuštěné proteiny.
pufru <9 M-. močoviny, ’2 0,1 , M Trisu, · 0-,02 /. byla inkuboyáná při 22 °C byly odděleny za pomoci
SDS-PAGE (Laemmli, Nátuře .(london) 227:630-665 <1970)) za //Ipbužití gólové, destičky//elekťroforézního systému ., š/'3,.%.
. ' akry-iamidu- ý navrstveném gelu a .10 X akřylamidu •v samostatném gelu. Po'elěktřóforéze bylý proteiny'přenesehy , ' buď -do PVDF nebo nitročelulózové membrány. .Přenos' byl .prováděn 2 hodiny při 150 Voltech za použití .25 mM Trisu,
192 . mM glycinu a 20 · metanolu jako přenosového pufru.·
,./Nespecifická, vazba· byla blokována pomočí inkubač ní membrány / š 5 mM CaCl2 v TES (20 mM Tris, 0,5 M NaCl při pH 7,5·)' po • '27''-':'
-·♦«· · • · ·· * > ,· * v · · · - .
.•'i· · •i, TBS přes noc. Po' dobu TO/ minut a. pak š Oj 5 ,7., Tweěnu . 20 v ťóňto kroku byla membrána. . p.rdmyta a' rozří znutá / ná dva· proužky. Jeden proužek byl irikubován .dvě hodiny s.0,6' mg/ml·; yDinóppý.-Olobulinu .· BSA . v , TBS obsahuj ícím. ; 1 ,'5. 7. želatiny a: druhý’ proužek byl irikubóvári:/ bé z •'BSA'.; Proužků./bylý. :Ptomyty anťi-hověz í m BSA po dobu /60' minut.’ v TBS 7. želatiny. Poté byly membrány' 2i promyty/ druhou , protilátkou (kozí !gG proti králičí:/·
IgG'·)' kon jugovánou s. ' alkalickou ' fosf atázou. .'Proteinově pruhy'·· ' bylý,., lokalizovány po přidání 5 -bromo. — 4/. -chl oro· p3~ / indoly, fosfátu 'a hitkomodré tetraZo '1 iové .'soli'·.'.
a inkubovány sobsahujícím 1,5 a inkubovány. s .Proteinově diátění ''' ·· ,. ·, „ ./ ...
.•BPMVĚC· <. membrány byly požity k izolován í 57·' kĎa/vazebného' áí bum.inového proteinu. Ligandový přenos byl ’ proveden /odhadem- ;·. přítomnosti' tohoto proteinů, na- každém·.. ./štupni/' .BPMV-EOj· membrány (100 mg) byly -předem inkubovány >s;l·:.·.·; dÍM PMSF-a 0,5' mM EĎTA na / 30 minut při .22 '^C.. Membrány'býl-y'-.rozpuštěny za použití konečné koncentrace 2,5 % ' c holá tu sodného’ a/4
M močoviny ve 4 <>C po dobu 3 hodin, při j emném mí c hán i .· 'Během// rozpouštění' byla upravena proteinová koncentrace', '. ha/-/4)/ mg/ml. Po této' úpravě byl.a' suspenze cen tri f ugována .. při TOP '_ 000 x.g;. po dobu 60 minut'.· Supeynatan t. byl sebrán á dialyzpván/ za- pomoci 5 mM·'HEPES/Tris ( pH 7,-2). Z .· tohoto: supěřriá.táň.ťu/ bylo získáno více než- 80% membránových-.'proteinů. '.Dia-ly zován.á/· suspenze byla z koncentrován a pomocí vysrážení· 60% - etanólemj/ při -4 °C. Etanolová sraženina byla sebrána cen trif ugací'.při 10 000 xg za 30 minut ve 4 °C a suspendována v .pufru’ Α.' Táto/.
S I . 4— V. 4 i U. I I l_S kj J Λ Ci l l_í J_ |“ l_13 1_ l_ I lí ' / TH ΊτηΠ’ i' V x 1ΛΛ . m^iaé 'rS ni/™ •L1 v/n’·*. 7 iJ · :Jtt ii X·, S—i—í i i_i , /\ . j. j i__) ·» i.ui_··. . » i_ ...
<lC při jemném míchání. Suspenze byla Centrifugována 'při
Λ ν’?Λ' ·-’’· ’··» · · · · „ „ , - · . .' ··· · · . · ·.· · ?;<· /· ·;.·/·. f · ' <$-··*· ··· ’ * · • · ·*^ 4· « 4 4··, ·.'
·. · ··’ Λ .» './ ,.'Λ?'
- ,Á'/· ý£ ' ·· * ' ·’ :
' · ί * 1 * ů ' / ' \< “ .20//7¾ :' n/ / ''·/ί'///:·/'/. /:.?-'/ '. ///';·Τ’77.:
.'' 1 i '•^.^ z .· ,·Χ' X /¾1..¾ >'/*', -'/7/-7,--- \·. /-” -7 ·, ' ~/ /// .'.‘//i'- >’ '''
.... ' * ' : -:-/ ?;. ·.«·<' •'-..'/i-C y »· ·· .,--..--7/- --,:
'. ;100<ΟΘρ,;κ£·-za 60 minut./Supěřnátant^byl-^sebifán. a/dia.lýz.aván-/ --pofriqcí '4/Γ /50 ,mlj /'Tris/'/ÍCÍ// 0/2 mH -EÉtTÁ j/Ο/ίΐίίί ;Trí tonu X-lOÓ? ,.-.-a ·: 0, ΐ- . mM PMSF,.; pH 8(0,/( pitf r. B) . / DiaiýzqVáný' ,ex tr á k ť ; byI. .;,jnánéšeri,7, .^n.a^kqióipú/j:^ cm). . Tato, kolona by la·, '',pčěd’t'í^ Bf Pb'použití' vzorku/
-.byla kolona promyta 50 ml pufru B. ,· Vazebné proteiny:by ly:
'.eluovány z kolony. pomocí 8Q mi 0. až ? 500 mM. lineárního NaCl /..gradientu. -v pufru 'Bj při průtokové 'rychlosti Í5 ml/hod. ' /-:F.řákc'e..... ž- / jednotlivých . -vrcholů, by ly : oddělené shromážděny -‘a;:-z;k:once.ntrovány yysrážením pomocí- - ·-50Ζ/acétonůi Acetonová';
.sřáženiňá (byla .použita ' pro; 1igandový, .;.přěno.s.; PoUze ,vrchol :1/prokázal vazebnou' albuminovou ' aktivi tu. Proteiny přítomně· .ve vrcholu 1 byly dálé; separovány za/.použití prepárátivní
- Sp.SřPÁGÉ- ( tfí. x 16, cm,- 3 ;mm- silná ..geldyá destička) anpr.o.
dál Ší ; pqzórdván í ’ by ló použ i to . proteinů.' 57 ' kOá- .eluov.ahéhó'. z i:gelů. /·.' '...-? ' ' '.··· ·' ./-.' l/ýrobá/a čištění protilátky ' kBá vazebného ,a-l buminovéh.o proteinu eluovaného z ./preparativní- -SDS-PAGE bylo použi to (K .. imunizaci králíků.
Přibližně 50 ýg proteinu (na králíka) bylo intramůskuí.árně : i-η jek tqváfio .'po, smíchání, se -stejným objemem úplného Freundova •ádjuyánsu. Druhá injekce 'bylá podána' po dvou. týdnech. Z
/.Křál.ici'/ býli vykrváceni' od 4 do- 6 týdnů po druhé injekci ;,á- by la'/Zkontrolována imunitní odpověď. Prěimunní .. sérum IgG , a ántisérum IgG byly vyčištěni' za použití proteinové kolony A-Šepharožy.
-.Tměni trii/ přenos Endotělově buněčné membrány byly.' vystaveny SDS-PÁGÉ • «44* /»/···.
ι« «ί* -· 4·' » 4' ···/
4 4 4. ·' . · 4 4 » *4 4 4 4 i ·Λ ' i .
