CN1195995A - 用于药物传递的胞转载体和增强剂 - Google Patents

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Abstract

通过与选自白蛋白和其片段、抗－GP60抗体和其片段,GP60肽片段和PDI(蛋白质二硫化物异构酶)和其片段的胞转增强剂或载体形成或结合来增强生理学活性剂的胞转作用,所述生理学活性剂是通过含GP60受体的内皮、上皮或间皮后发挥其作用。

Description

用于药物传递的胞转载体和增强剂
发明领域
本发明涉及药物传递。具体地说，本发明涉及能够传递并促使药物通过含GP60受体的内皮、上皮和间皮的胞转载体和增强剂。
发明背景
对于大部分通过动脉内或静脉内施用的治疗药物来说，分子活性的预定位点均在脉管外。对于经气道施用的药物来说，活性的预定位点通常在肺泡、细支气管或气管上皮第一细胞屏障外。在这两种情况下，都存在药物介导其作用前所必须跨越的内皮或上皮屏障。
对于小的亲脂药物，在屏障细胞的紧密接合处似乎有副细胞(paracellular)途径。但对于亲水药物和较大的大分子活性药物如肽、蛋白质、基因或反义核苷酸来说，跨越屏障的唯一途径是通过细胞。这就给静脉内施用因迅速降解或肝的第一次通过清除而具有很短半衰期的药物带来很特别的问题。为了保持与所述排泄和降解作用平衡的治疗水平，经常需要大剂量或输注。因此，本领域显然需要能够更迅速的使药物跨过细胞屏障的传递机制。
已经有许多有关介导胞吞过程的特异性受体，在所述胞吞过程中，通过相似的胞饮作用，配体与所述受体结合，然后内部化，并与所述受体复合。这涉及在配体受体复合物区内细胞膜的内陷，然后通过尚未完全了解的过程将配体释放到细胞中。已经报道了许多胞吞受体系统，包括LDL、胰岛素、表皮生长因子、胰岛素样生长因子和tPA-PAI-I(杂种分子)。
胞吞作用必须伴有在配体受体复合物周围的内吞和小泡形成，然后通过在basolateral膜的逆胞吞过程释放胞吞物。已将转铁蛋白受体的单克隆抗体与毒素结合，以便它们可通过胞吞作用跨过血-脑内皮。但本领域仍需要能够通过受体介导的胞吞作用传递或促进药物通过除血-脑内皮以外的细胞屏障的试剂，所述细胞屏障如脉管系统的内皮、肺泡上皮和腹膜间皮。
GP60受体(也称为albondin)是义献中报道数种白蛋白结合蛋白质中的一种(Schnitzer and Oh，J.Biol.Chem.269(8)：6072-6082(1994))。其它的包括SPARC(血清蛋白，酸性，半胱氨酸丰富)，oesteonectin或基膜蛋白40、GP30、GP18和GP60。SPARC和oesteonectin是细胞外蛋白质。如用抗-SPARC抗体确定的，GP60与SPARC有一定的同源性(Schnitzerand Oh，Am.J.Physiol.263：H1872-1879(1992))。
GP18和GP30是在各种细胞中发现的膜糖蛋白，而且在巨噬细胞中特别普遍(Schnitzer等，J.Biol.Chem.267：24544-24553(1992))。GP18和GP30是所谓“清除剂受体”，它们通过内吞作用介导除去白蛋白的氧化、糖化或加合形式，并因此认为其在各种器官的白蛋白分解代谢中起作用(Schnitzer and Bravo，J.Biol.Chem.268(10)：7562-7570(1993))。
与GP18和GP30相反，已发现GP60受体只在脉管系统的连续内皮(Schnitzer，Am.J.Physiol.263：H246-H254(1992))、肺泡上皮(Kim等，Am.J.Resp.and Crit.Care Med.151；A190(1994))以及推理上在腹膜间皮(Gotloib and Shostak，Kidney International.47：1274-1284(1995))中排外地表达。GP60在微泡内皮中特别丰富，但令人感兴趣的是，在几乎观察不到白蛋白流的的血液-脑屏障中则没有GP60(Rousseaux等，Methods inEnzymology 121：163(1986))。已表明内皮GP60的多克隆抗体也与肺泡上皮GP60结合(Kim等，同上文)。GP60受体还涉及受体介导的白蛋白跨上皮和内皮细胞屏障的胞吞作用(Kim等，同上义；Tirrupathi等，细胞分子生物学4(Supp)：338a Abstract No.1964(1993))。
GP60的氨基酸序列是本领域已知的(Yamauchi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.146：1485(1987))。
发明概述
本发明提供了能够运输生理学活性剂跨过含GP60受体的上皮、内皮和间皮的胞吞载体和增强剂。GP60受体还参与受体介导的白蛋白跨细胞屏障胞吞作用。利用本发明，可研究GP60受体介导的胞吞作用以用于不仅运输白蛋白，而且运输天然不能经GP60系统跨过上皮、内皮和间皮的生理学活性剂。
本发明的胞吞载体和增强剂包括白蛋白、白蛋白片段、抗GP60多克隆和单克隆抗体、抗-GP60多克隆和单克隆抗体片段和GP60肽片段。此外，还包括PDI(蛋白质二硫化物异构酶)和其片段(下文提到GP60片段也可解释为之PDI片段)。在PDI和GP60的至少T1-44片段中发现一个共有因子是CGMC基元。如果胞吞载体或增强剂是GP60肽片段，优选可与本发明的其它胞吞载体或增强剂如白蛋白或白蛋白片段一起施用。用溴化氰在甲硫氨酸残基裂解可产生14、20和32kDa的适宜白蛋白片段，并通过二硫键的还原进一步降低大小。根据本发明可作为胞吞载体和增强剂的抗-GP60多克隆和单克隆抗体片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。优选的GP60肽片段包括对应于GP60蛋白质N末端的18个氨基酸的T3118肽。
根据本发明，当将上述化合物与生理学活性剂结合时，将其称为“胞吞载体”。当与生理学活性剂一起施用，但不结合时，将上述化合物称为“胞吞增强剂”。在优选的实施方案中，本发明的胞吞载体和增强剂用于传递或促进生理学活性剂跨过脉管系统的内皮、肺泡上皮和腹膜间皮。本发明详述
正如其名称所表明的，本领域已报道了分子量为约60kDa的GP60蛋白质。在进行了更仔细的分析后，发现该蛋白质的“真正”分子量可能是约57kDa。认为分子量上的这种差异归因于蛋白质制备和凝胶条件的不同。但是，与本领域一致，本文(除下文实施例1外)也将该蛋白质称为GP60受体。
