CN1198101A - 组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种蛋白和多个表位的合成缀合物,可用于预防异种移植物的超急性排斥,或至少降低排斥的强度或速度。还可将其用于治疗某些疾病。

Description

组合物及其用途
本发明涉及移植领域，具体地讲，涉及预防异种移植物的超急性排斥或至少降低排斥的强度或速度。
将猪器官(例如，心脏、肾脏)移植到灵长类体内，会在受体内触发快速的(短于10分钟)超急性排斥，从而损坏供体组织。
超急性排斥的第一步被视为是受体预形成的“异种天然抗体”(XNA)与供体组织血管的结合，后者又激活受体的补体系统。已有有力的证据表明所述抗体的主要目标是半乳糖α1，3半乳糖(Galα1，3Gal)(Sandrin等，Prac，Natl.Acad.Sci USA 90：11391(1993))。这是一种在猪的组织中被普遍表达的糖，但人体中缺乏(Galili等，Prac Natl Acad SciUSA 84：1369-1373(1987))。这种二糖是由细胞表面糖蛋白和糖脂生成的寡糖链的末端修饰形式。已鉴定了多种能结合XNA，并因此可能携带Galα1，3Gal的猪内皮蛋白(Platt等，Transplantation 57：327-335(1994))。
已知大部分针对猪组织的XNAs能特异结合Galα1，3Gal。含有该结构的寡糖(B-三糖：Galα1，3Galβ1，4GlcNAc；B-二糖：Galα1，3Gal)是人血清对猪内皮细胞细胞毒性作用的最佳抑制剂(Neethling等，Transplantation 57：959-963(1994))。其它α-半乳糖基化糖类(非1，3-连接的)也能抑制，但效果差得多。
Cooper及其同事研究了输注α-半乳糖基化糖类阿拉伯半乳聚糖和蜜二糖至狒狒中是如何影响获自所述动物的血清体外杀伤猪内皮细胞的能力(Ye等，Transplantation 58：330-337(1994))。产生了一定程度的保护，但不足以达到显著延长异型猪心异种移植物寿命的程度。另外，输注大量糖类可能会使动物生病(多尿、呼吸困难)。
Cooper等研究组还试图用由Syntesome GmbH，FineBiochemicals，(Heimdall Str.4，D-81739 Munich，Germany)出售的B-二糖-聚丙烯酰胺(PAA)在体外抑制由抗体介导的猪细胞裂解(Riebin等，Xenotransplantation 2：98-106(1995))。所述二糖能以一定的取代密度结合于聚丙烯酰胺上，各自保护猪组织免受侵袭的能力不同。然而，尚没有对PAA缀合物和游离二糖的保护能力进行直接比较的报导。
WO 93/03735披露了各种据说可用于减轻抗体介导的异种移植排斥的方法和组合物。在一种实施方案中，将异种抗原结合在固相支持体上，并证明可用于患者血液的灌注，以便除去异种抗体。据说合适的固相支体的例子有硅石、合成硅酸盐如多孔玻璃、生物硅酸盐如硅藻土，含有硅酸盐的矿物如高岭土，以及合成聚合物如聚苯乙烯、聚丙烯和多糖。
按照本发明，提供了一种用于药品的、一种蛋白和多个表位的合成缀合物；其中，所述表位能被异种天然抗体结合。
本文所用“蛋白”一词包括具有肽键的组分，如肽(例如聚赖氨酸)、多肽和完全蛋白。因此，不能以过于局限的方式理解这一术语。如果必要，可以对用于本发明的蛋白的特性(例如电荷特性)加以修饰。例如，在聚(L-赖氨酸)中的赖氨酸ε-氨基的甲氧基乙氧基乙酰化所产生的多肽阳离子电荷会减弱它与组织之间的非特异相互作用(Gasho，A.，等，Biol.Pharm.Bull.17：275-282)1994))。
本文所用“合成的”一词是指该缀合物不是天然存在的。
“缀合物”一词是指蛋白与表位连接在一起。
本文所用“异种天然抗体”一词包括：
(a)已存在于宿主中并能参与该宿主中的异种移植物排斥作用的抗体(这种抗体被认为与异种移植物超急性排斥有关。)和
(b)由于异种移植物在宿主中的出现而在该宿主中新合成的抗体(这种抗体有时被称为“异种反应激发的抗体”，并被视为与异种移植物急性排斥有关)。
本发明人业已发现，本发明的缀合物在结合异种天然抗体方面是高效的，而且在结合IgM方面特别有效。这一发现十分重要，因为IgM参与了排斥的初期阶段，而且通常被认为是这一过程中最重要的一类免疫球蛋白。因此，阻止IgM与表达在异种移植物上的表位的结合在预防或缓解排斥方面是一个重大进展。
