JP2002501484A - 免疫毒素および免疫寛容を誘導する方法 - Google Patents

免疫毒素および免疫寛容を誘導する方法

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Abstract

(57)【要約】 新規なDT-およびETA-ベースの免疫毒素、ならびにＴ細胞増殖を含まない、免疫系障害を処置する方法が提供され、この方法は、抗CD3経路によって経路を定める抗体部分に連結される変異体ジフテリア毒素部分、またはその誘導体を含む免疫毒素を、障害が処置されるような条件下で、動物に投与する工程を包含する。従って、本発明は、移植片対宿主病を処置し得る。また、外来哺乳動物ドナー組識または細胞に対して、受容者において免疫寛容を誘導することによって拒絶応答を阻害する方法が提供され、以下の工程：ａ）受容者の抹消血Ｔ細胞リンパ球集団を、少なくとも80%まで減少するように、免疫毒素に受容者を曝露する工程であって、ここで免疫毒素はジフテリアタンパク質毒素に連結される抗CD3抗体であり、ここでこのタンパク質は結合部位変異を有する、工程；およびｂ）受容者にドナーの細胞を移植し、それによってドナーの器官細胞に対する受容者による拒絶応答は阻害され、そして宿主はドナー細胞に対して寛容される、工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫毒素および免疫寛容を誘導する方法 発明の背景発明の分野 本発明は、概して、免疫毒素、および霊長類において免疫学的寛容を誘導する ための技術に関する。これは、移植された器官の拒絶を阻害するための方法を提 供するに特に良好に適するようである。本発明はさらに、免疫毒素を投与するこ とによって、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫、移植片対宿主病、および自己免疫病 を処置する方法に関する。背景技術 米国において行われる臓器移植の数は、毎年約19,000件であり、主に、腎臓移 植（11,000）、肝臓移植（3,600）、心臓移植（2,300）、ならびにより少数の膵 臓、肺、心臓−肺、および腸の移植からなる。器官共有化のための米国ネットワ ーク（United Network for Organ Sharing）が国内の統計値を記入し始めた1989 年以来、約190,000件の臓器移植が米国で行われた。多いが確認することが困難 である件数の移植が、1989年以前に米国において行われ、そして同様に多数の移 植が、欧州およびオーストラリアにおいて行われ、そしてそれよりも少ない数の 移植がアジアにおいて行われている。 移植寛容は、不確定で非特異的な維持免疫抑制薬、およびそれに付随する副作 用についての必要性を伴うことなく行われる首尾良い同種異系の臓器移植を見る という理想を持った患者および医師に、捕らえどころのない目標を残存する。過 去10年間にわたって、これらの患者の大多数は、誘導免疫抑制または維持免疫抑 制のいずれかのために同様に使用される多様な他の免疫抑制剤とともに、シクロ スポリン、アザチオプリン、およびプレドニゾンで処置されてきた。米国におけ る維持免疫抑制療法の平均の一年の費用は、約10,000ドルである。拒絶を防止す るにおけるこれらの薬剤の効力は良好であるが、免疫抑制療法の副作用は、それ らが誘導する感受性の鈍さは非特異的であるので、かなりものである。例えば、 受容者は、感染に非常に感受性になり得る。移植免疫生物学における主な目標は 、連続的な薬理学的免疫抑制の副作用およびその付随する合併症および費用から 患者を解放する可能性を伴う、臓器移植に対する特異的な免疫学的寛容の開発で ある。 抗Ｔ細胞療法（抗リンパ球グロブリン）は、ドナー細胞の胸腺注射と組合わせ て、げっ歯類において使用されてきた（Posseltら、Science 1990；249：1293-1 295およびRemuzziら、Lancet 1991；337：750-752）。胸腺寛容は、げっ歯類モ デルにおける成功を証明し、そしてドナーからの器官同種移植の前に、同じドナ ーのアロ抗原への受容者の胸腺の曝露を包含する。しかし、胸腺寛容は、より大 きな動物においては報告されておらず、そしてヒトにおける寛容に対するその関 連性は知られていない。 このような免疫抑制を達成することを試みるための１つのアプローチは、後の 移植に対する寛容を誘導する可能性を伴って、移植の前にドナーからの細胞を受 容者に曝露することであった。このアプローチは、抗リンパ球血清（ALS）また は放射の適用後すぐに、受容者の胸腺においてMHCクラスI抗原を提示するドナー 細胞（例えば、骨髄）の配置を包含する。しかし、このアプローチは、生存する 霊長類（例えば、サル；ヒト）に適応するには困難であることを証明した。ALS および／もしくは放射は、宿主を、疾患もしくは副作用に対して感受性にし、な らびに／または効果が不十分である。 特異的な免疫学的寛容に対する信頼できる、安全なアプローチが開発されれば 、これは、新規な臓器移植に対する迅速な適用、および安全な移植機能を有する 受容者にける既存の移植片に対する潜在的な適用により、素晴らしく価値のある ものであり、および世界中の患者および移植医師を魅了する。従って、非常に特 異的な免疫抑制が所望される。さらに、ALSおよび放射を使用する有害な影響を 伴わずに、霊長類において寛容を与えるための手段の必要性がある。さらに、目 標は、拒絶応答を非常に簡単に遅延することを達成することである。むしろ、重 要な目標は、拒絶が、移植片受容者間の平均寿命を減少するにおける因子ではな い程度に拒絶応答を阻害することである。 本発明は、免疫寛容を誘導する方法を提供することによって、これらの必要性 を満たす。 シュードモナスの外毒素Ａ（ETA）は、免疫毒素構築のために広範囲に用いら れてきた（62〜63）。しかし、上述で列挙される制限下で２価抗体と結合または 融合され得る、減少したレセプター結合活性を有する利用可能なETAの唯一の形 態のETA-60EF61Cys161は、抗CD3抗体のUCHT1または抗CD5抗体のT101（Hybritech Corp.、San Diego、CA）を使用する場合、10nMで、20時間を超えて、ヒトＴ細 胞に対して非毒性である。ETA-60EF61は、残基60と61との間の位置での２つのア ミノ酸の挿入による結合部位活性の欠損を達成する。さらに、結合は、Met161を システインに変換して、チオエーテル結合を許容することによって達成される。 この毒素構築物は、ヒトトランスフェリンレセプター（IC50＝１pM）またはマウ スＢ細胞IgMレセプターにて標的される場合、非常に高い毒性を示す（64）。ETA は、DTよりもタンパク質分解的にプロセスすることが非常に困難であることが知 られ、そして多くの細胞はこの機能を行い得ない（53〜55）。細胞によって毒素 をプロセスする能力はまた、標的化エピトープまたは経路設定（routing）の経 路に依存するようである（55）。毒素は、プロセシング部位が、中性pHで「隠さ れ」、そしてインビトロで毒素を不活性化する酸性pHでのみ利用可能になるので 、DTのようにインビトロでプロ七スされ得ない（53）。 プロセシングを必要としないETAの誘導体は、残基280でプロセシング部位の後 ろの結合ドメインIを短縮することによって作製されてきた。しかし、共有結合 性の非還元性の結合は、移行効率を非常に減少することなく遠位の37kD構造を作 製され得ない。それゆえ、これらの誘導体は、チオエーテル結合化構造または融 合構造として、2価の抗体とともに使用され得ない。 ２価の抗体を有するジスルフィド結合体が記載されたが、脈管区分内のジスル フィド結合の還元に起因して、低いインビボ寿命を被る（62）。２つのFvドメイ ンを含む、sc短縮化ETA融合タンパク質が記載された。しかし、用量応答性の毒 性曲線は、単一のFv構築物に比較して、せいぜい３倍の親和性の増加のみを示し 、このことは二重Fv構築物が、典型的な２価の抗体として挙動しないことを示唆 する（65）。その結果として、ほとんどストリンジェントでないプロセシング特 性 を有するかまたはプロセシングを必要としない、ETA-60EF61Cys161の形態のいず れかを有することは、かなりの有用性である。 本発明は、これらの誘導体を提供する。これらは、利用可能なシステインを結 合することによって、またはアミノ末端で付加される１本鎖の２価抗体を有する 融合タンパク質としてのいずれかで、抗CD3または他の抗Ｔ細胞抗体でＴ細胞を 標的するために使用され得る。 発明の要旨 本発明の目的は、免疫系疾患を処置するための免疫毒素を提供することである 。 本発明のさらなる目的は、Ｔ細胞増殖を含まない免疫系疾患を処置する方法を 提供することであり、罹患された動物に、抗体部分に連結された変異体ジフテリ ア毒素（DT）またはシュードモナス外毒素（ETA）の毒素部分を含む免疫毒素を 投与する工程を含む。抗体または標的化部分は、好ましくは、Ｔ細胞エピトープ 経路（例えば、CD3経路）によって経路設定される。従って、本発明の方法は、 移植片対宿主病を処置し得る。 免疫寛容を誘導する方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。従 って、本発明は、外来の哺乳動物ドナーの組識または細胞に対して、受容者にお いて免疫寛容を誘導することによって、拒絶応答を阻害する方法を提供し、以下 の工程： ａ）受容者の抹消血およびリンパ節Ｔ細胞リンパ球集団を、少なくとも75%、好 ましくは80%まで減少するように、免疫毒素に受容者を曝露する工程であって、 ここで免疫毒素は、ジフテリア毒素に連結された抗CD3抗体であり、タンパク質 は結合部位の変異を有するか；または抗体はシュードモナスタンパク質外毒素Ａ に連結され、タンパク質は結合部位の変異および毒素のタンパク質分解性のプロ セシングを達成もしくは促進する第２の変異を有する、工程、ならびにｂ）受容 者にドナーの細胞を移植し、それによってドナーの器官細胞に対する受容者によ る免疫応答は阻害され、そして宿主は、ドナー細胞に対する寛容を生成される、 工程を包含する。 それゆえ、本発明の目的は、それらの器官からの移植された器官または細胞に 対する寛容を誘導するために上記の種類の方法を提供することを含む。本発明の このおよびさらに他の目的および利点は、以下の記載から明らかである。 図面の簡単な説明 図１ａ、１ｂ、および１ｃは、DTの最後の150アミノ酸にある毒性のヒト血清 の阻害に関与するエピトープを示す。DT変異体のCRM9、CRM197、およびMSP△5の 模式的な図が示される（図１ａ）。A-サブフラグメントおよびB-サブフラグメン ト、ならびにそれらの相対的な大きさおよび位置が示される。黒丸は、本明細書 中に記載されるような点変異を示す。ヤギ（図１ｂ）またはヒト（図１ｃ）の血 清（ヒト血清は、抗DT抗体についてポジティブなELISAを有する全てのサンプル からのプールである）は、漸増モル濃度のCRM197（-○-）、MRP△5（-×-）、ま たはDTのB-サブフラグメント（-△-）とともに、30分間、室温でインキュベート された。この反応のために、UCHT1-CRM9が、１×10-10Mの最終濃度に添加された 。次いで、この混合物は、材料および方法において記載されるように、タンパク 質合成阻害アッセイにおいてJurkat細胞上で10倍に希釈された。培地とともにイ ンキュベートされた免疫毒素は、コントロールの４%だけタンパク質合成を阻害 した。結果は、２つの独立したアッセイの代表である。 図２ａおよび２ｂは、sFv-DT390が、CD3複合体に対する特異性を維持するが、 Jurkat細胞に対して、UCHT1-CRM9よりも16倍毒性が低いことを示す。図２ａは、 材料および方法において記載されるように、タンパク質合成阻害アッセイにおい て試験された漸増濃度のsFv-DT390（-△-）またはUCHTI-CRM9（-○-）を示す。 結果は、４回の別個の実験の平均である。図２ｂは、１×10-10M UCHT1-CRM9（- ○-）または3.3×10-10M sFv-DT390（-△-）と混合され、次いでタンパク質合成 阻害アッセイのために細胞に添加された漸増濃度のUCHT1抗体を示す。 図３は、１本鎖抗体scUCHT1遺伝子構築物の作製のための、模式的なフローシ ートを示す。PCR：ポリメラーゼ連鎖反応；L：リンカー：SP；シグナルペプチド 。P1〜P6、SP1、およびSP2は、PCRにおいて使用されたプライマーであり、そし て表１において列挙される。 図４は、１本鎖抗体scUCHT1のウエスタンブロット分析を示す。scUCHT1は、免 疫沈降され、そして4〜20% SDS/PAGE勾配ゲル上で分離された。ProblottTMメン ブレンへのトランスファー後、scUCHT1は、ホスファターゼで標識された抗ヒトI gM抗体によって可視化された。分泌されたscUCHT1は、主にダイマー形態であっ た。レーン１〜３は、還元条件下での電気泳動を示し、そして４〜６は、非還元 状態下での電気泳動を示す。レーン１〜６はヒトIgMであり；レーン１は、IgM重 鎖である。軽鎖は、抗IgM抗体が重鎖で検出されるので、可視可能ではない；レ ーン６：IgM５量体は、矢印によって示される。レーン２および４は、COS-7細胞 からのscUCHT1であり；３および５は、SP2/0細胞からのscUCHT1である。 図５は、scUCHT1が、その親の抗体のUCHT1と同じ特異性および親和性を有した ことを示す。拮抗アッセイにおいて、125I-UCHT1は、Jurkat細胞の結合における トレーサーとして使用された。示された濃度を有するCOS-7細胞からの（□）お よびSP2/0細胞からの（△）、scUCHT1、または未標識のUCHT1（○）は、拮抗因 子として含まれた。結果は、拮抗因子の不在下の細胞に結合される125I-UCHT1の パーセントとして表された。 図６は、scUCHT1がヒトＴ細胞増殖応答を誘導しなかったことを示す。COS-7細 胞からのscUCHT1（△）およびSP2/0細胞からのscUCHT1（○）、ならびにUCHT1（ □）は、示された濃度でヒトPBMCに添加され、そしてＴ細胞増殖が、[3H]チミジ ン取込みによってアッセイされた。UCHT1は、活発な増殖応答を誘導した。対照 的に、scUCHT1は、任意の用量でほとんど効果を有しなかった。 図７ａは、UCHT1およびscUCHT1が、TNF-α分泌に対してほとんど効果を有しな かったことを示し、そしてCOS-7細胞（△）およびSP2/0細胞（○）の両方からの scUCHT1、ならびにUCHT1（□）は、ヒト血液単核細胞の培養物に添加された。培 養上清が収集され、そして材料および方法において記載されるように、TNF-αお よびIFN-γのELISA測定のために使用された。 図７ｂは、UCHT1およびscUCHT1が、IFN-γの基本的な産生を阻害したことを示 す。COS-7細胞（△）およびSP2/0細胞（○）の両方からのscUCHT1、ならびにUCH T1（□）は、ヒト血液単核細胞の培養物に添加された。培養上清が収集され、そ して材料および方法において記載されるように、TNF-αおよびIFN-γのELISA測 定のために使用された。 図８は、分泌されたscUCHT1免疫毒素を示すウエスタンブロットである。 図９は、２価の免疫毒素融合タンパク質を発現する１つのクローンを示す。 図10ａは、免疫毒素処置後の末梢血におけるCD3+細胞の涸渇および回復を示す 。日数は、免疫毒素の最初の投与後の日数をいう。 図10ｂは、免疫毒素処置後のリンパ節におけるCD3+細胞の涸渇を示す。 図11は、いくつかの２価の結合された免疫毒素の模式図であり、ここで１本鎖 抗体の可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）クローン化マウスドメインは、リン カー（L）によって連結され、そして２価構造を形成する鎖間ジスルフィドを提 供するためにヒトIgMのμCH2またはγIgG（H）のヒンジ領域のいずれかと融合さ れる。毒素は、チオエーテル結合を介して、γCH3の付加されたカルボキシ末端 システイン（C）、またはμCH3のC414もしくはμCH4のC575のいずれかに結合さ れる。DTまたはETAに基づく毒素部分は、結合鎖内にシステイン置換を含む結合 部位変異体である。ETAに基づく毒素は、酸性pHでのタンパク質分解性のプロセ シングからそれらを独立させるようにさらに変化されている。模式図は、タンパ ク質を示し、アミノ末端は左側である。 図12は、VLおよびVHドメインがジシストロニックな（dicystronic）発現ベク ターからの別々の鎖において作製されたことを除いて図11に類似する、いくつか の２価の結合された免疫毒素の模式図である。これらの構築物は、抗体部分の安 定性が増強される利点を有する。 図13は、ETAに基づく１本鎖融合タンパク質であるいくつかの２価の免疫毒素 の模式図であり、ここでETA触媒ドメインは、融合タンパク質のカルボキシ末端 を占有する。鎖間ジスルフィドは、図11におけるように作製される。ETAに基づ く変異毒素は、酸性pHでのタンパク質分解性のプロセシングからそれらを独立さ せ、中性pHプロセシングおよび還元後に遊離の37kD触媒ドメインの移行を許容す るようにさらに変化されている。 図14は、DTに基づくことを除いて図13に類似するいくつかの２価の１本鎖免疫 毒素融合タンパク質の模式図であり、ここでDT触媒ドメインは、融合タンパク質 のアミノ末端を占有し、中性pHプロセシングおよび還元後に遊離の毒素Ａ鎖の移 行を許容する。 図15は、DSG（デオキシスペルグアリン（deoxyspergualin））およびソルメド ロール（solumedrol）での処置を伴うサルと伴わないサルの腎臓移植後における FN18-CRM9免疫毒素処置後の血清IL-12の上昇を示す。 図16は、DSGおよびソラムドロールでの処置を伴うサルと伴わないサルの腎臓 移植後におけるFN18-CRM9免疫毒素処置後の血清IFN-γの上昇を示す。処置は、I FN-γの上昇を劇的に減少させる。 図17は、免疫毒素後の周囲移植期間（peritransplant period）におけるDSGお よびソラムドロールでの処置が、体重増加（IFN-γ上昇に関連する脈管漏出症候 群（vascular leak syndorome）の徴候）を抑制することを示す。 図18は、免疫毒素後の周囲移植期間におけるDSGおよびソラムドロールでの処 置が、低タンパク質血症（IFN-γ上昇に関連する脈管漏出症候群の徴候）を抑制 することを示す。 発明の詳細な説明 本発明は、免疫毒素、ならびに免疫寛容を誘導するためおよび疾患を処置する ためにこれを使用する方法を提供する。 免疫毒素 本発明は、免疫毒素に関連する。より詳細には、１本鎖（SC）可変領域抗体部 分（標的部分）に連結された変異毒素部分（例えば、DT毒素またはETA毒素）を 含む免疫毒素が提供される。従って、本発明は、組換え的に生成される毒素部分 に連結される（結合される）組換え的に生成される抗体部分を有する免疫毒素、 および融合免疫毒素（ここでは、毒素および抗体ドメインの両方は、組換え構築 物から生成される）を提供する。本出願は、毒素および抗体のドメインの配置、 ならびにその中のサブ領域に関する必要な情報を提供するので、任意の数の化学 結合または組換えDNAの方法が、本発明の免疫毒素を作製するために使用され得 ることが認識される。従って、融合毒素または結合された毒素に対する言及は、 必ずしも制限されない。 抗体部分は、好ましくは、抗CD3経路または他のＴ細胞エピトープ経路によっ て経路設定される。免疫毒素は、１価であり得るが、２価の抗体部分が現在好ま しい。なぜならそれらが約15倍まで細胞殺傷を増強することが見出されているか らである。免疫毒素は、組換え的に生成される融合タンパク質であり得る。免疫 毒素は、組換え的に生成される２価の抗体（標的部分）および組換え的に生成さ れる変異毒素部分の独特の部位での化学的なチオエーテル結合によって作製され 得る。免疫毒素の標的部分は、ヒトμCH2、μCH3、およびμCH4領域、ならびに マウスIg抗体由来のVLおよびVH領域を含み得る。これらの領域は、抗体UCHT1由 来であり得、その結果、抗体部分はscUCHT1であり、これは図において示される ように、ヒトμCH2、μCH3、およびμCH4領域ならびにマウス可変領域を有する １本鎖CD3抗体である。これらは、sc抗CD3抗体の最初の例であると考えられてい る。多数のDT変異毒素部分（例えば、DT390）が、本明細書中に記載される。従 って、免疫毒素のまさに１つの具体的な例として、本発明はscUCHTl-DT390を提 供する。この免疫毒素の誘導体は、本明細書中に記載されるように設計および構 築される。同様に、ETA免疫毒素もまた、本明細書中に記載される。 毒素部分は、その毒性機能、および全量でのサイトゾルへの膜移行機能を保持 する。タンパク質のレセプター結合ドメインに位置される結合機能の喪失は、非 標的細胞への結合を減少することによって全身性の毒性を減少させる。従って、 免疫毒素は、安全に投与され得る。毒素結合機能によって通常供給される経路設 定機能は、抗CD3抗体を標的化することによって供給される。不可欠な経路設定 の経路は、（１）エンドサイトーシスのためのコートされた窩（pit）への局在 化、（２）リソソーム経路設定からの脱出（escape）、および（３）形質膜への 帰還（return）である。さらに、ETAはまた、後期エンドソームを介して、およ びゴルジ区画を介して小胞体に、経路を定め得る。DTではなくETAを使用する利 点は、その異なる経路設定が、特定のＴ細胞サブセットに存在し得るCD3以外の Ｔ細胞エピトープをより良好に補充し得ことである。さらなる利点は、DTを有す る症例と同じように、ETAに対する抗体を含むヒトが非常に少ないことである。 特定の例は、以下に記載される。 この様式において経路を定め得る任意の抗体は、抗体が指向されるエピトープ に関わらず、毒素がこの経路に添って十分なタンパク質分解性のプロセシングを 達成する限り、毒素部分に有効である。十分なプロセシングは、細胞殺傷化のレ ベルによって決定され得る。このプロセシングは、ETAについて特に重要であり 、そして特定の細胞に存在しない（53〜55）。