已发现可研究GP60受体介导的胞吞作用以用于不仅运输白蛋白，而且运输大量天然不能经GP60系统跨过上皮、内皮和间皮的治疗上重要的生理学活性剂。因此，本发明提供了一种改进的方法，该方法用于运输如具有相对大的分子量，如50、100、150kDa或更大的生理学活性剂跨过脉管系统内皮、肺泡、细支气管和气管上皮以及腹膜间皮的细胞屏障。能够传递或促进生理学活性剂跨过含GP60的内皮、上皮和间皮的胞吞载体和增强剂包括白蛋白、白蛋白片段、抗-GP60多克隆和单克隆抗体、抗-GP60多克隆和单克隆抗体片段、以及GP60肽片段。如果胞吞载体或增强剂是GP60肽片段，则优选与本发明的其它胞吞载体或增强剂如白蛋白或白蛋白片段一起施用。
哺乳动物白蛋白是本领域已知的并很容易得到。优选所用的白蛋白来自与患者相同的哺乳动物种。例如，如果患者是人，则优选用人血清白蛋白作为胞吞载体或增强剂。同样，如果患者是马或牛，分别优选使用马或牛血清白蛋白。
生产白蛋白片段的方法是本领域熟知的。例如用溴化氰在甲硫氨酸残基裂解白蛋白可得到3个特别适宜的14、20和32kDa肽，所述肽可通过还原二硫键来进一步降低大小，得到3.3-20kDa的肽。或者可用蛋白酶消化来得到白蛋白肽片段。
用作本发明胞吞载体或增强剂的任何特定白蛋白片段可按照下述常规筛选试验进行确定。如下文实施例中所说明的，现已表明牛和人血清白蛋白均可作为胞吞增强剂，刺激生理学活性剂的摄入比对照多2.5-4倍。
可从内皮、上皮或间皮纯化的GP60受体产生抗-GP60多克隆和单克隆抗体。如上所讨论的，表达GP60受体的内皮、上皮和间皮细胞包括脉管系统的内皮(包括毛细管内皮(Ghinea等，J.Cell Biol.107：231-239(1988))；动脉内皮(Silflinger-Birnboim等，J.Cellular Physiology149：575-584(1991))；主动脉和静脉内皮(Schnitzer and Oh，Am.J.Physiol.(1992)，同上文)；肺泡组织上皮(Kim等，同上文)；和腹膜间皮(Gotloib and Shostak，同上文)。按照本领域已知的方法(参见例如Schnitzerand Oh，J.Biol.Chem.(1994))并按下文实施例1所述，可从上皮、内皮和间皮中纯化GP60。
按照本领域已知的技术，可在小鼠、兔或山羊中生产抗纯化GP60或GP60肽片段(如下文所讨论的T3118肽)的多克隆抗体。在下文实施例1中，从制备性SDS-PAGE上洗脱GP60受体以免疫兔。在与等体积的弗氏完全佐剂混合后，每只兔肌肉内注射约50μg蛋白质。第二次注射是在两星期后。在第二次注射后4到6星期取兔血，检测免疫反应。然后用ProteinA-Sepharose柱纯化抗血清IgG。
按照已知技术(Goding，J.Immunol.Methods 39：285(1980)；Oi andHerzenberg，Selected Methods in Cellular Immunology，p.352，Freeman，San Francisco，1979)也可制备单克隆抗体。例如，经腹膜内给Balb/c小鼠注射50-150μg GP60或GP60肽片段。融合前3-5天，阳性小鼠接受抗原的加强(booster)注射(50-150μg GP60或GP60片段)，然后每天注射10μg(静脉内和腹膜内)直到取出脾。基本上按照St.Groth等，J.ImmunologyMethods 35：1-21(1980)所述的方法，将脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合。用未结合的GP60或GP60片段作为抗原，通过ELISA筛选培养上清液。然后按Lutz等，Experimental Cell Research 175：109-124(1988)所述，通过免疫荧光检测阳性培养物并Western印迹到cDNA-转染的COS-1细胞上。在软琼脂上将分泌特异性抗体的杂交瘤克隆两次。在无血清培养基SFRI-4中适应各杂交瘤。为了进行腹水生产，将约2×106个细胞注射到pristine-primed Balb/c小鼠中。用Isotyping试剂盒进行型和亚型确定。SFRI培养上清液和腹水均可用作单克隆抗体源。
正如所讨论的，本发明的抗-GP60多克隆和单克隆抗体以及抗体片段可用作能够传递或促进生理学活性剂跨过含GP60受体的内皮、上皮和间皮的胞吞载体和增强剂。可用作本发明胞吞载体或增强剂的抗-GP60抗体片段包括含有通过木瓜蛋白酶消化产生的单(Fab)抗原结合结构域的片段；或通过有限的胃蛋白酶消化(Olsson and Kaplan，Methods inEnzymology 92：3(1983))而产生的F(ab’)2片段。其它适宜的片段包括Fab’和Fv。用作本发明胞吞载体或增强剂的特定白蛋白片段可按照下述常规筛选试验进行确定。在下文实施例3中，表明37℃施用抗-GP60多克隆抗体可使摄入的生理学活性剂比免疫前的血清对照摄入增加1.6-2倍。
根据本发明，在除人以外的动物如小鼠和大鼠中产生的抗-GP60抗体，由于对外源抗体熟知的不利反应而仅适宜于短期施用(即非慢性药剂)。但可用本领域描述的方法生产GP60受体的人单克隆抗体，以克服给人施用鼠克隆抗体产生的间题(Olsson and Kaplan，同上文)，由此提供于长期或慢性给予的抗体。此外，通过嵌合或CDR移植，可将本发明的鼠抗体“人化”。将鼠抗体的识别区移植到人抗体的适宜区，以避免或限制患者中的有害免疫反应。
GP60肽片段还可用作本发明的胞吞载体和增强剂。特别适宜的GP60肽片段包括GP60 N-末端的前18个氨基酸；发现该片段与牛的一段区域，膜结合的甲状腺激素(T3)结合蛋白有至少80％的同源性。按照任何已知的酶促或物理技术，包括蛋白水解降解，可生产所述GP60肽片段。或者，可合成GP60肽片段。如在下文实施例5中所说明的，通过固相合成法可生产对应于前18个残基的GP60合成N-末端肽(T3118)。作为胞吞作用的激动剂，该肽刺激人白蛋白的摄入比对照多5倍。
将本发明胞吞载体与生理学活性剂结合的方法对于本领域专业人员来说是显而易见的，包括但不限于涉及希夫碱形成的戊二醛结合；蛋白质与羧酸间的碳化二亚胺反应；含胺药物的酸酐激活，随后形成碳化二亚胺键；用3-(2-吡啶基二硫代)丙酸-N-琥珀酰亚胺基酐激活含伯胺的药物，然后与蛋白质的半胱氨酸基团相连；用氰尿酰氯将糖醇与蛋白质相连；经双过氧化作用结合胺和羟基。
例如，按照Hurwitz等，Cancer Res.35：1175-1181(1975)描述的方法，通过高碘酸钠处理可氧化生理活性剂的氨基糖部分并经希夫碱形成直接与本发明胞吞载体上的赖氨酸残基相连。或者，按照Hurwitz等，Int.J.Cancer 21：747-755(1978)描述的方法，通过碳化二亚胺介导的活性剂的氨基与载体上的羰基或氨基烷基相连而将生理活性剂与本发明的胞吞载体相连。按照Belles-Isles等，Br.J.Cancer 41：841-842(1980)描述的方法，通过用戊二醛将活性剂的氨基糖与载体上的氨基交联，可将生理活性剂与本发明的胞吞载体相连。