由于在一个蛋白分子上可以结合大量的表位，相对于应用单个表位而言，为患者免疫系统呈递特定数量表位所需的总分子数量可明显减少。该缀合物可用于避免患者体内的渗透扰动或产生较少的渗透扰动(与游离的糖比较)，因为渗透性直接与溶液中分子的浓度相关。
理想的是，所述表位可结合于参与取自猪体内的异种移植物的排斥(例如，急性或超急性排斥)的人异种天然抗体上。
不过，所述表位也可结合于参与取自其它动物体内的异种移植物的排斥的人异种天然抗体上。因此，优选的表位通常不存在于成人中。随后将讨论可以使用的具体表位。
本发明包括一种通过给异种移植物受体服用所述缀合物来预防异种移植物排斥或至少减弱排斥的强度或速度的方法。(可以在植入异种移植物之前、之中和/或之后服用所述缀合物。最好是在植入之前服用，例如，在移植手术前24小时内服用。随后再服用加强剂量)。该缀合物可结合存在于受体内的异种天然抗体，因此，可以阻止这些抗体与存在于异种移植物上的表位结合。这种阻止作用可从受体的循环系统中除去很多游离的异种天然抗体，因而这些抗体不能通过与异种移植物上的表位结合而自由地激活补体。补体激活被认为是异种移植物超急性排斥的一个重要因素，因此，可用本发明的缀合物获得的阻止作用是一个重要方面。实际上，即使这种阻止作用是短暂的(例如，仅持续几天)，但在本领域中已经证实它仍是十分有效的，因为可能发生接纳异种移植物的现象。Rieben等提到过这一点(同上文)，其中，用ABO系统描述了一种类似情况。在任何情况下均可监测受体，并在必要时提供额外的本发明缀合物。
本发明缀合物可以作为耐受原，即作为可以减弱对随后的半抗原攻击的免疫原性的分子。因此，在植入猪异种移植物之前服用本发明缀合物，可以通过耐受性而抑制对移植物本身的抗体反应。当移植物已经植入后，可以服用该缀合体通过抑制作用(即减少抗半抗原抗体的产生)来抑制对移植物的抗体反应。
作为背景技术，可以参考Dintzis有关多价聚丙烯酰胺缀合物的著作(例如，Dintzis，R.Z.等，J.Immunol.131：2196-2203(1983))。已证实呈递多个半抗原基团的缀合物可以是免疫原性的(即：可刺激抗半抗原抗体产生)或抑制性的(在免疫原性缀合物存在的条件下减少抗半抗原抗体的产生)。该缀合物是免疫原性的还是抑制性的取决于缀合物大小和半抗原密度。如果在用免疫原性缀合物攻击之前服用一种抑制性缀合物可以降低免疫原性缀合物的免疫原性，则该抑制分子被称为耐受原性的。上述所有作用(免疫原性、抑制、和耐受原性)被认为是通过竞争B-细胞上的半抗原受体而实现的。耐受原性抑制分子被设计成即使在从周围环境中清除后仍能结合在B-细胞受体上。
用于本发明的缀合物可以任何适当技术给患者服用，但优选通过输注服用(滴注法)。剂量水平可由本领域技术人员确定，并要依据以下因素，如患者体重、异种移植物大小、缀合物中蛋白的大小、缀合物中表位的数量、表位的间距等。在不受任何理论约束的情况下，在实施例中所涉及到的B-三糖-HSA的典型剂量可以为在血清中的终浓度为0.1mg/ml～5mg/ml。这一剂量范围源于观察到的在体外完全抑制10μg/ml XNA IgM对内皮细胞的裂解的缀合物浓度(见图3，如下文所述)，这一浓度接近0.5mg/ml。10μg/ml表示XNA IgM在血清中的预期浓度。可以用类似的分析方法估计出本发明其它缀合物的剂量范围。可以用动物实验更精确地确定剂量水平。
如上所述，可以对患者进行监测，并在必要时服用额外剂量的缀合物。可以用以下技术进行监测：在体外测患者血清中的可溶性XNA抗体(主要为G和M型)的含量。首先将血清分成单一的免疫球蛋白类型。然后将其加至独立的用Galα1，3Galβ1，4GlcNAc-HSA涂敷的微滴定板孔中。然后用报导酶缀合的抗人IgG或IgM抗体检测结合的抗体。
本发明还可用于提供一种免疫吸附剂，其位于患者体外，并起到清除患者体内与异种移植物排斥有关的异种天然抗体的作用。最好将该免疫吸附剂固定，例如存在于柱中。因此，可将异种天然抗体从血液中清除，或至少降低其效价。这是有利的，因为可以用这种方法对移植患者自身的血液进行处理并回输到患者体内。该技术的另一个优点是可以提供获自供血者的血液储液，可将其包装供以后使用，并用于治疗移植患者。这种处理过的血液在本发明范围内。
本发明还提供了一种装置，其中，在一个具有一个入口和一个出口的室中至少装有一种本发明的缀合物。通过入口和出口让血液从该室中通过可以对其进行处理。