それゆえ、合成の間にプロセシン グが行われるETA変異体、またはインビトロもしくはインビボプロセシングを容 易にする変異体が、記載される。従って、広範な種々の細胞型が標的化され得る 。 エンドソームの酸性化の結果として、特定のレセプターにおいて誘導されるレ セプターの立体配置における変化のために、抗体がそれらのレセプターから解離 する場合、抗体はリボソーム経路に入る。これは、形質膜により近い同じレセプ ター上の外部ドメイン（ectodomain）エピトープに対して抗体を指向することに よって、阻止または最小化され得る（Ruudら（1989）Scand．J．Immunol．29:29 9；Herzら（1990）J．Biol．Chem．265:21355）。 変異体DT毒素部分は、短縮化された変異体（例えば、DT390、DT383、DT370、 または他の短縮化された変異体）、ならびに点変異を有する全長毒素（例えば、 DTM1（実施例9〜11において記載される）、またはCRM9（C.ulceransにおいてク ローン化された））であり得、DTMIとDT483を有するscUCHT1融合タンパク質、DT 390およびDT370は、クローン化され、そしてE.coliにおいて発現されている。抗 体部分は、scUCHT1、または経路設定および本明細書中に詳細に記載される他の 特徴を有する他の抗CD3もしくは抗Ｔ細胞抗体であり得る。従って、本発明の方 法において使用するための免疫毒素の１つの例は、融合タンパク質の免疫毒素UC HT1-DT390である。原則として、記載される免疫毒素は、本発明の方法において 使用され得る。 組換え免疫毒素は、組換えsc２価抗体または組換えのジシストロニックな２価 抗体、および組換え変異毒素（それぞれ、対になっていない１つのシステイン残 基を含む）から生成され得る。本発明の方法の利点は、毒素が、それらのネイテ ィブの細菌によって容易に生成され、そして正確に折り畳まれるのに対し、抗体 は真核生物細胞においてより良好に生成され、そして折り畳まれることである。 さらに、このことは、いくつかの免疫毒素融合タンパク質で困難であり得る、真 核生物と原核生物との間のコード優先性（coding preference）における差異を 提示する。 本発明の２価の組換え抗Ｔ細胞免疫毒素を生成する一般的な原理は以下である ： １．２つの１価の鎖を架橋するジスルフィド結合は、天然のIgドメインから（ 例えば、μCH2（残基228〜340のC337、またはγIgGヒンジ領域（残基216〜238の C227[C220Pを有する]）から）から選択される（図11〜14を参照のこと）。 ２．１価の鎖間の十分な非共有結合性の相互作用は、高親和性相互作用および 密接な結晶学的接触または溶液接触を有するドメイン（例えば、μCH2、μCH4（ 残基447〜576）、またはγCH3（残基376〜346））を含むことによって供給され る。これらの非共有結合性の相互作用は、鎖間ジスルフィド結合の形成のための 適切な折畳みを容易にする。 ３．融合免疫毒素について、毒素に対する抗体の配向は、毒素部分の触媒ドメ インが、還元条件下でその天然のプロセシング部位でタンパク質分解を受ける場 合、遊離体になるように選択される。従って、ETAに基づくITにおいて、毒素部 分はカルボキシ末端にあり（図13）、そしてDTに基づく融合ITにおいて、DTに基 づく毒素部分は、融合タンパク質のアミノ末端にある（図14）。 ４．化学的に結合される免疫毒素について、１つのシステインが、毒素結合ド メイン内に挿入される。抗体は、鎖間接触（例えば、μCH3 414、μCH4 575、ま たはC447でのμCH3への付加）から離れて溶媒に突き出る、１鎖あたり１つの遊 離システインのみを有するように操作される。結晶構造は、この領域が非常に溶 媒に接近可能であることを示す。過剰の遊離のシステインは、アラニンに変換さ れる（図11〜12）。 ５．毒素は、点変異、挿入または欠失によってそれらの結合ドメインにおいて 変異され、野生型よりも結合活性において少なくとも1000倍の減少を有し、そし て移行欠陥がない。 ６．毒素結合部位変異体は、中性pHでのタンパク質分解性のプロセシングし得 ない場合、この結果を達成するためにプロセシング領域において改変される。 完全長のジフテリア毒素残基１〜535（Kaczovekら（56）によって記載される 番号付け設定を使用した）の結合部位変異体（CRM9）S525F（57）、は、結合ド メイン（残基379〜535）における残基をシステインに変更することによって、化 学結合についてさらに改変され得る。現在好ましい残基は、38%よりも大きい、 曝露される溶媒面積を有する残基である。これらの残基は、K516、V518、D519、 H520、T521、V523、K526、F530、E532、K534、およびS535である（57）。これら のうち、K516およびF530が、現在好ましい。なぜなら、それらが任意の残余の結 合活性をブロックするようであるからである（57）。しかし、新たなシステイン 残基の最大の結合は、もっとも高度に曝露される溶媒表面および正に荷電した残 基への近接（これは、システイン-SH pKaを低下する効果を有する）によって増 強される。これらの残基は、D519およびS535であり、これによってこれらは上述 の可能性の列挙から現在好ましい。 CRM9のS525F変異およびシステイン結合部位を導入するために結合部位ループ を曝露する514〜525内のさらなる置換（例えば、T521C）を含むDTの二重変異体 は、CRM9プロモーターおよびシグナル配列によって先行されるCorynebacterium ulceransにおいて生成され得る。二重変異体は、CRM9−抗体融合タンパク質を生 成するプラスミドと、526位で停止コドンを有する（ギャップ化プラスミド変異 誘発）PCR作製された変異体DNAとの間の組換え事象によって、Corynebacterium ulceransにおいて作製される。このCRM9-C'は、過剰なビスマレイミドヘキサン をCRM9-C'に添加し、そしてμCH4ドメインの末端またはμCH3ドメインの末端の いずれかで、遊離のシステインを含む１本鎖の２価抗体に結合することによって 、特異的なチオエーテル変異体毒素の２価抗体構築物を形成するために使用され 得る（出願番号第08/739,703号を参照のこと、本明細書中に参考として援用され る）。 これらのおよび他の変異は、二重変異体DT S508F S525F、またはCOOH末端に付 加されたタンパク質ドメインに起因して減少された毒性を有するCRM9 COOH末端 融合タンパク質構築物（59）のいずれか含む、新たに設計されるE.coli/C.ulcer ansシャトルベクターyCE96を使用して、ギャップ化プラスミドPCR変異誘発（56 ）によって達成される。ベクターyCE96の配列は、配列番号１において示される 。１〜373位および2153〜3476位の残基は、ベクターLITMUS 29に由来し、ならび にそれぞれ、ポリクーロニングリンカー部位およびアンピシリン耐性マーカーを 含む。374〜2152位の残基は、プラスミドpNG2に由来する配列であった。これら の 構築物の両方は、これらが両方ともに個々に毒性を減少する２つの変異を含み、 それゆえ一塩基対の反転によって野生型毒素をE.coliに導入する機会を非常に減 少させる点で、DT誘導体のE.coliへのクローニング(60)についての現在のNIHの 指針に従う。 毒素ヌクレオチドの1523位で制限部位SphI(56)、および毒素のCOOH末端部位を CE96のポリリンカークローニング部位にクローニングするために使用される制限 部分（例えば、XbaまたはBamHI）を使用して、毒素構築物のCOOH末端の52塩基対 を欠失することによって、変異誘発が行われる。SphI、Xba、およびBamHIは、挿 入される毒素構築物を含むベクターyCE96内で単独でのみ生じるので、COOH末端 コード領域が欠失された、ギャップ化されてＣ末端コード領域に欠失された直鎖 にされたされたプラスミドが、結果物である。PCRを使用して、CRM9のCOOH末端 領域は、所望の変異を導入し、そしてギャップに近接する下流領域および上流領 域に相同な30〜40塩基対を含んで再構築される。増幅された産物は、ゲル精製さ れ、そしてギャップ化プラスミドとともにC.ulceransにエレクトロポレーション される（58）。相同領域での組換えは、NIHの毒素クローニングの制限（60）に 具体的に供されないCorynebacteriae内で、DT産物の細胞内で達成される部位特 異的変異誘発を生じる。新規なベクターの例は、yCE96であり、その配列は、配 列番号１において提供される。 変異された毒素は、低レベルの還元剤（２mM βメルカプトエタノールと等価 ）が、対になっていない導入された-SH基を保護するために精製において含まれ ることを除いて、親毒素に類似して生成され、そして精製される。チオエーテル 化学結合は、ドメインμCH3における残基414（図11〜12を参照）またはドメイン μCH4における残基575のいずれかで、このドメインが含まれる場合、２価の抗体 構築物内の１つの対になっていないシステインに対して達成される。この場合に おいて、ドメインμCH3は、C414Aが変異され、単一の結合部位のみを提供する。 μCH4を含む利点は、２価抗体の安定性を増強することである。不利益は、過剰 なドメインは、大きさを増加させ、それによって抗体生成の間の分泌効率を減少 させることである。CH3ドメインで終結する利点は、別の改変体において、His6 精製タグが、抗体精製を容易にするためにμCH3 COOH末端で添加され得ることで ある。別の改変体は、鎖間ジスルフィドを形成し、そしてμCH3またはμCH4を介 して結合するγヒンジ領域を使用する。この改変体は大きさをより小さくする利 点を有し、CD3エピトープ結合ドメインにより近くに毒素部分を配置し、これは 、毒素膜移行効率を増加し得る（図11〜12を参照のこと）。Hisタグは、精製の 補助として、カルボキシ末端で含まれ得る。SH-CRM9は、PBS pH8.5中で10mg/ml に濃縮され、そして15倍モル過剰のビスマレイミドヘキサン（BMH）(Pierce、Ro ckford、IL）と反応する。過剰のBMHは、小さなG25Fカラム（Pharmacia、Piscat away、NJ）を介して通過することによって除去される。ここで、約５mg/mlでの マレイミド由来の毒素が、約10mg/mlでのscUCHT1 ２価抗体に、室温にて添加さ れる。１時間後、結合体は、非反応性の開始産物から、Zorbax（Dupont）GF250 ６ミクロン樹脂で充填された２インチ×10インチM0Dcolカラム（大規模生成のた めに）に対するサイズ排除HPLCによって分離される。ETA60EF61cys161の誘導体 はまた、同じ方法によってscUCHT1 ２価抗体に結合される。 付加されたシステインを含むCRM9に結合するために使用され得る、２価抗体の 別の改変体は、UCTH1のVL領域およびVH領域を含む操作されたキメラ抗体である 。しかし、この場合において、VLドメインは、κCLドメインおよび停止コドンが 続く。この構築物のアミノ末端は、VLシグナル配列を含む。この遺伝子は、発現 系に依存する適切なベクター中に挿入され、そして適切なプロモーターによって 先行される。ベクターはまた、第２のプロモーター、続いてVHシグナル配列、続 いてUCHT1からのVH、μCH1、μCH2、μCH3、およびμCH4を含む。μCH4が含まれ る場合、Cys575はアラニンに変更され、そして結合は、以前に記載されるように 、μCH3のCys414を介して行われる。しかし、μCH4は欠失され得る。カルボキシ 末端Hisタグは、精製を容易にするために使用され得る。この構築物は、真核生 物細胞からのμ重鎖を含む、正確に折畳まれた２価の抗体として分泌される。こ れは、Cys575の欠失に起因する単量体の抗体である。この構築物の利点は、CH1 およびCLドメインによって提供されるVL VH会合の増強された安定性、および軽 鎖のシグナル配列が完全なシグナル鎖構造を分泌するために使用される１本鎖抗 体構築物における場合（Peishengら、1995）と対照的に、重鎖は、重鎖シグナル 配列によって先行されるという事実に起因する、増強された分泌である。 DTに基づく２価のＴ細胞融合免疫毒素が提供され、ここでは毒素ドメイン（「 毒素部分」または「tox」としても本明細書中で呼ばれる）は、完全長変異体S52 5F（CRM9）であるか、または390または486で短縮される（まとめてTox）かのい ずれかであり、そして左から右へのアミノ末端からのドメインの配列は、以下の 中から選択され得る： Tox、μCH2、μCH3、VL、Ｌ、VH、ここで、Ｌは、(G4S)3リンカーであり、VLお よびVHは、抗CD3抗体UCHT1の可変軽鎖および可変重鎖ドメインである。 Tox、μCH2、μCH3、μCH4、VL、Ｌ、VH Tox、γCH3、Ｈ、VL、Ｌ、VH、ここでHは、γIgGヒンジであり Tox、Ｈ、VL、Ｌ、VH Tox、μCH2、VL、Ｌ、VH Tox、VL、Ｌ、VH、Ｈ、γCH3 Tox、VL、Ｌ、VH、μCH2 Tox、VL、Ｌ、VH、Ｌ、VL、Ｌ、VH （図14を参照のこと）。 非ジフテリア毒素ベースの抗Ｔ細胞の２価の免疫毒素の要件 タンパク質毒素部分の他のタイプが、寛容の誘導、ならびに自己免疫疾患およ びGVHDの処置のために、抗Ｔ細胞免疫毒素において利用され得る。必要とされる ことは、血液およびリンパ節区分内のＴ細胞の１〜２logの殺傷が、過度の全身 性の毒性を伴うことなく達成され得ることで全てである。次いで、これは、経路 設定エピトープが、毒素中毒経路と平行して経路を定めること、および結合部位 変異体が利用可能であるか、または毒素移行効率を妥協することなく野生型毒素 に比較して1000倍まで毒素結合を減少する、その結合ドメインにおいて短縮され る毒素が利用可能であることを必要とする（1992年12月１日に発行された、米国 特許第5,167,956号を参照のこと）。抗体を介する標的化を使用する場合に加え て、２価の抗体は、一般に、１価の抗体の15倍より低い親和性に起因する十分な 細胞殺傷を達成するために、インビボ条件下で必要とされる（図2a、2b）。しか し、１本鎖融合タンパク質としてか、または特定の操作された結合部位を介して のいずれかで、２価の抗体に毒素を連結する方法は、移行効率を妨げてはならな い。これは、毒素の触媒ドメインが妨げのない移行を達成し得るように注意が払 われない限り、１価のscFv抗体に比較して、より大きな大きさの多くの２価抗体 のに起因して生じ得る。これは、融合タンパク質抗体部分が、上述のように、毒 素結合鎖のCOOH末端と隣接するDTベースの結合部位変異体を使用して、DTベース の免疫毒素について達成される（図14）。これは、Arg/Serタンパク質分解性の プロセシング部位残基193/194をまたがるジスルフィドループが、還元されると すぐに、触媒Ａ鎖を移行させる。大部分の標的化細胞は、このプロセシング事象 を行い得、そして化学的に結合されるCRM9が使用される場合、このプロセシング は、結合の前にトリプシンによって行われる。非DT免疫毒素についてのこの関係 の影響は、以下にさらに記載される。 プロセシング制限から解放されたシュードモナスの外毒素Ａ誘導体 ETA-60EF61Cys161は、タンパク質分解性のプロセシング部位がジシストロニッ クなメッセージから合成される場合、残基279〜280の間のペプチド骨格における 破壊を用いて作製され得る。残基１〜279をコードするヌクレオチドは、毒素プ ロモーターの後ろに配置され、そして停止コドンが続く。プロモーターは、反復 され、第２の停止コドンが続く。この様式において作製されるITは、「ジシスト ロニック」と呼ばれる。分泌されるタンパク質の大規模画分は、抗体Fd片が、重 鎖および軽鎖のジシストロニックなメッセージから生成される（66）のとほとん ど同様に、279/280でのペプチド骨格破壊をまたぐS-Sループ265〜287によってと もに保持される、完全長の正確に折畳まれたタンパク質の形態にある。他の発現 ベクターが使用され得る。この構築物は、ETA-60EF61Cys161、279//280と呼ばれ る。 ETA-60EF61Cys161およびETA-60EF61は、プロセシング部位および架橋S-Sルー プ265-287の領域における部位特異的変異誘発によって改変され得、この領域を 中性pHでインビトロにて、またはエンドソーム酸性化の前にフリンを会合したイ ンビボの外細胞膜にて容易にプロセシングされるDTにおける領域に、より類似さ せる。この範囲においてDTに対する増加する類似性を有する、３つのさらなる変 異体が記載される。これらは、Cys161誘導体について示されるが、融合タンパク 質における使用についてのCysの置換を伴わないでもまた作製され得、抗体ドメ インについて付加された領域は、アミノ末端に供給される（図11、12、13）。 シュードモナス外毒素Ａに基づく２価の抗Ｔ細胞融合免疫毒素が提供され、こ こで、毒素部分（まとめてTox２として知られる）は、完全長の変異体結合部位 挿入変異体ETA60EF61であり、これは、中性pHのタンパク質分解性のトリプシン ／フリン様のプロセシングを許容するように、そのタンパク質分解性プロセシン グ領域においてさらに改変されており、以下のようであり得る： ETA-60EF61、M161C、P278R ETA-60EF61、M161C、P278R、Q277V、H275N、R274G ETA-60EF61、M161C、P278R、Q277V、H275N、R274G、T273A、F272C、C265A。 左から右へのアミノ末端からのこれらの免疫毒素におけるドメインの配列は、 以下から選択され得る： VL、L、VH、H、μCH3、Tox2 VL、L、VH、H、μCH4、Tox2 VL、L、VH、μCH2、μCH4、Tox2 VL、L、VH、μCH2、μCH3、μCH4、Tox2 VL、L、VH、H、Tox2 ２価の抗Ｔ細胞チオエーテル結合化免疫毒素は、シュードモナスの外毒素ＡＥ TA60EF61Cys161に基づき、完全長の毒素結合部位変異体部分が、システインに変 換される結合ドメイン（Tox3として集合的に知られる）を含み、ここでCys161は 、結合目的のためのMet161の操作された置換体である。ETA毒素部分は、タンパ ク質分解性のプロセシングを許容するためにさらに改変され得るか、またはプロ セスされた形態において合成され得る。あるいは、毒素部分が完全長ジフテリア 毒素に基づく場合、これは以下の変異を含み得る： S525F、K530C S525F、K516C S525F、D519C S525F、S535C。 これらの免疫毒素において、左から右へのアミノ末端からのドメインの配列は 、以下から選択され得る： VL、L、VH、H、γCH3、C、ここでCは、ネイティブでないC末端システイン結合 残基である、 VL、L、VH、H、μCH4、ここで結合は、μCH4 C575を介してである、 VL、L、VH、μCH2、μCH4、ここで結合は、μCH4 C575を介してである、およ び VL、L、VH、μCH2、μCH3、μCH4、ここでC575Aここで結合は、μCH3 C414を 介してである。 ２価のジシストロニックな抗Ｔ細胞チオエーテル結合化免疫毒素が提供され、 ここで、完全長の毒素結合部位変異体部分は、シュードモナスの外毒素Ａ ETA60 EF61Cys161に基づくか、またはタンパク質分解性のプロセシングを許容するため にさらに改変されるか、またはプロセスされた形態において合成される、システ インへの結合ドメイン（Tox2として集合的に知られる）の変換を含む。あるいは 、毒素部分が完全長のジフテリア毒素に基づく場合、これは、以下の変異を含み 得る： S525F、K530C S525F、K516C S525F、D519C S525F、S535C。 これらの免疫毒素において、一方のシストロンは、UCHT1の可変重鎖ドメイン の融合タンパク質、続いてγ定常軽鎖ドメインを、アミノ末端から分泌し、そし て他方のシストロンは、左から右へのアミノ末端からの以下のドメインの１つを 分泌する： VL、γCH1、H、μCH3、μCH4、ここでC575Aおよび結合は、μCH3 C414を介し てである、 VL、γCH1、H、μCH4、および結合は、μCH4 C575を介してである、 VL、γCH1、H、μCH3、C、ここでCは、操作されたC末端システイン結合残基で ある、ならびに VL、γCH1、H、μCH4、ここで結合は、μCH4 C575を介してである。 シュードモナス外毒素Ａ ETA60EF61Cys161は、シュードモナス残基１〜279お よび残基280〜612の別個のｍRNAをコードするジシストロニックな構築部におけ る発現によって残基279/280間のペプチド骨格破壊を達成するために、さらに改 変され得る。この免疫毒素は、タンパク質分解性のプロセシングを必要としない 。 本発明の抗体-毒素構築物は、関連のパラメーターが知られているので、免疫 毒素として効果であると予測され得る。以下のパラメータの考察は、寛容誘導に おける免疫毒素の使用に関連する。関連の結合構築物、レセプターの数、および ヒトについての移行速度が測定され、そして使用されている。インビトロでの標 的化および非標的化細胞についての抗CD3-CRM9についての結合価、ならびにイン ビトロでの標的化および非標的化細胞への抗CD3-CRM9結合体についての移行速度 は、記載されている（Greenfieldら（1987）Science 238:536、Johnsonら（1988 ）J．Biol．Chem．263:1295；Johnsonら（1989）J．Neurosurg 70:240；およびN evilleら（1989）J．Biol．Chem．264.14653）。インビトロで標的化細胞への移 行速度を制限する比率は、図２ａに記載され、ここで10-11Mでの抗CD3-CRM9結合 体は、20時間で、約75%の細胞におけるタンパク質合成の阻害によって測定され るように、約75%の存在する標的化細胞に移行されることが示される。タンパク 質合成の阻害は、結合体が移行する細胞において完全である。 