可通过实验常规确定用于将生理活性剂与本发明胞吞载体相连的其它适宜结合位点。例如，在与生理活性剂如胰岛素结合前或后，可用荧光素或125I标记本发明的胞吞载体。结合并标记后，可用如在下列实施例中描述的筛选试验来确定任何候选载体/活性结合物的内皮细胞摄入，上皮细胞流或间皮细胞流。所述常规筛选试验可使本领域专业人员确定，本发明的哪个胞吞载体在特定位点与生理活性剂结合后，仍保持胞吞能力。所述试验也用于常规筛选候选白蛋白片段、抗-GP60抗体片段和GP60肽片段以确定哪个适用作本发明胞吞载体和增强剂。
生理活性剂与本发明胞吞载体的结合特别适用于静脉内传递血清半衰期极短的低分子量药物，或在血液内很容易被降解或通过肝中的第一次排泄被除去的肽药。当然，在生理活性剂与本发明胞吞载体之一结合的情况下，结合后必须评估治疗剂的残留活性。检测治疗剂活性的技术是本领域熟知的，而且已成功地结合了许多治疗剂并保持了基本的活性。例如，文献中描述受体配体，或其片段，与药物的结合物以促进跨血液脑屏障的胞吞作用。Fukta等，Pharm.Research 11(12)：1681(1994)描述了辣根过氧化物酶(HRP)与胰岛素的结合，这样能够使HRP跨过血液、脑屏障。研究人员继续生产胰岛素片段，筛选其与培养物中牛脑微管内皮细胞的结合能力。同样，其它胞吞系统可以传递与活性药物结合的抗体，其中包括靶向转铁蛋白受体(Friden等，Proc.Natl.Acad.USA 88：4771(1991))的抗体-氨甲蝶呤，和靶向表皮生长因子受体(Chen等，FEBS Lett.338：167(1994))的抗体-多赖氨酸。
与胞吞载体相反，本发明的胞吞增强剂不与生理活性剂结合。已发现在含GP60受体的上皮、内皮和间皮上，本发明胞吞增强剂之一与生理活性剂的共存就足以增强所述活性剂跨细胞屏障的摄入和通过。理论上不希望结合，本发明的胞吞增强剂显然“引发”了GP60-介导的胞吞机制，由此增强了共存大分子包括治疗剂的摄入。
可用本发明的任何胞吞增强剂单独或结合来诱导或增强生理活性剂通过或跨上皮、内皮和间皮的摄入或通过。例如，下列试验表明作为胞吞激动剂，GP60肽T3118使人白蛋白的摄入比对照多5倍。在本发明的其它实施方案中，当上述讨论的胞吞载体结合物之一与本发明的一种或多种胞吞增强剂一起施用时，就可传递活性剂。
可将本发明的胞吞载体结合物和胞吞增强剂组合物(包括活性剂)与不会同结合物或组合物发生有害反应的可药用载体或赋形剂即适用的可药用有机或无机物质一起施用。适宜的可药用物质包括但不限于水、盐溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘石蜡、芳香油、脂肪酸单甘油酯和二甘油酯、petroethral脂肪酸酯，羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。可将药物制剂灭菌，如果需要与不同结合物有害反应的辅料如乳化剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、改变渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香物质混合。对于胃肠外给药，特别适宜的制剂是溶液，优选油或含水溶液，以及悬浮液、乳液或植入物，包括栓剂。安瓿是常用单位剂量。对于经肠给药，特别适宜的制剂是含有载体粘合剂如滑石和/或碳水化合物的片剂、糖衣丸或胶囊，所述载体优选是乳糖和/或玉米淀粉和/或马铃薯淀粉。也可使用其中使用增甜载体的糖浆、酏剂等。可配制缓释组合物，其中用差异降解的包衣如通过微被膜、多层包衣等保护活性组分。
可以按照任何本领域已知的技术包括注射或经肺气管来施用含一种或多种生理活性剂和一种或多种本发明胞吞载体或增强剂的结合物或共轭物。注射特别适合于脉管系统和腹膜给药，而肺气管特别适合于肺泡给药。适合于肺给药的适宜制剂包含与生理活性剂混合的一种或多种本发明的胞吞增强剂。或者适合于肺给药的制剂包含与所述试剂结合的胞吞载体。例如，可以用喷雾装置如Acorn或DeVilbiss喷气喷雾器制备制剂，其中在喷雾器的储药器中，试剂和胞吞增强剂以及载体作含水溶液而存在。或者，在用于肺给药的优选实施方案中，从干燥粉末吸入器(DPI)制备制剂。Sutton等在美国专利申请08/487420和WO/9609814中描述了DPI装置。它们要求将制剂喷雾干燥成适于肺泡透过的2-5μm的微颗粒。
具体地说，优选以约20％w/v的浓度将本发明的胞吞增强剂或载体或其混合物用于喷雾干燥。待喷雾的制剂可含有除胞吞增强剂或载体以及溶剂或载体液体以外的物质。例如，含水相可含有1-20％(重)水溶性亲水化合物如糖和聚合物作为稳定剂，如聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、明胶、多谷氨酸和多糖如淀粉、葡聚糖、琼脂、植物黄素等。可用相似的含水相作为载体液体，其中在使用前，最终的微球产物是悬浮的。可以用乳化剂(0.1-5％重)，包括大多数生理学可接受的乳化剂例如蛋卵磷脂或大豆卵磷脂或合成的卵磷脂如饱和的合成卵磷脂，如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱或不饱和的合成卵磷脂，如二油酰磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱。乳化剂还包括表面活性剂如游离的脂肪酸、脂肪酸与聚氧化烯类化合物如聚氧丙二醇和聚氧乙二醇形成的酯；脂肪醇与聚亚氧烷基乙二醇形成的醚；脂肪酸与聚氧烷基化的脱水山梨醇形成的酯；皂；甘油-聚氧乙烯蓖麻醇酸酯；聚亚烷基二醇的均聚物和共聚物；聚乙氧基化的豆油和蓖麻油以及氢化的衍生物；蔗糖或其它碳水化合物与脂肪酸、脂肪醇形成的醚或酯，可将其任选地多氧烷基化；饱和或不饱和脂肪酸的单、二和三甘油酯、甘油酯或豆油和蔗糖。
可将添加剂掺入到微球的壁中以改变物理特性如分散性、弹性和水渗透性。其中有用的添加剂包括可使壁“疏水化”以降低水渗透性的化合物，如脂肪、蜡和高分子量碳水化合物。改进微球在可注射液体-载体中的分散性的添加剂是两亲化合物，如磷脂；它们还可提高水渗透性和生物降解率。可提高壁弹性的添加剂包括增塑剂如肉豆蔻酸异丙酯等。掺入到壁中的添加剂量是极其可变的并可随需要改变。在某些应用中，根本不用使用添加剂；在其它情况下，添加剂的量可达壁重的约20％。
可用任何适宜的技术将含本发明一种或多种胞吞增强剂或载体以及如果有的活添加剂的溶液雾化并喷雾干燥，以得到上述2-5μm的分散微球或微胶囊。如本文所用的，“微胶囊”指封闭了一定空间的中空颗粒，用气体或蒸汽填充所述空间，但不用任何固体物质。