ť ··>,·/ · '· *? 9 ?
t ·>. Λ
I. ,κ.-·. . . ' V 7 i í Ý „ 1 1 přeneseny, na (kaemml-i,./ isuprá) a elektroforézně 'bylýnftroceluióžu nebo membránu- PVDF.· Nespecifická ýazbá.býiázablokováhajpomocí. . 3 7. želatiny v TES -pq; dobu . 5 ... ' hodin ' při
22'//.Gi .t/Měíribřáná : by.la ;-2x /promy.ta 0Í5Í.Z' T.weéri-tZO-· v TEŠ:
/-.- + ; ' . /V:/-/-V ,, .a ; inkubbvária se zeslabeným antisérem.'v/T.BŠ:' obsahujíc ím Γ. 7,želatiny'. Inkubace byla. prováděna, po dobu-4'.áž *6.'-'hodin ,.'2·;·:/...., promyta á pák inkubována 60 minut s druhou protilátkou (kozí·/;.;. IgG proti králičí IgG spojená s alkalickou f.qsfatázou);./..P.ol ·/ inkubaci . . by l.y .. membrány . 2x promyty a . byly lokalizovány// průtéinóyé/vá.zby jak je./ /popsáno v části .-''tigaridóvý.Jgřenqs/zli' Molekulární, „hmotnost i v- -proteinů tqiy - stanoveriý za (použiti . /. známých signálně značených proteinů. , ť . v /'' J'///
-Sťúdie vazebné. róonóuTstvy
BPMVEC byly' naočkovány' -.(3 x 10.5 jamkových korňíngpvých'··· tkáňovýchbuněk/jamka)v 'Šesti;/' ku 1-t iváČ n i ch'7'-pa 1 eťác h;/
2;; ' .promy ty r á inkubováriy 7 ve -tkáňovému jed n q vr s t e vři é 7/ a .kultivovány' do. shluků-. Monovrstyy /.byly; bezsérovým médiem (20 mM .. HEPÉ/DMEM pH 7,4) s . bezsérovým médiem po dobu 15-20 hodin kultivačním inkubátoru, F'o této inkubaci porosty byly 2x promyty vazebným pufrem (20. mM 'HEPĚS/T.ris.' HBSS pH;'7,4i, přidáním 1-ml -1 jjM íse iuBSA db · .vazebného; puf rul bylo. iniciováno navázání. Inkubace-' byla' provedená- vé'/';4 ,ýG/po/;/ dobu 60 minut. Navázání -bylo ukončeno ; tro j ím/· prqmy tí'ín(// monovřstvy vazebným../Pufřem. 'Po lýzoVánít buněk' s(. /17N:-NaDAi byla Stanovena radioaktivita- spojovaná (Tiruppathi et al, Am.J.Physiol. (Lung.. Cell?
L595-L601 (1992)).· Nespecifické navázán i inklůzí neoznačeného BSA (40 mg/ml) během vazebné hrocedury/. Testované komponenty, preimúnní sérum IgG a anti- .57 š mořiovrst vou
Mol. Physiol.) bylo- /stahového.;·· • 4':'£ , : / -
Λ - · '•„rt, .-fi. .1·* · · / .';
vf'*·;, * ·-'·»·.?
.’·':':·/5 .’>·'····· *· *· ··♦· « .· ,·.
,./:·♦»* ·/'..··,v·,/ ···.' ; ·’· j;;r? ./ t ..
-«.· v- f ·', ··-«· • ·. ·'♦.'.· ΥΎ/// ·’ ·' · ··' <·'1' ' • « · » ·;
• / / // Λ'' /;-/'/ // / / -/)//- ) / 3ú -'-/.,>)/ 3-Yi////)·.?: ·' ' ·'/-'.j 1 / //' ).-/1//3./ - - · · - ·.·':'-·' , /·/-< ///·
i* z’ *'· ·' : ’?’ ž*· ’-ι· · '’· ’ ·/; · ''· -.- 7..,--, . .jt;../-' /· ’»·>’ / ///··'/?//< -’·. · '·'-·
//-v// //.//// ·/· '· '-·/ '--'--/r--///- v
•) : k Ba- IgG by l y p řed e.m. · i n k u bóváný ·.,-. .ppý- dqbu. 1 30 minůt pomocí'' ) )/.·
monovr-stvy.před ’ přidán ím) 125;'I-BSA.
.-Trari^buriěčríépr&Lc/kp^épokuE-y·' //,//')/ ' ) ) · · .'//'')//
/'.’£? ,'V X ·*.*'>?%'νίΫΛ*' 5 ?’’ λ' c v
, ·ΤΓΗη5έΗάο^:βϊογέ’ / . <.‘i2^'I^aŤ.bLifn',i,nové · průtokové. /’ rychlosti 'i ')'·':''··.
v kultivovaných: ' éndote:lovýeb), monovrstvách ' byly použitý. ,‘ke-· 1/, .-staovení tradsendotelayého ., aibuminového přenosu. Systém
.. . - použitý . pro-- tuto studii' bý.l předtím popsán' CĎbpéř et a1,- .3/
,.,;/-.../ Appí _.·, /'Physiq-1.,)62: 10.76-1083 1987) , Garcia et al., - j. Gel 1.' ) , :
.... PhýsiOÍ. 128;,96-104 ( 1986) , Del) Vecchio et al, .Vitřo, Cell.
·// /.- //Ďéý'..l Bi.bi:/'28A':.7-Í 1-715' (1-992)),. a - S.i-f l i-ngeř /.'.Biřnboiřn et/al ,/ '/) ' /,)))// J./' Cell. / , Phýšiol. . )132:11.1-117 (1987))1 .'Systém·' měří '
·. transendotelový ·.) pohýb. .. označených makromolekul za ' . · . / nepřítomnosti·/ hydrostatických.' a - ?oncotic , tlakových /'-)./ gradientů. Tyto makromolekuly se. skládají z luminaldvých á. áibuminóvých/ / úseků separovaných' 7 polyúhliči.tanovým./ /1 , '/.): -pikřop.orézním filtrem. <0,8 ,pm průměr· póru),·. BPMVEC -bylý náoČkóVáný·')''105 bufikami/f i'l tr a- pěstovány 3' až 4 dny, aby dosáhly -shluku. Oba dva úseky obsahovaly stejné médium <20 ,·,..... mři.. .HEP..ÉS-DMEM,./ pH 7,4) a případně objemy 600 ml. a 25 ml. Lumináiový· úsek byl opatřen vnějším prstencem Sty rofóam’’
·.,//,.-; prstencem . ,)a . *·':' spuštěn do . al buminového, 'média ták.,) aby-· ' . ' pohyblivé ) hladiny zůstaly. ) stejné ·'.' po opakovaném -odebírání. , ./ ,)..) Vzorků'?’ z ' ál buminového úseku, Al buminový - úsek byl. stále ' míchán á celý systém by 1 udržován při teplotě /37 9C pomocí-' ·.. ..·/ termostaticky. . regulované vodní lázně. Transendotelová' * »
-. .clearance albuminu 12!;I byla stanovena jako objem luminalové komorové' radioaktivity vyčištěné v;.alb'uminové komoře. Změna Objemu·po určitém čase zajistila rychlost clereanče albuminů 125 x y jjl/min, jak bylo stanoveno podle zatížení -nejménších i?