ヌードマウスにおけるインビボ研究において決定されるパラメータは、以下を 含む：腫瘍荷重は、0.1%の体重に等しい定常質量として実施例１において記載さ れる；レセプター数およびレセプター数の変化は、実施例３において記載される ；「好ましい治療学的マージン」は、500〜600cGyの放射用量（群８および９） に等しい0.5MLD免疫毒素の確立された処置（群１）との、0.5MLD（最小の致死用 量）でのインビボ標的細胞3log殺傷の効力の比較として規定される。 インビトロで決定されるパラメーターは、インビボヌードマウス研究における 成功の予測を許容した。インビボ成功の予測は、実施例３〜４によって確認され た。サルまたはヒトにおける局所的なＴ細胞荷重に等しい場合、マウス研究から の標的細胞の数を使用して、サルにおける首尾良いＴ細胞剥離および免疫抑制が 予測され得た。この予測は、実施例５および７〜８におけるサルのデータによっ て確認された。同じパラメーターを使用して、当業者は、信頼をもってヒトにお ける成功の予測をなし得る。なぜならこれらのパラメーターは、予測的な成功を 有することが以前に示されているからである。 別の実施態様において、本発明は、CD3エピトープを保持するＴ細胞白血病ま たはリンパ腫、移植片対宿主病、または自己免疫病を処置するに有効な量におけ る抗CD3-DT変異体、ならびに薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、または腑形 剤を含む薬学的組成物に関する。当業者は、任意の特定の処置プロトコルについ て投与される量は、容易に決定され得ることを理解する。適切な量は、１〜３日 間にわたって、体重１kg当たり0.1〜0.2mg（毒素成分）の範囲内にあると予測さ れ得る。 ジフテリア毒素の非毒性変異体。 ほとんどのヒト血清は、幼年時代の免疫接種からの抗DT中和化抗体を含む。こ れについて補うために、抗CD3-CRM9の治療学的用量は、治療学的マージンを影響 することなく適切に上昇され得る。あるいは、本出願は、免疫毒素と組合せて投 与され得る、中和化抗血清と反応性の非毒性DT変異体（例えば、CRM197）を提供 する。 本発明の方法における使用のためのジフテリア毒素の非毒性変異体は、DTM2ま たはCRM197であり得る。DTM2およびCRM197は、DTの非毒性変異体であり、酵素鎖 における点変異を有する。非毒性変異体は、DT E148S、S525Fであり得る。しか し、これらは、DTおよびCRM9の完全な免疫特性を有し、そしてCRM197は、免疫接 種に使用され得る（Barbourら、1993．Pediatr Infact．Dis J．12:478-84）。 本発明の方法において使用され得る他の非毒性DT変異体は、Ａ鎖の酵素活性を全 く欠うか、またはその活性を約1000倍以上まで減弱されるかのいずれかの特性を 共有する。 非毒性毒素を投与する目的は、被験体において、先在する抗CRM9抗DT抗体を結 合し、そしてそれらの効果と拮抗するおよび／または循環からのそれらの除去を 誘導することである。これは、免疫毒素の活性を妨げ得る免疫毒素に対する任意 の宿主免疫応答を実質的に回避する。実施例に記載されるヒト血清サンプルまた はプールされたヒト血清の存在下でのタンパク質合成阻害アッセイは、個々の患 者に至適な免疫毒素の評価の重要な部分になり、そしてこの目的のために提供さ れる。このアッセイは、抗ヒト抗毒素によるインビボでの免疫毒素の妨害物を最 小にする目的のための、DT点変異とカルボキシ末端の欠失とのさらなる組合せの 系統的な評価を日常的なものにする。 非毒性変異体は、好ましくは、免疫毒素と同時に、またはそのすぐ前に投与さ れる。例えば、非毒性DT変異体は、免疫毒素の投与の前の、１時間および好まし くは約５分以内に、投与され得る。非毒性変異体の用量の範囲が投与され得る。 例えば、投与される免疫毒素のCRM9含量よりも約３〜100倍過剰の非毒性変異体 が、静脈内経路によって投与され得る。 本発明の方法における非毒性DT変異体の別の使用は、DTに対する患者血清の抗 体のいくつかまたは全てを除去するために、受容者患者の血液を、非毒性DT変異 体を含むカラムを介して、処理する（run）ことである。 免疫寛容を誘導する方法。 本発明に対する１つの実施態様は、受容者の末梢血Ｔ細胞リンパ球集団を、少 なくとも80%、および好ましくは95%以上まで減少するように、免疫毒素に、受容 者を曝露させることによって、外来哺乳動物ドナー器官細胞に対する免疫寛容を 受容者において誘導することによって、拒絶応答を阻害する方法を提供し、ここ で免疫毒素は、ジフテリアタンパク質毒素に連結された抗CD3抗体であり、そし てここでこのタンパク質は、結合部位変異を有する。用語「ドナー細胞」は、ド ナーリンパ球またはドナー骨髄から区別される場合、ドナー器官、または細胞も しくはドナー器官の細胞をいう。ドナー器官またはドナーの細胞が、受容者に移 植される場合、ドナー器官細胞に対する受容者による拒絶応答は阻害され、そし て受容者は、ドナー器官細胞に対して寛容される。あるいは、DTM2またはCRM197 のような非毒性DT変異体は、最初に投与され得、次いで免疫毒素が投与され得る 。この方法は、本明細書中に記載されるか、またはそうでなければ実施者によっ て決定されるような、投与の投薬量および態様で、本明細書中に記載される任意 の免疫毒素（例えば、抗CD3-CRM9、scUCHT1-DT390、など）、または非毒性DT変 異 体を使用し得る。 実施例においてさらに記載されるように、寛容を誘導するための上記の方法は 、さらなる処置レジメによってさらに増大され得る。例えば、この方法はさらに 、免疫毒素曝露工程の前に、同時に、または後に、胸腺に胸腺アポトーシスシグ ナルを投与する工程を包含する。胸腺アポトーシスシグナルは、高用量のコルチ コステロイド（この状況おいて、「免疫抑制薬」としてもまた言及される）であ り得る。胸腺アポトーシスシグナルは、リンパ球の照射であり得る。 寛容を誘導する方法のさらなる例において、ドナー細胞のMHCと同じハプロタ イプのMHC抗原を有するドナー白血球またはリンパ球の胸腺注射が、受容者に投 与され得る。胸腺完全性を破壊し、そして胸腺への免疫毒素の接近を増加するた めの生理食塩溶液、または結晶様のもしくはコロイド溶液の胸腺注射もまた、有 益であり得る。 本発明の寛容誘導方法はまた、免疫毒素曝露工程の前に、同時に、または後に 、免疫抑制化合物を投与する工程を包含し得る。免疫抑制化合物は、シクロスポ リンもしくは他のシクロフィリン類、mycophenolate mofetil（Roche）、デオキ シスペルグアリン（Bristol Myers）FK506または他の公知の免疫抑制薬であり得 る。特定のこれらの免疫抑制薬は、寛容状態の誘導において補助し得る、移植片 周囲期間において生じるサイトカイン放出に対して主要な効果を有する。免疫寛 容を誘導する方法はさらに、曝露工程と同時に、またはその後に、ドナー骨髄を 投与する工程を包含し得る。 これらの補助療法のうちの任意の１つ、２つ、またはそれ以上は、本発明の寛 容誘導方法において共に使用され得る。従って、本発明は、免疫毒素（IT）を使 用して寛容を誘導する少なくとも６つの方法を含む：（１）IT単独を投与するこ とによる寛容の誘導；（２）ITおよび胸腺機能を変化させる他の薬物（例えば、 高用量のコルチコステロイド）を投与することによる寛容の誘導；（３）ITおよ び免疫抑制薬物（例えば、mycophenolate mofetilおよび／またはデオキシスペ ルグアリン）を投与することによる寛容の誘導（４）ITおよび胸腺機能を変化す る他の薬物、および免疫抑制薬物を投与することによる寛容の誘導；（５）ITお よび骨髄を投与することによる寛容の誘導；ならびに（６）ITおよび骨髄、およ び胸腺機能を変化する他の薬物、および免疫抑制薬物を投与することによる寛容 の誘導。補助療法は、免疫毒素の投与の前に、同時に、または後に投与され得る 。異なる補助療法は、以下にさらに記載されるように、移植事象または免疫毒素 の投与に関連して、異なる時間にまたは同時に、受容者に投与され得る。 免疫抑制薬は、免疫毒素および／または他の処置の前に投与され得るので、本 発明の方法は、臓器移植を受けた、そして免疫抑制薬レジメにある患者に使用さ れ得る。これは、伝統的な免疫抑制療法およびその十分に記録されたネガティブ な副作用を減少または排除する有意な機会を示す。また、以下に記載されるよう に、移植の前の免疫抑制薬での治療は、死体移植において特に有用であり得た。 免疫抑制薬での移植前の処置のこのような設定において、免疫毒素の投与は、移 植後の７日以上まで遅延され得る。 臓器移植を受ける患者への免疫毒素および免疫抑制薬投与のスケジュールの例 は、以下のようである： −６日目−０時間：免疫抑制薬処置を開始する； ０日目 ：移植を行う； ０日目 ：移植後すぐに第１回目の免疫毒素用量を投与する； １日目 ：第２回目の免疫毒素用量 ２日目 ：第３回目および最後の免疫毒素用量。 免疫抑制薬処置は、３日目で終了し得るか、または14日目まで延長し得る。免疫 抑制薬処置はまた、移植時に開始される場合、効果的であり、そして移植後数週 間まで継続され得る。 あるいは、免疫毒素注射は、ドナー細胞処置の前の１週間または２週以内にな され得る。ドナー器官またはドナー器官からの細胞が、生存するドナーからであ る場合、免疫毒素は移植工程の15時間〜７日前に、または移植の直後に投与され る。ドナー器官が腎臓または腎臓細胞であり、そして死体からである場合、免疫 毒素は、好ましくは、移植工程の６〜15時間前に投与される。ドナー器官または ドナー器官からの細胞が、死体であり、そして心臓、肺、肝臓、膵臓、膵島、お よび腸からなる群より選択される場合、免疫毒素は、好ましくは、移植工程の０ 〜６時間前に投与される。死体の移植片の前進性の計画が困難であるので、実施 上の理由のために、免疫毒素処置および移植は、一般に、ほぼ同時（例えば、15 時間以内）に行われる。アポトーシス療法および免疫抑制剤療法の種々のスケジ ュールが、上述の方法とともに使用され得る。任意の上述の筋書きにおいて、ド ナー骨髄は、所望であれば、おおよそ移植の時にまたは移植後に投与され得る。 免疫毒素の現在好ましい用量は、注射前のレベルの80%、好ましくは90%（また は特に好ましくは95%以上）まで、末梢血Ｔ細胞レベルを枯渇するに十分な用量 である。これは、サルについてのレベル（（例えば、0.05mg/kg〜0.2mg/kg体重 ）、この毒性研究が示すレベルは、ヒトによって十分寛容されるべきである）と 同様に、ヒトについてmg/kgレベルを必要とするべきである。従って、免疫毒素 は、受容者Ｔ細胞集団を安全に減少させるために投与され得る。 対宿主性移植片病を処置する方法 別の実施態様において、本発明は、Ｔ細胞抑制に影響を受けやすいＴ細胞増殖 を含まない、免疫系障害を処置する方法に関する。より詳細には、動物において 対宿主性移植片病を処置する方法がまた、提供される。これは、ジフテリア毒素 結合変異体部分もしくはETA結合変異体部分と、抗CD3経路もしくは他のＴ細胞エ ピトープ経路によって経路を定める抗体部分とを含む免疫毒素、またはその誘導 体を、対宿主性移植片病が処置される（すなわち、対宿主性移植片病の症状が改 善される）ような条件下で、動物に投与する工程を包含する。あるいは、さらに 記載されるように、DTM2もしくはCRM197のような非毒性DT変異体（または、CRM9 およびCRM197における変異体の組合せを有する変異体）が最初に投与され得、そ の後免疫毒素が投与され得る。この方法は、本明細書中に記載されるか、または そうでなければ実施者によって決定される投与の投薬量および態様で、本明細書 中に記載される任意の免疫毒素または非毒性DT変異体を使用し得る。寛容の誘導 と同様に、サイトカイン遊離パターンを改変する特定の免疫抑制剤（例えば、コ ルチコステロイド、デオキシスペルグアリン、およびミコフェノール酸モフェチ ル（mycophenolate mofetil））はまた、効力を増加し、そして副作用を減少す るために短期間で使用され得る。 GVHDは、抗白血病／リンパ腫治療としてしばしば行われる骨髄移植の病的な合 併症である。GVHDは、移植の前に特異的に枯渇されない限り、骨髄移植において 獲得される、宿主内のドナーＴ細胞を循環することによって引き起こされる（Ga leおよびButturini（1988）Bone Marrow Transplant 3:185；Devergieら（1990 ）同書5:379；Filipovichら（1987）Transplantation 44）。首尾良いドナーＴ 細胞枯渇技術は、移植片拒絶および白血病再発のより高い頻度と関連されてきた （GaleおよびButturini（1988）Bone Marrow Transplant 3:185；Devergieら（1 990）同書5:379；Filipovichら（1987）Transplantation 44）。それゆえ、ドナ ーＴ細胞は、移植を補助し、そしてGVHDを引き起こすのと同様に、移植片対白血 病効果を提供するようである。骨髄移植後のＴ細胞荷重は、最初の14日間、低い （通常の10%未満）ので、ドナーＴ細胞のlog殺傷は、比例して増強される（Mars hおよびNeville（1987）Ann．N.Y．Acad．Sci．507:165；Yanら、提出された；G aleおよびButturini（1988）Bone Marrow Transplant 3:185；Devergieら（1990 ）同書5:379；Filipovichら（1987）Transplantation 44）。ドナーＴ細胞は、 初期の移植後期間の間、本発明の方法を使用して、設定された時間で排除され得 ることが予測される。この方法において、移植されたＴ細胞の有用な特性は、最 大化され得、そして有害な影響は最小化され得る。 自己免疫疾患を処置する方法 本発明の別の実施態様は、動物において自己免疫疾患を処置する方法を提供し 、ジフテリア毒素結合変異体部分もしくはETA結合変異体部分と、抗CD3経路もし くは他のＴ細胞エピトープ経路によって経路を定める抗体部分とを含む免疫毒素 、またはその誘導体を、自己免疫疾患が処置される（例えば、自己免疫疾患の症 状が改善される）ような条件下で、動物に投与する工程を包含する。動物におい て自己免疫疾患を処置するさらなる方法は、ジフテリア毒素の非毒性変異体、続 いて抗CD3経路によって経路を定めさる抗体CRM9結合体、またはその誘導体を、 自己免疫疾患が処置されるような条件下で、動物に投与する工程を包含する。こ の方法は、本明細書中に記載されるような、またはそうでなければ実施者によっ て決定されるような投与の投薬量および態様で、本明細書中で記載される任意の 免疫毒素または非毒性DT変異体を使用し得る。さらに、サイトカイン遊離を改変 す る一定の免疫抑制剤は、ITに対する短期の補助物質として有益であり得る。 Ｔ細胞白血病またはリンパ腫を処置する方法。 本発明のさらなる実施態様は、動物中にCD3エピトープを保有するＴ細胞白血 病またはリンパ腫を処置する方法を提供し、ジフテリア毒素結合部分変異体と、 抗CD3経路によって経路を定める抗体部分とを含む免疫毒素、またはその誘導体 を、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫が処置されるような条件下で、動物に投与する 工程を包含する。あるいは、さらなる実施態様は、動物においてＴ細胞白血病ま たはリンパ腫を処置する方法であり、ジフテリア毒素の非毒性変異体、続いて抗 CD3経路によって経路を定める抗体CRM9結合体、またはその誘導体を、Ｔ細胞白 血病またはリンパ腫が処置されるような条件下で、動物に投与する工程を包含す る。この方法は、本明細書中に記載されるか、またはそうでなければ実施者によ って決定されるような投与の投薬量および態様で、本明細書中で記載される任意 の免疫毒素もしくは非毒性DT変異体を使用し得る。 実施例１ 腫瘍の樹立 本発明を生じさせる研究の実験的な設計は、インビボ腫瘍療法において可能な 限りヒトに密接に関連するような動物モデルを有するという目標によって、指図 された。宿主キラー細胞免疫応答を最小にするために、ヌードマウスのbg/nu/xi d系統を使用した（Kamel-ReidおよびDick（1988）Science 242:1706）。ヒトＴ 細胞白血病細胞株の、Jurkatを、この株の以前の研究およびCD3レセプターのそ の比較的正常な平均補体(complement)のために、選択した（Preijersら（1988） Scand．J．Immunol．27:553）。個々の細胞間にレセプター改変が存在するよう には、株をクローン化しなかった。スキームを発展させ、それによって体重の0. 1%に等しい定常マス（約４×107細胞）の十分に樹立された腫瘍が、Jurkat細胞 の接種の７日後に達成され得た（Dillmanら（1988）Cancer Res．15:5632を参照 のこと）。これは、先の照射、および致死的に照射されたヘルパー支持細胞での 接種を必要とした（Dillmanら（1988）Cancer Res．15:5632を参照のこと）。 半滅菌的な環境において維持したヌードマウスbg/nu/xidを、−７日目に400cG yの全身性の137CS γ照射で予め調製する。０日目に、2.5×107個のJurkat細胞 （ヒトＴ細胞白血病CD3+、CD4+、CD5+）を、6000cGyを受けた１×107個のHT-108 0支持細胞（ヒト肉肺）で皮下に注射する。Jurkat細胞を、皮下腫瘍として、マ ウスにおいて１週間毎に継代し、そして接種の前にコラゲナーゼ／ディスパーゼ （dispase）によって解離した。この細胞集団は、10-11M抗CD-3DTへの５時間の 曝露後、タンパク質合成の40%阻害を示す。限界希釈によってこの集団から単離 されるクローンは、用量応答曲線における1.5log変量に対応する抗CD3DTに対す る種々の感受性示す（４より低い感受性、３より高い感受性）。免疫毒素処置を 、肺瘍が可視的に樹立される７日目に開始し、腹腔内注射によって与える。評価 は、37日目に行う。 実施例２ モルモット研究 免疫毒素毒性研究を、モルモット（ジフテリア毒素に対して高い感受性を伴う 動物（ヒトのような）（マウスは、ジフテリア毒素に対して非常に耐性である） ）において行った。CRM9結合体の治療を、モルモットの最小致死用量の1/2で設 定した。この研究において、最小致死用量（MLD）を、４週間の評価期間にわた って非生存および生存の両方を生じる最小試験用量として規定する。MLDが、0.5 まで減少される場合、全ての動物は生存する。MLDを、皮下注射によってモルモ ット（300〜1000g）において評価した。以下のMLDを見出し、そしてμg毒素／kg 体重として列挙する；DT、0.15；CRM9、30；抗CD5-DT（切断可能）、0.65；抗CD 5-CRM9（非切断可能）、150。最後に、腫瘍退行を生じる際の免疫毒素処置の治 療学的効力を、同様な腫瘍退行を生じる全身性の照射の類別された用量と比較し た。 実施例３ 免疫毒素の比較 免疫毒素のいくつかのタイプを、この研究において比較した。これらを、モノ クローナル抗体部分および毒素部分の両方をチオレート化し、次いでビスマレイ ミドクロスリンカーを架橋することによって、以前に記載されるように合成した （Nevilleら（1989）J．Biol．Chem．264:14653）。精製を、サイズ排除HPLCカ ラムによって行い、そして１：１の毒素：抗体のモル比を含む画分を、これらの 研究のために単離した。酸不安定性のクロスリンカーのビスマレイミドエトキシ プロパンを用いて作製した結合体を、非切断可能なミスマレイミドヘキサンと比 較した。この切断可能なクロスリンカーを用いて作製した結合体は、36分間のpH 5.5で測定された加水分解の半減期で、遊離毒素部分を放出する酸性化エンドソ ーム内で加水分解することが示された（Nevilleら（1989）J．Blol．Chem．264: 14653）。 この研究の結果を、表１において表にする。非処置群（例えば、群10）、抗CD 5免疫毒素で処置した群（群５および６）、ならびに抗CD3およびCRM9の混合物で 処置した群４は、退行を示さなかった。７日目で20mgと計量された血管化腫瘍小 瘤は、37日目に1.5〜7.8gの間に成長し、そして56日目に7.9〜11.6の間に計量さ れた。後期の自発的な退行は、何ら観察されなかった。対照的に、７、８、およ び９日目に25μg/kgで与えられた抗CD3-CRM9非切断可能な結合体（NC）での処置 からなる群１は、37日目までに６匹のうち１匹の腫瘍のみを示した。残りの動物 のいくつかは、剖検を受け、そしてそれらは残余の腫瘍または瘢痕さえも示さな かった。表面の観察によって37日目に退行されたとして同定された腫瘍は、研究 の経過の間（56日）、再発しなかった。 切断可能なクロスリンカーは、抗CD3-CRM9免疫毒素に対して治療学的利点を何 ら付与せず、そしてほとんど有効でないかもしれない（群３）。切断可能なクロ スリンカーは、インビトロにて抗CD5-CRM9結合体で、いくつかの利点を付与した （５）が、このインビボ系にて何ら効果を有さず（群５）、そして抗CD3-CRM9と ともに投与した場合、有意な有力な効果を欠損した（群２）。切断可能なクロス リンカーは、抗CD5野生型毒素結合体に、顕著な治療学的利点を付与し、そして 肺瘍退行が達成された。しかし、これらの場合において、モルモット毒性用量は 、上回った。６μg/kgでの切断可能な抗CD5-DTの７日目における単回の用量は、 8/10の腫瘍退行を生じたが、非関連性の抗体（OX8）で作製された切断可能な結 合体は、退行を何ら生じなかった（４/４）。しかし、この用量は、９倍までモ ルモットMLDを上回った。救済（rescue）ストラテジーを試み、上述の結合体用 量を、静脈内で与え、次いで４時間後にDT抗毒素を与えた（静脈内でもまた）。 ４時間の救済は、MLDを0.65μg/kgを超えて上昇し得なかった。１時間の救済は 、MLDを、0.65μg/kgを超えて上昇し得なかった。１時間の救済は、MLDを36μg/ kgに上昇したが、21.5μg/kgの切断可能な抗CD5-DT結合体を受けた10匹のマウス において腫瘍退行は何ら生じなかった。 