例如，在压力下使制剂通过至少一个小孔，或在含热空气或其它惰性气体的室中通过离心雾化器雾化形成胞吞载体或增强剂制剂的气雾剂。所述室应足够大，以使最大的喷出的液滴不会在干燥前撞到室壁上。室中的气体或蒸汽是干净的(优选无菌和无热原的)并且以与微胶囊同时给药的量施用到血液中时是无毒的。液体从制剂中蒸发的速率应足够高以形成中空的胶囊，但又不能高到使微胶囊破裂的程度。可通过改变气体流速、制剂中的胞吞载体或增强剂的浓度、液体载体的性质、溶液的给料速率以及更重要的是气雾剂所接触的气体温度来控制蒸发速率。例如，浓度为15-25％的白蛋白或白蛋白片段的水溶液、至少约100℃的气体入口温度，优选至少110℃，足以确保中空并且温度可以高达250℃而不会使胶囊破裂。约180-240℃，优选约210-230℃，并更优选约220℃。由于气雾剂所接触的气体温度还取决于气雾剂的释放速率和制剂中的液体含量，必须对出口温度进行监测以确保足够的室内温度。40-150℃的出口温度是适宜的。控制流速可以控制其它参数如完整中空颗粒的数量。
微粒可含有至少50％(重)，优选70％(重)或80％(重)，并最优选90％(重)的胞吞增强剂。为了用于吸入装置，可将微粒与常规赋形剂如乳糖或葡萄糖配制在一起。生理活性剂的量依据其性质和活性、给药方式以及本领域技术人员已知的其它因素进行选择。例如，施用的颗粒数是可以传递100mg/天α-1抗胰蛋白酶，或0.1mg/天活性剂如氯地米松的数量。下面给出可通过微粒进行给药的其它可能的生理活性剂。
本发明的另一实施方案是将生理活性剂与胞吞增强剂共喷雾干燥以利于在配制、包装过程中，更重要的是在停留在肺泡内膜上时稳定所述活性剂。在这种情况下，它们可以有强蛋白水解活性。在该或另一实施方案中，可将活性剂与胞吞载体在喷雾干燥前通过可裂解的键共价连接。该实施方案代表了可将活性剂从装置携带到血液，并可能带到体内靶位点上的方法。形成具有最佳空气动力学大小的颗粒意味着“物理”载体将活性剂传递到吸收位点。在沉积到肺泡上后，经GP-60介导的胞吞系统，“分子”载体就可以保护并促进进入血液的传递过程，在进入血液后，可进一步提高循环半衰期，甚至将活性剂导向含有GP60受体的特定位点。以上讨论了适宜的连接技术；此外，WO-A-9317713记载了酯酶敏感性的多羟基酸连接物。在喷雾干燥前用于衍生胞吞载体的所述技术可以产生用于将活性剂传递到全身脉管系统的共价载体系统。这利用了胞吞载体这样的潜力，即可跨过肺泡并较长时间携带活性剂同时保护可能不稳定的整体。
尽管可以在微粒配制后将本发明所用的生理活性剂嵌入微粒或与微粒缔合，但优选与胞吞载体或增强剂一起配制。微粒可至少用疏水或水不溶性材料如脂肪酸进行部分包衣，以延缓其溶解速率并防止其吸湿。
用于喷雾干燥并产生微粒(例如用于干粉吸入装置)的方法和设备更详细地记载于WO-A-9609814和美国专利申请08/487420，其内容引入本文作为参考。
可根据任何适宜的方法确定在用于肺传递的制剂中药物与胞吞增强剂的最佳比例。如下列实施例所述，制剂的一种体外最优化方法需要使用初级人上皮细胞单层细胞或在多孔滤纸上生长为单层细胞的不死的人上皮细胞。然后将药物和增强剂的混合物应用到下述跨孔流(transwell flux)系统的上层室中。用标记的示踪物和免疫检测，可确定药物或基因到达下层的流速。将最佳制剂定义为有最大速率并可最大程度通过限制性单层细胞的制剂。
优化制剂的另一种方法需要体内确定在研究条件下的肺到血液的药物流通量。已经报道了许多用大鼠、猪和绵羊进行的研究(Patton等，Journal of Controlled Release 28：79(1994)，Folkesson等，Acta.Physiol.Scand.147：73(1993)，Schreier等，Pharm.Res.11：1056(1994))，这些研究描述了将药物制剂滴注或雾化到气管和细支气管的方法以及通过免疫检测评估药物的血液中的出现或药理学活性的方法。优化需要用不同比例的药物和增强剂制成的一系列动物制剂，将与所希望的药物药理学分布匹配的曲线下的最有利的面积定义为最佳制剂。例如，只需简单地表明药物的最大生物利用度或者表明延长的或缓释分布。对于各种情况来说，可能需将不同量的增强剂掺入到制剂中。对于要求最大利用度的药物来说，需要利用最大量的增强剂和/或对GP60受体有最大激活作用的增强剂。对于因跨肺而需要呈现期较长的药物来说，需要利用较低量的增强剂和/或对胞吞GP60受体有较低激活潜力的增强剂。
可将增强剂或载体的“强度”定义为存在GP60受体-结合的配体、抗体或类似物(mimetic)的情况下与不存在配体时的胞吞作用的程度相比特定示踪物的胞吞作用可以被增强的程度。增强剂的“强度”在某种程度上也就是药物依赖性。标记物摄入的增加可随标记物和胞吞增强剂的性质而改变。下面列表的是标记物、增强剂、细胞系统的对照表以及高于不同标记物、细胞系统和试验类型的对照的增强程度。所用的缩写：
125I-BSA   125I-标记的牛白蛋白
125I-IgG   125I-标记的免疫球蛋白G
HSA         人白蛋白
BSA         牛白蛋白
FITC-胰岛素 荧光素标记的胰岛素
GP 60 Ab    抗-GP60多克隆抗体
T3118       从GP60的N-末端的18个残基衍生的合成肽
标记物   增强剂 细胞类型 增强的倍数
125I-BSA   GP60 Ab 牛/内皮/流量     1.6
125I-BSA   GP60 Ab 牛/内皮/流量     2.0
抗-BSA125I-IgG   BSA 牛/内皮/流量     1.5
FITC-胰岛素   HSA 人内皮/流量     2.5
FITC-胰岛素   BSA 大鼠上皮/流量     4
125I-BSA   BSA/T3118 牛内皮/摄入量     5
“生理活性剂”指包括核酸分子、药用肽和蛋白质的药物。本文中，可与“生理活性剂”互换的是“药物”、“活性成分”、“活性剂”和“治疗剂”。可得益于更迅速的跨内皮和上皮胞吞作用的药物包括：黄体化激素(LH)、绒膜促性腺激素、心房肽、干扰素、各种淋巴因子如白细胞介素(I、II、III、IV、V、VI和VII)以及集落刺激因子。