./
·» Τ , * », ♦ · · *' · · • · * .*, ♦ é*·,, «
-',31 . 'X*·. '.'Z/·'// 7, ploch nelineární / regresivní analýzou . (BřlDP íSťatiéťíčál/ Software, ..Bérkeley’, CA).' ·.'' k .'; '/i : -’'··'/'./i /
Na začátku· pokusu byl lůminálový úsek '-·· přenesen.:/«-do/ .ά1ό.μφίηονόΗο·,'-’π»^0ϊβ.··’·.β nasycen . médiem ·· obsaKu/ícíM' -ási' ' 6 iiCi /m ίa.l b'uminu i/5'j .'. a j bům'ihoVé’ ' .'vžořk:ý- ;-40b/iřll/bý ťý'·.st)í-řáfiy i v děsetiminutových intervalech po doba 60 minut;,a .,zaí použi tí,.' počítače gama Částic. . byla měřena radioaktivita.· Na konči·’ pokusu byl ·' stanoven volný .albumin, Í2SÍ. v /luminálových··· a al buminových úseč ích · za použití vysrážení., 122 TCA'-á ' pro;'· (volný al búfliin, i2--1 byly korigovány transendotělové -průtokové·':
rychlosti albuminu 12- I. (,'/ ' , ; /·.'/'//, :/-/-://’;J///
Den před tímto'pokusem byly monovrstvy BPNVEG 2x ;př,b(ny’tý.(.'2€>,;: .ml*l HEPES-DMEij pH 7,4. (bezsérovým médiem) . a/inkúbov.áhy ,-při 37 I?C v; buněčném ’ kultivačním·., inkubátoru s'' béžséřpyým /médiem ·. po. dobu 12 -až/ 15 '.hodin. .Po této inkubáčn í. ./době/bý-í y/testované. ..komponenty (preimůnní sérum ^/196.//^/:4(1^1/- /57/ kDA-.IgG) . zředěny- v bezsérovém ' : médiu.; //á’· ;yinkúbován/; s monovrstvami požadované doby. Ty to-.mónovrstvyk/býlý/pbté v, použity pro transendotelové měření aibuminovéhb/přenoéu. Transe.pitelové průtokové rychlosti byly měřeny' s'.nepatrnou·1·' modifikací metody popsané' pro endotelově' buňky. Průtokově . rychlostí byly stanoveny na primárním AEC. nebo A5'49> lidské, plicní' karcinomové buněčné linii ;·, .kul tivované:i. ják//-jě( popsáno.v Transwell filter.s (Costař) (Evans-ef al,. ' Exper 1 ;· Ce.ll· Res. 184:375-387 (1989,)). Neporušenost ./monóvy.stev; je.;:
definována transepitelovým elektrickým', odporem,;.. :k teřý '-jé/ větší než 500 ohmů/cm2. Filtry s neporušenými monovrstvami byly' umístěny do kultivačních desek se 24. . jamkami;. které' nHc n. hm/n 1 η ί' 7 i T“itvfC M n -> . Ί -! -< m L’· 1' V ί'>νί· 4 '«4 »ι-ίί·ι 5'
X 1 »i 4. UČ7*.Z>CIUVC!IU J_M IUI I NCl ; 1. ' J CUIIRU *- 1 dl L-F\_Ull XI.IUV UU komoru). Luminálová komora byla naplněna 2Ů0 jj'1 bezsérověho';
·' \. · '·'- ·«*.· .*s ·.·!····;».<--»· .·*' ·'*> i···.
·' 4 . 4' ' 4 ' 4-44-- 4 .· 4 44' ' 'u » : ·'.·· ·,. *..·····’ 4 ·.· » ·'. . '* . λ4.. > y ·' :· ··., '.· 4 · 1 ·.· ·· *
4 4 4 4 4.·..’. ’ t-f 4 4 . . '.. ·*· .··*· /·. :·< ·>· ··;
: *> -v;:··/·· * . J*' . X · · · ?
' -'i v, · λ/’- ·'*' .
ž*.>' ·'·? M<; ‘pM’ĚM-,9; který ábsáhtíVáij '-· V hodnou· ož rťáčenbu; .·' molekulu; íiňzui.í-π.. Y
PITČ) .-. Pohyblivě bíádihý ve dvou úsečí cli? byly'·totožné,' 'které /é li minová í ý. hýďřastaťic lýk.’tlak.9 Fi l trovaný; sy s tém ..byl /předeni .;
'Linkdboýáh;.'/:-/:30:.minut i-jáýpbtom.9 udržován..; při. -.;. - teplotě/3ýY?(CY'9, '-/-/9--39999: 9 . / ··';· £'. / ??99?.?9?:/9.ý ' 9-99 - · / ·9·-??/59 .. ? 9...:,../-/ v'·; inkubátoru'. CDs/.běhe.^přŮ.ťókovéhó - 'pbkúáu.ř V i první-Fá’'druhou hodinu' bylo odebráno 300. jrl . vzorků :z albuminové komory' . a .okamžitě ..· nahrazeno bezsérovým YDMEM. Na. .. plochém: deskovém měřidle . byla zaznamenána fluorescence ; transcy.tózóvahého materiálu. a / pomocí gelově -filtrační chromatografie · al.búmlhových vzor ků , by l . stápóvén'? poměr vazby ;'k volnému :FITC.·' ; nistřitiučé akt irióyé'ho. ui ákna' .••'Ďis-tribuGe 'aktinového -vlákna r. měny buněčné kostry.
Iňc.. , Warrington , · PA),, (Sigma). 9 .a. .zabarveny.
v endotelových/ monovrstvách.vypěstovaných na filtrech by.ly -.
-pozorovány za stejných podmínek jaké byly ůžlty pro- měřeni' . rýchíostí clearánce ' albuminu - ý2--.IPo: ' požadované předběžné -úpraVné. periodě s -testovanými : komponenty; byly monovrstvy na
- filtrů ustáleny,' v;· ’ 10, puf róváném formalínu tPa-11-ešče'nces permeabil.izovány ,1 % nonidetu P40 /rhodami.nem phálloidihu (Molecular
Přobes, lne., Eugene, OR) jak. Je popsáno , v Phillips and
JTsán,/ .4Y’!.'.'Histocřiem>·. ..‘Cýtochem. 36:551-554 .(1988·)·. Neporušené ltrý/ 'Obsahuji cí9.' monovrstvy ', byly odstraněny z . jamek'' á. umístěný'na' krycí .sklíčka. pokrytá ' .1:1 roztokem glycerinu.
' ve ·'; fyziologiekémkroztoku- -tlumeném fosfátem' a pak přikryty · kulatým krycím ' ski íčkem á neprodyšně' uzavřeny. Podložní sklíčka byla - analyzována za použití 'fluoreskujícího mikroskopu'/Nikon Láb -Diaphont (Nikon lne., .Melville,.. New .York) á ' fotografována za. použití TRI. X Pan 400 ASÁ kodak film.
·**** ·*-) ·»·'· •i.; · · * »4· ,*' - · .
»·...·. »·.·-.
> '4*' ;,J fc l )' ' ‘
Iděritif ikac^ uázétiriýčh, a lbůmlnových proteinů. /·,/, .
•:-Plazmaťíck.é' membrány bylý nejprve izolovány , z BPMVEČ 'pomocí'.' •frakcionováné .centřifugace' a ' vazebné álbuminové ,;přoteiny<,'R.ři tqmh.éú; y /.této,, membránové frakci// by ly identifikovány1 za '•použiti 1 i gáhdovéhó'. '''•přenosů'’· (viz-’ výše) i·· ' Bý i'á< · óbjevena·; . jednoduchá- metoda ., k identifikaci :přirozených ·: važebbýoh·-,,/ albuminoyých -proteinů v endotelovýdh buněčných .membránách. './., Membránové proteiny .'byly' separovány za použití -SDS-PAGE a-pák .přeneseny, ná PVDF ’ nebo nitroceíulóžů.· '.Nespecifická? vazba byla ' zablokována inkubováním .- .membránových/' proužků.
s, Ťween-:.2O a pak . upravena přirozeným monomerním BSA/prostým globál inu. Vazebné·' Oblasti. BSA byly identi.f ikaVáhy .' :za·’ / použití . pol yklonální.'; proti látky '.vyvinuté oproti. 'přirbžěnému/·// BSA. Za absenčě vlivu' membránového, proužku ' na,přirozený •.BSA,/.''’ prokazuje anti~BSA pouze 67 k'Da pólypeptidu -óznačůj-ící hp.’ /. přítomnost významného množství BSA vázaného k endotelovým, · buněčným membránám. Avšak .když byl proužek .upraven/pomoci. BSA, protilátka anti-BSÁ · reagovala ''se .3 křidáťnými. polypeptidy (110 kDa, 57 kDa. a 18 kDa). Z těchto poiy.péptitíů proti látka naznačuje, ž přirozeným reagovala
V.£ o/ kBa;
.co;
po 1 y pept i d j e větší ní proteinem i, ·.- -.Všechny nej intenzivněj i e zde. označený 57 kDa vazebným albuminovým endóte.-lDvé buněčné membránové frakce (100 00.Ó kg,? částečné frakce z BPMVĚC a. BFAEC) byly také připraveny a použitý- pro ligandový přenos.. Tyto částečné, frakce, také prokázalyprimární vzájemné působení BSA s póly peptid em 57kDa. '.'/,
Izolace vazebného albuminového proteinu 57 kDa . 7 Od té doby, co bylá, pozorována vazba přirozeného- . albuminu' s proteinem 57- kDa, byla objevená metoda pro izolaci tohoto • <s. ·*Λ. - .4 4 , .4^'.%^,,·,, £ . ·*? .·· • ' ’’ 4 4 / ' 4 ···-*· *4^ 4' · *r / *4‘' ' 4' 4- ‘ 4 · 4 I · - ' ' 4 '*<4 · 4 '.-i 4 ·.’··/ .4' ' .»-·'·4·’ » ·· θ'·'#·.·'·*· , · · '··· * ’♦·
,.ί..';.·· . 4,-,. >4.>;·'4ν ’.· ·ρ4\4^ 4, .444 4 -’4·'. .··*;' -99-- *. -4 ' * 4 ♦' '·. χ * · '·.