群７〜９において、全身性の照射の漸増する単回用量（102cGy／分）を、３× ３×５mmの腫瘍を保持する動物に与えた。400cGyで、完全な退行は何ら生じなか った。500cGyで、50%の完全な腫瘍退行が生じた。600cGyで、100%の退行が、動 物が照射の病気から死亡する10および13日目で判断されたように達成された（群 ７〜９は、以前の照射を受けず、そして腫瘍獲得は100%未満であった）。75μg/ kgの抗CD3-CRM9（NC）免疫毒素は、治療力（therapeutic power）において、照 射の500cGy〜600cGyの間に等しいようである。 実施例４ 細胞殺傷の評価 照射および免疫毒素によって達成される実際の細胞殺傷は、照射についてのＤ37 値とともに照射シングルヒット不活性化キネティクスを仮定することによって 評価され得る。n＝1.2〜3での70〜80cGyのＤ37値は、迅速に分裂しているヘ ルパーＴ細胞については不合理ではない。Ｄ37は、対数生存物対用量曲線の直線 部分から外挿されたl/eに対する生存細胞の画分を減少させる照射の用量であり 、そしてnは、０用量での切片（intercept）である（AndersonおよびWarner（19 76）Adv．Immunol，Academic Press Inc.，24:257）。550cGyの用量で、生存細 胞の画分は、約103であると算出される。大部分の腫瘍はこの用量で完全に消失 するので、両方の治療が約３対数殺傷を生じていると評価する。（残りの細胞、 ４×107×103＝４×104細胞は、明らかに腫瘍を維持し得ず、すなわち、インビ ボプレーティング効率は低く、ヌードマウス異種移植系における全く代表的な状 況である。）この３対数殺傷評価の信頼性は、７日目の樹立されたJurkat腫瘍（ 分散後）およびインビボで18時間前に600cGyまで曝露された腫瘍を限界希釈する ことによって、組織培養プレーティング効率を決定することによって証明されて いる。プレーティング効率は、それぞれ0.14および1.4×104であった。（プレー ティング効率は、増殖して１つのコロニーを形成する、ウェル当たりの細胞の最 小平均数の逆数である。） 高親和性ハロ免疫毒素では、細胞殺傷が、標的細胞数に逆比例することが強調 されるべきである。これは、おそらく、レセプターが寛容用量で飽和以下であり 、そして遊離の結合体濃度は標的細胞負荷の増加とともに低下するために、生じ る（MarshおよびNeville（1987）Ann．N.Y．Acad．Sci．507:165；Yanら（1991 ）Bioconjugate Chem．2:207）。この点を考慮して、この研究における腫瘍負荷 は、マウスにおいてＴ細胞の数がほぼ等しい（約108）。抗CD3-CRM9免疫毒素の 寛容用量が、CD3ポジティブＴ細胞の正常数のインビボ３対数欠乏を達成し得る ことが予測され得る。 実施例５ FN18-CRM9によって誘導されたアカゲザルにおける細胞欠乏 FN18-CRM9結合体 モノクローナル抗体FN18は、ヒト抗CD3（UCHT1）のサル等価物であり、そして ヒトCD3抗体によって結合したと同じCD3レセプターエピトープ（εおよびγ）を 結合することが知られ、そしてヒトCD3抗体と同じイソタイプである。したがっ て、予測している成功裡なＴ細胞欠乏に関連するパラメータに関して、このCD3- CRM9結合体およびFN18-CRM9は、同じ活性を有すると予測される。 投与 結合体は、0.1M Na2SO4＋0.01Mリン酸緩衝液，pH7.4からなるキャリア中の静 脈内ボーラスとして投与され得る。用量スケジュールは、約３日間で１日おきに または３日目に行う。総用量は、好ましくは、体重１kg当たり50〜200マイクロ グラムの毒素である。 使用したFN18-CRM9の実際の用量を、モルモットにおいて最小致死量（MLD）0. 167〜1.13の間で変化させた。MLDの評価を、免疫毒素標的細胞集団を欠く動物（ モルモット）で行ったので、FN18-CRM9および抗CD3-CRM9の真のMLDは、モルモッ トにおけるよりもサルおよびヒトではより高いと予測される。 Ｔ細胞殺傷 末梢血中のヘルパーＴ細胞（CD4+細胞）数は、２匹のアカゲザルにおいてFN18 -CRM9の最初の投与後に劇的に低下した。Ｔ細胞カウントは、４日目（FN18-CRM9 の２回目の投与の直前にサンプリングした）までに上昇し始めた。５日目にサル 8629において、CD4+細胞は、検出限界より下に低下した（＜50細胞/mm3）。細胞 は、21日目まで200/mm3より下かまたは等しいままであった。CD4+細胞のこの低 レベルは、ヒトおよびサルにおいて深い免疫不全に関連する（NooijおよびJonke r（1987）Eur．J．Immunol．17:1089-1093）。この研究の顕著な特徴は、免疫毒 素の最後の投与（４日目）に関してヘルパーＴ細胞欠乏が長期間(21日目)である ことである。なぜなら、静脈内投与した免疫毒素が、９時間未満の半減期で血管 系からクリアされた（Rostain-CapaillonおよびCasellas（1990）Cancer Resear ch 50:2909-2916）からである。この効果は、循環する免疫毒素をより長く持続 する。これは、結合していない抗CD3抗体によって誘導されたＴ細胞欠乏とは対 照的である（NooijおよびJonker（1987）Eur．J．Immunol．17:1089-1093）。 サル1WSでは、結合体の２回目の用量のみが、CD4+細胞回復の速度の減少を生 じるようであった。しかし、CD4+細胞は、21日目で正常よりもさらにより少なか った。免疫毒素の２回目の用量に対するサル1WSの鈍感な応答が、毒素に対する この動物の予め存在する免疫に起因することを見いだした。サル1WSは、ウエス タンブロットアッセイによって表される顕著な前処置抗ジフテリア毒素力価を有 した。この力価は、５日目に顕著に増加した。これは、古典的二次応答を示す。 対照的に、サル8629は、検出不可能な処置前の力価を、そして５日目までに痕跡 量のみの力価および28日目までに中程度の力価を有した。 Ｔ細胞に対するFN18-CRM9の特異性は、同じ２匹のサルにおいて総白血球（WBC ）カウントを比較することによって見られ得る。WBCは低下したが、CD4+Ｔ細胞 サブセットについてのベースライン値の６％に比較して２日目にベースライン値 のわずか45％までであった。WBC値の低下のほとんどは、WBC集団のＴ細胞成分に よって説明され得る（約40％）。しかし、Ｂ細胞は、FN18-CRM9後に最初に欠乏 されるが、これらの細胞はより迅速に回復する。FN18は、IgGであり、イソタイ プであり、そしてそれ自体、低親和性でＢ細胞およびマクロファージに存在する FcIIレセプターに結合することが公知である。Ｂ細胞のFN18-CRM9欠乏は、FN18 抗体のFc部分とＢ細胞との間の顕著な相互作用が起こっていることを示す。 免疫抑制を生じることが公知である用量0.2mg/kg/日で結合していないFN18に よって誘導された末梢Ｔ細胞欠乏（NooijおよびJonker（1987）Eur．J．Immunol ．17:1089-1093）を、1/9のFN18用量で投与された免疫毒素FN18-CRM9と比較した 。末梢CD4+Ｔ細胞欠乏は、より明白であり、そして結合体とともにより長く持続 する。FN18-CRM9は、21日もの長い期間200細胞/mm3以下のレベルまで末梢ヘルパ ーＴ細胞サブセット（CD4+）を減少させることの証明は、この免疫毒素およびそ の抗ヒトアナログが効果的な免疫抑制試薬であることを示す。 FN18-CRM9が非ヒト霊長類においてＴ細胞欠乏を誘導するための強力な薬剤で あることの証明は、FN18-CRM9の抗ヒトホモログのUCHT1-CRM9（Oxoid USA，Char lotte，NC）が、例えば、ヒトにおいてＴ細胞欠乏を誘導するための強力な薬剤 であることを証明する。 抗TCR/CD3モノクローナルのFc結合領域は、抗TCR/CD3モノクローナルがCRM9に 結合体化される場合、Ｔ細胞欠乏を誘導するために必要とされてもされなくても よい。FcII結合領域は、例えば、文献に示されるように、F(ab')2誘導体との結 合体を形成することによって除去され得る（Thorpeら（1985）J．Nat'I．Cancer Inst．75:151-159）。さらに、モノクローナル抗体T3のような抗TCR/CD3 IgAス イッチ改変体が、使用され得る（Ponticelliら（1990）Transplantation 50:889 -892）。これらは、F(ab')2免疫毒素に特徴的な迅速な血管クリアランスを避け る。したがって、抗TCR/CD3-CRM9免疫毒素のF(ab')2およびIgAスイッチ改変体は 、誘導体抗TCR/CD3免疫毒素である。これらの誘導体は、注目されるＢ細胞相互 作用を避け、そして特異性を増加させ得る。しかし、IgG2aスイッチ改変体は、F cIIレセプターを介するＴ細胞活性化を最大にし、そしてＴ細胞活性化が免疫毒 素誘導された毒性を助ける特定の状況において有用であり得る。 Fc領域を欠く抗体を作製するためのまたはヒト化されている抗体を作製するた めの一般的方法は、HarlowおよびLane，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1988に記載され る。したがって、請求の範囲で使用される場合、抗体とは、抗体全体、あるいは 特異的抗原またはレセプター結合に十分な抗体のいずれかの部分を意味し得る。 実施例６ 免疫毒素抗CD3-CRM9を使用するサルにおけるＴ細胞欠乏および免疫抑制。 CRM9は、ジフテリア毒素（DT）結合部位変異体であり、そして抗Ｔ細胞免疫毒 素抗CD3-CRM9の基礎を形成する。この免疫毒素は、ヒトおよびアカゲザルＴ細胞 に対して構築されており、そしてヌードマウス異種移植系においてヒトＴ細胞の ３対数を殺傷することが上記で示されている。本実施例は、サルにおいて皮膚同 種移植拒絶の延長を生じることも示されるアカゲザルリンパ節で、Ｔ細胞の２対 数殺傷を証明する。 ヒトは、幼児期におけるDPTワクチンへの曝露によってジフテリア毒素に対し て免疫される。この長期持続免疫は、DTベースの免疫毒素の効率を妨害し得る。 多くのサルは、毒素産生Corynebacteriumへの天然の曝露によってDTに対して免 疫される。本発明の方法は、本発明の免疫毒素の活性を使用した、予め存在する DT抗体の任意の潜在的妨害に取り組む。 ELISA ELISAアッセイを、27〜55の年齢の集団中９個体に存在する抗DT力価のレベル を決定するために行った。３個体は1:100（低い）の力価があり、そして６個体 は1:1000（中程度）の力価を有した。 アカゲザルを、同じアッセイによってスクリーニングし、そして1:1000力価の サルを選択した。 非毒性ジフテリア毒素変異体の投与 サルを、投与されるべき免疫毒素のCRM9含量を越える100倍過剰のCRM197によ って、免疫毒素投与の５分前に静脈内経路で処置した。CRM197を投与する直前に 、ベナドリル(Benadryl)またはタゲビル(Tagevil)のようなH1ヒスタミンブロッ キング剤を、静脈内投与して、アナフィラキシー反応のいかなる可能性をも最小 にした（ベナドリルについては４mg/kg）。ヒスタミン性反応は検出されなかっ た。 抗CD3-CRM9を、３日連続して３回の等分割用量（約0.033mg/kg）で0.1〜0.2mg /kg（毒素重量）の総用量で投与した。これらのサルでは、免疫毒素の総容量は 、0.1mg/kgであった。 表１は、リンパ節Ｔ／Ｂ細胞比の減少（リンパ節Ｔ細胞欠乏の尺度）、および ミスマッチの皮膚移植生存の延長によって判断されるような免疫毒素の免疫抑制 効果を比較することによる、サルにおける抗CD3-CRM9の効率の比較を示す。皮膚 移植の生存における効果は、所定の処置が被験体の免疫系において有する、一般 的効果の明確な指標である。 CRM197で前処置した予め存在する抗DT力価を有するサルは、ネガティブ力価の サルと同じレベルのＴ／Ｂ細胞逆転を示す。皮膚移植生存は、CRM197なしで処置 した力価のサルよりも著しく延長された。ネガティブの力価のサルと等しい移植 生存の延長を達成することができないことは、Ｔ細胞をより早く、この場合３〜 ４日早く再集団にさせるこのサルのより低い体重のため、より若い動物における より大きな胸腺Ｔ細胞前駆体プールのためのようである。これらのような、年齢 に関連する効果は、投与量レベルの改変および投与の時期によって補正され得る 。 実施例７ ステロイド耐性移植片対宿主病の処置についての免疫毒素UCHT1-CRM9 このタイプの病気についての処置プロトコルは、１年持続することが予測され 得、患者は少なくとも５年間追跡する。 UCHT1-CRM9およびCRM197の特徴づけ UCHT1-CRM9は、抗ヒトCD3 IgG1モノクローナル抗体およびCRM9の1:1共有結合 体である。結合体を、合成し、精製し、滅菌濾過し、そして濃度、標的細胞に対 する生物学的効率、および標準化された培養アッセイによる細胞毒性および非標 的細胞毒性についてアッセイする。合成、精製アッセイの方法は、実施例５〜７ に記載の前臨床サル研究で使用されたFN18-CRM9について使用される方法と同一 である。 CRM9およびCRM197を、Biotechnology Unit、IHによって産生し、そしてthe Co operating Facilityによって精製する。UCHT1は、マウス腹水中で産生され、プ ロテインA Sepharose上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製さ れる。UCHT1-CRM9の合成、精製、および貯蔵は、専門の安全な領域で行われる。 UCHT1-CRM9は、２mgロットで精製され、４℃でプールおよび貯蔵される。貯蔵寿 命は、完全な生物学的効力で５カ月であると実証されているが、この研究につい ては４カ月を越えない。好ましくは、免疫毒素のほとんどは、合成の３カ月以内 に使用される。 患者集団 患者集団は、予後が乏しいステロイド耐性GVHDに羅患している個体からなる。 患者は、抗CRM9（抗DT）力価およびマウス免疫グロブリンに対する抗体について アッセイされる。1:1000およびそれ以下の抗CRM197力価を有する患者は、このプ ロトコルに従って処置される。マウス免疫グロブリンを投与された病歴を有する 患者またはポジティブな抗Ig力価を示す患者は、特別な考慮を必要とし得る。 CRM9免疫毒素および非毒性変異体の投与量 UCHT1-CRM9は、Ｔリンパ球減少症患者において推定最小致死用量（MLD）の1/1 0以下である用量で投与される。MLDは、IgG1について標的細胞集団を欠損するモ ルモットにおける0.15mg/kgのIgG1-CRM9のMLDに基づいて、少なくとも0.15mg/kg （CRM9含量）であると予測される。（ヒトにおける標的細胞の存在は、免疫毒素 のためのシンク(sink)を提供することによってMLDを上昇させる。）最適用量ス ケジュールは、連続３日間での３つの等しく分割された用量の投与であると、サ ルにおいて見いだされており、そしてこのスケジュールは、処置期間を通して使 用され得る。このことによって、二次応答に起因する予め存在する抗毒素力価で のいくらかの上昇の前に総用量の投与を可能にする。さらに、胸腺からの初期再 増殖も排除され、したがって、総Ｔリンパ球プールをさらに低下させる。それゆ え、３つの等しく分割された用量で、合計0.0125mg/kgが患者に投与される。こ の用量は、サルにおいてＴ細胞涸渇を誘導し、その結果、Ｔ細胞サブセットなら びにGVHDの徴候および症状のモニタリングは最低の用量で適切である。この用量 の投与については、1:100以下の抗CRM9力価を有する患者が処置される。これは 、サルにおいて0.33mg/kgまたは容易に耐性になる1/10用量でのCRM197の前処置 用量を可能にする。第２の投与量群には、CRM197が1.0mg/kgで投与される1:330 以下の抗毒素力価について選択された患者を含み得る。第３の投与量群は、1:10 00抗毒素力価以下を有する患者を含み得、そして、サルは容易に耐性になるので 、ヒトにおいて耐性になると予測される用量である3.3mg/kgでCRM197を投与する （実施例７を参照のこと）。サルMLDデータは、体重当たりに基づいてヒトに非 常に類似すべきである。しかし、GVHD患者は、非GVHD患者と比較してより小さい 標的細胞集団を有するので、モルモットにさらに類似することが予測される。 用量エスカレーションは、1.5の係数で用量を増加させることによって試験さ れ得る。以下の表は、このような用量エスカレーション試験を例証する。例えば 、３名の患者が各投与量群で使用される。各患者間に３〜４週の遅延があり、そ のため何らかの遅い毒性は、投与量群が完了する前に検出される： 患者番号 各日のCRM用量 総用量 終わりの週 mg/kg mg/kg １、２、３ 0.00417 0.0125 12 ４、５、６ 0.00636 0.019 24 ７、８、９ 0.0083 0.028 36 10、11、12 0.0125 0.042 48 各患者が平均70kgの体重であると仮定すると、第１の投与量群は、2.6mgのCRM 9免疫毒素を消費し、そして２つの2mgバッチのプールとして供給される。第２の 群は、3.9mgを消費し、そしてまた２つのプールされたバッチとして供給される 。第３の群は、5.9mgを必要とし、そして３つのプールされたバッチとして供給 される。第４の群は、8.9mgを必要とし、そして３つのプールされたバッチおよ び さらに２つのプールされたバッチとして供給される。 投与 CRM197を投与する前に、ベナドリル（Benadryl）またはタゲビル（Tagevil） のようなH1ヒスタミンブロック剤は、静脈内投与されて、アナフィラキシー反応 の可能性を最小にする（ベナドリルについては４mg/kg）。CRM197は、リン酸緩 衝化生理食塩水pH7.4（PBS）中で５mg/mlの滅菌濾過した溶液で、５分間の時間 をかけて静脈内投与される。次いで、免疫毒素は、0.90mM硫酸ナトリウムおよび 10mMリン酸ナトリウムpH7.4の滅菌濾過した溶液中で２分間の時間をかけて0.2mg /mlで静脈内投与される。 生物学的パラメータの測定 以下のパラメータは、（以下のスケジュールに例示されるように）処置の間に 種々の間隔で測定され得る： Ａ サイトカイン、TNFα、γIFN、IL-6 Ｂ 日常的な臨床化学 Ｃ WBC、Hct、diff；リンパ球サブセットCD3、CD4、CD8、CD2、CD16、CD20 Ｄ 体重 Ｅ 免疫機能アッセイ。UCHT1（一次応答）およびCRM9（二次応答）に対する抗 体応答をモニターするための血清のELISAアッセイ。骨髄移植後１年でのポリオ およびＤＰＴ再免疫接種への抗体応答をモニターするためのELISAアッセイ。 （IT前）０日目 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ またＡは２時間後。 １日目 Ａ、Ｃ、Ｄ ２日目 Ａ、Ｃ、Ｄ ３日目 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ ４日目 Ｃ、Ｄ ７日目 Ａ、Ｃ、Ｄ 10日目 Ｂ、Ｃ 14日目 Ａ、Ｃ、Ｄ 21日目 Ｃ、Ｄ 28日目 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ 45日目 Ｃ、Ｄ 60日目 Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ 実施例８ 短縮型ジフテリア毒素での抗CD3一本鎖免疫毒素はヒト血液中の予め存在する抗 体による阻害を減少させる 本実施例は、Ｔリンパ球上のCD3分子に対する免疫毒素であるUCHT1-CRM9の毒 性に対する予め存在する抗DT抗体を有するヒト血清の効果を検査する。1:100以 上の希釈で検出可能な抗DT抗体を有する血清は、免疫毒素毒性を阻害した。放射 標識したUCHT1-CRM9での実験は、抗DT抗体が、細胞表面へのその結合を部分的に ブロックし、ならびにエンドソームからサイトゾルへの移行を阻害することを示 す。阻害効果は、全長DT変異体またはＢサブフラグメントを使用して、吸着され 得た。Ｃ末端短縮変異体は、阻害効果を吸着し得ず、これは、最後の150アミノ 酸が、阻害抗体によって認識されるエピトープを含むことを示唆する。 したがって、抗CD3一本鎖免疫毒素のsFv-DT390を、短縮型DTで作成した。sFv- DT390のIC50は、4.8×10-11Mであり、これは二価UCHT1-CRM9の1/16の効力であっ た。より重要なことには、sFv-DT390毒性は、ヒト血清中の抗DT抗体によってほ んのわずかに影響を受けただけであった。「sFv」および「scUCHT1」は両方とも 、可変領域を含む一本鎖抗体である。 変異した全長および短縮型ジフテリア毒素（DT）分子を、免疫毒素を作製する ために使用する。これらの免疫毒素は、その標的細胞に対して強い細胞傷害性効 果を示し、そしてそれらのいくつかは既に臨床治験に使用されている（１〜７） 。これまでに、Ｔ細胞レセプター複合体のCD3ε分子に対する免疫毒素である、 パン（pan）Ｔ細胞マーカーを構築した。この構築物は、マウス起源のUCHT1のモ ノクローナル抗体、およびジフテリア毒素（DT）の結合部位変異体のCRM9で作製 される（８）。免疫毒素のUCHT1-CRM9は、ヌードマウスにおいて樹立された異種 移植ヒトＴ細胞（Jurkat）腫瘍を退行し得る（９）。UCHT1-CRM9のアカゲザルア ナ ログのFN18-CRM9は、循環性Ｔ細胞を涸渇させるだけでなく、リンパ節にある常 在性Ｔ細胞を涸渇させ得た。この免疫毒素はまた、抗体処置および非処置コント ロールと比較して、皮膚同種移植拒絶を遅延した。 リシンおよびPseudomonas外毒素（PE）ベースの免疫毒素とは反対に、ヒトの 疾患の処置において、UCHT1-CRM9または他のDTベースの免疫毒素を使用する潜在 的な問題がある。ほとんどのヒトは、DTに対して免疫されている。したがって、 これらのヒトは、これらの免疫毒素の効率を強力に阻害または変化し得る、予め 存在する抗DT抗体力価を有する。