适用于本发明的其它药物包括：生长激素释放因子、促皮质素释放因子、黄体化激素释放激素(LHRH)、生长激素、降钙素、促甲状腺激素释放激素、降钙素基因相关肽(CGRP)、蛋白质如酶，包括转移酶、水解酶、异构酶、蛋白酶、连接酶、氧化还原酶、酯酶和磷酸酶、以及各种生长和神经营养因子如生长激素调节因子、表皮生长因子、尿抑胃素、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、胶质衍生的神经营养因子(GDNF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子、肿瘤坏死因子(TNF)和转化生长因子(TGF)。其它药物包括内源性的阿片激动剂，例如脑磷脂和内啡肽；下丘脑激素如促性腺激素释放激素、促黑激素抑制素、促黑激素释放激素、生长激素释放抑制因子、促甲状腺激素释放激素、P物质和神经紧张素；腺垂体激素，例如促肾上腺皮质激素、亲脂素、促黑细胞激素、促黄体素、促甲状腺激素、催乳素和生长激素；神经垂体激素；calcitrapic(甲状腺)激素，例如甲状旁腺激素和降钙素；胸腺因子例如胸腺素、促胸腺生成素、循环胸腺因子和胸腺体液因子；胰腺激素，例如胰岛素、高血糖素和生长激素释放抑制因子；胃肠道激素，如胃泌素、缩胆囊肽、分泌素、胃液抑制多肽、血管肠肽和胃动素；卵巢激素，例如松弛素；血管活性组织激素，如血管紧张素和缓激肽；以及人工肽或假肽如deferoxamine；和LHRH类似物如buserelin、deslorelin、gonadorelin、goserelin、histrelin、leuprorelin、nafarelin或triptorelin。
以上已对本发明进行一般性描述，参照以下实施例可以更容易地理解本发明，所述实施例是说明性而非限定性的。实施例1内皮和上皮单层细胞的生长
按所述方法(Del Vecchio et al.，In Vitro.Cell.Dev.Biol.28A：711-715(1992))分离并培养牛肺微管内皮细胞(BPMVEC)和(BPAEC)牛肺动脉内皮细胞。用含20％FBS的DMEM常规培养内皮细胞。为了分离质膜，在850cm3的旋转瓶中培养内皮细胞。向各旋转瓶中加入75ml培养基。导入空气-CO2混合物。然后将细胞转移到37℃的旋转瓶保温箱中，使其生长10-12天。
按照Uhal et al.，Am.J.Physiol.257：C528-C536(1989)中所述的方法分离初级大鼠肺泡上皮细胞(AEC)。将细胞在含10％FBS的DMEM中培养2或4小时，此时它们分别显示出II型或I型细胞样表型。按照Uhal等，Am.J.Physiol.Suppl.261：110-117(1991)的方法检验该表型。内皮细胞膜的分离
用磷酸盐缓冲盐水洗涤生长在旋转瓶中的内皮细胞两次。从旋转瓶中刮下细胞并悬浮在Buffer-A(20mM HEPES/Tris，0.15M NaCl，0.1mMPMSF pH7.4)中，以700xg离心10分钟，洗涤两次。将从6-8个旋转瓶中得到的细胞悬浮在75ml Buffer-A中，用Polytron匀浆器全速匀浆1分钟。以3000xg将匀浆物离心10分钟。收集上清液并以40000xg离心60分钟。然后将所得沉降物悬浮在buffer-A中，再以40000xg离心60分钟。将最终的膜沉降物悬浮在小体积含0.2mM EDTA的buffer-A中并测定蛋白质浓度(Lowry et al.J.Biol.Chem.193：265-275(1951))。测定质膜标记物的酶活性并将样品在-70℃贮存直到使用。配体印迹
将内皮细胞膜与1mM PMSF和0.5mM EDTA在22℃预保温20分钟，然后通过与1.5体积的增溶缓冲液(9M脲，2％SDS，2％β-巯基乙醇，0.1M Tris，0.02％溴酚兰pH6.8)混合使其增溶。将混合物在22℃培养30分钟。用平板凝胶电泳系统，通过SDS-PAGE(Laemmli，Nature(London)227：680-685)分离溶解的蛋白质，所述电泳系统在积层凝胶中含3％丙烯酰胺，在分离凝胶中含10％丙烯酰胺。电泳后，将蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上。用25mM Tris，192mM甘氨酸和20％甲醇作为转移缓冲液，在150伏2小时完成转移。通过与5mM CaCl2的TBS(20mM Tris，0.5M NaCl pH 7.5)溶液一起保温10分钟，然后与0.5％吐温20的TBS保温过夜来阻断非特异性结合。该步骤后，洗涤膜并切成两条。一条与含1.5％明胶的0.6mg/ml无球蛋白的BSA的TBS一起保温2小时，另一条不与BSA一起保温。洗涤所述条并与抗牛BSA在含1.5％明胶的TBS中一起保温60分钟。将膜洗涤两次并与同碱性磷酸酶结合的二级抗体(山羊抗兔IgG)一起保温。加入5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四唑盐后确定蛋白质带的位置。蛋白质纯化
用BPMVEC膜分离57kDa的白蛋白结合蛋白。进行配体印迹以评估在各步骤中是否存在该蛋白质。将BPMVEC膜(100mg)与1mM PMSF和0.5mM EDTA在22℃预保温30分钟。在4℃用终浓度为2.5％胆酸钠和4M脲将该膜溶解3小时，同时缓慢搅拌。在溶解过程中将蛋白质浓度调整到4mg/ml。该处理后，将悬浮液以100000xg离心60分钟。收集上清液并用5mM HEPES/Tris(pH7.2)透析。在上清液中回收了80％以上的膜蛋白。4℃用60％乙醇沉淀来浓缩透析的悬浮液。4℃以10000xg离心30分钟来收集乙醇沉淀并悬浮在Buffer-A中。4℃用2.5％Triton X-100溶解沉淀过夜，同时缓慢搅拌。将悬浮液以100000xg离心60分钟。收集上清液并用4升50mM Tris-HCl，0.2mM EDTA，0.15％Triton X-100和0.1mM PMSF，pH8.0(buffer-B)透析。将透析的提取物加到DEAE-52柱(10×13cm)上。该柱用buffer-B预先平衡。上样后，用50ml buffer-B洗涤该柱。用80ml在buffer-B中0-500mM的线性NaCl梯度，以15ml/小时的流速从该柱上洗脱结合的蛋白质。分别合并来自各峰的馏分并用50％丙酮沉淀浓缩。将丙酮沉淀用于配体印迹。只有峰I有白蛋白结合活性。用制备性SDS-PAGE(16cm×16cm，3mm厚的平板凝胶)进一步分离峰I中的蛋白质，将从凝胶中洗脱的57kDa蛋白质用于进一步的研究。抗体生产和纯化
用从制备性SDS-PAGE洗脱的57kDa白蛋白结合蛋白免疫兔。在与等体积的弗氏完全佐剂混合后，肌肉内注射约50μg蛋白质(每只兔)。在两周后进行第二次注射。在第二次注射后，将兔喂养4到6星期，然后检测免疫反应。用蛋白质A-Sepharose柱纯化预免疫血清IgG和抗血清IgG。免疫印迹