理想的是，所述缀合物的蛋白组分是一种人蛋白。本文所用“人蛋白”一词包括人体中存在的天然蛋白，以及具有相同或大致相似的生物学活性的蛋白或衍生物。这种蛋白可以天然生成或是人工合成(例如，化学合成或通过重组DNA技术合成)。
所述蛋白最好是一种血液成分。例如，它可以是血清白蛋白(天然或重组形式的)，或其它大致为惰性的天然或重组蛋白，在非缀合状态下，它是非抗原性的和非免疫原性的，而且不是人受体分子的配体。
该蛋白最好是可溶性的(而不是膜结合的)。
该蛋白可以通过任何适当技术与多个表位相结合以提供一种用于本发明的缀合物。最好将所述表位与该蛋白共价结合。可以用间隔分子进行这种结合。
可用于将3个原子的间隔分子引入其中的反应是在糖的丙烯酰衍生物与蛋白，如HSA之间的Michael加成反应(Boy等，J.Chem.Soc.Chem.Commun.1709-1711(1990))。该反应由3个主要步骤组成：
i.一种还原糖(例如B-三糖)的胺化：—在37℃下，在饱和碳酸氢铵中培养3天。
ii.丙烯酰化：—在一种甲醇-水溶剂中，在有Na2CO3的条件下用烯丙酰氯进行。
iii.充分冷冻干燥，并通过凝胶过滤和反相HPLC纯化衍生化的糖，然后在37℃下，在0.1M Na2CO3(pH10.0)中使其与HSA结合。反应产物为糖-NH-CO-CH2-CH2-NH-HSA。(可用相同的基础反应使糖与聚丙烯酰胺连接。)
另外，可以用一种方法将具有一个2碳烯丙基连接基的糖连接在一种蛋白上，该方法采用还原性臭氧物还原分解，然后用氰基硼氢钠进行还原性胺化(Bernstein，M.A.和Laurance，D.H.，Carbohydr.Res.78(1980))。
所述表位最好包括结合XNAs所需的最小配体作为最低结构，它是以α-构型连接的半乳糖。因此，所述表位优选为糖，最好为寡糖，或这些糖结构的模拟物。
所述表位最好是糖，尤其是寡糖。所述任何糖或寡糖的模拟物均属于本发明范畴。“模拟物”一词是指在结合抗体方面与糖或寡糖起着大至相同作用的任何结构。
在本领域中，这种模拟物是公知的。例如，Shikhman A.R.和Cunningham M.W.，(J.Immunol 152(9)：4375(1994))披露了细胞角蛋白肽的应用，它可以作为糖表位的模拟物抑制抗GlcNAc抗体；Vaughan等(Xenotransplantation 3：18-23(1996))披露了一种合成八肽(DAHWESWL)，它是表位Galα(1，3)Gal的模拟物；Koogman等披露了另一种肽(SSLRGF)，它也是表位Galα1，3Gal的模拟物。
该表位可以包括硫酸基团、唾液酸和α-半乳糖(或其模拟物)。
所述缀合物可以是新糖蛋白(一种非糖基化蛋白，在它上面结合有特定结构的糖)。Adler等披露了新糖蛋白(J Bio Chem，270：5164-5171(1995))，并将其用于检测糖-蛋白相互作用。这种蛋白可以通过酶催化反应生成(例如，用葡糖基转移酶或糖苷酶)或用化学合成方法合成。人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)的化学糖基化方法已十分成熟，如同B-三糖的化学合成一样成熟(Jacquinet等，JCS PerkinT：326-330(1981))。事实上，可从Dextra Laboratories Ltd.Reading，UK获得一系列合适的基于Galα1，3Gal的新糖蛋白。该公司生产HSA-缀合的Galα1，3Gal和HSA缀合的-Galα1，3Galβ1，4GlcNAc 。以上两种产品可作为3或14个原子的间隔分子获得。类似地，该公司生产4种基于BSA的新糖蛋白(HSA和BSA分别是指人血清白蛋白和牛血清白蛋白)。
当需要使用源于猪的异体移植物时，用于生产缀合物的优选表位包括两个半乳糖部分。两个半乳糖部分最好是由α1，3键连接。因此，Galα1，3Gal是用于本发明的优选表位。该表位可以作为较大的寡糖结构的一部分存在。例如，它可以是三糖的一部分：例如，Galα1，3Galβ1，4GlcNAc。可以使用的其它结构包括：
1)多极寡糖，它可以有多达4个Galα1，3Gal末端。这种寡糖可以方便地自天然来源，如牛或猪甲状腺球蛋白中纯化。
2)源于糖脂的α-半乳糖基化寡糖。
3)带有正常的末端结构的合成鞘糖脂。由此生成一种新鞘糖蛋白。
可以利用所述二糖Galα1，3Gal本身。