この制限はまた、アカゲザルの研究でも生じた 。FN18-CRM9は血液中のＴ細胞を涸渇し得るが、抗DT抗体を有する動物において 非常に低い程度まで枯渇し、そしてＴ細胞は、抗DT力価を有さないサルと比較し て数日早く再増殖した。この抗体が媒介する阻害を克服するために、抗DT抗体を 含むヒト血清の、UCHT1-CRM9毒性に対する影響およびメカニズムの第１の実験を 行った。 DT点変異体、短縮型変異体、およびDTサブフラグメントを、ヒト血清中の抗DT 効果を中和するための試みに使用した。中和データに基づいて、一本鎖免疫毒素 を、予め存在する抗DT抗体の阻害効果を回避することが予測されるDTのＣ末端欠 失変異体で構築した。 細胞 Jurkat細胞（ATCC）を、10％ウシ胎仔血清、25mM重炭酸ナトリウム、および50 μg/mlの硫酸ゲンタマイシンを補充したRPMI 1640中で保持した。 血清および吸着分子 ヤギ抗DT血清は、Dr．Randall K．Holmes（USUHS，Bethesda，MD）によって提 供された。ヒト血清サンプルは、Dr．Henry McFarland(NINDS，NIH，Bethesda M D)によって提供された。酵素活性のない、DTのA-サブフラグメント変異体（Gly5 2→Glu）であるCRM197（図１Ａを参照のこと）（10）は、Biocine-IRIS(Siena， Italy)から入手可能である。Ｃ末端でのさらなる５アミノ酸を有するDTの短縮型 変異体（アミノ酸385）であるMSPΔ5は、Dr．Richard Youle(NINDS，NIH，Be thesda MD)によって提供された。DT B-サブフラグメントの精製は記載されてい る(11)。免疫毒素-UCHT1-CRM9合成は記載されている(12)。 組換え免疫毒素のsFv-DT390を、２段階で生成した。最初に、UCHT1抗体の可変 軽鎖（ＶL）および可変重鎖（ＶH）領域のコード配列を、公開された配列に基づ くプライマーを使用してRT-PCRの２工程プロトコルによって増幅した（13）。5' ＶLプライマーは、独特なNcoI制限酵素部位を付加したが、3'ＶHプライマーは、 定常領域結合部に、Ｊで、終止コドン、およびEcoRI部位を付加した。ＶL領域は 一本鎖重複伸長によってＶH領域に連結され、そして２つの領域は(Gly3Ser)4リ ンカーによって分離される。このことによって、個々の可変ドメインが機能的な 抗体結合部位を形成するように適切に折り畳まれるべきである(14)。第２に、ゲ ノムDNAを、(15)に記載のようにDT変異体CRM9を産生するC．diphtheriaeの株（C 7[βhtox-201tox-9h']）から単離した。このDNAをPCRに使用した。5'プライマー は、シグナル配列で始まる毒素遺伝子に特異的であり、そして独特のNdeI制限部 位を付加した。3'プライマーは、アミノ酸390で終止するDT配列に特異的であり 、そしてコード配列とともにインフレームでNcoI部位を付加した。PCR産物を、 適切な制限酵素で切断し、そしてNdeIおよびEcoRIで線状にされているE．coli発 現プラスミドpET-17b（Novagen，Inc.，Madison，WI，USA）にクローン化した。 得られたプラスミドを使用して、E．coli BL21/DE3細胞を形質転換した。細胞を 、0.5のOD590まで増殖し、0.5M IPTG（Invitrogen，San Diego，CA，USA）で誘 導し、そしてさらに３時間インキュベートした。細胞をFrench Pressで破壊し、 そして溶解物を35,000×gでの遠心分離にかけた後、sFv-DT390タンパク質を可溶 性画分中に単離した。 タンパク質合成阻害アッセイ 阻害アッセイを、以下の改変とともに(12)に記載のように行った。免疫毒素を 、細胞に添加する前に、室温で、所定の血清サンプルまたはロイシンを含まない 培地とともに30分間インキュベートした。いくつかの実験では、血清を、所定の 濃度での吸着分子とともに30分間プレインキュベートして、抗体を結合させた。 免疫毒素／血清混合物を、Jurkat細胞（96ウェルプレート中５×104細胞/ウェル ） とともに20時間インキュベートした。[3H]-ロイシン（4.5μCi/ml）の１時間パ ルスを、細胞がSkatronハーベスターのフィルター上に回収される前に得た。サ ンプルを、Beckmanシンチレーションカウンターでカウントした。各実験を、４ 連で行った。結果を、平均値に算出し、そしてコントロール細胞の割合として記 録した。 血清抗体検出 抗DT抗体を、ELISAによってヒト血清中から検出した。CRM9（10μg/ml）を、C ostar 96ウェルEIA/RIA平底プレート（Costar，Cambridge，MA，USA）に２時間 吸着させ、次いで0.1%Tween 20を含むリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄し た。次いで、各ウェルを、３％ゼラチンを含むPBSとともにインキュベートして 、プラスチックへの抗体の非特異的な結合を阻害した。血清サンプルを、プレー トへの添加前に、0.1％Tween 20および0.3％ゼラチンを含むPBSで希釈した。１ 時間のインキュベーションの後、ウェルを上記のように洗浄し、そしてプロテイ ンＡ／Ｇ-アルカリホスファターゼ（1:5,000；Pierce，Rockford，IL，USA）と ともにさらに１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、そしてホスファター ゼ基質（Pierce）を、製造業者の指示に従って添加した。30分後、発色をNaOHで 停止し、そして吸光度（OD）を、カイネティックマイクロプレートリーダー（Mo lecular Devices Corporation，Palo Alto，CA，USA）で測定した。各サンプル を３連で行った。結果は、O.D.値および抗体力価として表される。 エンドサイトーシスアッセイ UCHT1-CRM9を、(16)に記載のようにBolton-Hunter試薬（NEN Dupont，Wilming ton，DE，USA）を使用してヨウ素化した。Jurkat細胞を、結合培地（0.2％ウシ 血清アルブミン、10mM Hepes(pH7.4)を補充したおよび重炭酸ナトリウムを含ま ないRPMI 1640）で２回洗浄した。細胞（1.5×106）を、血清または結合培地と ともにプレインキュベートした125I-UCHT1-CRM9（１×10-9M）とともに氷上で２ 時間インキュベートした。非結合抗体を、遠心分離および再懸濁するとともにPB S（pH7.4）中で２回細胞を洗浄することによって除去した。２連のサンプルを、 氷上でまたは37℃にて30分間インキュベートした。各温度の点からの１つのサン プルを、800×gで遠心分離して、全細胞会合型カウント（ペレット）を、エキソ サイトーシス型カウントまたは解離型カウント（上清）から分離した。両方の画 分とも、Beckmanγ-カウンターでカウントした。インターナリゼーションした免 疫毒素の量を決定するために、各温度での第２のサンプルからの細胞を、低pH培 地（10mMモルホリノエタンスルホン酸を含む結合培地、そのすべてはHClでpH2.0 に滴定した）中で５分間インキュベートして、表面に結合した125Ｉ-免疫毒素を 解離した(17)。サンプルを、800×gで遠心分離して、膜結合型（上清）からイン ターナライズ型（ペレット）を分離した。両方の画分とも、Beckmanγ-カウンタ ー（Beckman，Fullerton，CA，USA）でカウントした。 抗DT抗体を有する血清はUCHT1-CRM9毒性を阻害する ヒトはDTに対して免疫されているので、血清中の抗DT抗体の存在を、ELISAに よって決定した（表３）。限定されたサンプル集団において、血清サンプルの80 ％が、1:100以上の抗DT抗体力価を有した。ドナーのワクチン接種状態は利用可 能ではなかった。UCHT1-CRM9毒性におけるこれらの抗体の効果を決定するために 、免疫毒素を、種々の濃度の血清とともにプレインキュベートし、そして混合物 の毒性をアッセイした（表３）。顕著なELISA O.D.（バックグラウンドの２倍以 上）を有さない血清サンプルは、高濃度の血清（1:10）でUCHT1-CRM9毒性に影響 を及ぼし得なかった。しかし、ポジティブなELISAの結果を有する血清サンプル は、1:10の希釈で細胞傷害効果を中和し得、そして高いELISA O.D.（バックグラ ウンドの７〜11倍以上）を有するサンプルは、1:100の希釈でさえ毒性を阻害し た。類似の結果が、サル血清サンプルとともに行ったアッセイで見られた。血清はUCHT1-CRM9のエンドサイトーシスを阻害しない UCHT1-CRM9毒性における血清の阻害効果は、細胞表面への免疫毒素の結合また は細胞へのUCHT1-CRM9のエンドサイトーシスの抑制のためであり得た。エンドサ イトーシスアッセイを、125Ｉ-UCHT1-CRM9を使用して行って、これらのプロセス のいずれかが血清に存在する抗ＤＴ抗体によって影響を受けるかどうかを決定し た。結果は、血清（ヤギ抗DTまたはヒト）の存在が、細胞表面に結合する免疫毒 素の数が80％も減少することを示す（表４）。これは、結合の著しい減少である が、毒性アッセイにおいてインプットの免疫毒素（１対数低いUCHT1-CRM9）の90 ％を限定することは、コントロールの25％未満までタンパク質合成を減少させる （図２を参照のこと）。対照的に、抗DT抗体を含む血清の阻害効果は100％であ る。したがって、抗DT抗体の効果は、すべてが細胞表面への結合阻害のレベルで はない。氷上での２時間の125Ｉ-UCHT1-CRM9のプレインキュベーションおよびそ れに続く室温での洗浄は、内在した総細胞会合した数の18〜25％を生じた（表４ ）。37℃にて30分間のインキュベーション後、血清ありおよびなしの両方で内在 する数の２倍化(doubling)があり、これは標識された免疫毒素の同じ割合がエン ドサイトーシスすることを示す。血清の同一希釈物を、非標識UCHT1-CRM9とイン キュベートし、そしてタンパク質合成阻害アッセイで使用した。結果は、使用し た血清に対する免疫毒素の比が、毒性を完全に阻害し得た（表４）が、UCHT1-CR M9のエンドサイトーシスに影響を及ぼさなかったことを示す。抗DT抗体の阻害効果は吸着によって除去され得る 血清の阻害効果を抑制するため、および血清が毒性を阻害するメカニズムを洞 察するために、血清から防御抗DT抗体を吸着するように実験を設計した。血清（ ポジティブ抗DT ELISAまたはヤギ抗DTを有するすべての血清のプール）を、CRM1 97(酵素活性のないDTのＡ鎖変異体)、MSPΔ5（最後の150アミノ酸のない短縮型 変異体）、およびDTの精製したＡおよびＢ-サブフラグメントの漸増濃度ととも に30分間プレインキュベートした（図1A）。次いで、吸着した血清を、タンパク 質合成阻害アッセイにおいてUCHT1-CRM9とインキュベートした。全長DT様構築物 であるCRM197は、ヤギ（図1B）およびプールしたヒト血清（図1C）の両方からの 防御抗体を完全に吸着し得た。DTのB-フラグメントも、完全な吸着が可能である が、約100倍以上を必要とする。DTのＡサブフラグメントは、いずれの血清にも ほとんどまたは全く効果がなかったが、血清サンプルが、ウエスタンブロット分 析によってＡおよびＢの両方のサブフラグメントに反応性の抗体を含むことを証 明した。短縮型変異体のMSPΔ5で見られる結果は、興味深かった。MSPΔ5を有す るヤギ血清の吸着により、血清の防御効果の用量依存的除去を得た（図1B）。し かし、この吸着は、CRM197またはＢサブフラグメントを使用した場合に得られる レベルまで毒性を低下し得なかった。 ヤギ血清で観察される結果とは反対に、MSPΔ5は、プールしたヒト血清におけ る効果がほとんどなかった（図1C）。これらの結果は、ヒト血清において防御効 果に重要な予め存在する抗DT抗体が、主としてDTの最後の150アミノ酸に指向す ることを示唆する。 sFv-DT390は、ヒト血清に存在する抗DT抗体による阻害に比較的耐性である。 防御に重要な抗体によって認識されるエピトープがＣ末端の150アミノ酸にあ ることが観察されると、一本鎖免疫毒素を、DTの最初の390アミノ酸（535のうち ）で生成した。390位を、２つの理由について選択した：第１に、DTの３次元構 造は、この位置が酵素ドメインから離れた分子上の外部点であることを示唆し(1 8)、そして第２に、融合毒素は、血清効果の報告が無い、より長いDTサブフラグ メントを使用して生成された(19)。DTの最初の390アミノ酸をコードするDNAを、 抗CD3εsFv（(Gly3Ser)4リンカー配列を使用してＶHに連結したＶL）をコード するDNAに連結した。この融合タンパク質についての予測した分子量は71,000ダ ルトンであり、そしてインビトロで転写および翻訳したタンパク質ならびにヤギ 抗DT抗体を使用してE．coliから単離したタンパク質の両方のウエスタンブロッ ト分析によって確認されている。E．coli株BL21/DE3から単離したsFv-DT390タン パク質の毒性を、タンパク質合成阻害アッセイにおいてUCHT1-CRM9と比較した（ 図2A）。sFv-DT390のIC50（タンパク質合成をコントロールの50％阻害するため に必要とされる濃度）は、4.8×10-11Mであり、UCHT1-CRM9についての2.9×10-1 2 Mと比較して16倍の差があった。sFv-DT390構築物の特異性を証明するために、 競合物としてUCHT1抗体の漸増濃度を使用して、競合実験を行った（図2B）。結 果は、約1/8の抗体が、UCHT1-CRM9と比較した場合、sFv-DT390毒性を競合するた めに50％まで必要とされることを示した。抗体は、両方の構築物の毒性と全て競 合し得、それゆえそれらの特異性を示した。次いで、免疫毒素を、血清の漸増希 釈の存在下でタンパク質合成アッセイに供した（表５）。 UCHT1-CRM9毒性を、ヒト血清の1:10希釈で完全に阻害したが、1:100希釈では 毒性は、血清を含まないコントロールに等しかった。対照的に、sFv-DT390免疫 毒素は、ヒト血清の1:10希釈で部分的にのみ阻害され、そして1:100希釈は毒性 に対して影響しなかった。両方の免疫毒素は、ヤギ抗DT血清（1:1,000希釈）に よって完全に阻害される。これらの結果は、sFv-DT390免疫毒素が、ほとんどの ヒト血清に存在する、予め存在する抗DT抗体を部分的に回避することを示す。 これらの結果は、ヒト血清に存在する予め存在する抗DT抗体が、免疫毒素UCHT 1-CRM9の毒性を阻害することを示す。この毒性の阻害はまた、ヤギ抗DT血清でも 観察されたが、しかし、ヤギ血清は、毒性を完全に阻害するためにより少量で必 要とされた。実験を、インビボ状況を模倣するように設計した。動物モデルで現 在テストされている循環する免疫毒素のピーク濃度は、１×10-9Mである。ヒト 血清の1:10希釈とインキュベートした免疫毒素濃度は１×10-10Mであり、したが ってインビボ条件に近い。毒性の阻害は、ELISAによって決定された血清抗体レ ベルと相関し（表４）、これはより高い抗DT力価を有する血清が、より強い阻害 効果を有することを示す。同様に、最も高いELISA値を得るヤギ抗DT血清を10,00 0倍に希釈し、そしてなおUCHT1-CRM9毒性を完全に阻害し得た。この相互関連 が存在することから、血清の任意の他の成分が、UCHT1-CRM9の毒性を阻害するこ とを示さない。 さらに、データは、1:100希釈の力価が、免疫毒素毒性の阻害に必要であるこ とを示す。DTの最初の486アミノ酸が、インターロイキン-2、に融合した構築物D AB486IL-2を、リンパ球悪性腫瘍患者で使用した。DAB486IL-2に対する部分応答 を、処置前に1:100以下の希釈の抗DT力価を有する数名の患者で観察した。 免疫毒素による細胞の中毒は、４つの一般的段階に分けられ得る：1)細胞表面 への特異的結合、2)細胞へのエンドサイトーシス、3)エンドソームからの毒素の 酵素ドメインの転位、および4)標的分子の酵素不活性化。示された結果は、細胞 表面に到達する免疫毒素の量は血清の存在下でより低いが、結合した免疫毒素の 同じ割合がエンドサイトーシスされることを示す。細胞に結合した免疫毒素の減 少した量を考慮すると、エンドサイトーシスした免疫毒素の量は、コントロール の25％以下まで細胞を中毒すべきである。しかし、免疫毒素は、抗DT抗体を含む 血清の存在下でタンパク質合成に対して効果がなかった。DTのＡサブフラグメン トは血清の防御効果を吸着し得なかったがＢサブフラグメントは吸着し得たので 、血清の効果は、毒素の酵素活性を阻害するレベルではないようである。したが って、抗DT抗体は、おそらくサイトゾルへのＡサブフラグメントの転位に影響を 及ぼす。 CRM197、Ｂサブフラグメント、およびMSPΔ5は、ヤギおよびアカゲザル血清由 来の防御抗DT抗体を吸着し得た。しかし、３つのDT変異体の中で、MSPΔ5は、ヒ ト血清の存在下でUCHT1-CRM9毒性を阻害し得ず、これはヒト、ヤギ、およびアカ ゲザルの中での抗DT抗体レパートリーの差異を示した。この差異は、免疫経路に 起因するようではない。なぜなら、本研究に使用されるサルは、DTについて免疫 されず、そしておそらくC．diphtheriaeの毒素産生性株での天然の感染後に抗体 を得るからである。アカゲザルおよびヒトが類似の抗体レパートリーを共有した ことを示す報告(21)があるが、本発明の結果は、免疫毒素処置が意図される宿主 からの抗体の効果が有用であるべきであることを示唆する。 ヒト血清において予め存在する抗DT抗体のブロッキング効果を克服するために 、基本的に２つの経路が存在する。１つは、非毒性DT変異体で抗体を中和するこ と であり、そして他方は免疫毒素を作成するために使用されるDT構造を修飾するこ とである(3)。抗体中和経路は、上記のようにFN18-CRM9処置のサルにおける研究 で試験されている。 本結果は、ＡサブフラグメントおよびＢサブフラグメントの両方に対する抗体 がヒト血清には存在するが、MSP5は、予め存在する防御抗DT抗体を中和し得ず、 したがってUCHT1-CRM9の細胞傷害性の阻害を抑制し得ないことを示した。しかし 、ヤギおよびサル血清の阻害効果をブロックした。これは、本発明の組換え免疫 毒素のsFv-DT390の構築を促した。sFv-DT390のIC50は、4.8×10-11Mであり、UCH T1-CRM9の1/16の強さである。多くの他の一本鎖構築物と同様に、sFv-DT390は、 全長の二価抗体で生成される免疫毒素と比較して一価である。sFv-DT390の減少 した毒性は、主としてこの親和性の差異で説明され得る。抗体の精製されたF(ab )'フラグメントで生成された免疫毒素はまた、全長抗体で生成したその対照物と 比較した場合、インビトロで毒性の損失（一般的に1.5対数差）を示す(22)。sFv -DT390の毒性は、DAB486IL-2について報告された毒性に匹敵する(23)。本データ から、sFv-DT390のいくつかの利点が予測される。第１に、sFv-DT390は、UCHT1- CRM9の分子量のほんの1/3である。sFv-DT390のモル濃度は、同じ量（例えば、0. 2mg/kg）が与えられる場合、UCHT1-CRM9の濃度よりも３倍高い。したがってこれ らの効力の差異は、約５倍に減少され得た。第２に、インビトロ実験（表５）で は、sFv-DT390およびUCHTI1-CRM9の同じモル濃度を血清阻害テストに使用したが 、前者は、後者と比較して1/16のみの効力である。ヒト血清に予め存在する抗DT 抗体は、sFv-DT390の毒性をほんの部分的にブロックし得たが、UCHT1-CRM9の効 果は完全にブロックした。したがって、sFv-DT390は、インビボ状況で抗DT抗体 を回避するが、UCHT1-CRM9は回避し得ないと予測される。第３に、sFv-DT390は 、UCHT1の可変領域のみを含み、そして天然のマウス抗体UCHT1よりもヒト抗マウ ス抗体（HAMA）応答の免疫原性が低いと予測される。最後に、sFv-DT390の産生 費用は、UCHT1-CRM9の費用よりも非常に低い。これらの理由に基づいて、sFv-DT 390、または類似の特性を有する他のものは、ヒトにおいて、特に抗DTポジティ ブ個体および繰り返しの処置を必要とする患者において、Ｔ細胞が媒介する病気 の処置に有用であると予測される。この仮定を支持する証拠を得るために、sF v-DT390のアカゲザルアナログを構築し、そして上記の実施例に記載のようにサ ルのモデルで試験することのみが必要である。 実施例９ 二価キメラ抗ヒトCD3−本鎖抗体の発現および特徴づけ マウス抗CD3モノクローナル抗体（mAb）を、免疫抑制のために臨床実施で使用 する。しかし、この処置には２つの主な欠点がある：関連サイトカイン放出症候 群およびヒト抗マウス抗体応答。これらの副作用を克服するために、キメラ抗ヒ トCD3−本鎖抗体のscUCHT1を生成した。これは実施例９に記載のUCHT1のIgM改変 体である。scUCHT1は、UCHT1の軽鎖および重鎖可変鎖結合ドメインならびにヒト IgM Fc領域（CH2〜CH4）からなる。使用した方法はShuら(37)に報告されており 、そしてさらに以下に記載する。以下のデータは、操作されたキメラ抗CD3一本 鎖抗体（scUCHT1）が、臨床的免疫抑制処置に有用であることを示す。 オリゴヌクレオチドプライマーおよびDNA増幅 抗体操作に使用されるプライマーを表６に挙げ、そしてプライマー配列は刊行 されたデータに基づく(13)。scUCHT1をクローニングする手順を、図３に概略的 に示す。UCHT1ハイブリドーマ細胞（Dr．P.C．Beverley，Imperial Cancer Rese arch Fund Londonにより提供）から単離されたmRNAをcDNAに逆転写した。UCHT1 のＶL領域およびＶH領域を、それぞれプライマー対P1、P2およびP3、P4を使用し てcDNAからポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅した。