对内皮细胞膜进行SDS-PAGE(Laemmli，同上文)，然后电泳转移到硝酸纤维素或PVDF膜上。22℃用3％明胶的TBS经5小时阻断非特异性结合。用0.5％在TBS中的吐温20洗涤将该膜两次并与用含1％明胶的TBS稀释的抗血清一起保温。保温4-6小时，洗涤两次，然后与二级抗体(与碱性磷酸酶结合的山羊抗兔IgG)保温60分钟。保温后，将膜洗涤两次，按照“配体印迹”中所述确定蛋白质带的位置。用已知标记蛋白确定蛋白质的分子量。单层细胞结合研究
将BPMVEC接种(3×105细胞/孔)在6孔Corning组织培养皿中并生长至汇合。用无血清培养基(20mM HEPE/DMEM pH7.4)将单层细胞洗涤两次，然后在组织培养保温箱中与无血清培养基保温15-20小时。该保温后，用结合缓冲液(20mM HEPE/Tris HBSS pH7.4)将单层细胞洗涤两次，通过加入1ml 1μM 125I-BSA的结合缓冲液来启动结合。4℃保温60分钟。通过用结合缓冲液将单层细胞洗涤3次来终止结合。在用1NNaOH溶解细胞后确定与单层细胞有关的放射性(Tiruppathi et al，Am.J.Physiol.(Lung.Cell.Mol.Physiol.)L595-L601(1992))。。通过在结合过程中包含的未标记的BSA(40mg/ml)来确定非特异性结合。在加入125I-BSA前，将试验组分、预免疫血清-IgG和抗57kDa-IgG预保温30分钟。跨细胞流试验
用在培养内皮单层细胞中的多个跨内皮125I-白蛋白流速率来评估跨内皮白蛋白运输。以前已描述了用于该研究的系统(Cooper et al.，J.appl.Physiol.62：1076-1083(1987)；Garcia，et al.，J.Cell.Physiol.128：96-104(1986)；Del Vecchio et al.，Vitro.Cell.Dev.Biol.28A：711-715(1992)和Siflinger-Birnboirn et al.，J.Cell.Physiol.132：111-117(1987))。在不存在流体静压和oncotic压梯度的情况下，该系统测量了示踪大分子的跨内皮运动。该系统由通过聚碳酸酯微孔滤纸(孔直径为0.8μm)分开的发光和白蛋白隔室分开的隔室组成。以105细胞/滤纸接种BPMVEC，然后生长3-4天以至汇合。在体积分别为600ml和25ml的隔室中含有相同的培养基(20mM HEPES-DMEM，pH7.4)。发光隔室配有Styrofoam外环，并“浮”在白蛋白培养基中以便在从白蛋白隔室重复去样后液体水平仍保持相同。连续搅拌白蛋白隔室并通过恒温调节的水浴将整个系统保持于37℃。将125I-白蛋白的跨内皮清除率确定为清除到白蛋白隔室中的发光隔室放射性的体积。通过称重的最少面积非线性回归分析(BMDP统计软件，Berkeley，CA)确定体积随时间的改变，得到以/分钟计的125I-白蛋白清除率。
在试验开始，发光隔室浮在白蛋白介质中，并用含约6μCi/ml125I-白蛋白的介质填充。以10分钟的间隔收集白蛋白样品，400μl，共收集60分钟，然后用γ计数器测量放射性。在试验结束时，用12％TCA沉淀确定发光和白蛋白隔室中的125I，并对无125I校正跨内皮125I-白蛋白流速。
试验前一天，用20mM HEPES-DMEM pH7.4(无血清培养基)将BPMVEC单层细胞洗涤2次，然后37℃在细胞培养保温箱中与无血清培养基一起保温12-15小时。该保温过程后，用无血清培养基稀释试验组分(预免疫血清-IgG和抗-57kDa-IgG)，并与单层细胞保温所希望的时间。然后用这些单层细胞进行跨内皮白蛋白运输测量。
用稍加改变的用于内皮细胞的方法测量跨上皮流速。按对跨孔滤纸的描述(Costar)(Evans et al，Exper.Cell Res.184：375-387(1989))，确定初级AEC或培养的A549人肺癌细胞系的流速。通过跨上皮电阻来定义单层细胞的完整性，结果大于500ohms/cm2。将带完整单层细胞的滤纸放在每孔含1ml无血清DMEM的24孔培养板上(白蛋白室)。用含所需示踪分子(FITC-胰岛素)的200μl无血清DMEM填充发光室。在两个隔室中的液体水平是相同的，从而消除了静压。将过滤系统预保温(30分钟)，然后在整个流量试验过程中，均将其保温在37℃的CO2保温箱中。在1和2小时，从白蛋白室中取出300μl的样品并且立即用无血清DMEM代替。在平板阅读仪上记录胞吞物质的荧光，通过白蛋白样品的凝胶过滤色谱来确定结合的对游离FITC的比例。肌动蛋白丝的分布
在与用于测量125I-白蛋白清除率相同的条件下研究在生长于滤纸上的内皮单层细胞中肌动蛋白丝分布与细胞骨架的变化。在用试验组分预处理的所需的时间后，用10％缓冲的福尔马林(Pallescences Inc.，Warrington，PA)固定在滤纸上的单层细胞，并用1％Nonidet P40(Sigma)渗透，然后按Phillips and Tsan，J.Histochem.Cytochem.36：551-554(1988)所述用若丹明鬼笔环肽(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)染色。从孔中取出含单层细胞的完整滤纸，并固定在盖玻片上，用1∶1的甘油在磷酸缓冲盐中的溶液覆盖，然后用圆盖玻片覆盖并密封。用Nikon Lab Diaphot荧光显微镜(Nikon Inc.，Melville，New York)分析玻片，并用TRI X Pan 400 ASA柯达胶片拍照。鉴定白蛋白结合的蛋白质
用示差离心从BPMVEC中分离质膜，并用配体印迹(见上述)鉴定该膜馏分中白蛋白结合的蛋白质。研制了一种简单的方法以鉴定在内皮细胞膜中天然白蛋白结合的蛋白质。用SDS-PAGE分离膜蛋白，然后转移到PVDF或硝酸纤维素上。通过将膜条与吐温20一起保温来阻断非特异性结合，然后用无球蛋白单体天然BSA处理。用抗天然BSA的多克隆抗体鉴定BSA结合的区。在不将膜条暴露于天然BSA的情况下，抗BSA仅识别67kDa多肽，表明存在大量与内皮细胞膜结合的BSA。但是，当用BSA处理所述条带时，抗BSA抗体与3种另外的多肽(110kDa，、57kDa和18kDa)反应。在这些多肽中，抗体与57kDa的反应最强，这表明57kDa多肽是主要的天然白蛋白结合的多肽。另外还制备了总内皮细胞膜馏分(来自BPMVEC和BPAEC的100000xg颗粒馏分)并用于配体印迹。这些颗粒馏分表明BSA与57kDa多肽有主要的相互作用。分离57kDa白蛋白结合的蛋白质
由于发现天然白蛋白主要与57kDa蛋白结合，所以研制了从BPMVEC膜中分离该蛋白质的方法。用配体印迹评估纯化过程中是否存在该蛋白质。开始用2.5％胆酸钠和4M脲溶解BPMVEC膜，然后透析提取物并用60％乙醇沉淀浓缩。用Triton x-100(见上述)再提取该沉淀物。在DEAE柱上对Triton x-100溶解的提取物进行色谱，用线性梯度(O-500mM NaCl)洗脱结合的蛋白质。蛋白质洗脱出3个峰。收集来自各峰的馏分并用配体印迹试验筛选白蛋白结合。只有一个峰(I)与57kDa蛋白区有白蛋白结合。