可以用其它表位取代上述表位。它们包括：具有α-连接于一个亚末端残基的末端半乳糖的寡糖，所述残基不一定是半乳糖。该α-键不一定是1，3键。其例子有：蜜二糖：Galα1，6Glc；棉子糖：Galα1，6(Fucα1，4)Glc和阿拉伯半乳聚糖。
当所用异种移植物源于除猪之外的其它动物时，可以用合适这种动物的表位来制备本发明的缀合物。在任何情况下，Galα1，3Gal都普遍在非灵长类哺乳动物和新域猴体内表达，而且很可能是源于多种哺乳动物的器官异种移植的一种主要表位。不过，就猪而言，也可以采用其它表位。另外，其它物种可能存在能与人XNAs反应的独特表位。正如Galα1，3Gal的情况一样，上述表位无一可由成人表达。
可用于本发明中的各种表位是下列清单中所列的糖类。(不过，也可以使用其它表位(例如，WO93/03735中所披露的异种抗原))。优选表位结构清单
(i)任何以Galα1，3Gal为末端的糖类(如上文所述)，包括血型B相关的寡糖，戊糖Galα1，3Galβ1，4GlcNAcβ1，3Galβ1，4Glc，Galα1，3Galβ1，3GalNAcβ1，4Galβ1，4Glc和血型I活性糖(Dabrowski，U.，等，J.Biol.Chem.259：7648-7651(1984))。
(ii)n-乙醇酰神经氨酸。这是一种在猪组织中但不在正常人体组织中表达的单糖；不过，在人体肿瘤中已提到过它(Fukui，Y.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.160：1149-1154(1989)。在这些方面，n-乙醇酰神经氨酸与Galα1，3Gal类似。
(iii)Galα1，XGal，其中X可以是2，4或6。有某些证据表明，某些XNAs能识别这些结构(Wieslander，J.，等，Glycoconjugate J.7：85-100(1990))。
(iv)血型A或A样物质。有证据表明这些结构是在猪心上表达(Cooper，D.等，Transpl.Immunol.1：198(1993))并在猪肾上表达(Jalali-Araghi，K.，和Macher，B.A.，Glycoconjugate J.11：266-271(1994))。实验结果如本文表1所示，抗-A抗体是在灵长类受体内由异种肾脏移植物诱发的：
过去的做法是输注A和B型糖来控制由血型不相容性所导致的病理学(Romano，E.L.等，Transplantation Proceedings 19：4475-4478(1987))。
(v)T-和T相关抗原。人类具有抗T抗原的显著抗体效价。(Thomsen Freidenreich抗原＝Galβ1，3GalNAc-)。尽管通常它不会导致象二糖一样的问题-至少在猪和人淋巴细胞膜中—是隐敝的，通常由非免疫原性神经氨酸加帽(Newman等，Eur.J.Biochem.64：373-380(1976))。有可能这种加帽不是所有猪异种移植物所带组织中全面进行的。另外，对异种移植物的遗传操作，例如，末端Galα1，3Gal的剥离，可以暴露出T-抗原。
人类也常有抗Tn抗原(GalNAc-O-Ser/Thr)的天然抗体，这种抗原通常是一种隐敝抗原，它可以由于组织未能添加一个重叠的半乳糖而产生(Thurnher等，J.Clin.Invest.91：2103-2110(1993))。
该T抗原可能是粘蛋白(O-连接的)寡糖的一种常见取代基。用于检测猪心异种移植物的灵长类受体血清中的抗-T抗体。
在有经过处理除去了α-半乳糖基和神经氨酸的大分子量猪胃粘蛋白存在的条件下，将IgG和IgM亚型与固定的内皮细胞一起培养(表2)。通过IB-4凝集素结合研究证实了咖啡豆α-半乳糖苷酶能除去α-半乳糖(资料未发表)。在初步实验中，我们发现了其残余活性，可能是由于T-抗原识别，始终占结合于固定内皮细胞的15-20％左右，并被局限于IgM型(与抗-Galα1，3Gal不同，它可以为IgG或IgM型)。
(vi)聚-N-乙酰乳糖胺和乳糖胺(-Galβ1，XGlc NAc-)n，其中n＝1或＞1，X可以是3或4。尽管上述结构是人寡糖的一般修饰形式，具有A-B-和B-样末端的修饰形式却是猪所特有的。这种寡糖不仅能结合天然抗体，它还可以作为乳糖胺结合内酰亚胺的目标(LBLs，(Feizi等，Biochemistry 33：6342-6349(1994))，它可以将炎性细胞吸引到异种移植物上。