プライマーP2およびP3は 、25bpの相補的重複およびそれぞれをコードしたリンカーペプチド(Gly4Ser)3の 一部を有する。一本鎖可変フラグメント（ＶL-リンカー-ＶH）を、プライマーP1 およびP4を使用するＶLおよびＶHの組換え増幅によって生成した。マウスκ鎖シ グナル配列を、最初はプライマーSP2およびP4を、次いでプライマーSP1およびP4 を使用してPCRによってVLの5'末端に付加した。ヒトIgM Fc領域（CH2〜CH4）を 、プラスミドpBlue-huIgM（Dr．S.V.S．Kashmiri，National Cancer Institute ，Bethesdaの好意によって提供された）から増幅した。この遺伝子フラグメント は、約1.8kbであった。抗原認識に重要であるＶL-リンカー-ＶH-CH2領域を、配 列分析によって確認した。最後に、一本鎖可変フラグメントおよびヒトIgM Fc領 域を、プラスミドpBK/CMV（Stratagene，La Jolla，CA，USA）にクローニングし た。テンプレートとして生成されたpBK/scUCHT1プラスミドを使用して、インビ トロ転写−翻訳アッセイは、75kDaの予測されたサイズの産物を得た。COS-7およびSP2/0細胞での発現 次いで、scUCHT1をコードする遺伝子フラグメントを、発現ベクターpLNCXにク ローニングした(36)。scUCHT1遺伝子構築物を、リン酸カルシウム法(32)でCOS-7 細胞に導入し、そしてエレクトロポレーション(33)によってSP2/0ミエローマ細 胞に導入した。トランスフェクトした細胞を、DMEM培地中500μg/ml G418（GIBC O/BRL，Gaithersburg，MD，USA）で選択した。薬物耐性トランスフェクタントを 、抗ヒトIgM ELISA技法によってscUCHT1分泌についてスクリーニングした。scUC HT1をスクリーニングするトランスフェクタントを、限界希釈によってクローニ ングした。 ２つの安定なクローン、COS-4C10およびSP2/0-7C8は、培養培地中で約0.5mg/m lのscUCHT1を産生し得、これをさらなる評価のために選択した。COS-4C10および SP2/0-7C8細胞の培養上清を、抗ヒトIgM抗体を使用するイムノブロッティングに よって分析した（図４）。ヒトIgM抗体を、分析においてコントロールとして含 ませた。還元条件下、COS-7およびSP2/0細胞によって産生したscUCHT1は、コン トロールヒトIgM重鎖（75kDa）と類似の電気泳動移動度を有した。非還元条件下 、COS-7細胞からのscUCHT1は、約150kDaの一本のバンドとして現れ、一本鎖抗体 のホモダイマーであると考えられた。SP2/0細胞は、主として、いくつかのより 高い分子量の産物と類似のサイズのタンパク質を産生した。 scUCHT1を構築することにおいて、ShuらがＶL-ＶH配向に使用したsFv、ＶH-ＶL のドメイン配向を変化して、その結果重鎖定常ドメインをＶHドメインに連結し た。哺乳動物細胞では、免疫グロブリン分子の分泌は、軽鎖によって媒介され、 そして遊離した軽鎖が容易に分泌される(38)。しかし、遊離した重鎖は、一般的 に分泌されない(39)。細菌発現系において、ＶL-ＶHドメイン配向を有する分泌 されたsFvの収量は、ＶH-ＶLドメイン配向で得られたものより約20倍多かった(4 0)。scUCHT1構築物中のNH2末端位置でのＶLおよび重鎖定常領域に連結したＶHが 、哺乳動物細胞中でこの免疫グロブリン様分子の分泌を増強し得ると論証した。 実際、scUCHT1を、COS-7およびSP2/0細胞の両方の細胞によって効果的に産生し た。ホローファイバー培養は、その産生を増加させるはずである。さらに、IgM 様分子のscUCHT1は、重合化に関与する最後から２番目のシステイン（Cy s575）を含む分泌テイルピースを有し、そしてまたIgMモノマーの保持および分 解を提供する(41〜43)。Cys575をセリンで置換することはまた、収率を非常に改 善し得る。 COS-7細胞から分泌されるscUCHT1は、イムノブロッティングによって二価形態 であることを示され、これは、２つの一価分子のジスルフィド結合連結を示唆し た。ジスルフィド結合は、おそらくCH2領域とCH3領域との間に位置し、ここでＣ ｙｓ337-Cys337ジスルフィド結合が、存在すると考えられる。Cys337は、IgMモ ノマーの構築に十分であると考えられ、そしてポリマーの形成に十分でも必要で もなかった。しかし、Cys575は、IgMポリマーの構築に必要であり、そしてCys41 4は、IgMモノマーまたはポリマーの形成を必要としなかった(44)。一本鎖抗体の この二価形態は、その結合親和性を増加させるはずである。SP2/0細胞から産生 されたscUCHT1は、主として二価形態にあったが、小量の抗体は、より高い分子 量を有し、分泌されたヒトIgMの天然の形態であるヒトIgMペンタマーにほぼ匹敵 する。 scUCHT1のウエスタンブロット分析 scUCHT1を、ヤギ抗ヒトIgM-アガロース（Sigma，St．Louis，MO，USA）を使用 して培養上清から沈殿させ、そして還元および非還元条件下で４〜20％SDS-PAGE 勾配ゲルで分離した。分離したタンパク質を、50ボルトにて１時間エレクトロブ ロッティングすることによってProBlottTMメンブラン（Applied Biosystems，Fo ster City，CA，USA）に移した。メンブランをブロックし、そして製造業者の指 示に従ってアルカリホスファターゼ標識したヤギ抗ヒトIgM抗体（PIERCE，Rockf ord，IL，USA）とインキュベートした。発色を、基質NBT/BCIP（PIERCE）を用い て行った。 scUCHT1の精製 培養上清を、抗ヒトIgM-アガロースと混合し、そして振盪しながら一晩４℃に てインキュベートし、次いで混合物をカラムに移した。フロースルーのOD280が0 .01未満になるまで、カラムを洗浄緩衝液（0.01Mリン酸Na、pH7.2、0.5M NaCl） で洗浄した。scUCHT1を、溶出緩衝液（0.1Mグリシン、pH2.4、および0.15M NaCl ）で溶出した。画分を、直ちに1Mリン酸Na（pH8.0）で中和し、次いで濃縮し、 そしてPBSに対して透析した。 競合結合アッセイ 親抗体UCHT1を、既述のようにボールトン-ハンター(Bolton-Hunter)試薬（NEN ，Wilmington，DE，USA）を使用してヨウ素化した(34)。125Ｉ-標識したUCHT1を トレーサーとして使用し、そしてDMEM培地で0.3〜0.6nMに希釈した。UCHT1なら びにCOS-7およびSP2/0トランスフェクタント細胞から精製したscUCHT1を、競合 物として使用した。ヒトCD3発現Jurkat細胞を、DMEM培地（２×107/ml）に懸濁 した。50μlのこのような細胞懸濁液（１×106）を、50μlの希釈したトレーサ ーおよび50mlの希釈した競合物とともに氷上で２時間インキュベートした。その 後、細胞をペレット化し、そしてガンマカウンターでカウントした。結果を、競 合物の非存在下で細胞に結合した125Ｉ-UCHT1の割合として表した（図５）。 COS-7およびSP2/0細胞の両方からのscUCHT1は、用量依存的にJurkat細胞への1 25 Ｉ-UCHT1の結合を特異的に阻害し得た。競合物（UCHT1、COS-7およびSP2/0細 胞からのscUCHT1）の濃度が１から100nMへと増加させるにつれて、Jurkat細胞に 結合したトレーサー（125Ｉヨウ素化したUCHT1）は、80％からほぼ０％に減少し た。UCHT1とCOS-7およびSP2/0細胞からのscUCHT1の親和性曲線の中で、有意差は 観察されなかった。これは、操作した抗体scUCHT1が、UCHT1とほぼ同じ親和性を 有することを示す。さらに、scUCHT1は、ヒトIgM定常領域を含み、そしてUCHT1 より低い免疫原性であることが期待される。その免疫原性の程度は、scUCHT1の マウス可変領域によって変化し得る。CDR移植によるヒト化可変領域またはヒト 可変領域は、さらにその免疫原性を減少させるために使用され得る(31)。 Ｔ細胞増殖アッセイ UCHT1およびscUCHT1に応答するＴ細胞増殖を、健常ドナーからのヒトPBMCでテ ストした（図６）。ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、Ficoll-Hypaque勾配での密 度遠心分離によって健常成人の血液から単離した(34)。PBMCを、10％FCSを補充 したRPMI 1640に再懸濁し、そして５×104細胞/ウェルで96ウェルＵ底プレート に小分けした。漸増量の抗CD3抗体（UCHT1、scUCHT1）を添加した。5%CO2を含む 湿潤雰囲気中37℃にて培養の72時間後、１μCi[3H]チミジン（NEN）を各ウェル に添加した。16時間後、細胞を採取し、そして[3H]チミジン取り込みを、液体シ ンチレーションカウンターでカウントした。 親抗体UCHT1は、0.1ng/mlで増殖を誘導し始め、そして100ng/mlでピークにな った。CPMでの小さな低下（small drop）を、濃度が1,000ng/mlに増加するにつ れて観察した。しかし、scUCHT1とインキュベートしたPBMCにおける[3H]チミジ ンの取り込みは、0.１〜10ng/mlの範囲でほんのわずかに増加し、そして濃度が1 0ng/mlよりも高かった場合、取り込まれたカウントは減少し、そして1,000ng/ml で０カウントに近づいた。 TNF-αおよびIFN-γの測定 UCHT1およびscUCHT1によって誘導されたヒトPBMCのTNF-αおよびIFN-γの産生 を、ELISAで測定した。４×105PBMCを、10％FCSを補充したRPMI 1640中96ウェル 平底プレートに抗CD3抗体（UCHT1、scUCHT1）の連続希釈物と培養した。上清を 、培養開始後TNF-αについては36時間、およびIFN-γについては72時間で収集し た(35)。TNF-αおよびIFN-γを、製造業者の指示に従ってELISAキット（Endogen Inc．Cambridge，MA，USA）で測定した。 天然の抗体UCHTIは、用量依存的にTNF-αおよびIFN-γの両方の産生を誘導し た（図7aおよび7b）。より高い濃度のUCHT1は、TNF-αおよびIFN-γのより高い 産生を誘導した。反対に、scUCHT1は、どの濃度でもTNF-αの分泌を誘導せず（ 図7a）、そしてその濃度が0.1ng/mlよりも高い場合、IFN-γ産生を阻害した（図 7b）。上清採取の際に、UCHT1およびscUCHT1と培養したPBMCをまた、トリパンブ ルー排除テストでチェックした。細胞は、両方の状況で生存することが示された 。TNF-αおよびIFN-γELISAアッセイでは、関連のないヒトIgMを含ませ、そして それはTNF-αおよびIFN-γ産生に影響を及ぼさなかった。 scUCHT1による可能性のある相補的結合の測定 二価scUCHT1は、検出可能な量の補体を結合しなかった。この特徴は、免疫複 合病を最小にする点で外来タンパク質で患者を処置することに有利である。 抗CD3 mAbは、インビトロおよびインビボの両方の状況でＴ細胞活性化および 増殖を誘導し得る(45)。Ｔ細胞とFcR発現細胞との間の抗CD3抗体の架橋は、この プロセスに必須の工程である(46)。したがって、Ｔ細胞活性化は、ヒトFcRとのm Abの効率的相互作用を反映する。インビトロ研究のこれまでのデータは、Ｔ細胞 活性化が、TNF-α、IFN-γ、およびIL-2の増加した産生を生じることを示した(2 4)。ヒトIgG Fcレセプター（FcγR I、FcγR II、FcγR III）は、ヒト単球、Ｔ リンパ球、Ｂリンパ球、およびNK細胞上に分布する(47)。FcγR IおよびFcγR I Iは、マウスおよびヒトのIgGの両方とも認識し得る。上記の観察によれば、UCHT 1は、Ｔ細胞増殖ならびにTNF-αおよびIFN-γ放出の誘導が強力であった。ヒトI gM Fcレセプター（FcμR）は、主として、Ｂリンパ球、NK細胞、およびおそらく Ｔリンパ球のヘルパーサブセットの小画分に存在すると報告された（47、48）。 IgMのペンタマー形態およびインタクトなCH3ドメインは、FcμRへの最適結合に 必要とされる。IgMのモノマーまたはダイマーサブユニットは、FcμRへの結合に はあまり効率的ではない（49、50）。Ｔ細胞上でのIgMのFcμRへの架橋は、マイ トジエン誘導Ｔ細胞増殖を阻害し、そしてFcμRは、ネガティブシグナル伝達分 子として機能し得る（51、52）。 したがって、ヒトCD3分子およびFcμRに特異的に結合し得る。scUCHT1が、ヒ トＢおよびＴ細胞、およびおそらくＴおよびＴ細胞を架橋し得ると考えられる。 インビトロアッセイでは、COS-7およびSP2/0の両方の細胞からのscUCHT1は、低 濃度（10ng/ml未満）でＴ細胞増殖アッセイでほとんど効果がなく、そして濃度 の増加につれて阻害した。これらの結果によれば、scUCHT1は、TNF-α産生を誘 導せず、そしてIFN-γの基本収量を阻害までもした。 本発明のキメラ抗CD3−本鎖抗体scUCHT1は、高いヒトCD3結合特異性および親 和性を有し、そしてＴ細胞増殖およびサイトカイン放出を誘導しない。さらに、 ヒト抗マウス抗体応答を誘導する可能性を減少させるはずであるヒトIgM Fcフラ グメントを有する。したがって、scUCHT1は、臨床的免疫抑制処置に使用され得 る。 実施例10 DTM2の構築のためのDT遺伝子の全長をクローニングすること Corynebacteriophage beta（C．diphtheriae）tox 228遺伝子配列は、geneban k由来であった。（Science 221,885-858，1983）。配列は2220bpである。（-180 〜-10）の付近のプロモーター配列を含む300bpの5'非翻訳領域（１〜300）、シ グナルペプチド（301〜376）、Ａ鎖（377〜955）、およびＢ鎖（956〜1983）を 含む1682のコード領域（301〜1983）、ならびに3'非翻訳領域（1984〜2220）が ある。 全長DTを、２つのフラグメントに増幅した。pelBリーダー配列（ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTGCGCT GCC CAA CCA GCG ATGG CC 3'、配列番号10）を、プライマーEcosignalDT-1およびEcosignalDT-2による ポリメラーゼ連鎖反応中のすべての構築物に対するDTコード配列の5'末端に付加 した。311bpの上流フラグメント（位置301〜546bp）を、オリゴEcosignalDT-2お よびp546RによってテンプレートとしてCRM9 DNAとともに増幅し、そして1471bp の下流フラグメントを、p514Sおよびp1983RによってテンプレートとしてDTM1 DN Aを用いて増幅した。次いで、全長DTの合わせたPCR産物を、プライマーEcosigna lDT-1およびp1983Rを用いて増幅した。結果として、増幅したDTコード配列（位 置376〜1983bp）は、5'末端に付加されたpelBリーダー配列を獲得し、そしてDTM 1と同様に２つの変異体部位[（508 Ser→Phe）および（525Ser→Phe）]を含む。 プライマー： 変異体残基を、52位に導入した。52位野生型DTでのグリシン（GGG）を、グル タミン酸（GAG）に置換した。この２つのプライマーp546Rおよびp514Sは変異コ ドン（GGGからGAGへ）を有した。これらの２つのプライマーのPCR産物は、コド ンGGGの代わりに置換したコドン（GAG）を含んだ。２つのフラグメントの連結し た二本鎖DNA（1683bp）を、制限部位NdeIおよびBamHIによってpET 17bにクロー ニングした。 データは、抗ヒトブロッキング抗体が、毒素のＣ末端に特異的に指向すること を示す。UCHT1 VLVH領域に由来する特異的配列を記載するが、当業者は、この誘 導体を使用して融合免疫毒素に対するより好ましい治療剤比に与えるsc-抗CD3抗 体の親和性を増加させるように設計され得るVLVHドメインに、配列改変をし得る 。このような改変は、本発明の教示の範囲内である。一価抗体VLVH構築物の不利 点は、二価抗体を利用して化学結合した結合体と比較して、Ｔ細胞に対するより 低い親和性を有することである。 これらは、sc抗CD3抗体の第１の例であると考えられる。非常に少ないＢ細胞 またはマクロファージがIgM Fcレセプターを含むので、IgMを選択した。（Ｔ細 胞以外の細胞に対する免疫毒素の結合は、抗Ｔ細胞免疫毒素の特異性を減少させ 、そしてこの状況を意図して避ける）。しかし、細菌発現系を使用して、炭水化 物は、Fcレセプター結合もまた排除する抗体に結合しない。したがって、他のヒ トIgG定常ドメインを置換することは、日常的改変であり、そして請求されるべ きである。 種々の二価融合タンパク質の免疫毒素を提供する。これらは、E．coliで発現 されており、そして還元および非還元SDSゲルのウエスタンブロットは、免疫毒 素のほとんどが、ダイマー（二価）種として分泌されることを確認する（図８） 。毒素の位置は、二価抗体部位の立体障害を最小にするのを試みるために変化さ せており、なお、膜を横切る毒素転位を容易にするためにCD3レセプターとの最 良の相互作用を提供する。図９は、二価免疫毒素融合タンパク質を発現するクロ ーンを示す。これを産生するクローンは、一本鎖抗体を使用することによって構 築されるクローン、次いで停止コドン、ならびに一本鎖免疫毒素からなり、すべ て１つのプロモーター下にある（BetterらProc．Natl．Acad．Sci．90:457-461 ，1993年1月）。鎖間ジスルフィドの分泌および酸化後、３種が存在する：sc二 価抗体、二価融合免疫毒素、および１つのみの毒素を含む二価sc抗体。この種は 、サイズ分離によって単離される。この種の利点は、二価後退ドメインに対する 立体障害が１つのみの毒素ドメインの存在によって制限される。他の変更は、本 明細書に記載のおよび当該技術分野の方法を与える構築物に対して日常的である 。 図示したものは、二価特徴を最もよく示すようであると考えられる。抗体ドメイ ンに対する毒素の多くの配向が行われ得、そして多くは有効であると予測される 。 さらに、毒素Ｃ末端の長さは、二つの競合する機能間の最適化を提供するよう に種々のものとされている。DT後の数字は、毒素Ａ鎖のアミノ末端を１として計 数したアミノ酸残基の数を指す。完全長毒素をDTM1と呼び、これは、Dr.Richard Youle NINDS,NIH(Nichollsら、J.Biol.Chem.268(7):5302-5308,1993)から提供 を受けた。これは、508および525位にＳからＦへの点変異を有する。この完全長 毒素変異体は、CRM9の525位にＳからＦへの本質的な変異を有しており、転位機 能を破壊することなく、DTレセプターへの結合性を３〜４log減少させる。508位 にＳからＦへの他の変異が付加されてきた。なぜなら、単一塩基対復帰変異によ って、0.1μg/kgの最低致死用量で野生型毒素に復帰し得るクローニング変異体D Tに先の制限があるためである。この機能を実行する他の変異は、C末端で日常的 に作製され得る(Shenら、J.Biol.Chem.269(46):29077-29084,1994)。これらは、 F530A;K526A;N524A;V523A;K516A,Y514Aである。毒性を10〜100倍減少させる、DT に単一の点変異を有するクローンが、クローンが抗体フラグメント融合タンパク 質を含有する条件で作製され得る。なぜなら、DTへの抗体の化学結合により、全 身性野生型毒素の毒性が100倍減少することが示されているからである(Neville ら、J.Biol.Chem.264(25):14653-14661,1989)。従って、本発明は、525位のＳか らＦへの変異のみならびに上記に記載の変異を有する完全長変異体DT配列を提供 する。また、これらの同じ変異が、DTM2のＢ鎖変異体部位について考えられてお り、同様に作製され得る。化学結合に関する先のデータは、C末端が長いほど、 転位機能が良くなることを示した(Colombattiら、J.Biol.Chem.261(7):3030-303 5,1986)。しかし、C末端が短いほど、循環抗毒素ブロック抗体作用が低下する。 患者は、測定され得る（毒性アッセイを参照）異なるレベルのブロック抗体を有 するので、至適免疫毒素は個々の患者に対して選択され得る。DTM1とDT483、DT3 90およびDT370とを有するscUCHT1融合タンパク質は、クローン化され、E.coliで 発現されている。これらの各毒素ドメインを使用する、これらの各変種および二 価scUCHT1融合タンパク質が提供される。 本発明は、CRM197(1994年９月19日に出願された米国特許出願第08/034,509号 に記載の非毒性毒素変異体)における改良を提供するもので、本明細書において はDTM2と称される。DTM2は、CRM197と同じ変異に加えて、結合をブロックするC 末端における二つの変異を有する（シートおよび図８を参照）。これは、CRM197 が細胞に結合された後、さらに循環抗毒素により結合されるときに生じ得る免疫 複合疾患の確率を減少させることが期待される。腎臓は、特に影響を受けやすい 。DTM2は、細胞に結合し得ず、それにより組織損傷の可能性を弱める。さらに、 DTM2は、E.coliにおける産生用のpelB分泌性シグナルまたはC.diphtheriaeにお ける産生用のCRM9 DNAからクローン化した鉄非依存性変異プロモーターDT配列を 含有させることにより高レベル産生のために作製される。DTM2の本質的特徴は、 525位のSからFへの変異および52位のGからEへの変異であり、これら二つの変異 を有する構築物が提供される。 本明細書に報告した全ての構築物は、pelBシグナル配列または他の適当なシグ ナル配列を使用してE．coliにおいて発現され得る。