;·:///·· ’ ^“ΐΖ·^ ’·ν ζ* ' . ,?7···, Λ·.?'*,. /· ‘Λ ·’>.· -/.-: u '·» ’ ι f.-/---;·/ V./:- .-·.; ν . ‘,ι- -.;. λ·..;/,·:: /px-.iv.,/..r ./-/
·. proteinu z , membrán BRMVEC./, ? Ligandový přenos / bý 1/použit’..
' k určení /pří temnost i,; /tohoto/proteinů/během čištění/ Membrány^ •BPMVEC·:·by'.ly.: nejprve •.•řpž.ptiŠ^ěrtV^-pófnÍboi···. /2/.5X/ chdlátu sodného/.
?-/ a -..4../, K/ močov inoú a / ex.ťrak t //byl di a 1 y zaván·; -/ať koncentrován.1 '.v- o;- yy/y>. ·' / ’ ; /u.- í^í-^s.·^'. ////<:'/?//· y,v/ -///t :/ y><.
pomocí . vysrážení. á.OŽA-etánÓTu. ' Tato .sřážen.ihá/byTá znovu “ .extrahována ; pomočí ·'/Ťritohú-/-«ř/i0'0 (viz/ Výše·} Rozpuštěný . extrakt Tritonu .x~l'OO . by 1 čhromatográf ován, na..koloně DEAE, a vazebné proteiny bylý' ' eluováný lineárním ·.,gradientem :/.(0,-500'.. mM/NáCl}., ; Froteiriý,'.býTý/.' eluoyáby. 'j.áko.' -3 píky. Frakc.e' ·/·· z každého' píku ;byíý'/spp'jeny/á /scre.enováný/na./vazebný albumin1 '//za . použití : . l i.gápďq.ý£^ i Pouze/ - jeden . vrchol I);.
'prokázal vazebný · albumin'. s: proteinovou oblastí 57’· kDa:
/Byla provedena . .SDS;,; elěktřpf óréza· 'za použití .proteinů . Z; přirozené. membrány-·:/.'BPMVEČ/ .á·,kolony, DEAE „.vrcholu /1. po/.
' .obarveni, bri l íantovou- modří / R'~250 .Copmássié./ Pří tomnost proteinu 57 kDa/'/' k terý,, od pov í dá vazebnému albuminu, . byla '·' pozorována ' pomocí lígandového přenosu v. obou. .přirozených 'membránách stejně jako, ve /vrcholu Ϊ· DEAE.SDS-PAGE. by 1- také. ' upraven za neredukovaných podmínek ( za absence CME) a vazebný.;, albumin, byl,//pozorován pouze v oblasti .57 k.Da,· která předpokládá nepřítomnost sulfidového můstku v tomto proteinu... . tento' protein, / byl dále.· čištěn ' ža použití preparativníhp/SDS-FAGE/a (protein eluoyariý ' z gelu byl použit proTprotilátkový/přípravek/ ímuriiťní přenos ',···'
BPMVEC., a BPAEC membránové proteiny byly separovány za použití SBS-PAGE a . přeneseny na nitrocelulózové proužky. Proužky byly: imunně -předěšeny antisérem' 57/kDá, Préimitnhí sérum nezjistilo ' žádné proteiny z BPMVEC a BPAEC membrán.
. ;4’,4.- 4 · 4 4 4 . · ' 4---44 ·'/_' ·44 «. · « 444· 4 ' 444 4' ' 4* *.
··*·, »4
C·: <;7·.
· x -/'••'-tr, ý?’’ v1' ' .. t.. ’ » \l',. ' . * ,j« ·. A- / . ; . ·.' ,/* ' J . ’ · · '
-Ant i sérum' zjistilo ;dva větší·. proteiny/ '(57;kDa a. 36'-i;k6á) a .jeden menší protein ' (43 kDa) v /Přípravcích,.' . Částečné frakce , z BPMVEC, obou membránových a BPAEC byly také.
./použity · přo; / imunitní ς přenos. Proti láťká-/rozpoznal a· pouze .-týtp; . tři · proteiny'v’ ;/' Částečných' f rakcich.' To (Vřed pokládá/ (že vazebný albuminový protein. .. by l vyčištěn do (oči vid né. V/ · homogenity,. - >·· . K studování . navrženého . · ' strukturální ho ' vztahu.'. \'!/ňě±'i'‘?:f’' .. . endotělóvou . , připojenou membránou a vy lučovanými (SPARC) .
vazebnými .álbuminovými. .proteiny, byl reál i zován . imunitní^, ./přenos BPMVEC membrán pomocí.· protilátek vypěstovaných .pro·,ti ·.· 'vyčištěnému· '· hověz í.mu' SPARCu.. Ántisérum ' vypěstovahé -prot i 'Vyčištěnému . hovězí mu . SPARCu rozpoznali» polýpepťidý: ,;.·67... I; pa, .6.1·. .‘kDa’,'. '· 57· ' kDa, --43- -kDa a / 36' ,'kDa v 'membránách'-'Í.BPMVÉ-C.
peptidové ’anti-SPAŘC-NHz- ; . an.ťisérům ( silně.\-polypeptidem 36 kDa' . a slabě-s 1 polypeptidem' '43···.·.
Terminál ní reagovalo s kDa. To ,' předpokládá, čistící·' réc.eptbry · jsou/- Úplně rozdílné, od při rozených al buminových receptořů.'
I-BSA- k- ' moríovrší vám:
kDa-IgD byly příbuzně
Účinek arit i . -57-.kD-á-lgG. na n.év-ázání 1!
BPMVEC
Pr.eimunní sérum I gG a anti-57 vyčištěny' za' použití -proteinově' kolony '.· Á.-SěpharÓiy..,.-Byl'.·'. ,·/ zkoumán' vliv . frakcí IgG na navázání 12ET~BSA k monovrstvám ·' BRMVEC při 4 °C; nespecifická vazba'se. pohybovala rozmezí od40 ' až 50 Z. Preimunní sér.um IgG podstatně- neovlivnilo /·'' specifické navázání 12EI~BSA k monovrstvám BPMVEC. Naopak·; anti-57 k.Da-IgG redukoval '-specifické 'navázání ' iSS-iWBSÁií.y'' závislosti (na druhu- dávky. Redukce b'ý la 50 7.) při koncentraci 200 jjg/ml v anti-57 .
k ..monovrstvám. v maximální (40 až · ., ν· . ·,·>-, ·,>· α· i.··,· i-,*· ,λ4 *.··> ··!·ν· '·· ·»*. ί • ·-·' ,?·' ' ·' - v. ·· ·· ♦’ ,· · * '*'· .·.·*' . * .· - f’· — . ‘Λ*· . » · ' ’ ··-.·- · ·-’♦· ϊ Λ » · 4 ‘ · ·. '. '· · ··'«,·» 4' · ' · j'· r·;.·. :· ·;· · -.· ··*,· -·· ' \· ,·v- '-η. ·· ’·♦·'
-Γ<· .
(„ -'C · *4,-*
-·‘ Λ '· . - -36' . '···· /A '· .