(vii)3-硫酸半乳糖(SO4-3Galβ-)。以前它是作为一种潜在的异种抗原披露的(Samuelsson和Cairns，见Complex Carbohydrates inDrug Research，Alfred Benzon Symposium 36，368-379，Bock著，Clausen(1994))，因为它是作为一种隐敝抗原在正常人体组织中表达。
(viii)与Galα1，3Gal竞争结合异种天然抗体的肽表位。它可以是通过噬菌体演示技术确定的肽序列，或天然存在的序列。一种例子是猫骨骼肌快速肌球蛋白的序列，它可以结合单克隆抗galα1，3Gal单克隆抗体(Kirkeby，S.，Cell Tissue Res.283：85-92(1996))。
(ix)N-乙酰-β-D-葡糖胺(GlcNAc)。Cooper已证实了从猪心中洗脱的人抗体之中抗GlcNAc特异性(Cooper，D.，等，Transpl.Immunol.1：198(1993))。然而，众所周知的是，人血清中含有一种抗GlcNAc的天然抗体(Emmrich等，J.Exp.Med.161：547(1985))，它可以与角蛋白发生交叉反应(Shikhman和Cunningham，1994)。在后一份文献中，指出这种抗糖抗体仅能结合于带有最起码20个GlcNAc残基的BSA-缀合物上。白蛋白具有优于其它潜在“支架”的独特优点，其中，它大到足以带有大量的表位，但仍然是可溶性的。
在本发明的一种优选实施方案中，所述缀合物包括一个能被异种天然抗体结合的表位，以及一个结合于肝细胞的部分(最好具有高特异性)。该部分优选包括末端β-连接的半乳糖，因为这与存在于肝细胞上的肝蛋白/脱唾液酸糖蛋白结合(见Virgolini等，Nucl.Med.Commun.12：507-517(1991))。所述缀合物，及其所结合的异种天然抗体可由肝脏快速从循环系统中清除。
本发明的缀合物可以试剂盒形式提供，并任选地包括关于其在预防或减轻排斥方面应用的说明。
本发明缀合物通常以可以药用的组合物的无菌形式提供，它可以包括其它成分，例如，缓冲液、赋形剂等。
例如，所述缀合物可以存在于无菌盐水或盐水-葡萄糖中。
为便于服用，可将其制成单位剂量形式。它可以为适于注射或输注到人体中的形式。
该缀合物可用于生产用于预防异种移植物(例如，不合谐的异种移植物)排斥或至少减弱排斥的速度或强度的药品。最好将该药品用于预防人类受体所产生的异种移植物排斥。
应当注意，尽管上文已主要结合异种移植对本发明的缀合物进行了说明，但它们还有其它用途。例如，可将其用于治疗与异种抗原(例如Galα1，3Gal)相关的疾病。本文所用“治疗”一词包括预防治疗和已患有特定疾病的患者的治疗。
有几种人类疾病涉及抗Galα1，3Gal抗体对Galα1，3Gal的识别，例如，Chagas病和利什曼病(Avila等，J.Immunol.142：2828-2834(1989))及自发性(ideopathic)骨髓纤维化(Leoni等，BritishJ.Haematology 85：313-319(1993))。Towbin等(J.Exp.Med.166：419-432(1987))报导，一种天然的蛋白连接的缀合物Galα1，3Gal-小鼠层粘连蛋白是利什曼病病人血清及正常人血清中产生的抗Galα1，3Gal抗体的极好抑制剂。因此，本发明可有效应用于治疗Chagas病、利什曼病和自发性骨髓纤维化。
下面将结合附表和附图仅以举例形式对本发明进行说明；其中：表1表示移植前(pre-Tx)、移植后(post-Tx)血清的全IgM级分对人A+和B+红细胞(0.3％)的凝集作用。
从猪心异种移植物(W544、W141、和W135)或猪肾异种移植物(T381和V337)的灵长类受体中收集血清。对其进行大小分级，以产生主要含有IgG或IgM的库。用人O红细胞预吸附IgM级分，以消除对表位而不是A-或B-物质的反应性。然后将IgM与人A1或B红细胞混合，使其相对原始血清的最终稀释比例为1∶40。括号中的数字表示手术至采集血清之间的间隔天数。“前”是在异种移植手术之前采集血清。室温下2小时之后，检查红细胞的凝集迹象。第二和第三栏的值表示可导致所述红细胞完全凝集的IgM的最低稀释率(相对纯血清而言)。作为对照，同样用单克隆抗A-或B型抗体攻击人A1和B红细胞。表2表示猪胃粘蛋白的脱半乳糖基-，脱唾液酸-高分子量级分对抗体与固定的猪主动脉内皮细胞结合的抑制。