用考马斯亮兰R-250染色后，用来自天然BPMVEC膜和DEAE柱峰I的蛋白质进行SDS电泳。在天然膜和DEAE峰I中均用配体印迹观察到存在对应于白蛋白结合的57kDa蛋白。还在非还原条件下(不存在βME)完成SDS-PAGE，只于57kDa蛋白区观察到白蛋白结合，这表明在该蛋白质中不存在二硫化物键。用制备性SDS-PAGE进一步纯化该蛋白质，用从凝胶中洗脱的蛋白质制备抗体。免疫印迹
用SDS-PAGE分离BPMVEC和BPAEC膜蛋白并转移到硝酸纤维素条带上。用57kDa抗血清免疫印迹该条带。预免疫的血清不识别BPMVEC和BPAEC膜的任何蛋白质。抗血清识别两种膜制品中的两种主要蛋白质(57kDa和36kDa)以及一种少量蛋白质(43kDa)，再用BPMVEC和BPAEC膜的颗粒馏分进行免疫印迹。抗体仅识别颗粒馏分中的这3种蛋白质。这表明已将白蛋白结合的蛋白质纯化到了显著的均一度。
为了研究内皮膜相关的白蛋白结合蛋白与分泌的(SPARC)白蛋白结合蛋白之间的结构关系，用抗纯化的牛SPARC的抗体进行BPMVEC膜的免疫印迹。抗纯化的牛SPARC的抗血清识别BPMVEC膜中的67kDa、61kDa、57kDa、43kDa和36kDa多肽。抗-SPARC-NH2末端肽抗血清与36kDa多肽的反应强，而与43kDa多肽的反应弱。这表明清除剂受体与天然白蛋白受体明显不同。抗-57kDa-IgG对125I-BSA与BPMVEC单层细胞结合的影响
用蛋白质A-Sepharose柱亲和纯化预免疫血清-IgG和抗-57kDa-IgG。4℃研究IgG馏分对125I-BSA与BPMVEC单层细胞结合的影响：40-50％的非特异性结合。预免疫血清-IgG对125I-BSA与BPMVEC单层细胞的特异性结合没有显著影响。相反，抗-57kDa-IgG以剂量依赖的方式降低125I-BSA与BPMVEC单层细胞的特异性结合。抗-57kDa-IgG的降低作用在浓度为200μg/ml时最大(40-50％)，在浓度为1000μg/ml时仍保持不变。
这些结果表明抗57kDa蛋白质的抗体不会完全识别受体中的白蛋白结合结构域，或天然白蛋白可与内皮细胞表面上的其它结合位点相互作用。不存在内皮细胞形状改变的情况下，用抗-57kDa-IgG激活跨内皮白蛋白流
为了研究抗-57kIDa-IgG对白蛋白跨内皮运输的影响，测量BPMVEC单层细胞中跨内皮125I-BSA清除率。将单层细胞与预免疫血清-IgG和抗-57kDa-IgG预保温15分钟、30分钟和60分钟，然后测量60分钟内的跨内皮的125I-BSA清除率。抗-57kDa-IgG诱导的渗透性增加是时间依赖性的。抗-57kDa-IgG预保温30分钟导致125I-BSA清除率比预免疫IgG高2倍。在预保温15分钟内，渗透性没有显著增加，而当抗-57kDa-IgG与单层细胞预保温达60分钟时，有40-50％的改变。预免疫血清-IgG在所有测试的预保温时间，对跨内皮白蛋白运输均无影响。4℃抗-57kDa-IgG影响125I-白蛋白渗透性的恢复。
用先前所述的技术(Phillips and Tsan，同上文；Siflinger-Birnboim etal.，Lab Invest.67：24-30(1992))研究用预免疫血清-IgG和抗-57 kDa-IgG处理后，内皮细胞形状的改变。将在核孔滤纸上生长的BPMVEC与预免疫血清-IgG和抗-57kDa-IgG一起预保温30分钟，用若丹明鬼笔环肽将单层细胞染色(见上文)。在这两种情况下，均未观察到细胞“环”或内皮间缺口。
这些结果表明抗-57kDa白蛋白结合的蛋白质抗体激活了白蛋白运输。还有另一种可能性，即通过扩宽内皮间连接的缺口，该抗体可能非特异性地增加了白蛋白的近细胞(pericellular)运输。为了描述这种情况，研究抗受体IgG和预免疫血清IgG对内皮细胞形态的作用。用预免疫血清-IgG或抗-57kDa-受体-IgG预处理BPMVEC单层细胞对内皮间连接缺口没有影响。抗57kDa白蛋白结合蛋白的抗体可激活白蛋白的胞吞作用。在4℃该抗体没有渗透性增强作用，这支持抗体经小泡的形成激活白蛋白胞吞作用的结论，所述小泡形成是温度敏感性的(Lo et al.，J.Cell.Physiol.151：63-70(1992))。实施例2抗GP60抗体
按实施例1所述用抗来自内皮细胞的GP60的抗体检测上皮细胞膜提取物。抗GP60抗体识别在上皮提取物中发现的60kDa蛋白质。这清楚地表明在该系统中存在免疫相关蛋白。
按实施例1所述使上皮和内皮细胞生长成单层细胞，以产生汇合单层细胞，表明与溶质流有适宜的反应性。在不存在可能导致GP60内部化的代谢活性的情况下，4℃将抗GP60抗体(200-500μg/ml)与单层细胞一起保温以使抗体与受体结合。在这些条件下，抗GP60抗体的结合会导致内皮单层细胞的125I-BSA结合降低80-90％。再将上皮单层细胞与抗初级兔抗GP60抗体的二级抗体一起保温，以交联受体。洗涤这两个单层细胞，然后在37℃与上皮细胞的125I-BSA或内皮单层细胞的125I-抗BSA免疫球蛋白一起保温以使受体-抗体复合物内部化以及125I-标记的示踪物共胞吞。与抗GP60抗体一起保温导致摄入与预免疫血清对照高1.6-2倍。因此，抗GP60抗体引起的GP60受体结合会激活胞吞机制，由此提高在凹缩膜附近大分子的摄入。实施例3白蛋白与大分子的使用
存在BSA的条件下，4℃保温内皮单层细胞以引发BSA与GP60的结合，但防止配体受体复合物内部化。充分洗涤除去未结合的BSA后，将细胞与作为大分子示踪物的125I-标记的抗-BSA免疫球蛋白在37℃一起保温。用BSA预处理产生的免疫球蛋白示踪物的胞吞作用比与未标记抗-BSA免疫球蛋白一起预保温的对照细胞高1.5倍。此外，当洗涤37℃保温的细胞并用相同的方法立即取出时，未观察到大分子流；这表明一旦内部化，GP60受体就不可能与配体结合。因此，用GP60系统，可将大(150kDa)分子与HSA共胞吞。实施例4白蛋白与肽的使用
按实施例1所述使人和大鼠上皮单层细胞生长汇合。然后37℃将细胞与FITC-胰岛素(1mg/ml)或FITC-胰岛素和BSA(各1mg/ml)在上述跨细胞流系统中一起保温。对于人和大鼠上皮单层细胞，FITC-胰岛素流比单独FITC-胰岛素的对照有2.5或4倍的增加。因此，白蛋白还刺激小分子量肽跨含GP60受体的上皮细胞的共胞吞作用。实施例5GP60N-末端肽1-18的用途