í - < - f ’ ř ; ?;...n. ·,;') 'ríy;' <; l·; vb/ř ·27·λ.'. b ··.' 7 í : 1 ·'·'. /-*» ·> ·.>.. j < < <··\’••A;/’j':Λ cí--·; ,Ť- f.LiA.''. ' ; *’ ’·;? ?“Av ·;,'i., fi·.· jG'. 'áTzástaTa- nezměněná?: ažv-dá/ výšé-íŤQOo ru.g/ml>% ' , ?..,;
kBa-Igp·. á
..Tyto výsledky?' demoristruj?í '?,··<· -že?’? bb;jev‘ená'·’ 'proti Vátká·· proti
\.,.k
- .S; jinými:· vazebnými' místy ná onďójtě.i.óýém^lbuněeném povrchu? ·
A&.ťii/.ace. traris&ndotélai/ěhci ?;á2'í>'umi-nouébp.' prQtoku ..pomoci ani i-57: ·.kDa-lRG za absence.změny · 'endotělového buněčného·· beru.. . - .' '' - ?;.'/ ; . ??'/ ’?-. · : . t . ..... ' ...-.-Při ? studiu'..úfcinfcft. aňťi-57-,·' :kDá,kI?g'G na transendotelový přenos .albuminu by l y měřeny?'?rychlosti · ..transendótelové c 1 ea.rance:
i^T-BŠA.' v monóvřs’tvách .· .-BPrtVĚC.; Monoyřstvy?.'' by;ly předem inkubovány. s preimunním -sérem IgG a anti-57·,. kBa-IgG po dobu 15', ,30 á .;60) minut- a potom byly. , .měřeny'-rychlosti c learánce-. transendotelové 12S:T-BSA. až; τϊ'ά·-dobý; 60.'minut. Indukované' ' an.ti-57kEia“IgG· zvětšují .. .perm^ábi 1 i.tu v. závislosti na čase.' .30. minutová; preinkúbáč.ní. , ,'peřioda 'antÍ-57 . kDa-IgQ měl.a za násl edek .-dvo jnášůbriě. zvýšen i ’' rychlosti cíeárance' 1£-Ι-ΒΞΑ nad' Preimunním. IgG. ' L) 15 minutové preinkubace bylo .pozorováno nepodstatné; 'zvýšení y perme.abi 1 itě .; a·., byla .zaznamenána 40 až · .50 ' 7. změna, když anti-57 kDa-IgG byl ' předem inkubóván š . monóvrst.vou· . až do. doby ' Preimuhní -sérum- -.IgG.:. nemělo. vůbec T-. žádný . transendotelový . ' .ai bumihový přenos při všech préinkubačních testováriých . - periodách.,' : Účinek ? anti-57 'kpá-IgD na peYíňeabilitu ' al buminu ýt-25 i 5 e ' vrátil- do svého původního minut, vliv na stayu při teplotě 4 °C. .Tvarová změna end-otelovýčh buněk po úpravě preimunním sérem -p.ÍgG?--á1 anti-57 ' .'!kDa~-I gG,' by 1 a' 'studována . za. použití techniky pop.s-an.é dříve. (Phillips and. Tsan, supra, Sif 1 inger-Birnboim
A A · M'VÍ
A A. · Á AA A ' ·> ' ··· · .· · A A A* .
.AA A AA.,,.- ·#>·/>
A ’ A' A · A A A '· A ’
A A A ' A . A ' A A ·
A A AAA A ·♦ AAA · , A A A . A . · A A ,
A A , A ·. · · ·,
/v//.' )37.<
'.r’í •’'ť •et al, Lablnvest. 67:24-30 (1992))/. BPMVEČ vy pěstované, na r , .'•nukleoporézních· filtrech hýly, předem ' inkutjbyáňý s přeimúnním ; sérém I;gG' a an ti-57 . kDa-ί gG po dobu 30.'. minut. a. mohovřs.ťvy. .·;·.·.· ;/>8ýiy.:. obarveny-; rhodáminem ,, phaliqidinu. 'tCv-i-z· r.výšé)y/V jiném r .· případu.* byly 'pozorovány hebunéčné'“' kruhové ' úťvářý... hěbo ·’ útvary meziendotelových mezer.·’ * - ' - .·-/-· .-./.Tyto; -.výsledky '..předpokládají, že anti-57 ..kDa /vážébná-,/· albumindv.á proteinová protilátka aktivuje al buminový;,'přenos. . , 7-/-'’/ ' Existují' další ..možnosti,'· např. že- tato ·' proti látka '.může ./ nespecificky' zvýšit periteluTářní přenos albuminu '.rozšířenímt ·;...'/ v meziendotelových spojovacích mezer. Při .tomto zobrazování ' 7;.'.'/ by 1' pozorován ' 'účinek · anti-receptqru 'Ί gG .a preimunníhů š'érá :; ' IgG na. endóťeloyoú .••buněčnou morfologii.· Předběžnánůpi-avá monovřstev’ BPMVEČ pomoci ' jiného preimuhního .séra IgG nebo .// anti—receptorů IgG. neměla žádný vliv, na mezíendófe lově.· spojovací, mezery. Tato protilátka k. vazebnému./albuminovémú :/./' proteinu 57 kDa může aktivovat tran.scytózu albuminů'< 'Eťekť; ; /7 -.
zvyšující peřmeabi 1 i tu této protilátky, se 'nevyskytl'' 'ři'ř.i· ý teplotě 4 OC, což podporuje závěr, že protilátka aktivovala, albumirtovou. transčytózu přes .měchýřkovitý útvar, ú nichž.' . byla prokázána citlivost' na teplotu (Lo et. al,· J.ďell. '
Phy.siol. ,151:63-70 (1992·)·).
Příklad 2: Protilátky vypěstované proti GP60 - .· '.·..
Protilátka proti GP60 vypěstovaná z endotelových buněk., byla použita ke zkoumání epitělových membránových extraktů jak' je popsáno v příkladu 1. 'Protilátky anti-DP60- rozpoznaly protein 60 kDa nalezený v ěpi tělových extraktech: Toto .-..jasně, .prokazuje, že v tomto systému je- přítomen imunologicko· . /'Cř/Ý'· »9. - .9». ‘
9 9 9 ' * · 9 ' 9.--.999 9.» · ·. 9 •«9999
9* .'9 9- 9 • '9 9999
9 · 9 ’ • 99 - 9 9.99 9 <
.. 9 · » ' 999 9 '·’ ' ' ·;·/ ·' 9 .
.99 99 ·
Příbuzný protein/ ,
38'
Epitělové a•‘endtotélpvě. buňky-býlý pěstovány .'jakó:..móhbvřsťv:y,;'j jak'.· je popsáno- v . příkladu'; láby.-/'vytvořily· 'splývající [ňoňoYfStvi//.^^ í*·-’’ pÁiměřenbii/reaktivrtu^k.^prClťcík ró'zpuštěných látek.. Protilátka anti-(jP6Ó'· <200 až- 5QÓ'jjg/ml ) ' bylá·' inkubóvána pomocí' moňovřšťěv'4 při 'teplotě- 4Cý ‘ aby navázala protilátku k rec-ep toru:'· - .za·' 'absence- · ínet'ábol.ickě= · aktivity, .která možná· způsobu je .‘začlenění''GP60'. '.Navázání . protilátkylanti-GPňÓ za- těchtó ' podmínek způsobilo 80 až · 90.2 . zmenšení v navázání /2.s r-BáÁ-'pomočí ·. .enďo.tél.ayýčh'.mpnovrstev. Epitelo.vé . monovrstvý lby lý. '/dále; .yinkubováríy pomočí druhá , proti látky: k, .primární králičí- anti-GFóO protilátce, abý' příčně navázalý ' recěpbórý·. Obě·'mondyrštvy . býly promyty a:.'pak inkubovány. pomocí imunoglóbul-ínu- . *2.εT-BSA· iná·'... endotelnvéi monovrstvý- ..-při teplotě '37-'. '°Č, aby umožnily začlenění proti látkového’.·' .receptorového j komplexu- . a. kó-transcytózu stopovací látkou -označeného -í-žs χ... inkubace., pomocí·. protilátky aňti-GPóO způsobila 1-,.6 až 6 '.násobné' zvýšení absorpce . nad hladinu kontroly prei-munníbo ·. séra. Tudíž navázání recepťoru GPóQ ' pomocí protilátky/ ahti-GPóO ' -způsobuje aktivaci transcytózního mechanismu,· . a tím ' zvýšení absorpce makromolekuly v blízkosti i,'nvaginované. membrány,.
Příklad 3: .Použití albuminu š nňakhamal ekul ami
Endotelové monovrstvý byly inkubovány za .přítomnosti BSA při teplotě 4 °C, aby iniciovaly. navázání BSA k .GP60, ale aby zabránily . zač leněn í' 1'igandového- receptorového komp lexu. Pq častém' promývání, při němž še'. odstranil, nevázaný BSA, bylý. buňky inkubovány- pomocí imúnoglobulínu anti-BSA označeného
Τ»Λ· ί* •Λ ’ΐ.