将来自血清样品的IgG和IgM级分与由HSA或脱唾液酰化α-半乳糖苷酶处理过的猪胃粘蛋白(高分子量级分)混合，以使抗体相对血清的最终稀释倍数为1∶12，抑制剂的终浓度为100μg/ml。′W544′和′W141′是表达hDAF的猪心异种移植物的两个猕猴(cynomolgusmonkey)受体。数字表示移植后天数。′前′表示移植前样品。在4℃下放置2小时后，将该混合物加入涂有固定的猪主动脉内皮细胞的孔中。在室温下培养2小时后，用由过氧化物酶缀合的抗人IgM或IgG检测结合的抗体。表2表示在存在粘蛋白的条件下，与存在HSA的条件相比免疫球蛋白结合的百分比变化。由可溶性糖和糖缀合物抑制XNA IgM与B-三糖-HSA的结合图1与缀合物的竞争结合抑制试验的结果，以及用游离寡糖进行这种试验的结果，该缀合物可用于本发明中。
该图表示，就摩尔数的比较而言，在结合XNA IgM方面，B-三糖-HSA大约比游离B-三糖好2个数量级，即使将呈递的表位总数考虑在内也是如此。一种假说是，表位在所述蛋白上的排列使得免疫球蛋白的几个臂可以同时进行结合，提高了该免疫球蛋白的亲和力。另外，该蛋白支架可抑制所述糖表位的自由运动，增强其抗原性。这些特性并非由所有缀合物自动分享(如在WO93/03735中所述的缀合物)，但采用一种蛋白骨架对于它们来说均有明显优点。对正常猪内皮细胞(PAE 68#3)的两步铬释放试验，包括首先与亲和分离的IgM或IgG的系列稀释液进行培养，然后与1/8幼兔补体进行培养。图2表示对正常猪主动脉内皮细胞(本文命名为PAE-68#3)的两步铬释放试验结果，包括首先与亲合分离的IgM或IgG的系列稀释液进行培养，然后与1/8幼兔补体进行培养。
铬释放量反映了由XNA结合引起的补体介导的裂解程度。对正常猪内皮细胞(PAE-68#4)的两步铬释放试验，包括首先在有4种不同的糖的条件下与亲和分离的人IgM(10μ/ml)进行培养，然后与1/8幼兔补体进行培养。图3表示对正常猪内皮细胞(PAE-68#4)的两步铬释放试验的结果，包括首先在有3种不同的糖或HSA-B-三糖糖缀合物的条件下与亲和分离的人IgM(10μg/ml)或IgG(80μg/ml)进行培养，然后与1/8幼兔补体进行培养。通过与B-三糖-HSA(HSA-3)预培养来抑制收集到的人血清中的IgG或IgM与固定PAEC的结合图4表示竞争结合抑制试验的结果，其中，在与微量滴定板孔中的培养的猪主动脉内皮细胞的固定单层培养之前，将人血清的全IgM和IgG级分与各种浓度的B-三糖-HSA混合。
第二步，加入1/200过氧化物酶缀合的抗人IgM和IgG抗体(Sigma)。测定结合的过氧化物酶(纵轴)，并用简单方式建立它与结合于猪细胞的血清抗体量的关系。在有缀合物的条件下，免疫球蛋白结合降低显示出Galα1，3Gal在移植前IgM和IgG对猪组织结合的重要性。
应当指出，IgG和IgM的大部分结合是通过Galα1，3Gal识别，但缀合物的效果优于IgG。可能的情况是，只需对结合有部分抑制就足以显著降低所述抗体的细胞毒性作用。W544：移植后AAG IgG图5表示在移植了猪心(进行过遗传修饰以克服超急性排斥)后灵长类(W544，一种猕猴，它接受了转基因(表达人DAF)猪心异种移植物，按照一种低环磷酰胺(免疫抑制剂)方法进行)血清中抗-αGal抗体的变化。
最初通过凝胶过滤层析分离IgM和IgG，并通过一种ELISA方法用B-三糖-HSA作为靶测定IgG库中的抗-αGal组分。直方图表示在异种移植物排斥之前不久受体血清中抗-αGal IgG浓度增加。还示出了通过补体依赖型猪红细胞裂解试验测出的泛化抗猪抗体效价。在有B-三糖-HSA的条件下抑制异种移植后IgG与PAEC的结合图6表示在受体异种移植后免疫球蛋白与猪细胞的结合中Galα1，3Gal识别的重要性。
将图5中所述获自受体的异种移植后血清在有HSA或B-三糖-HSA(0.2mg/ml)的条件下加入固定的主动脉内皮细胞系中。B-三糖-HSA的插入具有抗在排斥前自血清中采集的异种移植前IgG和IgM的最大作用。因此，尽管可通过ELISA测得抗-αGal抗体的连续存在，但在有猪细胞的条件下该缀合物的竞争强度是可变的，并可能与所诱发抗体的亲和性变化相关。令人兴奋的是，在这种情况下，在排斥之前的抗-αGal IgG峰对与缀合物的竞争较为敏感。用亲和纯化的IgM进行PAEC的相对染色图7表示B-三糖-HSA、其它天然α-半乳糖基化糖蛋白和XNAIgM靶异种抗原的抑制效果的对比。
将从人血清中获得的亲和纯化的抗-Galα1，3Gal IgM加入固定的猪主动脉内皮细胞(PAEC)中，在此之前，所述细胞用HSA、B-三糖-HSA、鼠EHS层粘连蛋白、牛甲状腺球蛋白或猪血小板异种抗原进行预培养。水平轴表示用辣根过氧化物酶缀合的人抗IgM抗体测出的与PAEC结合的XNAIgM量。