発現はまた、適当なシャト ルベクター(Serwold-DavisらFEMS Microbiol.Letters 66:119-14,1990)を使用し てC.diphtheriaeで、または適当なシャトルベクター(WuらBio.Technol.11:71,Ja nuary 1993)を使用してB.subtilisのプロテアーゼ欠損株で実行され得る。 実施例11 霊長類における胸腺注射および耐性誘導 胸腺処理をしなければ、アカゲザル腎臓異系移植片は、平均７日間で拒絶反応 を示す。アカゲザル（２〜５歳；体重２〜３kg）における腎異系移植を実施した 。実験プロトコールは、まず、MHCクラスIの異なるアカゲザル供与者および受容 者を選択することから成る。供与者リンパ球を受容者胸腺に注射し、７日後に同 じ供与者の腎異系移植片を移植した。受容者は、静脈内注射により、本発明の免 疫毒素の投与を受容した。腎異系移植を行った後、受容者は、在来の腎摘出術を 受けた。 免疫毒素 抗CD3-CRM9（この抗体は、ヒトT細胞レセプター複合体「CD3」に指向されてい る）を調製する技術は、先に記載されている。米国特許第5,167,956号およびD.N evilleら、89 P.N.A.S.USA 2585-2589(1992)を参照。UCHT1を分泌するハイブリ ツド細胞は、Dr.Peter Beverly,Imperial Cancer Research Fundの好意により提 供されたものであり、腹水で増殖させ、固定化プロテインＡにより精製した。こ れはIgG1である。 FN18（これもまたIgG1である）は、UCHT1のアカゲザルアナログであり、混合 単核細胞の存在下でＴ細胞マイトジェンとなる特性を、これと共有する。FN18を ホローファイバで生成し、プロテインＡにより精製した。CRM9、C7(βh tox-201 tox-9 h')の産生のために使用するC.diphtheriae株をR.Holmes,Uniformed Servi ces University of Health Sciences,Bethesda,MDから入手した。V.Huら、902 B iochimicia et Biophysica Acta 24-30(1987)もまた参照。 抗体-CRM9を鉄濃度の注意深い制御下の30リットル発酵ランの上清から回収し た。S.L.Welkosら、37 J.Virol.936-945(1981)を参照。CRM9を膜濃縮、硫酸アン モニウム沈降法およびDEAEによるクロマトグラフィーにより精製した。S.Carrol lら、165 Methods In Enzymology 68(1988)を参照。 免疫毒素の大規模精製をZorbax(DuPont Company)GF-250 5μm,150Åを充填し たMODcol(1266 Andes Blvd.,St.Louis,Missouri 63132)2"x10"カラムでHPLCサイ ズ排除クロマトグラフィーにより達成した。毒素：抗体を1:1のモル比で含有す る画分をこれらの研究のために単離した。 免疫毒素を、前述のように、モノクローナル抗体部分および毒素部分を共にチ オール化した後、ビスマレイミドヘキサンで架橋化することにより、合成した。 D.Nevilleら、264 J.Biol.Chem.14653-14661(1989)を参照。CRM9にニックを入れ 、モノマー(Carrollら）を上述のMODcolカラムにより単離した後、チオール化し た。 CRM9は、現時点で好ましい変異体ジフテリア毒素タンパク質であるが、DT結合 領域に変異を有するジフテリア変異体（例えば、DT390（実施例９を参照））を 含む他の好ましい実施様態もまた、適当であるはずである（背景概念として、免 疫毒素は、正常な結合機能を、最小限の配座変化で抗体提供Ｔ細胞結合機能と置 き換え得る）。 Ｔ細胞切除 免疫毒素CRM9に結合したモノクローナル抗体FN18(アカゲザルＴリンパ球に特 異的)を使用し、成体アカゲザルの末梢血Ｔ細胞を200細胞/M13以下のレベルに枯 渇させた（注射から６日後に測定）。いくらかの適度なＢ細胞枯渇が生じた。枯 渇後、完全なＴ細胞の回復には、この薬剤を使用する幼年アカゲザルのモデルで は約３〜４週間を要する。驚くべきことに、この速い回復にもかかわらず、胸腺 に注射した供与者Ｔ細胞は、なお寛容産生能力を損なわなかった。 四匹のサルに、免疫毒素0.2mg/kgを三回の用量に分けて投与した（24時間間隔 で）。別のサルには、免疫毒素0.133mg/kgを二回の用量に分けて投与し（24時間 間隔で）、他のサルには、0.1mg/kgを二回の用量に分けて投与した（24時間間隔 で）。最後の免疫毒素の投与から２日後、最後以外のサルはすべて、末梢血およ びリンパ節中の両Ｔ細胞が少なくとも80％（実際は、99％を超える）枯渇してい た。最後のサルに使用した最低用量により、末梢血またはリンパ節のリンパ球は 低下したが、いずれも実質的には除去されなかった。 リンパ球 贈与するリンパ球は、単一供与者の腋窩および頚部リンパ節から好ましくプー ルされる。リンパ節を採取し、メッシュでろ過してリンパ球を分離し、生理食塩 水で希釈した後、注射する。あるいは、供与者以外の数種の霊長類由来のリンパ 球の代表的な「カクテル」（その少なくとも一つが、有望な供与者と同じハプロ タイプであると判明している）もまた効くはずである（供与者を十分に初期に利 用出来ない場合）。 移植 表７は、免疫毒素治療と併用した、供与者リンパ節リンパ球（ＴおよびＢ細胞 の混合物）の胸腺注射後に行った腎臓移植の結果を要約する。胸腺内に注射した 細胞は、列挙した番号のプール腋窩および鼠径リンパ節から成った。 一匹は、39日目に、他方は、13日目に、２匹のサルが肺炎で死亡した。第三の サルは、尿漏出に起因する合併症のため、８日目に死亡した。剖検時、これら三 匹のサルでは、総体的または組織学的にも腎移植の拒絶反応の徴候は認められな かった。 胸腺内注射および免疫毒素を７日間与えた後、腎移植を行ったサル#93023は、 移植後、180日間を超えて正常な腎機能を有した。100日目の移植腎臓の腎生検は 、拒絶反応の徴候を示さなかった。 外科手順 好ましい外科手順は、部分正中胸骨切開術により胸腺を暴露し、胸腺内に供与 者リンパ球を注射すること；鼠径および腋窩リンパ節切除術による供与者リンパ 球の獲得；腎供与者の左腎を獲得する側腹切開；および腎移植を行う第二側腹切 開および本来の右腎摘出術を含む。これらの手順はすべて、下に概略するように 、全身麻酔下で行う。一連の採血を、下に概略するように、ケタミンおよびキシ ラジン麻酔下で行う。 胸骨の中央部へ下方に伸びる胸骨切痕で開始する正中胸部切開により胸腺注射 を行う。胸骨を分けた後、元に戻して、下にある胸腺を暴露する。胸腺に供与者 リンパ球を注射し、胸骨を再接合した後、軟組織を閉じる。 全身麻酔下で腹部の上部正中切開によりドナーの腎摘出を行う。左腎の腹膜付 着部を分割し、尿管を結紮し、膀胱周辺で分割した後、左腎動脈および静脈を切 り離す。左腎動脈および静脈を大動脈および下大静脈と隣接して結紮し、そして 腎臓を切り出し、保存溶液を用いてバックテーブル上で洗う。 腎移植の受容者手術を、全身麻酔下で正中腹部切開を作製して行う。遠位大動 脈および下大静脈を切り離す。大静脈を分岐付近の近位および遠位でクランプで 止め、溶ける７〜０プロリン縫合糸を使用して、ドナー腎静脈の端を受容者の下 大静脈の側面に吻合する。大動脈を分岐のすぐ近くで近位および遠位で交差クラ ンプにより止め、溶ける８〜０プロリンを使用して、ドナー腎大動脈の端を、大 動脈の側面に吻合する。次に、前方膀胱切開を行った後、ドナー尿管のへら形先 端を膀胱粘膜にB-0プロリン縫合糸を使用して吻合することにより、尿管膀胱吻 合を行う。次に、膀胱切開を閉じる。次いで、腹部を閉じる。 鼠径リンパ節切除には約2cm鼠径部を切開し、腋窩リンパ節切除には同様の長 さの切開を行うことにより、リンパ節切除を行う。このリンパ節を切除し、出血 点を焼灼する。次に、皮膚を、溶ける４〜０ナイロン縫合糸で閉じる。 腎臓移植は、単なる適用例であることを理解すべきである。本発明は、様々な 種類の器官（例えば、肝臓、心臓、肺、膵臓、膵島および腸）に関する使用に適 しているはずである。 要約すると、驚くべきことに、Ｔリンパ球を激しく枯渇するとが公知の免疫毒 素は、ドナーＴリンパ球の寛容誘発能力を妨害することなく、宿主のリンパ球を 選択的に枯渇させる。さらに、この免疫毒素により惹起された極端なレベルの枯 渇により、寛容の誘導が促進される。 実施例12 抗CD13-CRM9免疫毒素は、霊長類腎同種移植片における寛容を促進する。 胸腺注射および一過性Ｔリンパ球の枯渇が、アカゲザル腎同種移植片に対する ドナー特異的寛容の発現を可能にする能力を調査した。Ｔ細胞除去については、 リンパ節および血液区画の両方からＴ細胞を枯渇させる免疫毒素FN18-CRM9を使 用した（実施例５およびNevilleら、J.Immunother.1966(印刷中)を参照）。FN18 -CRM9は、抗アカゲザルCD3モノクローナル抗体(mAb)、FN18(Nevilleら、1996)お よびジフテリア毒素の結合部位変異体CRM9(Nevilleら、Proc Natl Acad Sci USA ;89:2585-2589(1992))から構成される。臨床的および実験的移植で使用する他の 抗Ｔ細胞剤と比較して、FN18-CRM9は、Ｔ細胞のより有効な殺傷を生じ、これは 、移植寛容促進薬剤としての選択に妥当であった。抗CD3-CRM9は、単独で移植拒 絶を首尾よく遅延させた。胸腺注射と併用した抗CD3-CRM9によるＴ細胞枯渇によ り、受容者５例中、５例で移植片生存期間が＞150日間延長し、受容者５例中、 ４例でドナー特異的寛容が誘導された。ドナー皮膚移植片は長期間許容されたが 、第三者皮膚移植片は即座に拒絶された。これらの結果は、非ヒト霊長類モデル における皮膚移植により確認されたように、ドナー特異的寛容の信頼可能な誘導 の点で特異である。この寛容に対するアプローチは、ヒトでの寛容誘導と合理的 に相関する。 MHCタイピングおよびドナー-受容者選択。 ドナー-受容者の対をMHC不一致の最大化に基づいて選択した。これは、移植前 の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)および混合リンパ球反応(MLR)分析(Derry H,Mille r RG.Fathman CG,Fitch FW編,New York:Academic Press,510(1982)およびThomas らTransplantation,57:101-115(1994))、一次元等電点電気泳動(1-D IEF)による MHCクラスIの差の分析(WatkinsらEur.J．Immunol;18:1425-1432(1988))ならびに PCRに基く分析によるMHCクラスIIの評価に基づいた。 フローサイトメトリー。 末梢血あるいは鼠径リンパ節、腋窩リンパ節、または腸間膜リンパ節から得た ２×105個のリンパ球をFITC標識FN18またはアイソタイプコントロール抗体で染 色した。細胞をBenton Dickenson FACSCANでフローサイトメトリーに供した。 動物および外科手順。 異系交配した雄性若年アカゲザル（年齢１〜３歳）（無ウイルス性）をドナー および受容者として使用した。外科的手順を、ケタミン7mg/kg,i.m.およびキシ ラジン６mg/kg、i.m.誘導、および１％ハロタンの吸入を使用して全身麻酔を維 持して、全身麻酔下で行った。手術後に、疼痛の制御のために、サルにブトルフ ァノール0.25mg/kg、i.v.およびアスピリン181mg、p.o.を与えた。制限された正 中胸骨切開により胸腺を露出させることにより、胸腺注射を行った。腎移植の７ 日前、胸腺の各小葉に、通常生理食塩水0.75〜1.0mlに懸濁したドナーリンパ球 を27ゲージ針を使用して注射した。ドナーの鼠径リンパ節、腋窩リンパ節、およ び腸間膜リンパ節からドナーリンパ球を調達し、計数後、注射用に通常生理食塩 水に再懸濁した。異所腎移植をドナー左腎を用いて実施した。移植後、受容者は 、自身の腎摘出を受けた。移植機能を血清クレアチニンの測定によりモニターし た。剖検時、尿漏れまたは閉塞などの技術的な問題がなく、＞0.07mol/Lまでの 血清クレアチニンの上昇および組織学的確認により拒絶を診断した。腎臓を拒絶 した場合、サルをペントバルビタールナトリウムの致死用量で屠殺し、そして剖 検し た。寛容を試験するため、ドナーからの腹側腹部の皮膚を使用して、全層の皮膚 移植片を受容者の背中の背側上部に置いた。移植片を毎日検査により評価した。 免疫抑制。 FN18-CRM9を、記載のように(Nevilleら、1996)、化学的に結合させ、そして精 製した。これを、腎移植の７日前から開始して、0.2mg/kgの用量を三回に分けた １日用量で静脈内投与した。どのサルにも、さらなる免疫抑制薬を与えず、そし てサルからは環境性病原体が単離されなかった。 アカゲザル末梢血リンパ球およびリンパ節リンパ球に対するN18-CRM9の効果を 第10a図および第10b図に要約する。末梢血からの一過性Ｔ細胞枯渇を生じること に加えて、FN18-CRM9は、三回目の用量の薬物投与から０〜４日後に測定した場 合、与えた用量でリンパ節リンパ球をほとんど完全に枯渇した。絶対白血球数は 、処置により有意には変化しなかった。回復時間は変動し得るが、一般的に、末 梢血Ｔリンパ球は、処置後２〜４週間でベースラインレベルに回復した。回復速 度は、個々のサル間で変動した。 未処理のサルは、１週間以内に同種移植片(n=3)を速やかに拒絶した（表７） 。胸腺内にリンパ球を与えたが、抗CD3-CRM9を与えなかったサルは、出血、梗塞 、ならびに濃密好中球およびリンパ球浸潤の典型的な組織学的特徴を伴って、24 時間以内に超急性拒絶を発現した（表７）。胸腺内でドナーリンパ球および抗CD 3-CRM9により処置した受容者３例中３例は、長期間の移植生存期間を有した（表 ７）。一匹のサル(92108)は、ドナー特異的寛容を試験するために、ドナーおよ び第三者皮膚移植片を置いてから40日目にその腎臓を拒絶した。このサルは、10 日目にこの第三者皮膚移植片を拒絶し、ドナー皮膚移植片におけるリンパ球浸潤 は、40日後に腎同種移植片の拒絶反応と共に発現した。ドナーリンパ球および抗 CD3-CRM9の他の受容者２例は、ドナーから首尾良く皮膚が移植され、これらの皮 膚移植片の生存期間は、100日間より長かったが、第三者皮膚移植片の拒絶は、1 0日目であった。これらの腎同種移植片の生検はすべて、間質浸潤を示したが、 糸球体または尿細管の浸潤または傷害の証拠は認められなかった。胸腺に通常生 理食塩水注射を抗CD3-CRM9と併用して受けた二匹のサルは、腎同種移植片に対し て寛容になった。これらのサルは共に、第三者皮膚移植片を10日目に拒絶し、ド ナー皮膚移植片の長期の生存期間を有した。全皮膚移植片の結果を表８に要約す る。長期生存する寛容受容者の腎生検は、尿細管または糸球体の侵襲または損傷 のない限局性間質単核浸潤を示した。抗CD3-CRM9単独で処置したサルは、２例で 後期拒絶を54および88日目に発現し、剖検時のこれらの腎臓組織学により、濃密 リンパ球浸潤を示した。他の２例では、>127日間および>79日間という長期間に わたる不応答性が観察された（表７）。移植片を拒絶した二匹のサルの胸腺は、 処理前の年齢を合わせたコントロールと比較して、剖検時のサイズが著しく減少 したが、小さな胸腺レムナントが同定された。 このデータは、抗CD3-CRM9が、異系交配したMHCクラスＩおよびクラスIIの異 なるアカゲザルにおいて寛容を誘導し得る強力な新免疫抑制剤であることを示す 。この特性により、抗胸腺細胞グロブリン、シクロスポリンまたは、大型動物で の寛容誘導でより限定された効力または安全性を有するか、あるいはより煩わし い戦略を必要とするモノクローナル抗体のような他の現在公知の免疫抑制剤と区 別される(Powelsonら、Transplantation 57:788-793(1994)およびKawaiら、Tran splantation 59:256-262(1995))。３用量の薬物により生成したＴ細胞枯渇度は 、抗リンパ球グロブリンの、より長期の過程により達成される枯渇度より完全で ある。抗リンパ球グロブリンは、一般的にずっと低い程度でしか枯渇しない(Abo unaら、Transplantation 59:1564-1568(1995)およびBourdage JS,Hamlin DM,Tra nsplantation 59:1194-1200(1995))。必ずしもＴリンパ球を殺傷しない活性化抗 体であるOKT3とは異なり、抗CD3-CRM9は、Ｔ細胞に対してOKT3よりも顕著な効果 、および寛容誘導についての優れた可能性を有する溶解治療である。この効力は 、リンパ節区画および末梢血中のＴ細胞を枯渇するその能力と部分的に関連し得 る。なぜなら、潜在的に同種異系反応性のＴ細胞の大部分は、リンパ節区画に存 在するからである。抗CD3-CRM9により生成されるＴ細胞枯渇は、全リンパ球照射 を含む任意の他の公知の薬理学的手段により達成されるＴ細胞枯渇より完全であ り、照射による中毒性副作用を回避する。抗CD3-CRM9による処置後、胸腺は、サ イズが顕著に減少するが、胸腺皮質および髄質構造は、なお明らかである。抗CD 3-CRM9は、アカゲザルにおいて安全かつ充分に寛容であるようである。有意な有 害薬 物作用には、遭遇しなかった。約半数のサルを、投与後、３〜５日間、静脈内流 体で処置し、脱水症を防止した。これらの実験で感染症には遭遇せず、そして日 常的な手術時の抗生物質による予防のみを腎移植および胸腺注射時に行った。サ イトカイン遊離症候群は認められず、そしてサルは、薬物の投与後、熱性疾患を 発症しなかった。 抗CD3-CRM9と共に、ドナーリンパ球か、または通常生理食塩水のいずれかの胸 腺注射を受けたサルの耐性誘導は、胸腺注射が、抗CD3-CRM9でのＴ細胞枯渇を使 用する耐性誘導に付加物（adjunct）を提供し得ることを示唆する。おそらく、 ドナーリンパ球接種物中に存在するCD3+リンパ球もまた、レシピエントに投与し た薬剤によって死滅する。これは、ドナーＢ細胞にレシピエントの胸腺において ドナーMHCクラスIおよびクラスIIを発現させる。蓄歯類の研究は、胸腺耐性の促 進に重要であるのは、一つまたは両方のこれらの抗原の存在であることを示唆す る(Goss JA,Nakafusa Y,Flye MW,Ann Surg 217:492-499(1993);Knechtleら、Tra nsplantation 57:990-996(1994)およびOluwoleら、Transplantation 56:1523-15 27(1993))。さらにより興味深いのは、抗CD3-CRM9と共に、胸腺内へ注射した通 常生理食塩水が、２レシピエント中の２に耐性を生成したという観察である。驚 くべきことに、このアプローチの成功は、胸腺注射よりもむしろ免疫毒素が重要 であることを示唆する。あるいは、胸腺の完全性の非特異的な崩壊が寄与し得る 。 抗CD3-CRM9単独で処理した４レシピエント中、２が耐性になったという観察は 、薬剤によるＴ細胞の一過性の枯渇が耐性の促進に重要であることを示唆する。 齧歯類において、ドナー抗原および抗Ｔ細胞薬剤の同時投与により、移植片耐性 を達成し得るが(QinＳら、J Exp Med 169:779-794(1989);Mayumi H,Good R.A.,J Exp Med 1989;169:213-238(1989);およびWood MLら、Transplantation 46:449- 451(1988))、この報告は、Ｔ細胞特異的治療のみを使用するドナー特異的耐性を 示す。抗CD3-CRM9によるリンパ節区画由来のＴ細胞の枯渇は、耐性誘導剤として の効力の促進に重要であり、末梢血CD3細胞を枯渇するが、リンパ系組織には弱 い作用しか及ぼさない抗CD3 mAbのみの場合と区別され得る(Hirschら、J.Immuno l.140:3766-3772(1988))。 異系交配したMHC不適合の非ヒト霊長類モデルを使用するこれらの実験は、ヒ ト臓器移植における耐性戦略の理論的根拠を提供するものである。この結果は、 ヒト固体臓器移植に免疫学的に類似するモデルにおける耐性に対して、簡単で、 信頼し得る安全なアプローチを提供する点で独特である。抗ヒトCD3免疫毒素(例 えば、scUCHT1-DT390および抗CD3-CRM9)は、構築されており、FN18-CRM9（実施 例９および11 Neville 1992およびNeville 1996を参照）と類似したＴ細胞殺傷 特性を有する。本明細書に報告した予備的な結果は、ヒトにおける耐性について 広範な意味を有する。 要約すると、免疫毒素処理のみで、現在までの症例の100％において移植片の 生存を顕著に延長する。胸腺操作の排除は、成功率は変化させなかった。他の薬 剤または処理法で、霊長類においてこれらに近い結果が達成されるものはない。 実施例13 免疫毒素単独で耐性を誘発する 成熟Ｔ細胞の枯渇は、特に、ドナー骨髄注入液と併用したとき、MHCミスマッ チ異系移植片の安定な受容を促進し得る。ATGおよび抗Ｔ細胞mAbは、再循環細胞 を排除するが、リンパ球組織の残余Ｔ細胞は、免疫回復および拒絶を統合する可 能性を有する。純粋な抗体とは異なり、CD3-免疫毒素(CD3-IT)は、直接結合およ び細胞内取り込みの後に、免疫エフェクター機構を制限することなく細胞を破壊 し得る。従って、CD3-ITは、優れた免疫抑制活性を有し得る。アカゲザル腎移植 片レシピエントにおけるCD3-ITの作用を試験した。 CD3-ITのこの実施例は、IgG1mAb抗アカゲザルCD3イプシロン(FN18)および変異 体ジフテリア毒素CRM9(FN18-CRM9)の結合体である。CRM9ジフテリア毒素のＢ鎖 は、ジフテリア毒素レセプターへの結合を顕著に減少させる変異を保有し、特異 性を抗CD3により指向させる。 CD3-ITを、3〜5kgの正常雄性アカゲザル異系移植片レシピエントに、-1日目に 67μg/kg、そして+0および+1日目に33μg/kgの用量で、免疫抑制剤を追加せずに 投与した。レシピエント−ドナーの組み合わせを、MLRおよびマルチ（multiple ）DR対立遺伝子ミスマッチによって不適合になるように選択した；そして、すべ てが、ジフテリア毒素に対するCRM9-反応性抗体について血清陰性であった。