··>
» · · • »» · • * »««» • «.
»> · » ·' · * /<·'_' • » ·».
« · · ·' ϊ *« . ·« *. -
12 Ε'.Ι ; při ’ teplo tě ,37 j PC. / j a kb látka/ Předběžná -úprava pomocí . 7 --.¾. '/'' ..... \ · //-/// mak-rombiekulářrií stopovací-';/,' BSÁ zvýšila trahsdyfcózu ·' '
imunoglobulínové stopovací '-látky; 1,.-5 krát-. '. nad; kontrolované /;/// . buňky;; ' které byly /předem. inkubované. . pomoc í neoznačeného / ' ' •'imunógíobulinu- anti--BSři'. 'Dále, ' když by ly 'buňky'' inkúbbváhý/jýě'/////// '37 °Č byly -promyty· a ihned prošly. stejným- -postupem, nebyl .
pozorován - žádný makromolekulám i průtok,., to. -prohazuje,· .Že už .,,;/ jednou 'začleněný receptor GP60 . je nepoužitelný -pro. ligandové . . / // /navázání.' A 1 tedy velké, molekuly' ,( 150 kDá) mohou .být . ,1///.
kÓT.třanšcytováný ve shodě s.HSA -za'použiťí systému·GP60./ --/.-:1
Příklad 4; Použíí i ''albuminu' a Peptidy / · . 7'/ .Lidské a - .krysí epitělové/ moriovrstvy- · byly yypěstovány; do - t-/7 ' ; shluku, . jak ' je popsáno -v příkladu . 1'.·,. Buňky 'byly poté //../. -· .inkubovány pomocí inzulínu FITC- (1 .mg/ml')7riébo inziii-ínu'-:FI.TC7-- // ..
• 'a-BSA (každý 1 mg/ml·) při teplotě 37'b-C v trahšcěluláyním .'·. 'v/-/ .. průtokovém systému popsaném výše. U 1 idsk'éa' krysí epi tělové monoyrstvy bylo 2,5 až 4 násobné zvýšení v průtoku' inzulinu'
FITC nad. kontrolu samotného inzulínu FITC. T.udíž albumin .·', také stimuluje ko--transcytózu peptidů o malé molekulární hmotnosti napříč epitelovými buňkami, .které obsahují
.. , receptor GP60. , ' . í . . -,
Příklad. 5ϊ· Použití h~terminálril ho peptidu 1--ÍS z peptidu' GPÁO '',
Syntetický N--terminálo i peptid (Τ311Θ) z peptidu GP60, který odpovídá prvním 1S zbytkům, .byl vytvořen pomocí pevné '.fáze pept-idové syntézy; Sekvence (SEQ ID No.l) 'prokazuje nejméně'/ SÓa homologii s hovězím hormonem,' vazebnou membránou hormonu »·..»» »» .
'.* · · ’ « · ·· . ·'*“ « ·'..·>/ * ·' · .· ♦ 4 4 4* ··.·.··.···..,
4,-./.44 4 4 .4 · · 4 4 4 ·. 4 4 4,4. .4 <
',|λ· -., ►. . 4 4 . 4.
•4444- 4« • 4 ' .''4». .
R 2/ ··.·'·
-.šťí.tňé žlázy·..--(131- vázaj ící ' protein;:-.(.Ýámaúčh'i..>,ět.'.. á 1,2 Biochémv., ·.Biophyé’. Rěs. Comm. 146: 1485 .' (1987)..''.'Má'.'-972 ' homdlogii;-
s.PDl. ; ' · ' ' ?' ý ' ž.'- · ú . '· - ;i 2: ?
.Protilátky -proti/:131.18 bylý.' .pěs.íjhváný^ý-;;..kř.ál..ících a'.' použity . tak,, aby'· pronikly / endotělovými měrnbřánóyými .' extra!-ty, aby byla stanovena.·· 2vž-ájemná · reaktivita· s „'proteiny·' rozpoznanými pomočí protilátek- anti-GPóO, .jak·, je popsáno- níže. Membránové (100 jíg) byly. ', . izolovány na 3DS-PAGE nitrocelui-ózové ' 2 membránové proužky. '
Nespecifické ' navázání by lo . blokováno pomocí. .52 nétučnéh.o sušeného . mléka· -.v puf rovaném^Triši .fýiiblogickém .. roztoků;· Antišéra byly,'razředěna v .blokujícím -'roztoku, inkLibována po hodin při' teplotě·.··'4.2PC;,'.. ipromy ta/. a ' upravena.
proteiny- BPMVEC .a přeneseny'' na dobu 4 až, pomocí. , kozí. I.gG proti králičí IgG . kónjugovaného· pomocí alkalické fosfátázy. Proteinově vazby' byly určeny za použití signálně značených ' proteinů o známé .' molekulární hmotnosti. .Protilátky an-ti~T311& prokázaly.· . réak ti.yitu pouze vůči proteinu GP60 a' ne vůči SPARCovým peptidům, které byly rozpoznány protilátkou ánti~ GP60..
Peptid T311S , .byl potom . použit i v .ěndotelovém absorpčním, pokusu, aby se určilo., zda by se choval jako antagonistá při rozpoznávání .a absorpci albuminu. Endotelové monovrstvy byly inkubová.ny při teplotě 4't>C za přítomnosti íssi-BSA nebo; 12-I-BSA navíc s' peptidem T3118. .Po inkubaci byly buňky důkladně ' promyty, lýzovány .'· á·('spočítány pro absorpci stopovací látky..Překvapivě· spíše 'než by se choval jako v „ antagonista, peptid T3118 ve skutečnosti stimuloval absorpci albuminu 25 k-rát nad kontrolu samotného albuminu. Zvýšení bylo saťůrovatel.né při koncentraci '500 -jjm peptidu. T3118. Tyto údaje dokládají, Že peptid T31.18, který se chová jako
-.4 4- 99 v » w ' · · '.· 4 ·* '4 « ' ·< 4 444 ·-.···/· 4 4 4444 · ' 4 , 4 4' ’ ' 4 4 ' .
-4444 44 . 44' '4
4 4 ' ·
4 44 · . 444 4 v 4 •44 4 >
44
-.41 *v:
•ágOnistši můžě způsobit strukturální změnů.v albuminu, který zvyšuje 'rozpoznání' pomocí GP60 neboje podnětem pro absorpci'· -pomocí endotelových buněk. '' . :
Odborníkem ve. '..'s.tayU.· techniky bude oceněno, 7>še , vynález . může ý být'· proveden .'v .' ěirók^ěffl·' rozsahu ekvivalentních- parametrů , •prostředku, koncentracích, způsobů podávání a podmínek -bez ; odchylek od podstaty nebo, dosahu vynálezu nebo jakéhokoliv,, pokusu téhož.
Popis sekvence ...
1) Informace pro -SED ID No: 1;
. . (i) Charakteristika .'sekvence: ' , .· - .·· .' . - '· <A) délka; 18 aminikyšel in. ' '' ·. . ' .· ( B) typ:.. aminckýsel ina ' ' '(C) řetězce':
ÍD) typologie; lineární.
(ii) Molekulový typ: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 1:'
Lyš Pro Asp Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Val Lys-.Gly 1 .3 10
Asn Phe Asp Val 1 ..W ,··ΧΜ ν·ΕΛ .</ L/ ···:' 4 4 4 4 1 4 *4 4 . f ‘ 4 · ' 4 4 4 - 4 · 4 . 4 4 · · 4 4 4 4 4· 4 4 i#·,'’ · 4 4 4 4 ‘ · · 4 4 »··« 44 ' '44 -.4 44 ··

Claims (13)

  1. Ρ ΑΤΕ Ν Τ- 0'V Ε Ν ftRDK Υ •1. Prostředek nebo, jeho konjúgát, třártscýtózní fyziologicko.
    - akti'vní... činidlo,.které 'vykonává svou, činnost', během průchodu' ., endotelem,· ěpiťeíem nebo mězótelem obsahuj ícfm recěpťor GPóO a transcyťózní zesilovač transkripce -nebo .prostředek vybraný z albuminu a jeho .fragmentů,, '. protilátky anti-GPéO a jejích fragmentů, fragmentů peptidu GP6O a1' PDI (proteinová disulfidová izomeráza) a jejích, fragmentů;
    podle 'nároku lrj,
    Prostředek nebo kde konjúgát transcýtózn.í zesilovač· transkripce ..- nebo'·,prostředek obsahuje motiv 'CGMC»
  2. 3. Prostředek nebo .konjúgát podlé· '.nároku- kde transcytážní zesilovač transkripce nebo prostředek obsahuje albumin nebo albuminoyý fragment.