                   实施例
通过在甲状腺球蛋白Sepharose上进行亲和层析从500ml人血清中纯化XNA。甲状腺球蛋白是一种富含α-半乳糖的糖蛋白。在第二步中通过凝胶过滤分离IgG和IgM亚型(这一过程是基于大小进行分离)。
检验所选择的游离和缀合糖抑制XNA IgM与α1，3-半乳糖基化糖蛋白(本文中称之为“B-三糖-HSA”。它是一种包括通过3个原子的间隔分子与人血清白蛋白连接的多个Galα1，3Galβ1，4GlcNAc部分(即B-三糖)的结构，并可购自Dextra Laboratories Ltd，Reading，UK，产品编号NGP 2334)(图1)。最为惊人的结果是，B-三糖-HSA对IgM结合的抑制比未缀合的Galα1，3Galβ1，4GlcNAc(在图1和图3中称之为B-三糖)强百倍。这些图形也涉及“B-二糖”，那就是Galα1，3Gal。在某些场合，它与一个间隔臂一起使用。该间隔臂为OCH2CH2CH2NH2。图1表示B-二糖-PAA。如Rieben等在Xenotransplantation 2：98-106(1995)中所述，它是聚丙烯酰胺与多个Galα1，3Gal表位和聚丙烯酰胺的缀合物。每一个二糖表位通过一个组成为CH2CH2CH2O的间隔分子与聚丙烯酰胺上的CONH部分连接。这种产品可从Syntesome GmbH购买并用于与B-三糖-HSA进行比较。采用10％摩尔的取代形式。
通过两步51铬释放试验测定亲和分离的人IgG和IgM触发猪内皮细胞裂解的能力。简单地讲，在96孔平板上将正常猪内皮细胞生长至铺满，然后洗涤并用51铬标记。除去过量的标记物，并将细胞暴露于不同浓度的XNA。除去未结合的抗体，并加入1/8幼兔补体，在37℃下培养1小时。细胞裂解以占与内皮细胞相关的总数的百分比表示，可以在与补体一起培养细胞之后在培养基中测出细胞数。
结合于内皮细胞的两种免疫球蛋白，通过其固定作用和随后幼兔补体的激活作用导致细胞裂解。在对照实验中，抗体或幼免补体单独不能导致细胞的特异性裂解(图2)。将IgG级分稀释到12.5μg/ml，而IgM的值为0.47μg/ml。要实现50％的裂解，二者有10倍的差异，IgG约为0.32μg/ml，而IgM为3.2μg/ml。
然后用各种糖抑制结合于猪内皮细胞(以致细胞裂解)的抗体。如上文所述，在有不同浓度的4种不同糖制剂的条件下将亲和分离的IgM(10μg/ml)或IgG(80μg/ml)与内皮细胞一起培养。然后如上文所述洗涤细胞并暴露于幼兔补体。
有任一种免疫球蛋白的条件下细胞裂解以致抗体结合的最有效的抑制剂是B-三糖-HSA缀合物(图3)。作为XNA IgM结合的抑制剂，在有IgM的条件下它比非缀合的B-三糖的效果强10倍，而后者又比B-二糖(即Galα1，3Gal)的效果好。对于IgG的效果不那么突出，但仍然显著。对于IgG结合来说，B-三糖与B-二糖之间的差异很小，但在其抑制作用方面，对于IgG的抑制比对于IgM的抑制强。作为非特异性的糖的葡萄糖，即使在浓度为10mM时对于IgG或IgM结合也无抑制作用。
所用的B-三糖-HSA缀合物是因体外使用人XNA所引起的猪细胞降解的极为有效的抑制剂。
这种化合物可以延长猪-人异种移植的寿命，而且，由于在保护时仅需很少量的分子(与游离的α-半乳糖基化糖相比)，可以降低受体的渗透干扰。
支持本发明的进一步数据示于表1和2以及图4-7中。这些资料在上文已作过探讨。所用缩略语表BSA：牛血清白蛋白HSA：人血清白蛋白Glc：葡萄糖GlcNAc：N-乙酰葡糖胺GalNAc：N-乙酰半乳糖胺Gal：半乳糖XNA：异种天然抗体IgG：G型免疫球蛋白IgM：M型免疫球蛋白B三糖-HSA：与人血清白蛋白缀合的多个Galα1，3Galβ1，4GlcNAc表位DME：Dulbecoo’s改性的Eagle′s培养基
                    表1
抗体源     抗-A     抗-B
抗-A mAb     1∶800     ＜1∶50
抗-B mAb     ＜1∶50     1∶1600
544 pre-Tx     ＜1∶40     ＜1∶40
W544 Tx+17天     ＜1∶40     ＜1∶40
W544 Tx+24天     ＜1∶40     ＜1∶40
W544 Tx+27天     ＜1∶40     ＜1∶40