３ つのグループが、CD3-ITを：（１）単独で(n=3)、（２）０日目にドナー骨髄DR- CD3-注入と組み合わせて(n=3)、（３）または-1および０日目にドナー骨髄およ び200cGyリンパ球照射と組み合わせて(n=3)、受けた。 腎臓異系移植片生存は、顕著に延長した。CD3-IT単独に関しては、移植片生存 時間は、57、51、および44日間であった。ドナー骨髄注入との併用では、移植片 生存は、＞400、124および36日間であった。CD3-IT、リンパ球照射およびドナー 骨髄は、移植片生存が、＞300、143および45日間であった。36または45日間で損 失した移植片は両方とも、水腎症によるもので、拒絶反応の徴候は認められなか った。末梢血Ｔ細胞数は、選択的に2log低下し、50％回復までの時間は、20〜60 日間であった。末梢血CD3+CD4/CD8比は、３週間で基準値に順応する前に、２〜 ６倍増加した。リンパ節のＢ細胞／Ｔ細胞比は、５〜７日目に＞40倍上昇し、こ れは、循環および固定組織Ｔ細胞区画の１〜２logの減少を反映する。LN CD4/CD 8比は、５〜７日目で正常であったが、CD45RA+CD4およびCD28-CD4細胞サブセッ トは、＞1 log増加し、一方、CD28+CD8細胞は、＞1 logまで減少した。これは、 機能性サブセット変化を示唆する。 抗ドナーMLR応答は、一様に減少するようになったが、特異的な非応答性は、 ドナー骨髄処理グループでのみ認められた。末梢血マイクロキメラ現象は、ドナ ー骨髄注入後、対立遺伝子特異的PCRにより検出可能であった。これらの研究は 、 CD3-ITが非ヒト霊長類移植における並外れて有効から特異的免疫抑制剤であるこ とを示し、ヒトでの移植に適用可能な臨床的耐性誘導戦略を提供する。 実施例14 ヒト死体ドナー擬似モデルのサルで 耐性を誘導する免疫毒素プラス短期間免疫抑制剤 異系移植片生存の延長におけるITの効力をヒト死体ドナー由来の臓器移植の擬 似モデルで評価した。アカゲザルのドナー−レシピエント対をMHCクラスIおよび II不一致に基づいて選択した。サルに、抗CD3-CRM9免疫毒素の0.2mg/kgを、腎異 型移植日に開始して、三回に分割した１日用量でiv投与した(第１の群)。第２の 群では、レシピエントはまた、移植日に開始して、メチルプレドニゾロン125mg/ 日で３日間のiv投与およびマイコフェノレートモフェティル250mg/日で３日間の 経口投与を受けた。拒絶反応を血清中クレアチニンレベルによりモニターし、組 織学的に確認した。 移植時に与えた集中的抗Ｔ細胞治療の短い集中治療は、良好に寛容であり、そ して確実に、長期異系移植片生存をもたらすようである。このプロトコルの腎移 植生検から得た移植片浸潤細胞のmRNAサイトカインのプロフィールは、IL-2およ びγ-IF(TH1関連性)が測定可能なレベルで存在し、IL-4および10(TH2関連性)を 非常に低レベルで検出されることを示唆する。非ヒト霊長類モデルのこれらの結 果は、維持免疫抑制剤に頼らないことから実質的に利益を得ると思われるヒト臓 器移植レシピエントに適用し得る戦略を提供する。 ミスマッチ腎移植を受けたアカゲザルの第２の群は、移植18時間前に抗CD3-CR M9(IT)を0.067mg/kg、そして０および+1日目に0.033mg/kgの投与を受けた。第１ の群は、IT単独投与を受けた(n=6)。第２の群、n=7は、IT投与中に、ITに加えて 、デオキシスペフレグアリン(DSG)IV 2.5mg/kg/日ならびにソルメドロール(SM) ，7,3.5および0.33mg/kg IV投与を受けた。DSGは、４日間から最長14日間連続し た。血漿サンプルをサイトカイン放出症候群について移植前および移植後の血漿 中IL-12およびINFγレベルを測定することにより、ELISAで試験した。 移植片生存（日間） 第１の群（IT単独） 第２の群(IT+DSG+SM) 10-57 n=6(拒絶反応) ＞155-200 n=4 28-45 n=3(拒絶反応) 拒絶反応以外の原因で２例が死亡 IT、第１の群（または、アカゲザル抗CD3抗体のみ）は、IL-12およびINF-8γ の両方を上昇させた。DSGおよびソルメドロールは、NF-κ／βと関連し得る機構 は、INF-γのIL-12誘導性活性化をブロックするようである（図15〜16を参照） 。この処理は、移植片周囲の（peritransplant）重量増加（第17図）および血清 低タンパク血症（第18図）を排除することが見出されている。これらは共に、血 管漏出症候群の徴候であり、この研究では初期移植片拒絶反応と関連する。この 移植片周囲の処置法は、死体移植に適用可能な寛容誘導についての拒絶反応のな い窓口を提供し得る。 ITがリンパ節Ｔ細胞死滅効果の大部分を発揮するのに、24時間より多くかかる 。従って、IT死体移植プロトコル（全般的に初期治療の６時間以内および18時間 以内に臓器移植を行うプロトコル）は、上記データが示すように、移植片周囲の 補充的短期免疫抑制剤から実質的に利益を受け、新しい臓器に対する移植片周囲 Ｔ 細胞応答性を最小化する。 この出願の全体にわたって、様々な刊行物には、括弧内に番号で引照が付けら れている。これら刊行物の完全な引用は、以下の通りである。また、上記本明細 書に述べたいくつかの刊行物によっては、本明細書中でその全体が参考として援 用される。これらの刊行物の開示の全体を、参考としてこの出願に援用し、この 発明が属する分野の技術水準をより完全に記載する。 前述の発明を、明瞭にそして分り易くするために、多少詳細に記載してきたが 、この発明および添付の特許請求の範囲の真の範囲から逸脱することなく、形式 および細部を種々に変更し得ることは、当業者により理解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/21 Ｃ０７Ｋ 14/21 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ネービル，デイビッド エム. アメリカ合衆国 メリーランド 20814, ベセスダ，パークウッド ドライブ 9624 (72)発明者 ネッチル，スチュアート アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53575, オレゴン，ケイン ロード 2268 (72)発明者 トーマス，ジュディス エム. アメリカ合衆国 アラバマ 35242，バー ミンガム，ブルック ハイランド リッジ 2117 (72)発明者 トンプソン，ジェリー ティー. アメリカ合衆国 サウス キャロライナ 29445，グース クリーク，ウィンチェス ター サークル 103 (72)発明者 フ，ファイツォン シンガポール共和国 シンガポール 129793，クレメンティ ロード 113，ブ ロック ディー ナンバー05―08 (72)発明者 マ，シェンリン アメリカ合衆国 アラバマ 35205，バー ミンガム，16ティーエイチ プレイス サ ウス 911

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．２価の抗Ｔ細胞免疫毒素標的部分であって、μCH2における天然のIgMドメイ ン内の残基228〜340のC337でのジスルフィド結合によって結合される２つの１価 の抗体鎖を含む、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素標的部分。 ２．２価の抗Ｔ細胞免疫毒素標的部分であって、γIgGヒンジ領域の残基216〜23 8の、C227もしくはC229、またはC227およびC229でのジスルフィド結合によって 結合される２つの１価の抗体鎖を含み、そしてここでC220はＰに変化される、２ 価の抗Ｔ細胞免疫毒素標的部分。 ３．請求項１に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素標的部分であって、μCH４におけ る残基447〜576、またはμCH3における残基344〜446、またはγCH3における残基 376〜346、またはそれらの組合せをさらに含む、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素標的部 分。 ４．請求項２に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素標的部分であって、μCH4におけ る残基447〜576、またはμCH3における残基344〜446、またはγCH3における残基 376〜346、またはそれらの組合せをさらに含む、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素標的部 分。 ５．２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、請求項１に記載の標的部分、および毒素 部分を含み、ここで該毒素部分への該標的部分の配向は、該毒素の触媒ドメイン が、還元条件下でその天然のプロセシング部位でタンパク質分解的にプロセスさ れる場合、遊離体になるように固定される、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ６．２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、請求項２に記載の標的部分、および毒素 部分を含み、ここで該毒素部分への該標的部分の配向は、該毒素の触媒ドメイン が、還元条件下でその天然のプロセシング部位でタンパク質分解的にプロセスさ れる場合に遊離体になるように固定される、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ７．請求項５に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、前記毒素部分がジフテ リア毒素であり、および該毒素部分が、融合免疫毒素のアミノ末端にある、２価 の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ８．請求項６に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、前記毒素部分がジフテ リア毒素であり、および該毒素部分が、融合免疫毒素のアミノ末端にある、２価 の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ９．請求項５に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで前記毒素部分が ジフテリア毒素であり、および該毒素部分が、融合免疫毒素のカルボキシ末端に あり、および該毒素が、フリンタンパク質分解性切断部位（RXR/KR）を含むペプ チドリンカーを介して抗体ドメインのカルボキシ末端に結合される、２価の抗Ｔ 細胞免疫毒素。 １０．請求項６に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで前記毒素部分 がジフテリア毒素であり、および該毒素部分が、融合免疫毒素のカルボキシ末端 にあり、および該毒素が、フリンタンパク質分解性切断部位（RXR/KR）を含むペ プチドリンカーを介して抗体ドメインのカルボキシ末端に結合される、２価の抗 Ｔ細胞免疫毒素。 １１．２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、請求項７に記載の標的部分、および毒 素部分を含み、ここで該毒素部分と該標的部分とがチオエーテル結合され、単一 のシステインが該毒素部分の結合ドメイン内に挿入され、および該標的部分が、 鎖あたり単一の遊離のシステインのみを有する、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 １２．２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、請求項８に記載の標的部分、および毒 素部分を含み、ここで該毒素部分と該標的部分とがチオエーテル結合され、単一 のシステインが該毒素部分の結合ドメイン内に挿入され、および該標的部分が、 鎖あたり単一の遊離のシステインのみを有する、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 １３．請求項１１に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで前記単一の システインは、前記標的部分との鎖間接触から離れて溶媒に放出する、２価の抗 Ｔ細胞免疫毒素。 １４．請求項１２に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで前記単一の システインは、前記標的部分との鎖間接触から離れて溶媒に放出する、２価の抗 Ｔ細胞免疫毒素。 １５．請求項１３に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここでチオエーテ ル結合に使用される前記標的部分の単一のシステインは、μCH3 C414、μCH4 C5 75、およびγCH3のC447からなる群より選択される、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 １６．請求項１４に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここでチオエーテ ル結合に使用される前記標的部分の単一のシステインは、μCH3 C414、μCH4 C5 75、およびγCH3のC447からなる群より選択される、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 １７．請求項１１に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで前記毒素部 分の結合ドメインは、野生型毒素に比較して少なくとも1000倍まで毒素結合活性 を減少する変異を含む、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 １８．請求項１２に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで前記毒素部 分の結合ドメインは、野生型毒素に比較して少なくとも1000倍まで毒素結合活性 を減少する変異を含む、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 １９．請求項１７に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで前記毒素部 分は、完全長変異体S525Ｆ（CRM9）である、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ２０．請求項１８に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで前記毒素部 分は、完全長変異体S525Ｆ（CRM9）である、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ２１．請求項１９に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで該免疫毒素 は融合タンパク質であり、左から右へのアミノ末端からのドメインの配列は、以 下： 毒素部分、μCH2、μCH3、VL、L、VH； 毒素部分、μCH2、μCH3、μCH4、VL、L、VH； 毒素部分、γCH3、H、VL、L、VH； 毒素部分、H、VL、L、VH；および 毒素部分、μCH2、VL、L、VH、 毒素部分、VL、L、VH、H、γCH3 毒素部分、VL、L、VH、μCH2 毒素部分、VL、L、VH、L、VL、L、VH からなる群より選択され、 ここでLは、(G4S)3リンカーであり、VLおよびVHは、抗CD3抗体UCHT1の可変軽 鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインであり、ならびにHは、γIgGヒンジである、 ２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ２２．請求項２０に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで該免疫毒素 は融合タンパク質であり、左から右へのアミノ末端からのドメインの配列は、以 下： 毒素部分、μCH2、μCH3、VL、L、VH； 毒素部分、μCH2、μCH3、μCH4、VL、L、VH； 毒素部分、γCH3、H、VL、L、VH； 毒素部分、H、VL、LV、H；および 毒素部分、μCH2、VL、L、VH、 毒素部分、VL、L、VH、H、γCH3 毒素部分、VL、L、VH、μCH2 毒素部分、VL、L、VH、L、VL、L、VH からなる群より選択され、 ここでLは、(G4S)3リンカーであり、VLおよびVHは、抗CD3抗体UCHT1の可変軽 鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインであり、ならびにHは、γIgGヒンジである、 ２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ２３．請求項１７に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、前記毒素部分は、 390または486で短縮される、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ２４．請求項１８に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、前記毒素部分は、 390または486で短縮される、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ２５．請求項２３に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで該免疫毒素 は融合タンパク質であり、および左から右へのアミノ末端からのドメインの配列 は、以下： 毒素部分、μCH2、μCH3、VL、L、VH； 毒素部分、μCH2、μCH3、μCH4、VL、L、VH； 毒素部分、γCH3、H、VL、L、VH； 毒素部分、H、VL、L、VH；および 毒素部分、μCH2、VL、L、VH 毒素部分、VL、L、VH、H、γCH3 毒素部分、VL、L、VH、μCH2 毒素部分、VL、L、VH、L、VL、L、VH からなる群より選択され、 ここでLは、(G4S)3リンカーであり、VLおよびVHは、抗CD3抗体UCHT1の可変軽 鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインであり、ならびにHは、γIgGヒンジである、 ２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ２６．請求項２４に記載の２価の抗Ｔ細胞免疫毒素であって、ここで該免疫毒素 は融合タンパク質であり、および左から右へのアミノ末端からのドメインの配列 は、以下： 毒素部分、μCH2、μCH3、VL、L、VH； 毒素部分、μCH2、μCH3、μCH4、VL、L、VH； 毒素部分、γCH3、H、VL、L、VH； 毒素部分、H、VL、L、VH；および 毒素部分、μCH2、VL、L、VH 毒素部分、VL、L、VH、H、γCH3 毒素部分、VL、L、VH、μCH2 毒素部分、VL、L、VH、L、VL、L、VH からなる群より選択され、ここでLは、(G4S)3リンカーであり、VLおよびVHは、 抗CD3抗体UCHT1の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインであり、ならびにH は、γIgGヒンジである、２価の抗Ｔ細胞免疫毒素。 ２７．外来哺乳動物ドナー細胞に対して、受容者において免疫寛容を誘導するこ とによって拒絶応答を阻害する方法であって、以下の工程： ａ）受容者のＴ細胞リンパ球集団を、少なくとも80%まで安全に減少するように 、免疫毒素に受容者を曝露する工程；および ｂ）受容者にドナーの細胞を移植し、それによってドナーの器官細胞に対する該 受容者による拒絶応答が阻害される工程、 を包含する、方法。 ２８．請求項２７に記載の方法であって、前記免疫毒素が、請求項１に記載の免 疫毒素である、方法。 ２９．請求項２７に記載の方法であって、前記免疫毒素が、請求項２に記載の免 疫毒素である、方法。 ３０．請求項２７に記載の方法であって、前記ドナー細胞が器官を構成する、方 法。 ３１．請求項２７に記載の方法であって、前記ドナー細胞が、器官からの組識を 構成する、方法。 ３２．請求項２７に記載の方法であって、前記ドナー細胞が同種間である、方法 。 ３３．請求項２７に記載の方法であって、前記ドナー細胞が異種間である、方法 。 ３４．請求項２７に記載の方法であって、前記免疫毒素の抗Ｔ細胞効果を増強す るために、免疫抑制化合物を投与する工程をさらに包含する、方法。 ３５．請求項３４に記載の方法であって、前記免疫抑制化合物が、インターフェ ロンγのIL-12誘導性の誘導をブロックする、方法。 ３６．請求項３４に記載の方法であって、前記免疫抑制化合物が、mycophenolat e mofetilである、方法。 ３７．請求項３４に記載の方法であって、前記免疫抑制化合物が、デオキシスペ ルグアリンである、方法。 ３８．請求項２７に記載の方法であって、コルチコステロイドを投与する工程を さらに包含する、方法。 ３９．請求項２７に記載の方法であって、前記免疫毒素が、移植工程前の数時間 から移植工程後の数日間まで投与される、方法。 ４０．請求項３４に記載の方法であって、前記免疫抑制物が投与され、移植工程 前の約０〜６時間以内に開始し、そして移植工程後数週間まで継続する、方法。 ４１．請求項４０に記載の方法であって、前記ドナー器官細胞が、屍体からであ る、方法。 ４２．請求項２７に記載の方法であって、曝露する工程と同時に、またはその後 に、ドナー骨髄を投与する工程をさらに包含する、方法。
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