用固相肽合成法生产对应于前18个残基的GP60的合成N-末端肽(T3118)。该序列(SEQ ID NO.1)与牛的膜结合的甲状腺激素(T3)-结合蛋白(Yamauchi et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.146：1485(1987))有80％的同源性。与PDI有97％的同源性。
在兔中生产抗T3118抗体，并用于检测内皮细胞膜提取物，以便按照下述确定与抗GP60抗体识别之蛋白质的交叉反应性。在SDS-PAGE上分离BPMVEC膜蛋白(100μg)并转移到硝酸纤维素膜条带上。用5％脱脂干奶粉在Tris缓冲盐中阻断非特异性结合。用阻断溶液稀释抗血清，在4℃保温4-5小时，洗涤并用与碱性磷酸酶结合的山羊-抗-兔-IgG处理。用已知分子量的标记蛋白鉴定蛋白质带。抗T3118抗体只与GP60蛋白有反应性，与抗GP60抗体识别的SPARC肽没有反应性。
然后将T3118肽用于内皮摄入试验以确定它是否可作为白蛋白识别和摄入的拮抗剂。存在125I-BSA或125I-BSA加T3118肽的情况下，在4℃保温内皮单层细胞。保温后，彻底洗涤细胞，溶解并计数示踪物的摄入。令人惊奇的是，除作为拮抗剂外，T3118肽事实上可使白蛋白的摄入比白蛋白单独对照高5倍。在T3118肽的浓度为500μM时，增强作用达到饱和。这些数据表明T3118肽作为激动剂可诱导白蛋白构型的改变，这样可提高GP60的识别，或作为内皮细胞摄入的信号。
本领域专业人员可以理解，在组合物、浓度、给药方式和条件的相同参数的宽范围内，可以完成本发明而不会偏离本发明或其任何实施方案的精神和范围。序列表(1)一般资料：(I)申请人：
(A)名称：Andaris Limited
(B)街道：1 Mere Way
(C)城市：Ruddington
(D)州：Nottingham
(E)  国家：英国
(F)邮政编码(ZIP)：NG 15AQ(ii)发明名称：用于药物传递的胞吞载体和增强剂(iii)序列数：1(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容的
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的资料：(I)序列特征：
(A)长度：18个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Lys  Pro  Asp  Glu  Glu  Asp  His  Val  Leu  Val  Leu  Val  Lys  Gly  Asn  Phe1                   5                        10                       15Asp  Val

Claims (17)

1.含有生理活性剂和胞吞增强剂或载体的组合物或所述组分的结合物，所述生理活性剂在跨过含GP60受体的内皮、上皮或间皮后发挥其作用，所述胞吞增强剂或载体选自白蛋白和其片段、抗GP60抗体和其片段、GP60肽片段和PDI(蛋白质二硫化物异构酶)和其片段。
2.根据权利要求1的组合物或结合物，其中所述胞吞增强剂或载体包含CGMC基元。
3.根据权利要求1的组合物或结合物，其中所述胞吞增强剂或载体含有白蛋白或白蛋白片段。
4.根据权利要求1的组合物或结合物，其中所述胞吞增强剂或载体含有抗GP60抗体或抗GP60抗体片段。
5.根据权利要求1的组合物或结合物，其中所述胞吞增强剂或载体含有GP60肽片段。
6.根据权利要求1的组合物或结合物，其中所述胞吞增强剂或载体含有白蛋白或白蛋白片段以及GP60肽片段。
7.根据权利要求5或6的组合物或结合物，其中所述GP60肽片段是或含有SEQ ID NO.1。
8.根据前述任一权利要求的组合物或结合物，其中所述生理活性剂选自黄体化激素(LH)、绒膜促性腺激素、心房肽、干扰素、淋巴因子I、淋巴因子II、淋巴因子III、淋巴因子IV、淋巴因子V、淋巴因子VI和淋巴因子VIII、集落刺激因子、生长激素释放因子、促皮质素释放因子、黄体化激素释放激素(LHRH)、生长激素、降钙素、促甲状腺激素释放激素、降钙素基因相关肽(CGRP)、转移酶、水解酶、异构酶、蛋白酶、连接酶、氧化还原酶、酯酶、磷酸酶、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、胶质衍生的神经营养因子(GDNF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)、脑磷脂、内啡肽、促性腺激素释放激素、促黑激素抑制素、促黑激素释放激素、生长激素释放抑制因子、促甲状腺激素释放激素、P物质、神经紧张素、促肾上腺皮质激素、亲脂素、促黑细胞激素、促黄体素、促甲状腺激素、催乳素、生长激素；神经垂体激素、甲状旁腺激素、降钙素、胸腺素、促胸腺生成素、循环胸腺因子、胸腺体液因子、胰岛素、高血糖素、生长激素释放抑制因子、胃泌素、缩胆囊肽、分泌素、胃液抑制多肽、血管肠肽、胃动素、松弛素、血管紧张素、缓激肽、somatomedins、表皮生长因子、尿抑胃素、deferoxamine、buserelin、deslorelin、gonadorelin、goserelin、histrelin、leuprorelin、nafarelin和triptorelin。
9.权利要求1-8任一项中限定的生理活性剂和胞吞增强剂用于制备使用所述活性剂进行治疗的药物用途。
10.权利要求1-8任一项中限定的结合物用于制备使用所述活性剂进行治疗的药物用途。
11.将生理活性剂施用给哺乳动物的方法，改进包括：施用权利要求1-7任一项中定义的与胞吞载体或增强剂结合或混合的所述活性剂，其中所述胞吞载体或增强剂传递或增强所述生理活性剂跨含GP60受体的上皮、内皮或间皮的传递。
12.根据权利要求11的方法，其中所述施用是施用给脉管系统、肺气管或腹膜。
13.根据权利要求12的方法，其中经注射施用给脉管系统或腹膜。
14.根据权利要求12的方法，其中经干粉吸入施用到肺气管。
15.根据权利要求11的方法，其中所述生理活性剂是权利要求8所定义的。
16.根据权利要求11的方法，其中所述生理活性剂通过下列方法与所述胞吞载体结合：利用希夫碱形成的戊二醛结合、蛋白质和羧酸间的碳化二亚胺反应、含胺药物的酸酐激活和随后的碳化二亚胺连接、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸-N-琥珀酰业胺基酐活化含伯胺的药物，然后与蛋白质的半胱氨酸基团相连、用氰尿酰氯将糖醇与蛋白质相连以及经双过氧化作用结合胺和羟基。
17.权利要求11的方法，其中所述哺乳动物是人。
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