W544 Tx+34天     ＜1∶40     ＜1∶40
W141 pre-Tx     ＜1∶40     ＜1∶40
W141 Tx+21天     ＜1∶40     ＜1∶40
W141 Tx+29天     ＜1∶40     ＜1∶40
W135 Pre-Tx     ＜1∶40     ＜1∶40
W135 Tx+34天     ＜1∶40     ＜1∶40
W135 Tx+36天     ＜1∶40     ＜1∶40
W135 Tx+37天     ＜1∶40     ＜1∶40
T381 Pre-Tx     1∶320     ＜1∶40
T381+2天     ＜1∶40     ＜1∶40
T381+5天     1∶320     ＜1∶40
T381+8天     1∶320     ＜1∶40
V337 Pre-Tx     ＜1∶40     ＜1∶40
V337+1天     1∶320     ＜1∶40
V337+4天     ＜1∶40     ＜1∶40
V337+7天     ＜1∶40     ＜1∶40
表2
     样品   IgG结合的降低(％)  IgM结合的降低(％)
  W544-前        14.5      17.4
  W544-13天        0      14.9
  W544-20天        0      12.5
  W141-4天        0      20.2

Claims (22)

1.一种用于药品的、一种蛋白与多个表位的合成缀合物，其中，所述表位能够结合于异种天然抗体。
2.如权利要求1的用于药品的缀合物，其中，所述蛋白存在于人体时不会产生不利的免疫反应。
3.如权利要求1或2的用于药品的缀合物，其中，所述蛋白是一种人蛋白或其官能性等同物。
4.如上述权利要求中任一项的缀合物，其中，所述蛋白是存在于血液中的一种蛋白。
5.如上述权利要求中任一项的用于药品的缀合物，其中，所述蛋白是血清白蛋白。
6.如上述权利要求中任一项的用于药品的缀合物，其中，所述表位选自一种寡糖或其模拟物，包括一种α-构象的末端半乳糖，并且它任选地通过一个间隔分子连接于所述蛋白上。
7.如上述权利要求中任一项的用于药品的缀合物，它具有多个表位，包括α-连接的半乳糖。
8.如权利要求7的用于药品的缀合物，它具有多个表位，包括Galα1，3Gal。
9.如上述权利要求中任一项的用于药品的缀合物，它还包括一个结合于肝细胞的部分。
10.如权利要求9的用于药品的缀合物，其中所述结合于肝细胞的部分包括一个β-连接的半乳糖。
11.一种用于预防异种移植物排斥或至少减轻排斥的强度或速度的方法，包括给患者服用上述任一项权利要求所述的缀合物。
12.一种用于治疗涉及能够结合异种天然抗体的表位的疾病(例如，Chagas病、利什曼病或自发性骨髓纤维化)的方法，包括给患者服用权利要求1-10中任一项所述的缀合物。
13.一种用于对获自血液供体的血液进行处理以减少其所含异种天然抗体数量的方法，包括让血液流经权利要求1-10中任一项所述的缀合物。
14.如权利要求13的方法，其中，所述缀合物是固定化的。
15.适用于权利要求13或14的方法的装置，它包括一种免疫吸附剂，一个缀合物保留于其中的室，和一个流体入口及出口，所述吸附剂包括至少一种如权利要求1-10中任一项的缀合物。
16.按权利要求13或14所述方法处理过的血液。
17.一种可以药用的组合物，包括权利要求1-10中任一项所述的缀合物。
18.如权利要求17的可以药用的组合物，适用于注射或输注。
19.一种试剂盒，包括权利要求1-10中任一项的缀合物，权利要求16的血液，权利要求17或18的可以药用的组合物，或权利要求15的装置；任选包括用于：
a)预防异种移植物排斥或至少减弱排斥的速度或强度；或
b)治疗涉及一种能够与一种异种天然抗体结合的表位的疾病(例如，Chagas病、利什曼病或自发性骨髓纤维化)
的说明。
20.将权利要求1-10中任一项的缀合物用于制备预防异种移植物排斥或至少减弱排斥的强度或速度用的药品的用途。
21.将权利要求1-10中任一项的缀合物用于制备用于治疗涉及一种能够与异种天然抗体结合的表位的疾病(例如，Chagas病、利什曼病或自发性骨髓纤维化)的药品的用途。
22.大致如上文结合所附实施例所述的本发明。
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