  3. 4. Prostředek nebo ' konjúgát , podele- nároku 1θ, kde transcyťózní zesilovač transkripce- nebo zahrnuje protilátku GP&O nebo . fragment proti látky .anťi-GPóO.' '
  4. 5. ’ Prostředek. nebo konjúgát transcytózní zesilovač transkripce peptidový fragment GP60.
  5. 6. Prostředek nebo konjúgát transcyťózní prostředek ' zahrnuje podle .nároku 1^, kde nebo prostředek zahrnuje podle nároku'· Iq-., kde albumin -nebo aibuminový fragment ve spojení s peptidovýmfragmentem GP60.
  6. 7-„ Prostředek nebo konjúgát. podle nároku nebo nároku , kde peptidový fragment GPóO obsahuje nebo je SEG IDNo.l.
  7. 8. Prostředek. nebo konjúgát podle jakéhokoliv předešlého nároku, kde fyziologicko-aktivní činidlo je vybráno ze skupiny, ' která sestává z luteinizačního hormonu (LH), chorogonadotropinu, síňových peptidů, interferonu, limfokínu • ·
    ·. · fl* • · . ’·. • - ··· . « ·· ···« ·· • ♦..flfl ·« • ‘fl·» • · ···« ·' -a- ' · ·· a ·
    -«· ·· • •4 * efl ·· «·· ♦ * · a «· ·· '43 I., iimf.okinu II,'limfokinu' III, limfok-inu IV,. 1 i.mfokinu' V, iimfbkiriu VI, limfbkinu VII, faktoru stimulujícího kolonie, hormon uvolňující růstový faktor, faktor uvolňující kortikotropin, hormon uvolňu jící luteinizační hormon . (LHRH)., sbmáťbstátin', J.íalcitonih·, .hormbn' uvolňující .-tyřeotropin, peptid ' příbuzný, kalcitóninovému genu (CGRP), -transf er.ázý, hydrbíázy, izomerázy, proteázy, ligázy, oxidoreduktázy esterázý, .fosíatázy, nervový růstový faktor (IMGF), ciliární neurotropní faktor •'(ČNTF), odvozený, mozkový, neurotropní faktor' íBDNF5., odvozený gliový neurotropní faktor. (GDŇF)·,·· •z epidermální růstový ·faktor . (EGF), ' fibroblastový . růstový' faktor (FGF), inzulínu podobný růstový faktor, nádorový někrózn.í faktor (TGF), encéfalíny, endorfíny, gonadollberin., melánoštatin, melonol iberin, somatostatin, ty.reol iberin, neurbtensin, kortikotropin, lipotropin,' substanci F’, melanotropin, sonia to tropin, kaleitónin, lutrópih, tyreotropihi' neúrohypofyzální hormony tymozin, týmopoietin, t y m i c l·: ý Ku morá1 η í somatostatin, gastrin, inhibiční polypeptid, relaxin, angiotenzin, faktor, prolak tin,', paratyrin, cirkulující týmický inzulín, glukagon, sekretin, gastrické . cholecystokinin v-azointestináln í peptid, mobil in, bradykinin, somatomediny, epidermální růstové faktory, urpgastron, de.feroxáťnin, · buserelinj deslorelin, gonadorelin, goserelin, histrelin, leuprórelin, nafarelin a triptorelin.
    R, Použití -fyziologicko-aktivního činidla a transcytózního zesilovače transkripce jak je definováno v jakémkoliv nároku 1«; až 8A) pro výrobu léku pro terapii za. použití činidla.
    1Ó=„. Použití konjugátu, jak je definováno v jakémkoliv nároku 1., až 8„. pro výrobu léku pro terapii za použití činidla.
    ··' 4 , 99 . 49 · • · 4 '4 ' · '9 9 4 .4-99 4 r 4 4 , 9 ‘ 4 4 4 4 4 «44 • 44« 4 4 * 49*44 4 »·Ι 4 «
    4 ♦ ί».' · 4' 4 · »9 « ·4·4 44 49 .. 4 44 44
    44 11. Způsob podávání fyziologicko-aktivního činidla savci vyznačující se tím, Se zlepšení zahrnuje·;
    podávání zmíněného aktivního činidla-buď kon.jugovaného nebo přimíšeného k · transcytůznímu prostředků .nebo. zesilovači' transkripce jak je definováno v ' jakémkoli v ' nároku lrý -až ' kde' zmíněný transcy ťózn í prostředek -nebo- zesilovač, transkripce dodává nebo zvyšuje průchod zmíněného
    Ťyziologicko-aktivního činidla napříč epitelem, endotelem nebo mezotelem obsahujícím receptor GP60.
  8. 12. Způsob podle nároku lly vyznačující sě tím, Se podávání je do vaskulár,·pulmonálními cestami . nebo . pér i.fonéěm.·.
    /působ podle nároku
  9. 13,«λ vyznačující se tím, že podávání Ά.*' je injekcí do vaskulár nebo peritonea·.
  10. 14.
    'působ podle nároku 12/ vyznačující se tím, že podávání je suchou práškovou inhalací do pulmonálních cest.
  11. 15. Způsob podle nároku 1 ly vyznačující se tím, i fyziologicko-ak.tivní činidlo definováno v nároku 8.
    imíněné
  12. 16, Způsob podle nároku 11^ vyznačující se tím, že zmíněné fyziologicko-aktivni činidlo je konjugováno ke zmíněnému transcytůznímu prostředku pomocí metody vybrané ze skupiny, která se skládá z glutaralde.hydové konjugace za použití formace Schiffovy báze, karbodiimidové reakce mezi proteiny a kyselinami karboxylevými, kyselou' anhydridovou aktivaci aminu, který obsahuje léčiva doprovázená karbodiimidovou. vazbou, aktivaci primárního aminu, který obsahuje léčiva s anhydridem 3-í2-pyridiIdytio)propionát-N-sukcinimidy1 doprovázený spojením k cysteinovým skupinám proteinů,
    1,•anuncky konjugaci mezi aminy a hydroxylovými skupinami přes bisperoxidaci.
    v v . »» • . 4 4 4· ♦ 4 ·
    4- ·»· 4
    4 ' 4
    O 4 4 4 4 4 4 • ' ♦ 4 4
    4 4-4444 • 4 V
    44 . 4
    4 4 4 4 • .4 44
    4 ' »44 I 4
    4 4 4 »4 44
  13. 17. Způsob podle nároku 11^ vyznačující se tím, Se zmíněný' savec jě Člověk.
CZ98503A 1995-09-21 1996-09-20 Přípravek nebo jeho konjugát obsahující fyziologicko-aktivní činidlo, transcytózní prostředek nebo zesilovač transkripce a jejich použití pro výrobu léků CZ50398A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US409795P 1995-09-21 1995-09-21
GBGB9606315.1A GB9606315D0 (en) 1996-03-26 1996-03-26 Transcytosis vehicles and enhancers for drug delivery

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ50398A3 true CZ50398A3 (cs) 1998-07-15

Family

ID=26308989

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ98503A CZ50398A3 (cs) 1995-09-21 1996-09-20 Přípravek nebo jeho konjugát obsahující fyziologicko-aktivní činidlo, transcytózní prostředek nebo zesilovač transkripce a jejich použití pro výrobu léků

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6204054B1 (cs)
EP (1) EP0851767A1 (cs)
JP (1) JPH11512451A (cs)
KR (1) KR19990063632A (cs)
CN (1) CN1195995A (cs)
AU (1) AU717329B2 (cs)
BR (1) BR9610492A (cs)
CA (1) CA2230479A1 (cs)
CZ (1) CZ50398A3 (cs)
HU (1) HUP9900017A3 (cs)
NO (1) NO981146D0 (cs)
NZ (1) NZ318472A (cs)
PL (1) PL326078A1 (cs)
RU (1) RU2169010C2 (cs)
WO (1) WO1997010850A1 (cs)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6391343B1 (en) 1991-01-15 2002-05-21 Hemosphere, Inc. Fibrinogen-coated particles for therapeutic use
US20070117862A1 (en) * 1993-02-22 2007-05-24 Desai Neil P Novel formulations of pharmacological agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
US6165976A (en) 1994-06-23 2000-12-26 Astra Aktiebolag Therapeutic preparation for inhalation
CN1170527C (zh) 1994-12-22 2004-10-13 阿斯特拉公司 含有甲状旁腺激素(pth)的吸入用治疗剂
US6261787B1 (en) * 1996-06-03 2001-07-17 Case Western Reserve University Bifunctional molecules for delivery of therapeutics
US8137684B2 (en) 1996-10-01 2012-03-20 Abraxis Bioscience, Llc Formulations of pharmacological agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
JP2002503254A (ja) 1997-06-05 2002-01-29 ヘモスフィア，インコーポレイテッド フィブリノゲンをコーティングしたミクロスフィア
US20030199425A1 (en) * 1997-06-27 2003-10-23 Desai Neil P. Compositions and methods for treatment of hyperplasia
GB9801070D0 (en) * 1998-01-19 1998-03-18 Andaris Ltd HIV inhibition
EP1279406A4 (en) * 2000-04-03 2007-10-24 Santen Pharmaceutical Co Ltd TRANSPORTERS AND DRUG DISPENSING SYSTEMS USING THESE
WO2002032396A2 (en) * 2000-10-16 2002-04-25 Massachusetts Institute Of Technology Lipid-protein-sugar particles for delivery of nucleic acids
DE60140069D1 (de) * 2000-10-16 2009-11-12 Cytoguide Aps Funktion eines haptoglobin-hämoglobin-rezeptors und anwendungszwecke dafür
CA2435563A1 (en) * 2001-02-02 2002-08-15 Conjuchem Inc. Long lasting growth hormone releasing factor derivatives
CA2451511A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 The University Of British Columbia Antimitotic eleuthesides
WO2003028765A1 (fr) * 2001-09-28 2003-04-10 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Injections pour tissu oculaire contenant un medicament lie a du polyethylene glycol
US7482366B2 (en) 2001-12-21 2009-01-27 X-Ceptor Therapeutics, Inc. Modulators of LXR
EP1465869B1 (en) * 2001-12-21 2013-05-15 Exelixis Patent Company LLC Modulators of lxr
US20040038303A1 (en) * 2002-04-08 2004-02-26 Unger Gretchen M. Biologic modulations with nanoparticles
EP3470084A1 (en) 2002-12-09 2019-04-17 Abraxis BioScience, LLC Compositions and methods of delivery of pharmacological agents
KR20150108943A (ko) * 2002-12-09 2015-09-30 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨 약리학적 물질의 조성물 및 그 전달방법
RU2361615C2 (ru) * 2002-12-09 2009-07-20 Абраксис Байосайенс, Ллс. Композиции и способы доставки фармакологических агентов
US7736653B2 (en) * 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier
AU2006249235B2 (en) 2004-05-14 2010-11-11 Abraxis Bioscience, Llc Sparc and methods of use thereof
US20090304684A1 (en) * 2005-12-05 2009-12-10 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of antibodies
JP4711013B2 (ja) * 2008-02-28 2011-06-29 東レ株式会社 経鼻投与用医薬組成物
US20100166808A1 (en) * 2008-11-17 2010-07-01 Giovanni Marco Pauletti Method of Facilitating Intracellular Uptake or Transcellular Transport of Cargo Using Nanocarriers Containing Optimal Surface Densities of Integrin-Specific Ligands
CN104174025B (zh) * 2008-12-05 2017-01-11 阿布拉西斯生物科学有限责任公司 Sparc结合肽及其应用
WO2011044701A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 The University Of British Columbia Inhibitors of phosphatase and tensin homolog (pten) compositions, uses and methods
WO2011074578A1 (ja) 2009-12-14 2011-06-23 国立大学法人北海道大学 脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチド、ならびにそれらペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体
KR101881176B1 (ko) * 2010-09-15 2018-07-23 랜달 제이 미스니 박테리아 독소에서 유래된 수송 서열을 이용한 생물활성제 시스템 및 방법
WO2014197546A1 (en) * 2013-06-04 2014-12-11 The Johns Hopkins University Therapeutic strategy via controllable transepithelial delivery of therapeutics and diagnostics
WO2016036960A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Genesegues, Inc. Therapeutic nanoparticles and related compositions, methods and systems

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB737961A (en) * 1952-08-14 1955-10-05 Roskilde Medical Company Ltd Method for the production of insulin preparations with protracted effect
CA1196863A (en) * 1983-06-08 1985-11-19 Mattheus F.A. Goosen Slow release injectable insulin composition
US4801575A (en) 1986-07-30 1989-01-31 The Regents Of The University Of California Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US5254342A (en) 1991-09-30 1993-10-19 University Of Southern California Compositions and methods for enhanced transepithelial and transendothelial transport or active agents
WO1993020834A1 (en) 1992-04-10 1993-10-28 Brigham And Women's Hospital Methods and compositions for oral delivery of therapeutic agents

Also Published As

Publication number Publication date
NO981146L (no) 1998-03-16
PL326078A1 (en) 1998-08-17
BR9610492A (pt) 1999-03-30
US6204054B1 (en) 2001-03-20
WO1997010850A1 (en) 1997-03-27
CA2230479A1 (en) 1997-03-27
NO981146D0 (no) 1998-03-16
AU717329B2 (en) 2000-03-23
HUP9900017A3 (en) 2001-08-28
RU2169010C2 (ru) 2001-06-20
MX9802286A (es) 1998-08-30
HUP9900017A2 (hu) 1999-04-28
EP0851767A1 (en) 1998-07-08
AU6995796A (en) 1997-04-09
CN1195995A (zh) 1998-10-14
JPH11512451A (ja) 1999-10-26
KR19990063632A (ko) 1999-07-26
NZ318472A (en) 1999-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ50398A3 (cs) Přípravek nebo jeho konjugát obsahující fyziologicko-aktivní činidlo, transcytózní prostředek nebo zesilovač transkripce a jejich použití pro výrobu léků
JP6889199B2 (ja) ｐ９７のフラグメントおよびその使用
JP6076902B2 (ja) 新規な持続型グルカゴン結合体およびこれを含む肥満の予防および治療用薬学的組成物
Lindner et al. Role of basic fibroblast growth factor in vascular lesion formation.
Seon et al. Long-lasting complete inhibition of human solid tumors in SCID mice by targeting endothelial cells of tumor vasculature with antihuman endoglin immunotoxin.
AU608531B2 (en) Advanced anticancer therapy and cytotoxic medicaments for its implementation
US20090010966A1 (en) Modified diphtheria toxins
US11773150B2 (en) Antibody peptide conjugates that have agonist activity at both the glucagon and glucagon-like peptide 1 receptors
Spencer et al. Characterization of the tissue macrophage and the interstitial dendritic cell as distinct leukocytes normally resident in the connective tissue of rat heart.
WO1998022141A2 (en) Enhanced effects for hapten conjugated therapeutics
CN101124243A (zh) 缀合产物
US20230181752A1 (en) Multimeric elastin-like polypeptides
JPH03503887A (ja) 自己免疫疾患に対する抗ｔ細胞イムノトキシンの治療的使用
JP2002501484A (ja) 免疫毒素および免疫寛容を誘導する方法
US20050037967A1 (en) Vascular endothelial growth factor fusion constructs and uses thereof
CZ299486B6 (cs) Konjugacní produkt, jeho použití, cDNA kódující cytokin a farmaceutický prostredek
JP2001511122A (ja) 新規な上皮組織標的化薬剤
US20220008513A1 (en) Combined treatment of primary central nervous system lymphoma
JP2007534621A (ja) Ｚｏｔおよびゾニューリンに対するレセプターのアゴニストペプチド
CA2130182A1 (en) Methods of treating diabetes
Wileman Properties of asparaginase-dextran conjugates
JPH10501003A (ja) 免疫調節作用を有する新規ペプチド
FI100305B (fi) Menetelmä autoimmuunisairauden hoitoon tai ennaltaehkäisyyn käyttökelp oisen immunotoksiinin valmistamiseksi
US6426401B1 (en) Pharmaceutical composition containing an inhibitor of immunoglobulin-receptor interaction
MXPA98002286A (en) Vehicles and incrementers of transcitosis paraliberation of farma

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic