KR20070004026A - 선택적 스플라이싱을 이용하여 진핵 세포에서 폴리펩티드다량체를 발현하기 위한 방법 및 구축물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단일 발현 벡터를 사용하여 진핵 세포에서 다중 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 발현 벡터는 원하는 비로 2개 이상의 독립적 유전자 산물로서 선택적으로 스플라이싱하고 발현하도록 하는 스플라이스 부위를 갖는 2개 이상의 발현 카세트를 포함하도록 단일 프로모터의 조절 하에 공학처리된다. 진핵 숙주 세포에서의 재조합 항체의 효율적 발현을 위한 벡터의 용도, 및 그러한 항체의 진단적 및 치료적 적용에서의 용도가 개시되어 있다.

선택적 스플라이싱, 진핵 세포, 폴리펩티드 다량체

Description

선택적 스플라이싱을 이용하여 진핵 세포에서 폴리펩티드 다량체를 발현하기 위한 방법 및 구축물{METHODS AND CONSTRUCTS FOR EXPRESSING POLYPEPTIDE MULTIMERS IN EUKARYOTIC CELLS USING ALTERNATIVE SPLICING}

본원에 개시된 본 발명의 특정 실시양태들은 선택적 스플라이싱을 이용하여, 생체외 및 생체내 모두의 진핵 세포에서 폴리펩티드 다량체를 발현하기 위한 벡터 및 방법에 관한 것이다. 이 벡터를 포함하는 세포의 생산 방법, 및 질병의 치료 및 그러한 다량체형 단백질의 효율적 생체내 또는 생체외 생산을 위한, 상기 벡터 및 그것으로부터 발현된 폴리펩티드의 용도가 포함된다.

폴리펩티드 다량체는 함께 착체를 형성하는 2개 이상의 폴리펩티드의 조합체이다. 착체를 구성하는 폴리펩티드는 주로 상이하다. 항체는 함께 4량체형 착체를 형성하는 2개의 항체 경쇄 폴리펩티드 및 2개의 항체 중쇄 폴리펩티드로 이루어진다는 점에서 전형적인 폴리펩티드 다량체이다.

숙주 세포에서의 폴리펩티드 다량체의 발현은 폴리펩티드 다량체를 구성하는 각기 상이한 폴리펩티드의 발현을 주의하여 조정해야 한다는 점에서 도전적 공정이다. 예를 들어, 진핵 세포에서 항체를 발현하기 위해, 항체 경쇄를 코딩하는 제1 유전자 및 항체 중쇄를 코딩하는 제2 유전자가 세포에 도입되어, 허용가능한 비의 범위 내에서 발현되어야 한다. 동일 세포 또는 배양 시스템에서의 항체 중쇄에 대한 경쇄의 허용가능하지 않은 비의 발현은 원하는 다량체형 착체의 비효율적 생산, 또는 세포 또는 유기체 독성을 초래할 수 있다.

진핵 세포에서 폴리펩티드 다량체를 발현하기 위한 과거 방법들은 폴리펩티드 다량체를 구성하는 각각의 상이한 폴리펩티드를 분리하여 코딩하는 2개 이상의 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 각 벡터는 전형적으로 착체의 하나의 폴리펩티드의 발현을 주도하는 프로모터를 담지하고, 하나 이상의 벡터는 전형적으로 선택 마커를 코딩한다. 벡터는 이어서, 일련으로 또는 함께 세포에 (통상 트랜스펙션에 의해) 도입되고, 세포는 양 선택 마커 모두의 발현을 위해 동시 선택된다.

다른 한 방법에서, 폴리펩티드 착체를 구성하는 각 폴리펩티드를 위한 프로모터와 함께 코딩 서열은 단일 벡터로 공학처리된다. 이 방법은 다중 벡터를 이용한 작업의 필요를 없애나, 여전히 각 코딩 서열 간의 프로모터 경쟁에 대한 가능성을 없애지는 않는다. 또한, 이 방법은 전형적으로, 단백질 다량체가 효율적으로 발현되도록 하는 허용가능한 비로 단백질 다량체를 포함하는 개별 폴리펩티드를 발현하는 과제를 해결할 수 없다.

따라서, 상기 방법들 중 어느 방법에서도, 2개 산물의 일정 비가 항상 숙주 세포에서 수득되는 것이 아닐 수 있다. 이는 차별적 프로모터 활성, 최적 발현에 요구되는 세포 인자들을 위한 프로모터 경쟁, 단백질 다량체 성분 폴리펩티드의 전사 및/또는 번역의 효율성, 및/또는 세포에 도입된 각각의 벡터의 복제수의 차이와 같은 인자들에 기인할 수 있다.

단일 스플라이스 도너 및 스플라이스 어셉터를 이용하는 스플라이싱 벡터도 또한 개발되었다. U.S. 특허 No. 5,043,270은 선택가능한 마커, 예컨대 DHFR를 발현하는 미니유전자를 개시하고, 관심 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 인트론을 가진다. U.S. 특허 No. 5,561,053은 관심 단백질을 코딩하는 서열이 코딩 서열에 대해 5'에 있는 인트론을 포함하는 역 상황을 개시한다. 이 인트론은 스플라이스 도너 및 어셉터에 의해 결합된 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자를 포함한다. 이 유형의 인트론형 발현 벡터는 [Lukas, B. K. 등, Nucleic Acids Res. 24:1774-1779(1996)]에 또한 기재되어 있다. U.S. 특허 출원 공개 No. 2005/0019925 A1은 융합 선택가능한 마커를 갖는 유사한 인트론형 벡터를 개시한다. 그것은 또한 1개 초과의 관심 단백질의 발현을 위한 두 쌍의 스플라이스 도너 및 스플라이스 어셉터의 용도를 개시한다. 그러나 이 모든 공개된 구축물들 모두는 스플라이스 도너 및 스플라이스 어셉터의 쌍에 의존하며, 즉 하나의 스플라이스 도너가 단일 스플라이스 어셉터에 매칭되어 있다. 각각의 이 구축물들은 유효성을 위해 모든 부위들에서 매우 효율적인 스플라이싱에 의존한다. 다중 폴리펩티드를 발현하기 위해 1개 초과의 스플라이스 어셉터로부터 선택적 스플라이싱을 활성화하기 위해 단일 스플라이스 도너를 사용하는 것에 대한 언급은 없다. 또한, 상이한 비로 폴리펩티드를 발현하는 것이 바람직하다는 것, 또는 상이한 스플라이싱 어셉터를 치환하여 폴리펩티드의 상대적 발현을 조절하는 것은 제시되어 있지 않다.

따라서, 수득되는 유전자 산물이 효율적으로 생산되고 조립되도록, 일정한 비로 2개 이상의 유전자들의 발현을 연결하는 구축물에 대한 필요성이 존재한다.

발명의 개요

본 발명은 선택적 스플라이싱의 사용을 통해 2개 이상의 유전자의 발현을 연결함으로써 하나의 발현 벡터를 이용하여, 숙주 세포에서 폴리펩티드 다량체를 발현하는 상기 과제를 해결한다. 따라서, 하나의 프로모터를 갖는 단일 벡터를 사용하여, 2개 이상의 상이한 mRNA 전사체로 스플라이싱될 수 있는 프리-mRNA의 발현을 주도함으로써, 2개 이상의 mRNA 전사체가 상이한 폴리펩티드를 코딩하도록 할 수 있다. 따라서, 2개 이상의 산물의 상대적 발현은 독립적 프로모터의 차별적 활성, 프로모터 경쟁, 또는 벡터 복제수에 의해 영향을 받지 않는다.

특히, 본 발명은 단일 프로모터를 이용하여 단일 발현 벡터를 진핵 세포에 도입하여, 후에 2개 이상의 상이한 폴리펩티드로 번역될 수 있는 2개 이상의 상이한 유전자 산물로 선택적으로 스플라이싱되는 단일 프리-mRNA의 전사를 주도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 유전자 산물은 다량체형 단백질의 폴리펩티드 서브유니트를 코딩한다. 다른 한 실시양태에서, 유전자 산물은 항체를 포함하는 항체 경쇄 및 중쇄이다.

따라서, 본 발명은 하기의 것들을 비제한적으로 포함하는 수가지 이점들을 가진다:

- 다중 폴리펩티드, 특히 이가동의(heteromeric) 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 발현하기 위한 벡터를 제공함;

- 진핵 세포, 예컨대 동물 세포 또는 효모 세포에서 다중 폴리펩티드, 예를 들어 항체 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 생산하는 효율적 방법;

- 진단적 또는 치료적 용도에 사용하기 위한 재조합 항체를 생산하는 효율적 방법; 및

- 재조합 항체 치료가 필요한 대상을 치료하기 위한, 상기 방법에 의해 생산된 재조합 항체.

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 5'에서 3'으로 또는 하향류(downstream) 방향으로의 프로모터, 예컨대 CMV 프로모터; 예컨대 캡핑 신호를 제공하는 5' 비번역 영역(UTR); 스플라이스 도너; 인트론; 제1 스플라이스 어셉터; 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 엑손; 제2 스플라이스 어셉터; 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 엑손(여기에서, 프로모터가 제1 및 제2 엑손에 작용적으로 연결됨)을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 스플라이스 부위(즉, 도너 및 어셉터)는 자연 발생 스플라이스 부위, 공학처리된 스플라이스 부위, 예를 들어 합성 스플라이스 부위, 정규 또는 일치 스플라이스 부위, 또는 비정규 스플라이스 부위, 예컨대 은폐 스플라이스 부위일 수 있다. 각 엑손은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함할 수 있다.

여기에서, 유전적 소자, 예컨대 엑손, 인트론, 임의의 스플라이스 부위 등에 적용되는 용어 "제1" 또는 "제2"는 단지 상호로부터 각종 요소를 확인하고 구별하기 위해 사용되며, 유전자 내의 요소들의 사실상의 선형 배치 또는 넘버링, 또는 단백질 다량체의 분리된 폴리펩티드 성분을 코딩하는 프리-mRNA 분자가 발현되는 순서를 가리키지 않는다.

다른 한 실시양태에서, 벡터는 하나의 스플라이스 도너 및 1개 초과의 스플 라이스 어셉터, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 스플라이스 어셉터를 포함한다. 각 스플라이스 어셉터는 스플라이스 어셉터의 바로 하향류에 위치한 엑손과 연합된다. 그러므로, 벡터는 1개 초과의 엑손, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 엑손을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 항체의 중쇄이고 제2 폴리펩티드는 항체의 경쇄이거나, 대안적으로 제1 폴리펩티드는 항체의 경쇄이고 제2 폴리펩티드는 항체의 중쇄이다.

한 관련된 실시양태에서, 경쇄 및/또는 중쇄는 설치류, 키메라, 인간화 또는 인간의 것이다. 경쇄 또는 중쇄는 아미노산 변경, 예컨대 글리코실화 부위, 예컨대 Fc 영역 내의 글리코실화 부위의 도입 또는 절제를 포함할 수 있다.

다른 한 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 약 20:1 내지 약 1:20, 약 15:1 내지 약 1:15, 약 12:1 내지 약 1:12, 약 10:1 내지 약 1:10, 약 9:1 내지 약 1:9, 약 8:1 내지 약 1:8, 약 7:1 내지 약 1:7, 약 6:1 내지 약 1:6, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 3:1 내지 약 1:3, 약 2:1 내지 약 1:2, 또는 약 1:1의 비로 발현된다. 특별한 실시양태들에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 약 20:1, 약 19:1, 약 18:1, 약 17:1, 약 16:1, 약 15:1, 약 14:1, 약 13:1, 약 12:1, 약 11:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6:1, 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9, 약 1:10, 약 1:11, 약 1:12, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15, 약 1:16, 약 1:17, 약 1:18, 약 1:19 및/또는 약 1:20의 비로 발현된다. 비의 결정은 전형적으로 역전사 효소 폴리머라제 사슬 반응(RT-PCR) 또는 (전사체의 상대적 양을 측정하기 위한) 노던 블로트, 또는 (폴리펩티드의 상대적 양을 측정하기 위한) 면역블로트 또는 효소 연결 면역흡수검정(ELISA) 기법을 이용하여 결정된다.

한 실시양태에서, 벡터는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28을 포함한다.

한 관련 실시양태에서, 벡터는 서열번호 29를 포함한다.

다른 한 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 선택적으로 스플라이싱된 유전자 산물을 발현할 수 있는 상기 벡터를 포함하는 진핵 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터는 세포의 염색체 DNA에 통합되고, 또 다른 한 실시양태에서, 벡터는 염색체외이다. 관련 실시양태들에서, 본 발명 선택적 스플라이싱 카세트 또는 구축물은 세포의 염색체 DNA에 통합된다. 다른 한 관련 실시양태에서, 본 발명의 선택적 스플라이싱 카세트 또는 구축물은 염색체외이다. 또 다른 관련 실시양태들에서, 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터는 바이러스성 벡터를 포함한다.

다른 한 실시양태에서, 본 발명의 벡터를 포함하는 진핵 세포는 포유동물 세포, 예컨대 예를 들어, 베이비 햄스터 신장 세포, 섬유아세포, 골수종 세포, NS0 세포, PER.C6 세포, 또는 CHO 세포, 또는 대안적으로 곤충 세포, 예컨대 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다 ( Spodoptera frugiperda )(Sf9) 세포, 트리코플루시아 니( Tricoplusia ni(Tn. TnHigh-Five) 세포, 또는 누에(Bombyx mori)(BMN) 세포이 다. 대안적으로, 본 발명의 벡터를 포함하는 진핵 세포는 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스(Saccharomyces) 세포, 시조사카로마이세스 ( Schizosaccharomyces ) 세포, 또는 피치아(Pichia) 세포이다.

다른 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 포함하는 상기 세포를 배양한 후, 세포 배양물로부터 제1 및 제2 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다.

방법의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 폴리펩티드 다량체, 예컨대 항체를 형성한다.

다른 한 실시양태에서, 본 발명은 질병 또는 장애의 치료 또는 예방용 의약품을 제조하기 위한, 상기 방법에 의해 생산된 상기 펩티드 다량체를 제공한다.

다른 한 실시양태에서, 본 발명은 생체내 환자에 대한 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 선택적 스플라이싱 카세트 또는 구축물의 전달을 제공한다.

다른 한 실시양태에서, 본 발명은 체외 환자의 세포 또는 조직으로의 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 선택적 스플라이싱 카세트 또는 구축물의 전달을 제공한다. 관련 실시양태들에서, 본 발명은 또한 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 선택적 스플라이싱 카세트 또는 구축물을 포함하는 환자의 세포 또는 조직을 환자의 신체에 복귀시키는 것도 또한 제공한다.

본 발명의 다른 특성 및 이점들은 하기 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 당업자에게 명백해질 것이다.

도 1은 단일 프로모터가 후에 2개 이상의 전사체로 선택적으로 스플라이싱될 수 있는 단일 프리-mRNA의 전사를 주도하도록 설계된 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터의 구조적 및 기능적 측면들의 개략을 나타낸다. 이어서, 2개 이상의 전사체는 2개 이상의 상응 폴리펩티드로 번역된다.

도 2는 후에 성숙 사량체형 항체를 형성하도록 조립되는 항체 경쇄 및 중쇄를 발현하도록 사용될 때의 본 발명의 발현 벡터의 개략을 나타낸다.

도 3은 단일 프로모터로부터 항체 경쇄 및 중쇄를 발현하여 진핵 세포에서 항체를 생산하도록 설계된 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터의 플라스미드 지도이다. 플라스미드 지도는 또한 진핵 세포(DHFR)에서의 스플라이스 부위, 클로닝 부위, 폴리아데닐화 서열, 및 선택 마커의 위치 및 배향, 및 원핵 세포(베타-락타마제)의 전파를 가리킨다. 또한, 벡터 골격의 서열을 제공하는 서열번호 29를 참고한다.

도 4는 피험 제1 스플라이스 어셉터, 인트론 및 엑손 영역(각기, 소문자 및 대문자)의 스플라이스 부위의 서열, 및 상응 플라스미드 표시 및 서열 확인자를 나타낸다.

발명의 상세한 설명 및 특허청구범위의 명료한 이해를 제공하기 위해, 이하 하기 정의들이 편리하게 제공된다.

정의

용어 "제1 폴리펩티드" 또는 "제2 폴리펩티드"는 동시 발현이 요망되는 폴리펩티드를 가리킨다. 이는 예를 들어 다중 폴리펩티드 서브유니트들로 이루어진 다량체형 단백질의 폴리펩티드 "사슬"을 포함한다. 이 다량체형 단백질은 자연에서 발견되는 것들, 예를 들어 당업계에 기재된 것들일 수 있다. 물론, 용어 "제1 폴리펩티드" 및 "제2 폴리펩티드"는 또한 당업계에 아직 기재되지 않은 다량체형 단백질을 기술하기 위해 향후 사용될 수 있다. 이 다량체형 단백질은 인공적일 수 있고, 예컨대 정상적으로 자연과 연관된 것으로 발견되지 않는 폴리펩티드로 이루어질 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 함께 연합하지 않을 수 있으나, 일부 기능적인 목적을 위해 동시 발현될 수 있는데, 예를 들어 선택가능한 마커와 관심 폴리펩티드가 동시 발현될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 고유(native) 서열이거나, 예컨대 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의해 변이된 것일 수 있다. 당업자는 넓은 범위의 폴리펩티드에 대한 본 발명의 벡터의 적합성을 용이하게 인식할 것이며, 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 이 폴리펩티드와 함께 사용하기 위해 벡터를 적합화할 수 있을 것이다.

용어 "항체" 또는 "항체 단편"은 표적 폴리펩티드 또는 수용체에 대한 결합 활성을 가지거나, 원하는 작용자 기능을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편의 조합체를 가리킨다. 전형적으로, 그러한 조합체는 적어도 항체 경쇄 및 중쇄의 가변 영역, 예를 들어 Fab 단편, 또는 2개의 항체 경쇄 및 2개의 항체 중쇄(이 4개 사슬은 함께 사량체형 항체(L:H:H:L)(이의 가변 영역은 항원에 결합할 수 있음)를 형성함)를 포함한다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 임의의 형태의 것일 수 있는데, 예를 들어 설치류, 키메라, 인간화, 인간 또는 합성의 것일 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 변형된 글리코실화 부위 또는 Fc 영역과 같은 다른 특성을 가지도록 변형될 수 있다.

용어 "UTR"은 비번역 영역을 의미하고, 프리-mRNA 및 성숙 mRNA의 비번역 영역으로 번역되는 핵산 서열의 세그먼트를 가리킨다. 5' UTR은 전형적으로 mRNA 전사체를 폴리펩티드로 번역하는 것을 개시하는 7-구아노, 7-메틸구아노신 캡으로 "캡핑"되거나 번형되는 전사체의 5' 말단으로 작용한다.

용어 "비로 발현된"은 전사체 또는 폴리펩티드로서 발현된 유전자 산물의 생성 비를 가리킨다. 비의 결정은 전형적으로 역전사효소 폴리머라제 사슬 반응(RT-PCR) 또는 (전사체의 상대적 양을 측정하기 위한) 노던 블로트, 또는 (폴리펩티드의 상대적 양을 측정하기 위한) 면역블로트 또는 효소 연결 면역흡수검정(ELISA) 기법을 이용하여 결정된다.

특정 실시양태들에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 약 20:1 내지 약 1:20, 약 15:1 내지 약 1:15, 약 12:1 내지 약 1:12, 약 10:1 내지 약 1:10, 약 9:1 내지 약 1:9, 약 8:1 내지 약 1:8, 약 7:1 내지 약 1:7, 약 6:1 내지 약 1:6, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 3:1 내지 약 1:3, 약 2:1 내지 약 1:2 또는 약 1:1의 비로 발현된다. 특별한 실시양태들에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 약 20:1, 약 19:1, 약 18:1, 약 17:1, 약 16:1, 약 15:1, 약 14:1, 약 13:1, 약 12:1, 약 11:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6:1, 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9, 약 1:10, 약 1:11, 약 1:12, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15, 약 1:16, 약 1:17, 약 1:18, 약 1:19및/또는 약 1:20의 비로 발현된다.

용어 "제1 엑손"은 코딩 서열, 즉 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역을 코딩하는 핵산의 서열을 가리키고, 용어 "제2 엑손"은 상이한 제2 코딩 서열, 즉 제2 폴리펩티드 영역을 코딩하는 핵산의 서열을 가리킨다. 본 발명의 제1 및 제2 엑손은 또한 5' 스플라이스 어셉터 서열을 포함한다.

용어 "숙주 세포" 또는 "진핵 숙주 세포"는 본 발명의 발현 시스템을 이용하여, 제1 및 제2 엑손의 유전자 산물을 생산하거나 발현하는 임의의 진핵 세포를 가리킨다. 이는 예를 들어 포유동물 세포, 예컨대 베이비 햄스터 신장 세포, 섬유아세포, 골수종 세포(예컨대, NS0 세포), 인간 PER.C6 세포, 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다. 발현에 유용한 곤충 세포는 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다(Sf9) 세포, 트리코플루시아 니(Tn. TnHigh-Five) 세포, 또는 누에(BMN) 세포를 포함한다. 발현에 유용한 세포 효모 세포는 예를 들어 사카로마이세스 세포, 시조사카로마이세스 세포, 또는 피치아 세포를 포함한다. 그러한 세포는 공중 및 상업용 원천, 예컨대 미국모식균주보존센터(American Type Culture Collection)(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 용이하게 입수가능하다.

용어 "인트론"은 프리-mRNA에서 번역되고 존재하나, 스플라이스 도너 및 스플라이스 어셉터(들)의 서열에 기초하는 스플라이싱 기작에 의해 절단됨으로써, 성숙 mRNA 전사체 내에 존재하지 않는 핵산 서열의 세그먼트를 가리킨다.

용어 "작용적으로 연결된"은 성분들이 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계로 있는(예컨대, 기능적으로 연결된) 병렬배치를 가리킨다.

용어 "폴리아데닐화 신호"는 효소 폴리아데닐 트랜스퍼라제의 존재 하에 있을 때, 전사체가 폴리아데닐화되도록 하는 RNA 전사체 내에 존재하는 핵산 서열을 가리킨다. 많은 폴리아데닐화 신호가 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에 유용하다. 예는 인간 변종 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 후 폴리아데닐화 신호 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다.

용어 "프로모터"는 전사, 바람직하게는 진핵 세포에서의 전사를 주도하기에 충분한 최소의 서열을 가리킨다. 본 발명에 사용하기 위한 프로모터는 예를 들어 높은 수준의 발현을 제공하는 바이러스, 포유동물, 곤충 및 효모 프로모터, 예컨대 포유동물 거대세포바이러스 또는 CMV 프로모터, SV40 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 적당한 당업계에 공지된 임의의 프로모터를 포함한다.

용어 "스플라이스 부위"는, 진핵 세포의 스플라이싱 기작에 의해 절단되고/되거나 상응하는 스플라이스 부위에 접합되기에 적당한 것으로 인식될 수 있는 특정 핵산 서열을 가리킨다. 스플라이스 부위는 프리-mRNA 전사체 내에 존재하는 인트론의 절제를 허용한다. 전형적으로, 스플라이스 부위의 5' 부분은 스플라이스 도너라고 칭해지고, 3' 상응 스플라이스 부위는 어셉터 스플라이스 부위로 칭해진다. 용어 스플라이스 부위는, 예를 들어 자연 발생 스플라이스 부위, 공학처리된 스플라이스 부위, 예를 들어 합성 스플라이스 부위, 정규 또는 일치 스플라이스 부위, 및/또는 비정규 스플라이스 부위, 예를 들어 은폐 스플라이스 부위를 포함한다.

용어 "~와의 스플라이스"는 스플라이스 도너가 스플라이스 어셉터와 상호작용하여, 스플라이싱 기작(예컨대, 스플라이오좀)에 의해 전사체의 스플라이싱을 허용하는 것을 가리킨다. 상술된 바와 같이, 스플라이싱은 스플라이스 도너 및 스플라이스 어셉터에 의해 결합된 전사체의 부분(인트론)의 절제이다. 각 전사체에 대해, 스플라이스 도너는 단지 하나의 스플라이스 어셉터와 스플라이싱한다. 선택적 스플라이싱에 대해, 전사체의 풀 내에서, 스플라이스 도너는 1개 초과의 스플라이스 어셉터와 스플라이싱한다. 예를 들어, 스플라이스 도너는 하나의 전사체에 대해 제1 스플라이스 어셉터와 스플라이싱할 수 있으나, 다른 한 전사체에서 스플라이스 도너는 제2 스플라이스 어셉터와 스플라이싱하여, 전사체의 불균질 풀을 생성시킬 수 있다.

용어 "스플라이싱된 전사체"는 제1 또는 제2 엑손을 포함하는 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터로부터 전사되고, 스플라이스 도너와 제1 또는 제2 스플라이스 어셉터 간에 스플라이싱을 겪는 RNA를 가리킨다.

용어 "벡터"는 숙주 세포 또는 숙주 세포 추출물에 도입될 때 유전자 산물이 발현되도록 할 수 있는 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 가리킨다. 이 용어는 "선택적 스플라이싱 벡터", "발현 벡터", "발현 카세트" 또는 "구축물"과 혼용될 수 있다. 그러한 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물은 본 발명의 선택적 스플라이싱 요소, 및 세포에서의 벡터의 전파, 세포로의 벡터의 도입, 및 후속 발현을 위한 부가적 서열, 선택가능한 마커, 또는 임의의 다른 기능적 요소를 포함할 수 있다. 그러한 요소는 당업계에 공지되어 있고, 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 필요에 따라 혼용될 수 있다.

용어 "바이러스성 벡터" 또는 그에 대한 변형태(예컨대, "아데노바이러스성 벡터")는 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 포함하는 감쇠 또는 복제 결핍 바이러스 입자를 가리킨다. 이하 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 그러한 바이러스성 벡터는 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 숙주 세포에 삽입하는데 유용하다.

[발명의 상세한 설명]

1. 총론

본 발명은 그 일부분으로서 2개 이상의 발현가능한 전사체로 선택적으로 스플라이싱되도록 공학처리된 2개 이상의 엑손의 발현을 주도하는 단일 프로모터를 포함하는 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 제공함으로써 진핵 세포에서 2개 이상의 유전자 산물을 발현하는 방법을 제공한다. 따라서, 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물은 2개 이상의 폴리펩티드, 특히 폴리펩티드 다량체, 예를 들어 전형적으로 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄 항체 폴리펩티드의 조립체인 항체(또는 항체 단편)를 발현하기에 적당하다.

또한, 본 발명의 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물은 단일 프로모터를 사용하여, 이후 2개 이상의 유전자 산물로 선택적으로 스플라이싱되는 프리-mRNA의 발현을 주도하기 때문에, 본 발명은 다중 벡터의 사용, 다중 프로모터의 사용으로부터의 프로모터 경쟁, 또는 독립적 프로모터로부터 차별적 활성을 피한다.

부가적으로, 본 발명은 다중 스플라이스 어셉터의 사용을 통해, 원하는 비로 진핵 세포에서의 다중 유전자의 발현을 제공하여, 예를 들어 폴리펩티드의 수득된 조립체, 예를 들어 사량체형 항체가 효율적으로 생산되도록 하는 이점을 가진다.

또한, 본 발명은 스플라이싱 요소, 특히 제1 스플라이스 어셉터의 서열을 변화시킴으로써 코딩된 폴리펩티드의 발현 비를 변형시키는 것을 제공한다. 발현된 폴리펩티드의 비의 변형능은 최적 양의 폴리펩티드를 제공함으로써 폴리펩티드의 더욱 효율적인 다량체화 또는 기타 기능적 측면을 허용한다. 따라서, 본 발명의 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물은 하나 이상의 원하는 단백질을 생산하기에 충분한 양으로 폴리펩티드가 발현되도록 한다.

따라서, 본 발명은 또한 선택적 스플라이싱을 이용한 폴리펩티드 다량체, 예컨대 항체의 발현에 적당한 벡터, 또한 벡터를 포함하는 세포, 및 그러한 세포로부터의 항체, 및 그것들의, 예를 들어 대상, 예를 들어 인간 환자에 있어 장애 또는 질병을 예후, 진단, 예방, 완화 또는 치료하기 위한 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 대상에게 직접적으로 벡터를 전달하거나, 또는 체외 기법을 통해, 생체내 폴리펩티드를 발현하기에 적당한 벡터를 제공한다.

2. 폴리펩티드 다량체를 발현하기 위한 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물 설계

본 발명의 방법은 (5'에서 3'으로, 또는 하향류 방향의) 프로모터; (코딩 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는) 5' 비번역(UTR) 영역; 단일 5' 스플라이스 도너; (산물의 원하는 비에 따라) 바람직하게 약 5 내지 95% 효율로 사용되는 3' 스플라이스 어셉터로 끝나는 인트론(예시적 3' 스플라이스 어셉터 효율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 및 95%을 비제한적으로 포함함); 제1 유전자 및 임의적으로, 폴리아데닐화 신호를 포함하는 엑손; 50% 초과의 효율을 갖는 3' 스플라이스 어셉터(바람직한 실시양태들에서, 3'스플라이스 어셉터는 75% 초과(예컨대, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)의 효율, 85% 초과의 효율(예컨대, 90%, 95% 또는 100%), 90% 초과의 효율(예컨대, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)을 가지거나, 매우 바람직한 실시양태에서, 95% 초과의 효율(예컨대, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)을 가짐)로 끝나는 인트론 서열; 및 제2 유전자, 및 임의적으로, 폴리아데닐화 신호를 포함하는 엑손을 포함하는 벡터의 사용을 이용한다(도 1 참고). 본 발명의 벡터, 발현 카세트 또는 구축물은 숙주 세포에 도입될 수 있고, 거기에서 그것은 선택적으로 스플라이싱된 mRNA 전사체를 생산한다. 이 2개 이상의 mRNA 전사체는 이후 충분량으로 발현되어 하나 이상의 원하는 다량체형 단백질을 생산하게 되는 구별된 폴리펩티드를 코딩한다. 2개 이상의 산물의 비는 원할 경우, 적당한 스플라이스 부위, 예컨대 보다 약하거나 보다 강한 스플라이스 어셉터의 선택을 통해 변형될 수 있다. 특별한 실시양태들에서, 2개 이상의 산물의 비는 단지 제1 스플라이스 어셉터만의 선택을 통해 변형될 수 있다.

전형적으로, 프리-mRNA 스플라이싱은 인트론 서열의 정확한 제거와 관련되고, 부분적으로 스플라이싱 기작, 예컨대 스플라이스오좀에 의한 인트론-엑손 경계에서의 특성 서열, 즉 도너 및 어셉터 스플라이스 부위에 기초한다. 이 경계 서열은 전형적으로 인트론의 5' 말단에 대해서는 MAG/GURAGU(서열번호 30), 및 인트론의 3' 말단에 대해서는 Y₁₀NCAG/G(서열번호 31)의 일치 서열에 부합한다(여기에서, M = A 또는 C, 밑줄친 부분은 비변형 뉴클레오티드이며, Y₁₀ =10개의 연속적 C 또는 T 뉴클레오티드, 및 N = 임의의 뉴클레오티드임). 인트론 및 엑손 내의 서열, 및 인트론 크기는 또한 스플라이싱의 효율에 기여하는 것으로 나타났다(예컨대, [Chabot, B. Trends in Genetics, 12: 472-478(1996)] 참고).

본 발명의 특정 실시양태들에서, 선택적 스플라이싱은 본 발명의 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물의 엑손에 의해 코딩되는 각 폴리펩티드의 발현을 제어할 수 있다. 각 개별 스플라이싱된 전사체에 대해, 스플라이스 도너는 단지 하나의 스플라이스 어셉터 또는 0개의 스플라이스 어셉터와 스플라이싱한다. 그러나, 선택적 스플라이싱은, 스플라이스 도너가 한 전사체 상의 제1 스플라이스 어셉터와 스플라이싱할 수 있고, 다른 한 전사체 상의 제2 스플라이스 어셉터와 스플라이싱하고, 전사체의 불균질 풀을 형성한다. 따라서, 단일 스플라이스 도너의 다중 스플라이스 어셉터에 대한 스플라이싱은 세포 내의 본 발명의 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물로부터의 제1 및 제2(또는 그 이상) 엑손의 스플라이싱된 전사체의 수준을 제어할 것이다. 차별적으로 스플라이싱된 전사체 수준의 상대량은 스플라이스 도너가 특별한 스플라이스 어셉터와 결합되는 빈도(이는 스플라이싱 이벤트 효율로도 칭해짐)에 의존할 것이다. 특별한 스플라이싱 이벤트가 전사체의 풀에 더욱 종종 일어날수록, 스플라이싱 이벤트와 연합되는 스플라이스 도너 및 스플라이스 어셉터가 더욱 효율적이고 강한 것이라 말해진다.

본 발명의 특정 실시양태들에서, 스플라이스 도너 및 3' 말단 스플라이스 어셉터(예컨대, 제2 스플라이스 어셉터)가 매우 효율적이어서, 전체 스플라이싱이 매우 효율적이도록 하고, 제1 스플라이스 어셉터의 강도가 스플라이싱된 엑손 전사체의 선택적 수준을 조절하도록 하는 것이 바람직하다. 스플라이싱되지 않은 전사체의 번역은 전형적으로 매우 비효율적이어서, 최대 스플라이싱은 폴리펩티드 발현을 촉진한다. 예를 들어, 스플라이스 도너 및 제2 스플라이스 어셉터가 매우 효율적인 경우, 초기 mRNA의 대부분이 스플라이싱될 것이다. 제1 스플라이스 어셉터가 강한(즉, 효율적인) 경우, 제1 엑손을 포함하는 스플라이싱된 전사체의 비교적 높은 수준이 세포 내에 존재할 것이며, 이는 제2 폴리펩티드에 비해, 제1 폴리펩티드의 발현 비가 더 높도록 한다. 제1 스플라이스 어셉터가 더 약한 경우, 제1 엑손을 포함하는 스플라이싱된 전사체의 비교적 낮은 수준이 세포 내에 존재할 것이며, 이는 제2 폴리펩티드에 비해, 제1 폴리펩티드의 발현 비가 낮도록 한다. 번역은 소정의 엑손을 포함하는 스플라이싱된 전사체의 수준에 매우 의존적이기 때문에, 제1 또는 제2 엑손에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현은 그 엑손의 바로 상향류에 있는 스플라이스 어셉터를 이용하는 스플라이싱의 수준에 의존적이다. 그러므로, 특정 실시양태들에서, 스플라이싱이 본 발명의 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물에 의해 코딩된 각 엑손을 포함하는 성숙 전사체의 수준에 영향을 주기 때문에, 선택적 스플라이싱을 사용하여 엑손에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 조절한다.

스플라이스 도너 및 스플라이스 어셉터는 당업계에 공지되어 있고, 임의의 것이 본 발명에 이용될 수 있다. 이 요소는 특히 당업계에서 발견되거나, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 실험적으로, 또는 스플라이싱 서열을 예측할 수 있는 소프트웨어, 예컨대 네트진(Netgene)2 버전 2.4를 이용함으로써 일치 서열로부터 유도될 수 있다. 그러한 스플라이싱 요소는 본 발명에서, 예컨대 실시예에 기재된 방법을 이용함으로써 적합성에 대해 시험될 수 있다. 부분적으로, 본 발명은 공학처리를 통해, 진핵 세포에서의 2개 이상의 바람직한 재조합 유전자 산물의 선택적 스플라이싱을 달성하기 위해 상기와 같은 서열을 혼입하고 향상시킨다.

본 발명의 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물은 다양한 이종다량체형 단백질을 발현하는데 유용하다. 그 예는 이종이량체, 예컨대 당단백질 호르몬(예컨대 융털막성고나도트로핀(CG), 타이로트로핀(TSH), 루트로핀(LH) 및 폴리트로핀(FSH)) 또는 인테그린계의 원들을 비제한적으로 포함한다. 2쌍의 동일한 서브유니트로 구성된 이종사량체가 또한 사용될 수 있다. 적절한 이종사량체의 예는 항체, 인슐린 수용체(알파2 베타2) 및 전사 개시 인자 TFIIE(알파2 베타2)를 포함한다. 또한, 2:1 비의 발현을 발생시키는 스플라이스 어셉터 쌍을 이용하여, 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물이 림포톡신 알파1 베타2와 같은 이종삼량체의 발현을 위해 사용될 수 있다. 상이한 스플라이스 어셉터들의 조합에 의해 발현 비를 변경시킴으로써 상이한 비로 다량체를 발현할 수 있는 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 발현시켜, 많은 상이한 다량체형 단백질들이 효율적으로 발현되도록 할 수 있다. 특정 실시양태들에서, 스플라이스 도너 및/또는 어셉터 신호의 서열에 기초하여 발현 비를 예측한다. 다른 실시양태들에서, 발현 비는 실험적으로 결정된다.

또한, 본 발명의 선택적 스플라이싱 시스템을 이용하여, 폴리펩티드 다량체, 예를 들어 항체를 생산하는데 유용한 유전 서열은 수많은 상이한 원들로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 다양한 인간 단백질 유전자들이 공개적으로 접근가능한 유전 서열 축적 및/또는 플라스미드, 클론, 세포 등의 축적물의 형태로 입수가능하다. 단백질 및 단백질-코딩 유전자의 많은 서열들이 공개되었고, 적당한 유전자가 본원에 기재된 것과 같은 이 서열로부터 합성될 수 있다. 대안적으로, 단백질-생산 세포주는 당업계에 인식된 기법을 이용하여 선택되고 배양될 수 있다. 다른 실시양태들에서, 유전 서열은 등록 데이터베이스에 대한 접근을 통해 수득된다. 당업자라면 유전 서열 정보를 수득하기에 적당한 많은 방법들을 알 것이다.

예를 들어, 항체-코딩 RNA가 표준 기법, 예컨대 구아니디듐 이소티오시아네이트 추출 및 석출, 그에 이은 원심분리 또는 크로마토그래피에 의해 원래의 항체-생산 혼성체 세포 또는 다른 형질변환된 세포로부터 단리될 수 있다. 바람직할 경우, mRNA는 표준 기법, 예컨대 올리고 dT 셀룰로스 상의 크로마토그래피에 의해 총 RNA로부터 단리될 수 있다. 이 목적을 위해 적당한 기법은 당업자에게 자명하다.

항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA가 공지된 방법에 따라 역전사효소 또는 DNA 중합효소를 이용하여 동시에 분리하여 따로 생산될 수 있다. 그것은 예를 들어 공개 항체 경쇄 및 중쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기초하여 하나 이상의 특정 프라이머에 의해, 혹은 일치된 불변 영역 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, PCR을 또한 사용하여, 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 코돈을 단리할 수 있다. 이 경우에, 라이브러리가 일치 프라이머 또는 보다 큰 동종성 프로브, 예컨대 마우스의 불변 영역 프로브에 의해 선별될 수 있다.

대안적으로, 항체 및 항체 단편은 공지된 컴퓨터 모델링 기법으로부터 유도된 서열을 이용하여 합성될 수 있다. 그러한 모델링 기법을 사용하여, 보존 아미노산 서열에 의해 한정되는 소정의 항체 틀구조(framework)의 부문에서 예측되는 리간드 구조에 결합하는 항체 서열을 예측할 수 있다. 이 공지된 관계를 이용함으로써, 당업자는 원하는 항체 또는 항체 단편의 아미노산 서열을 설계한 후, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 합성할 수 있다. 그렇게 설계된 항체 또는 항체 단편은 "합성"인 것으로 칭해진다.

본 발명의 조성물 및 본 발명의 방법은 임의의 항체, 또는 실제로 임의의 다중-사슬 또는 다량체형 단백질에 적당하다. 본 발명의 이 실시양태에 상용적인 올리고뉴클레오티드 합성 기법은 당업자에 의해 공지되고, 수가지 시중 입수가능한 자동화 합성장치들 중 임의의 것을 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 본원에 나와 있는 수가지 유형의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 상업적 DNA 업체의 서비스를 통해 수득될 수 있다. 이어서, 상기 방법들 중 임의의 방법을 이용하여 수득된 유전 물질을 본 발명과 상용적인 항체, 및 그러한 항체의 원하는 용도를 제공하도록 변형 또는 변경될 수 있다.

다양한 상이한 유형의 항체들, 예를 들어 항원, 예컨대 종양 관련 항원, 병원체 또는 자동면역 질병과 관련된 자기-항원에 대한 특정 면역반응 활성을 갖는 항체 또는 항체 단편이 본 발명에 따라 발현될 수 있다. 항체 (또는 그것의 단편)은 하나 이상의 불변 영역이 결실되거나 그와 달리 변형되어, 원하는 기능적 활성, 예컨대 혈청 반감기, 또는 작용자 기능을 제공하도록 할 수 있다. 그러한 많은 항체들이 [Kuby, J. Immunology, 제3판., W. H. Freeman and Co.(1997)]에 기재되어 있다.

본 발명의 방법을 이용하여 진핵 세포에서 발현하기에 적당한 항체는 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM의 5가지 구분된 항체 부류들을 포함한다. 5개 부류 모두가 본 발명의 범주 내에 속하나, 하기 논의는 일반적으로 IgG 분자의 부류에 대한 것이다. 당업자는 하기 논의를 면역글로불린의 다른 부류에도 용이하게 적용할 수 있을 것이다. IgG 분자는 전형적으로 각기 대략 23 kD의 분자량의 2개의 동일한 항체 경쇄, 및 각기 53 내지 70 kD의 분자량의 2개의 동일한 항체 중쇄를 포함한다. 도 2에 나와 있는 구성형태에서 사슬내 디술피드 결합은 4개 사슬을 결합시킨다. 또한, 항체 경쇄 및 중쇄 모두는 구조적 및 기증적 동질성의 영역으로 나뉜다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 항체 경(VL) 및 중(VH)쇄의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 역으로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 성질들, 예컨대 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 및 기타 작용자 기능을 부여할 수 있다.

경쇄는 카파 또는 람다 사슬로 분류된다. 각 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 2개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 혼성체, B 세포, 또는 유전공학처리된 숙주 세포에 의해 발생될 때 공유 디술피드 연결기에 의해 서로 결합된다(도 2 참고). N-말단에 가변 영역이 있고, C-말단에 불변 영역이 있다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 그것들 사이에는 몇가지 하위부류들이 있다. 항체의 "부류"를 IgA, IgD, IgE IgG 또는 IgM로 결정하는 것은 상기 사슬의 성질이다. 면역글로불린 하위부류(아형태), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1는 잘 특징화되어 있고, 기능적 분화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 제1 엑손 또는 제2 엑손은, 수득된 벡터가 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 코딩하는 한, 대안적으로 항체 경쇄 또는 중쇄를 코딩하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

항원-결합 부위는 VH 및 VL 사슬의 각각에 있는 3 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 한정된다. 각 단량체형 항체에 존재하는 6개의 CDR은, 항체가 수성 환경에서 3차원 구성형태를 가질 경우, 항체로서 항원 결합 부위를 형성하도록 특이적으로 위치된 아미노산의 짧은 비인접 서열이다. 중 또는 경 가변 도메인의 나머지는 아미노산 서열 내의 보다 낮은 분자간 가변성을 나타냈고, 틀구조 영역으로 칭해진다. 틀구조 영역은 대체로 베타 시이트 구성형태를 채택하고, CDR은 루프 연결을 형성하며, 일부 경우들에는 베타 시이트 구조의 부분을 형성한다. 따라서, 틀구조 영역은 사슬내 비공유 상호작용에 의해 바른 배향으로 6개 CDR을 위치시키는 골격을 형성하는 작용을 한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원-결합 부위는 면역활성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 한정한다. 이 상보적 표면은 면역반응성 항원 에피토프에 대한 항체의 비공유 결합을 촉진한다.

항체 단편은 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 이용한 발현에 적당하다. 그러한 단편은 원하는 항체의 임의의 위치 또는 위치들이고, 예컨대 Fab 단편, F(ab')₂ 단편 및 Fc 단편을 포함할 수 있다. 또한, 항체 단편은 전장 미만의 사량체형 항체 단백질을 포함하는 단쇄 항체 또는 다른 항체-유도 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 이용하여 발현된 항체는 선택된 항원과 항체가 연합되도록 하는 임의의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다. 이와 관련하여, 가변 영역은 체액성 반응을 일으키고 원하는 항원에 대한 면역글로불린을 발생시키도록 유도될 수 있는 임의의 유형의 포유동물로부터 유도되거나 그것에 포함될 수 있다. 이에 따라, 변형된 항체의 가변 영역은 예를 들어 설치류, 비인간 영장류, 또는 인간의 것일 수 있다. 항체는 상이한 종, 전형적으로는 인간 불변 영역에 융합된 설치류 가변 영역으로부터 유도될 때, 키메라 항체라 칭해진다. 바람직한 실시양태들에서, 항체의 가변 및 불변 영역 모두는 인간의 것이다. 다른 선택된 실시양태들에서, (주로 비인간 원으로부터 유도된) 상용성 항체의 가변 영역은 분자의 면역원성을 감소시키거나 결합 성질(예컨대, 친화성 성숙)을 향상시키기 위해 공학처리되거나 특이적으로 조정될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 유용한 가변 영역은 도입된 DNA 또는 아미노산 서열을 포함시킴으로써 인간화되거나 그와 달리 변형될 수 있다. 다른 한 종으로부터 그라프트된 CDR을 갖는 상기와 같은 인간 항체를 인간화 항체라 칭한다. 또한, 가변 영역은 전술된 바와 같이 공학처리되거나 합성될 수 있다. 상기 항체 중 임의의 항체는 변형된 글리코실화 부위, 페그화에 적당한 부위, 및/또는 항체에 변형된 작용자 기능, 예컨대 변형된 보체 결합, 변형된 Fc 수용체 결합 및/또는 변형된 면역 세포 상호작용 활성을 부여하는 부위를 가지도록 추가로 변형될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 수많은 선택적 스플라이싱 발현 벡터 시스템들이 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물은 동물 바이러스, 예컨대 인간 또는 소 인유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스 안데노바이러스, 백신 바이러스, 바큘로 바이러스, 레트로바이러스(예컨대, HIV), 거대세포바이러스, 또는 SV40 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 함유할 수 있다. 부가적으로, 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 염색체에 통합하거나, 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 염색체외로 유지할 수 있는 세포는, 트랜스펙션된 숙주 세포가 선택되도록 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 DNA 서열에 직접적으로 연결되어, 코트랜스펙션에 의해 동일 세포로 도입되거나 발현될 수 있다. 본 발명의 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 도입하기에 적당한 숙주 세포가 하기 논의된다.

3. 배양액 중 진핵 세포에서의 폴리펩티드 다량체의 발현

본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 이는 예를 들어 트랜스펙션(전기영동 및 전기천공 포함), 원형질 융합, 인산칼슘 석출, 엔벨로핑된 DNA를 이용한 세포 융합, 마이크로주사, 및 바이러스 감염을 포함한다(예컨대, [Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" 제24.2장, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez 및 Denhardt 편저(Butterworths, Boston, Mass. 1988) 참고). 상술된 바와 같이, 본 발명의 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물은 숙주 세포의 염색체에 통합되어, 염색체외에 유지되거나 일시적으로 발현된다. 형질전환된 세포를 세포 내의 코딩된 폴리펩티드, 예컨대 항체, 경쇄 및 중쇄의 생산에 적절한 조건 하에서 성장시켜, 폴리펩티드 합성에 대해 검정한다. 폴리펩티드 합성을 확인하고 정량화하기 위한 예시적 검정 기법은 예컨대 효소-연결 면역흡수 검정(ELISA), 형광 공명 에너지 이동(FRET), 방사선면역 검정(RIA), 형광-활성화 세포 분류기 분석(FACS) 및 면역조직화학을 포함한다.

단백질 발현에 사용되는 숙주 세포주는 바람직하게 진핵 세포 기원, 예를 들어 포유동물 기원, 또는 대안적으로 효모 또는 곤충의 것이다. 예시적 숙주 세포주는 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주, HeLa(인간 자궁경부암), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610(중국 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), NS0(골수종), (소 내피 세포), RAJI(인간 림프구), 293(인간 신장), PER.C6(인간), 스포도프테라 프루기페르다(Sf9)(곤충), 트리코플루시아 니(Tn. TnHigh-Five)(곤충), 누에(BMN)(곤충), 사카로마이세스(효모), 시조사카로마이세스(효모), 및 피치 아(효모)를 포함한다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 서비스, 예컨대 미국모식균주보존센터 또는 공개 문헌을 통해 입수가능하다.

생체외 생산은 본 발명의 선택적 스플라이싱 시스템을 이용하여 생산된 원하는 폴리펩티드, 바람직하게는 항체를 다량으로 수득하도록 스케일-업을 허용한다. 조직 배양 조건 하에서의 진핵 세포, 예컨대 포유동물 및 효모 세포 배양 기법이 당업자들에 의해 공지되어 있고, 이는 예컨대 에어리프트 반응기 또는 연속 교반기 반응기, 또는 예컨대 중공 섬유, 마이크로캡슐, 아가로스 마이크로비이드, 세라믹 카트리지 또는 발효기에서의 고정 또는 포획 세포 배약액 중에서의 균질 현탁액 배양을 포함한다. 본 발명에 따른 다량체형 단백질, 특히 항체의 단리 및 회수를 위해, 배양액 상등액 중의 단백질(예컨대, 면역글로불린)을, 먼저 예컨대 황산암모늄을 이용한 석출, 흡습성 물질, 예컨대 PEG에 대한 투석 및 선택적 막을 통한 여과에 의해 농축될 수 있다. 필요한 경우, 및/또는 원하는 경우, 다량체형 단백질(예컨대, 다가 항체)의 농축 용액은 통상적 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로스 상의 크로마토그래피, 또는 면역친화성 크로마토그래피(예컨대, 단백질 A 또는 단백질 G)에 의해 정제된다.

본 발명은 또한 본 발명의 선택적 스플라이싱 시스템을 이용하여 발현될 때 연합하여 기능적 항체, 예컨대 표적 항원, 예컨대 종양 관련 항원, 병원체 또는 자가-항원에 특이적으로 결합하거나 원하는 작용자 기능을 가지는 항체를 생산하는 임의의 항체 경쇄 및 중쇄 서열의 발현을 구상한다.

중요하게도, 선택적으로 스플라이싱된 구축물 내의 항체 경쇄 및 중쇄 유전자의 복제수는 경쇄/중쇄의 바람직한 비가 수득되도록 선택될 수 있다. 특정 실시양태들에서, 경쇄는 전형적으로 중쇄에 대해 약 10/1, 약 5/1, 약 3/1 또는 약 1/1 범위의 수준으로 발현된다. 관련 실시양태들에서, 경 및 중 폴리펩티드는 약 20:1 내지 약 1:20, 약 15:1 내지 약 1:15, 약 12:1 내지 약 1:12, 약 10:1 내지 약 1:10, 약 9:1 내지 약 1:9, 약 8:1 내지 약 1:8, 약 7:1 내지 약 1:7, 약 6:1 내지 약 1:6, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 3:1 내지 약 1:3, 약 2:1 내지 약 1:2 또는 약 1:1의 비로 발현된다. 특별한 실시양태들에서, 경 및 중 폴리펩티드는 약 20:1, 약 19:1, 약 18:1, 약 17:1, 약 16:1, 약 15:1, 약 14:1, 약 13:1, 약 12:1, 약 11:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6:1, 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9, 약 1:10, 약 1:11, 약 1:12, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15, 약 1:16, 약 1:17, 약 1:18, 약 1:19 및/또는 약 1:20의 비로 발현된다.

본 발명은 또한 예컨대 소정의 세포주에서, 원하는 비가 달성되도록 상이한 스플라이스 부위를 갖는 벡터를 선별함으로써 임의의 원하는 비를 선택하는 방법을 제공한다(예컨대, 실시예 2 참고). 이는, 경쇄의 특정 발현 수준이 항체 중쇄 및 경쇄의 적절한 조립을 지정함에 있어 유익할 수 있고, 과도한 쌍을 이루지 않은 중쇄가 세포 독성을 유도할 수 있는 것으로 관찰되었기 때문에, 항체를 효율적으로 발현할 때 특히 중요하다. 더욱이, 경쇄는 또한 조립된 항체 중쇄 및 경쇄의 접힘을 유도하여, 소포체에서 기능적 항원-결합 항체를 생산함에 있어 결정적이다. 따라서, 특정 실시양태들에서, 항체 경쇄는 전형적으로 항체 중쇄에 대해 약 10/1 내지 1/1로 발현된다(예시적 경쇄/중쇄 비는 비제한적으로 약 10/1, 9/1, 8/1, 7/1, 6/1, 5/1, 4/1, 3/1, 2/1 및 1/1을 포함함).

특정 실시양태들에서, 주제 발현 시스템에 따라 발현되는 항체는 임의의 원하는 항원에 대해 특이적일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 치료적 효과를 도출하는 기능적 항체, 예컨대 자동면역, 염증성, 감염성, 알레르기성 또는 신생물(암) 질병을 치료하기에 유용한 항체일 것이다. 항체는 상승효과를 위해 다른 치료제와 조합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 예컨대 암 화학치료제로서 사용하기 위한 다른 항체, 소분자, 또는 방사능 원과 조합될 수 있다.

특정 실시양태들에서, 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물은 다중 폴리펩티드를 발현하기 위해 선택적 스플라이싱에 의도적으로 의존하지 않는 다른 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물과 조합하여 사용된다.

4. 약제학적 조성물

본 발명은 또한 특히, 치료가 필요한 대상 또는 환자의 치료를 위한, 본 발명의 방법 및/또는 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 이용하여 발현된 다량체형 단백질을 포함한 치료적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은, 본 발명의 방법에 의해 생산된 치료적 폴리펩티드의 투여를 통해, 또는 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 포함하는 유전자 치료에 의해, 처리가 필요한 대상(즉, 환자)를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 처리가 필요한 대상은 본 발명의 조성물을 투여함으로써 치료 또는 예방될 수 있는 질병, 장애 또는 상태를 앓고 있거나, 앓을 위험에 처해 있는 대상이다. 대상은 포유동물 대상일 수 있다. 바람직한 대상은 인간 대상이다.

특정 실시양태들에서, 그러한 치료적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 내에 상기와 같은 다량체형 단백질을 포함한다. 바람직한 실시양태들에서, 그러한 치료적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 내에 본 발명에 따라 생성된 하나 이상의 재조합 항체 또는 항체 단편을 포함한다. "약제학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분의 투여를 위해 정상적으로 사용하는 약제학적 제제의 하나 이상의 성분을 가리킨다. 따라서, 담체는 당업계에 사용되는 임의의 약제학적 부형제 및 임의의 형태의 투여용 비히클을 포함할 수 있다. 조성물은 예를 들어 주사용 용액, 수성 현탁액 또는 용액, 비수성 현탁액 또는 용액, 고체 및 액체 경구 제형물, 고약, 젤, 연고, 피내 패치, 크림, 로션, 정제, 캡슐, 지연방출성 제형물 등일 수 있다. 부가적 부형제는 예를 들어 착색제, 맛 마스킹 제제, 용해 보조제, 현탁제, 압착제, 장코팅제, 지연방출 보조제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 제제는 종종 활성 치료제 및 기타 다양한 약제학적으로 허용가능한 성분들을 포함한 약제학적 조성물로서 투여된다. [Remington's Pharmaceutical Science(제15판, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania(1980)]을 참고한다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 방식 및 치료 용도에 의존한다. 조성물은 또한 원하는 제형에 따라, 동물 또는 인간 투여를 위한 약제학적 조성물을 제형하는데 통상 사용되는 비히클로서 정의되는, 약제학적으로 허용가능한 비독성 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 희석제는 조합물의 생물학적 활성을 저해하지 않도록 선택된다. 그러한 희석제의 예에는 증류수, 생리학적 인산염 완충 염액, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 행크 용액이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 또한, 약제학적 조성물 또는 제형물은 또한 기타 담체, 보조제, 비독성 비치료적 비면역원성 안정화제를 포함할 수도 있다. 전형적으로, 그러한 조성물은 본 발명의 조성물을 이용한 치료를 받을 수 있는 질병, 장애 또는 상태를 앓고 있거나 앓을 위험에 처해 있는 대상 또는 환자에게, 검출가능한 효과, 바람직하게는 의료적으로 유익한 효과를 산출하기에 충분한 양인 치료 유효량으로 투여된다.

본 발명에 따라 생성된 다량체형 단백질은 활성 성분의 지연 방출을 허용하는 방식으로 제형될 수 있는, 주사 또는 이식 제제의 형태로 투여될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 그러한 다량체형 단백질은 항체이다. 한 예시적 조성물은 HCl로써 pH 6.0로 조정된, 50 mM L-히스티딘, 150 mM NaCl로 구성된 수성 완충액으로 제형된, 단클론성 항체를 5 mg/mL로 포함한다.

전형적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사제로 제조되거나; 주사 전에 액체 비히클에 용해 또는 현탁되기에 적당한 고체 형태가 제조될 수도 있다. 제제는 또한 상기 논의된 바와 같이, 폴리락티드, 폴리글리콜라이드, 또는 증강된 보조 효과를 위한 공중합체와 같은 마이크로입자 또는 리포좀 내에 캡슐화되거나 유화될 수 있다([Langer, Science 249:1527(1990)] 및 [Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97(1997)] 참고).

5. 예방 및 치료 방법

특정 실시양태들에서, 본 발명은 임의의 질병, 장애 또는 상태를 예방, 경감 또는 치료하는데 적당한 단백질의 생산에 관한 것이다. 그러한 장애 또는 질병은 암, 전암 상태, 및 근육 이영양증과 같은 유전적 질병 또는 상태를 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 단백질을 이용한 치료를 받을 수 있는 질병, 장애 또는 상태는 유전 질병 (즉, 하나 이상의 유전자 결함이 원인일 수 있는 질병 상태), 후천적 병리(즉, 타고난 결함이 원인이 아닐 수 있는 병리학적 상태) 및 예방 과정(즉, 질병 또는 원치 않는 의료 상태의 예방)과 같은 상태들을 포함한다. 후천적 병리는 비정상적인 생리학, 생화학, 세포, 구조 또는 분자 생물학적 상태에 의해 나타내어지는 질병 또는 증후군일 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 단백질을 이용한 치료를 받을 수 있는 질병, 장애 또는 상태는 바이러스 및 세균 감염을 포함한 감염, 암 및 전암 상태를 포함한 과다증식성 질병 또는 장애, 면역 장애, 예컨대 류마티스성 관절염, 유전적 면역결핍 상태, 예컨대 과-IgM 증후군, 호중구감소증을 특징으로 하는 상태를 포함한 일차 또는 조합 면역결핍 상태, 및 신경 장애, 심장혈관 장애, 예컨대 허혈, 및 내분비 장애, 예컨대 당뇨병, 갑상선 장애 및 불임일 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 단백질을 이용한 치료를 받을 수 있는 질병, 장애 또는 상태는 암을 포함한 과다증식성 질병 또는 장애일 수 있다. 그러한 질병 또는 장애는 뇌, 폐, 편평 세포, 방광, 위, 췌장, 유방, 두부, 목, 간, 신장, 난소, 전립선, 결장, 직장, 식도, 비인두, 갑상선 및 피부를 포함한 임의의 세포, 조직 또는 기관과 관련될 수 있다. 암은 흑색종, 림프종, 백혈병, 다중 골수종, 육종 또는 암종일 수 있다. 암은 고형 종양이거나, 체액, 예컨대 혈액과 관련될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 단백질을 이용한 치료를 받을 수 있는 질병, 장애 또는 상태는 유전적으로 타고난 질병, 예컨대 헌팅턴씨병, 양극성 장애, 파키슨씨병, 수근관증후군, 낭성 섬유증, 펠리제우스-메르츠바하병, 다발성 경화증 또는 듀첸 근육 이영양증일 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 단백질을 이용한 치료를 받을 수 있는 질병, 장애 또는 상태는 감염성 질병, 예컨대 결핵, 말라리아, 황열병, 또는 B형 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 등에 의한 감염에 의해 유발되는 질병일 수 있다.

특별한 실시양태들에서, 본 발명은 특히 장애 또는 질병, 예컨대 면역계의 장애 또는 질병의 예방 또는 치료에 적당한 항체 또는 항체 단편의 생산에 관한 것이다.

따라서, 특정 실시양태들에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 예를 들어 사구체신염, 경피증, 간경변, 다발성 경화증, 낭창성 신염, 죽상동맥경화증, 염증성 대장병, 알레르기 또는 류마티스성 관절염을 포함한 면역 장애의 예방 또는 치료에 유용하다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 알츠하이머씨병, 중한 천신, 아토피성 피부염, 악액질, CHF-허혈, 죽상반 재협착, 크론씨병, 당뇨병성 신증, 림프종, 건선, 섬유종/복사-유도, 연소형 관절염, 뇌졸중, 외상에 의한 뇌 또는 중추신경계의 염증, 및 궤양성 대장염을 포함한 염증성 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 생산된 항체 또는 항체 단편을 이용하여 예방 또는 치료될 수 있는 기타 염증성 장애에는 각막 이식, 만성 폐쇄성 폐 질병, C형 간염, 다발성 골수종 및 골관절염이 포함된다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 방광암, 유방암, 두부 및 목암, 카포씨육종, 흑색종, 난소암, 소세포 폐암, 위암, 백혈병/림프종, 및 다중 골수종을 비제한적으로 포함하는 신생물성 종양을 예방하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 부가적 신생물성 종양 상태에는 자궁경부암, 결장-직장암, 자궁내막암, 신장암, 비편평세포 폐암 및 전립선암이 포함된다.

다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 알츠하이머씨병, 뇌졸중 및 외상 뇌 또는 중추신경계 손상을 비제한적으로 포함하는 신경퇴행성 장애를 예방하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 부가적 신경퇴행성 장애에는 ALS/운동 뉴런 질병, 당뇨병성 말초 신경병, 당뇨병성 망막증, 헌팅턴씨병, 황반부 변성, 및 파키슨씨병이 포함된다.

임상적 용도들에서, 대상은 질병 또는 장애의 하나 이상의 표시 또는 증상을 나타냄으로써 상기 상태들 중 하나를 가지거나 발병할 위험에 처해 있는 것으로 확인된다. 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 그것의 항체 단편, 또는 하나 이상의 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 본 발명의 조성물은 예를 들어 상술한 바와 같은 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하기 위한 충분량으로 투여된다.

따라서, 본 발명의 단백질은 예를 들어, 상술한 바와 같은 질병 또는 장애를 치료하기 위해, 댕사자에게 유익한 치료 반응을 일으키는 상태 하에서 대상에게 치료 시약으로서 투여하기에 적당하다.

본 발명의 치료제는 전형적으로 원치 않는 오염물질이 실질적으로 없이 순수하다. 이는 제제가 전형적으로 약 50% w/w(중량/중량) 이상의 순도이고, 방해 단백질 및 오염물질이 실질적으로 없음을 의미한다. 경우에 따라, 제제는 약 80% w/w 이상의 순도, 더욱 바람직하게는 90% 이상 또는 약 95% w/w 순도이다. 그러나, 예를 들어 상술된 바와 같은 통상적 단백질 정제 기법을 이용하여 99% w/w 이상의 동종성 펩티드가 수득될 수 있다.

방법은 무증상 대상과 질병의 증상을 현재 나타내는 대상 모두에 대해 사용될 수 있다. 그러한 방법에 사용되는 항체는 인간, 인간화, 키메라 또는 비인간 항체, 또는 그것의 단편(예컨대, 항원 결합 단편)일 수 있고, 단클론성 또는 다클론성일 수 있다.

다른 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 생산된 항체를 약제학적 담체와 함께 약제학적 조성물로서 투여하는 것을 특징으로 한다. 대안적으로, 항체는 하나 이상의 항체 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써 대상에게 투여될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 발현되어 대상 내에 항체 사슬을 생산한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩한다. 폴리뉴클레오티드는 발현되어 대상 내에 중쇄 및 경쇄를 생산한다. 예시적 실시양태들에서, 대상의 혈관 내의 투여된 항체의 수준에 대해 대상을 모니터한다.

6. 유전자 전달

본 발명은 또한 선택적 스플라이싱 벡터를 포함하는 핵산이 처리가 필요한 환자에게 제공되도록 하는 유전자 치료를 포괄한다. 동일한 질병, 장애 및 상태는 본 발명의 방법에 의해 생성된 폴리펩티드로 치료함으로써 상기한 바대로 치료, 경감 또는 예방될 수 있다. 유전자 치료라고도 달리 칭해지는, DNA를 세포에 전달하여 유전자 산물 단백질을 발현하는 각종 방법들이, 본원에 참고로 인용되는 [Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn.12 (4): 335-356(1992)]에 개시되어 있다. 유전자 치료는 체외 또는 생체내 치료로 DNA 서열을 체세포 또는 생식 계열 세포에 혼입시키는 것을 포괄한다. 유전자 치료는 유전자를 대체하고, 정상 또는 이상 유전자를 강화하며, 유해성 질병 및 기타 병리에 대응하는 기능을 한다.

이 의학적 문제를 유전자 치료로 처리하는 방안은 결함 유전자를 확인한 후, 기능적 유전자를 부가하여 결함 유전자의 기능을 대체하거나 기능적 유전자를 약간 증강시키는 것과 같은 치료 방안; 또는 증상을 치료하거나 조직 또는 기관을 치료 섭생법에 더욱 순응적으로 만드는 산물 단백질을 부가하는 것과 같은 예방적 방안을 포함한다. 대안적으로, 면역 부여 유전자는 예컨대, 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터 내의 특별한 항원에 대한 항체를 제공함으로써 전달될 수 있다.

유전자 치료를 위한 유전자 전달 방법은 3가지 넓은 범주, 즉 물리적(예컨대, 전기천공, 직접 유전자 전달 및 입자 충격), 화학적(지질계 담체 또는 기타 비바이러스성 벡터) 및 생물학적(바이러스 유도 벡터 및 수용체 흡수) 방법들로 분류된다. 예를 들어, DNA와 착화된 리포좀을 포함하는 비바이러스성 벡터가 사용될 수 있다. 그러한 리포좀/DNA 착체는 환자에게 직접적으로 정맥내 주사될 수 있다. 리포좀/DNA 착체가 간에서 농축되어, 거기에서 그것들이 DNA를 대식세포 및 별큰포식(Kupffer) 세포에 전달하는 것으로 믿어진다. 이 세포는 수명이 길어, 요망되는 DNA의 장기 발현을 제공한다. 부가적으로, 유전자의 벡터 또는 "네이키드" DNA는 치료적 DNA의 표적 전달을 위해 요망되는 기관, 조직 또는 종양에 직접 주사될 수 있다.

유전자 치료 방법은 전달 부위에 의해 또한 기술될 수 있다. 유전자 전달을 위한 기본적 방식은 체외 유전자 전달, 생체내 유전자 전달, 및 생체외 유전자 전달을 포함한다. 체외 유전자 전달에서, 세포를 환자로부터 위하여, 세포 배양물에서 성장시킨다. DNA를 세포에 트랜스펙션하고, 트랜스펙션된 세포를 수 확장시킨 후, 환자에게 재이식한다. 생체외 유전자 전달에서, 방법은 동일하나, 다만 트랜스펙션된 세포가 배양물 내에 성장하는 세포, 예컨대 조직 배양 세포이고, 개별 환자로부터의 세포가 아니다.

생체내 유전자 전달은 세포가 환자 내에 있을 때 환자의 세포에 DNA를 도입하는 것을 포함한다. 방법은 비감염성 바이러스를 사용한 바이러스성 매개 유전자 전달을 이용하여, 환자 내에 유전자를 전달하거나 네이키드 DNA를 환자 내의 한 부위에 주사하여, DNA가 유전자 산물 단백질이 발현되는 세포의 백분율에 의해 취해지는 것을 포함한다. 부가적으로, 본원에 기재된 다른 방법들, 예컨대 기계적 또는 화학적 방법은 본 발명의 핵산의 생체내 삽입을 위해 사용될 수 있다.

DNA 전달의 기계적 방법은 DNA의 직접 주사, 예컨대 DNA의 생식세포 또는 체세포로의 직접 주사, 기압 전달 DNA-코팅 입자, 예컨대 "유전자총"에 사용되는 금 입자, 및 무기 화학적 방법, 예컨대 인산칼슘 트랜스펙션을 포함한다. 다른 한 방법으로서의 리간드-매개 유전자 치료는 DNA를 특정 리간드와 착화하여, 리간드-DNA 접합물을 형성하고, DNA를 특정 세포 또는 조직으로 유도하는 것을 포함한다.

유전자 치료의 화학적 방법은, 세포에 결합하고/하거나 DNA를 세포막을 가로질러 운반하는 화학 물질, 예컨대 리포좀과 같은 용해성 지질 소낭, 또는 기타 막 융합, 리포펙틴과 같은 DNA 혼입 양이온성 지질, 또는 DNA의 폴리리신-매개 전달의 지질 입자를 위한 소낭과 관련될 수 있다. 리포펙틴 또는 사이토펙틴, 음으로 하전된 DNA에 결합하는 지질계 양성 이온은, 세포막을 가로지르도록 하여 세포 내부에 DNA를 제공할 수 있는 착체를 만든다. 다른 한 화학적 방법은 특정 리간드를 세포 표면 수용체에 결합시키고, 그것을 싸서, 세포막을 가로지르도록 하는 것을 포함하는 수용체 이용의 세포내이입(endocytosis)을 이용한다. 리간드는 DNA에 결합하고, 전체 착체가 세포에 수송된다. 리간드 유전자 착체는 혈류에 주사된 후, 수용체를 가지는 표적 세포는 리간드에 특이적으로 결합하여, 리간드-DNA 착체를 세포에 수송하는 것을 포함한다.

많은 유전자 치료 방법은 유전자를 세포에 삽입하는 바이러스성 벡터를 이용하고, 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터와 포함하도록 공학처리될 수 있다. 예를 들어, 변형된 레트로바이러스성 벡터는 유전자를 주변 및 종양 침윤 림프구, 간세포, 상피 세포, 근세포 또는 기타 체세포에 도입하기 위해, 체외 방법에 사용되었다. 이어서, 이 변형된 세포를 환자에 도입하여, 삽입된 DNA로부터 유전자 산물을 제공한다.

바이러스성 벡터는 또한 생체내 프로토콜을 이용하여 세포로 유전자를 삽입하기 위해 사용되었다(예컨대, [Eck, S. L. 및 J. M. Wilson, "Gene Based Therapy", Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 제9판., pp. 77-101, McGraw-Hill, New York(1996)] 참고). 외래 유전자의 조직-특이적 발현을 지정하기 위해, 조직 특이적인 것으로 알려진 시스-작용 조절 요소 또는 프로모터를 사용할 수 있다. 대안적으로, 이는 생체내 특정 해부학적 부위에 대한 DNA 또는 바이러스성 벡터의 인시츄 전달을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 생체내 혈관으로의 유전자 전달은, 동맥 벽의 선택된 부위에 생체외 유도된 내피 세포를 이식함으로써 달성되었다. 바이러스는 유전자 산물을 또한 발현한 주변 세포도 감염시켰다. 바이러스성 벡터는 예를 들어 카테테르에 의해 생체내 부위에 직접적으로 전달되고, 이에 바이러스에 의해 단지 특정 부분만이 감염되도록 하고, 장기적 부위 특이적 유전자 발현을 제공할 수 있다. 레트로바이러스성 벡터를 이용한 생체내 유전자 전달은 또한, 변형된 바이러스를 혈관에 주사하여, 이에 따라 기관에 도달하도록 함으로써, 유선조직 또는 간조직에서 입증되었다.

유전자 치료 프로토콜을 위해 사용된 바이러스성 벡터는 레트로바이러스, 기타 RNA 바이러스, 예컨대 소아마비 바이러스 또는 신드비스 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 연합 바이러스, 포진 바이러스, SV 40, 우두 및 기타 DNA 바이러스를 포함하나, 이들에 제한되지 않는다. 복제-결함 설치류 레트로바이러스성 벡터 및 아데노바이러스성 벡터는 가장 광범위하게 사용되는 유전자 전달 벡터이다. 설치류 백혈병 레트로바이러스는, 핵 코어 단백질 및 중합효소 (pol) 효소와 착화되고, 단백질 코어(gag)로 씌워지고, 숙주 범위를 결정하는 당단백질 엔벨로프(env)에 의해 둘러싸인 단일 나선 RNA로 구성된다. 레트로바이러스의 게놈 구조는 5' 및 3' 길이 말단 반복체(LTR)에 의해 둘러싸여진 gag, pol, 및 env 유전자를 포함한다. 레트로바이러스성 벡터 시스템은, 5' 및 3' LTR를 포함하는 최소 벡터, 및 패키징 신호는 벡터 팩키징, 감염 및 표적 세포로의 통합으로 바이러스 구조 단백질이 팩키징 세포주에 트랜스로 공급되도록 허용함에 있어 충분하다는 사실을 이용한다. 유전자 전달을 위한 레트로바이러스성 벡터의 기본적 이점은 대부분의 세포 유형들에서의 효율적 감염 및 유전자 발현, 표적 세포 염색체 DNA로의 정확한 단일 복제 벡터 통합, 및 레트로바이러스 게놈의 조작 용이성을 포함한다.

아데노바이러스는 코어 단백질로 착화되고 캡시드 단백질로 둘러싸인 선형 이중 나선 DNA로 구성된다. 분자 바이러스학에 있어서의 진전은, 신규 유전 서열을 표적 세포에 생체내 유도할 수 있는 벡터를 생성하기 위해 상기 유기체들의 생물학을 이용할 수 있도록 초래하였다. 아데노바이러스 이용의 벡터는 높은 수준으로 유전자 산물 펩티드를 발현할 것이다. 아데노바이러스성 벡터는 바이러스의 보다 낮은 역가로, 높은 감염 효율을 가진다. 부가적으로, 바이러스는 세포 비함유 비리온으로서 완전 감염성이고, 이에 생산자 세포주의 주사가 필요하지 않다. 아데노바이러스성 벡터에 대한 다른 한 가능한 이점은 일부 세포 유형에서 생체내 이종 유전자의 장기 발현을 달성할 수 있다는 것이다.

아데노바이러스성 벡터가 전형적으로 E1 유전자 결실을 포함하는 복제 비경쟁 아데노바이러스로부터 유래된다. 그러한 벡터는 세포, 예컨대 293개 인간 배아 신장 세포주에 트랜스펙션되어, E1 결실 아데노바이러스가 복제되도록 한다. 트랜스펙션 후, 아데노바이러스성 벡터는 이 분화 헬퍼 세포에서 복제되어, 감염성 입자를 형성하여, 이 입자들이 수집되고 정제되도록 한다. 이 입자는 형질전환 유전자, 예컨대 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터의 발현을 위해 광범위한 숙주 세포들을 감염시킬 수 있으나, 부가적 바이러스 인자의 부가 없이 복제할 수 없다. 복제-경쟁 아데노바이러스의 아데노바이러스 제제 오염 가능성을 감소시키기 위해, 바이러스 게놈에서의 부가적 결실 또는 변이를 갖는 아데노바이러스성 벡터, 예컨대 E1/E3 결실 벡터, 또는 바이러스 유전자들 모두 또는 대부분을 불활성화한 "무자력(gutless)" 벡터가 사용될 수 있다. 대안적으로, U.S. 출원 No. 60/621,782 및 No. 60/631,246에 기재된 바와 같은 전환 단백질 pIX 유전자를 포함한 아데노바이러스성 벡터가 사용될 수 있다.

플라스미드 DNA를 근육 세포에 주사하면, 트랜스펙션되어, 마커 유전자의 발현을 지연한 세포의 높은 퍼센티지가 초래됨이 밝혀졌다. 플라스미드의 DNA가 세포의 게놈에 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 트랜스펙션된 DNA의 비통합은, 세포 또는 미토콘드리아 게놈에서의 변이적 삽입, 결실 또는 변경의 위험없이 연장된 시간된 말단 분화되고 비증식성인 조직에서 유전자 산물 단백질이 트랜스펙션되고 발현되도록 한다. 치료적 유전자의 특정 세포로의, 반드시 영구적이지 않으나 장기적인 전달은 유전 질병의 치료, 또는 예방적 용도를 제공할 수 있다. DNA는 수령 세포의 게놈에 일어나는 변이 없이 유전자 산물 수준을 유지하기 위해 주기적으로 재주사될 수 있다. 외인성 DNA의 비통합은 한 세포 내의 수가지 상이한 외인성 DNA 구축물의 존재를 허용할 수 있고, 그 구축물 모두는 각종 또는 다중 유전자 산물을 발현한다.

입자-매개 유전자 전달 방법을 식물 조직의 형질변환에 먼저 이용하였다. 입자 충격 장치, 또는 "유전자총"을 이용하여, 모티브력을 발생시켜, DNA로 피복된 고밀도 입자(예컨대, 금 또는 텅스텐)를 표적 기관, 조직 또는 세포의 통과를 허용하는 고속으로 가속화한다. 입자 충격은 생체외 시스템에, 또는 체외 또는 생체내 기법으로 사용되어, DNA를 세포, 조직 또는 기관에 도입할 수 있다.

유전자 전달을 위한 전기천공은 세포 또는 조직을 전기천공-매개 유전자 전달에 순응적이도록 전류를 사용한다. 소정의 전계 강도를 갖는 짧은 전기 펄스를 이용하여, DNA 분자가 세포로 투과될 수 있도록 하는 방식으로 막 투과율을 증가시킨다. 이 기법은 생체외 시스템에, 또는 체외 또는 생체내 기법으로 사용되어, DNA를 세포, 조직 또는 기관에 도입할 수 있다.

생체내 담체 매개 유전자 전달을 사용하여 외래 DNA를 세포에 트랜스펙션할 수 있다. 담체-DNA 착체는 편리하게 체액 또는 혈류에 도입된 후, 부위 특이적으로 신체 내 표적 기관 또는 조직에 지정될 수 있다. 리포좀 및 다양이온, 예컨대 폴리리신, 리포펙틴 또는 사이토펙틴 모두가 사용될 수 있다. 세포 특이적 또는 기관 특이적인 리포좀이 개발될 수 있고, 이에 따라 리포좀에 의해 담지된 외래 DNA가 표적 세포에 의해 취해질 수 있다. 특정 세포 상의 특정 수용체를 표적으로 하는 면역리포좀이 수용체를 갖는 세포로 DNA를 삽입하는 한 편리한 방법으로 사용될 수 있다. 사용된 다른 한 담체 시스템은 생체내 유전자 전달을 위해 DNA를 간세포에 전달하기 위한 아시아로당단백질/폴리리신 접합 시스템이다.

트랜스펙션된 DNA는 또한 DNA가 수령 세포로 운반된 후, 세포질 또는 핵원형질에 있도록, 다른 종류의 담체와 착화될 수 있다. DNA는 특별히 공학처리된 소낭 착체 내의 담체 핵 단백질에 결합되어, 핵으로 직접 운반될 수 있다.

예를 들어, 환자로부터 제거된 종양 세포는 항종양 폴리펩티드를 발현하는 본 발병의 벡터로 트랜스펙션되어, 환자에게 재도입될 수 있다. 트랜스펙션된 종양 세포는 종양의 성장을 억제하는 환자 내의 단백질 수준을 생성시킨다. 환자는 인간 또는 비인간 동물일 수 있다. 세포는 또한 당업계에게 공지된 물리적 또는 화학적 방법, 예컨대 전기천공, 이온투과, 또는 "유전자총"을 통해 트랜스펙션될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터를 포함하는 핵산이 담체를 이용하지 않고 직접적으로 환자에게 주사될 수 있다. 특히, 벡터 DNA는 피부, 근육 또는 혈액에 주사될 수 있다.

본 발명의 벡터를 환자에게 트랜스펙션하기 위한 유전자 치료 프로토콜은 벡터 DNA의 세포의 게놈으로의 통합, 소염색체로의 통합을 통한 것이거나, 세포의 세포질 또는 핵원형질의 분리된 복제 또는 비복제 DNA 구축물로서의 것이다. 단백질 발현은 장기 지속될 수 있거나, 세포, 조직 또는 기관 내의 원하는 단백질 수준, 또는 소정의 혈액 수준을 유지하기 위해 주기적으로 재주사될 수 있다.

7. 치료 방안 및 투약량

예방적 용도들에서, 약제학적 조성물 또는 의약품은 본 발명의 재조합 단백질로 치료가능한 장애, 예를 들어 면역 시스템 장애를 앓는 대상에게, 위험을 제거 또는 감소시키거나, 심각도를 경감시키거나, 장애, 및 장애의 발달 중에 나타나는 그 장애의 합병증 및 중간 병리학적 표현형의 생화학적, 조직면역학적 및/또는 거동적 증상을 포함한, 장애의 발병을 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 용도들에서, 조성물 또는 의약품은 그러한 장애를 앓는 것으로 의심되거나 이미 앓은 대상에게, 장애의 발달 중에 나타나는 그 장애의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함한, 장애(생화학적, 조직면역학적 및/또는 거동적 장애)의 증상을 치료하거나 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 본 발명의 폴리펩티드는 혈액 내에 있는 표면 활성 황원의 생물학적 활성을 조절하기에 특히 유용하고, 여기에서 치료 또는 예방되는 질병은, 적어도 부분적으로 항원의 비정상적으로 높거나 낮은 생물학적 활성에 의해 유발된다.

일부 방법들에서, 본 발명의 조성물의 투여는 면역 장애, 예를 들어 염증을 감소시키거나 제거한다. 치료적 또는 예방적 처리를 달성하기에 적당한 양은 치료 또는 예방 유효 투약량으로 정의된다. 예방적 및 치료적 방안 모두에서, 제제는 주로 충분한 면역 반응이 달성될 때까지 수회 투약으로 투여된다.

상기 증상의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 투약량은 투여 수단, 표적 부위, 대상의 생리학적 상태, 대상이 인간 또는 동물인지의 여부, 기타 투야 의약품, 및 처리가 예방적인지 치료적인지의 여부를 포함한, 많은 상이한 인자들에 따라 변화한다. 주로, 대상이 인간이나, 유전자변형 포유동물을 포함한 비인간 포유동물도 또한 치료될 수 있다.

본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물에 의해 발현된 폴리펩티드 및 단백질은 당업자에게 공지된 제형 방법을 이용하여, 약제학적으로 허용가능한 제형물 내에 단리되고, 실질적으로 정제된 단백질 및 단백질 단편으로서 제공될 수 있다. 이 제형물은 표준 경로에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 조합물은 국소, 경피, 복강내, 두개내, 측뇌실내 대뇌내, 질내, 자궁내, 경구, 직장 또는 비경구(예컨대, 정맥내, 척수내, 피하 또는 근육내) 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 생체분해성 중합체에 혼입되어 화합물의 지연 방출을 허용할 수 있고, 중합체는 약물 전달이 요망되는 부근, 예를 들어 종양 부위에 이식되거나, 폴리펩티드가 천천히 계통적으로 방출되도록 이식된다. 캐뉼러를 통해 관심 부위에, 예컨대 그 종양의 전이성장 또는 혈관 공급에 직접 고농도의 폴리펩티드를 제어 전달하도록 하기 위해, 삼투 미니펌프가 또한 사용될 수 있다. 생체분해성 중합체 및 그것의 용도가 예를 들어 [Brem 등, J Neurosurg . 74:441-446(1991)]에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 투약량은 피처리 질병 증상 또는 상태, 및 인간 또는 동물의 체중 및 상태와 같은 기타 임상적 인자, 및 화합물의 투여 경로에 의존할 것이다. 인간 또는 동물의 치료를 위해, 대략 0.5 mg/킬로그램 내지 500 mg/킬로그램의 폴리펩티드가 투여될 수 있다. 특별한 동물 또는 인간에 있어서의 폴리펩티드의 반감기에 따라, 폴리펩티드는 1일 수회 내지 1주 1회 투여될 수 있다. 본 발명은 인간 및 동물의 용도 모두에 대한 용도를 가짐을 이해하도록 한다. 본 발명의 방법은 단일 투여, 및 동시 또는 연장 시간에 걸친 다중 투여를 구상한다.

항체를 이용한 수동 면역에 있어, 투약량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg 숙주 체중, 더욱 통상적으로는 0.01 내지 20 mg/kg 숙주 체중의 범위 내이다. 예를 들어, 투약량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중, 또는 1 내지 10 mg/kg, 바람직하게는 1 mg/kg 이상의 범위 내일 수 있다. 대상은 매일, 교대 일로, 주당 또는 실험 분석에 의해 결정되는 임의의 다른 스케줄에 따라 상기와 같은 투약량으로 투여될 수 있다. 한 예시적 치료는 연장된 기간, 예를 들어 6개월 이상에 걸쳐 다중 투약으로 투여하는 것을 포함한다. 부가적 예시적 치료 방안은 2주마다 1회, 또는 1월 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회로 투여하는 것을 포함한다. 한 예시적 투약량 스케줄은 연속 일수로 1 내지 10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 교대 일로 30 mg/kg, 또는 매주 60 mg/kg을 포함한다. 일부 방법들에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 단클론성 항체가 동시에 투여되고, 이 경우 투여되는 각 항체의 투약량은 나타내어진 범위 내에 포함된다.

항체는 주로 다수 시기에 투여된다. 단일 투약 간의 간격은 주, 월 또는 년일 수 있다. 일부 방법에서, 투약량은 1 내지 1000 ㎍/ml의 혈장 항체 농도, 또한 일부 방법에서는 25 내지 300 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다. 대안적으로, 항체는 지연 방출성 제형물로서 투여될 수 있고, 이 경우에 빈도가 덜한 투여가 요구된다. 투약량 및 빈도수는 대상에게 있어 항체의 반감기에 따라 다양하다. 일반적으로, 인간 항체는 가장 긴 반감기를 가지고, 그 다음으로 긴 것으로는 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 항체이다.

투여의 투약량 및 빈도수는 치료가 예방적 또는 치료적인지의 여부에 따라 다양할 수 있다. 예방적 용도들에서, 본 항체 또는 그것의 칵테일을 함유하는 조성물은 이미 질병 상태에 있지 않은 대상에게 투여되어, 대상의 저항을 증강시킨다. 그러한 양은 "예방적 유효 투약량"으로 정의된다. 이 용도에서, 정확한 양도 역시 대상의 건강 및 일반적 면역 상태에 의존하나, 일반적으로 1회 투약 당, 0.1 내지 25 mg의 범위, 특히 1회 투약 당, 0.5 내지 2.5 mg의 범위 내이다. 비교적 낮은 투약량이 장기간에 걸쳐 비교적 덜 빈번한 간격으로 투여된다. 일부 대상은 자신의 수명의 나머지 동안 계속해서 치료를 받는다.

치료적 용도들에서, 비교적 짧은 간격으로의 비교적 높은 투약량(예컨대, 1회 투약당 약 1 내지 200 mg, 더욱 통상적으로는 5 내지 25 mg의 투약량)은 경우에 따라 질병의 진전이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 대상이 질병의 증상을 부분적으로 또는 완전하게 경감시킴을 나타낼 때까지 필요하다. 그 후, 환자에게 예방적 방안이 적용될 수 있다.

항체를 코딩하는 핵산을 위한 투약량은 1인 대상 당, 약 10 ng 내지 1 g, 100 ng 내지 100 mg, 1 ㎍ 내지 10 mg, 또는 30 내지 300 ㎍ DNA의 범위 내이다. 감염성 바이러스성 벡터를 위한 투약량은 사용된 바이러스성 벡터의 유형에 따라 변화할 것이나, 생체내 1회 투약 당 1×10⁵ 내지 1×10² 비리온일 것이다. 생체외 투약량에 대해, 일반적으로 세포당 투약량 약 0.5 내지 100 비리온이 사용될 것이다.

치료제는 예방적 및/또는 치료적 처리를 위해 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 복강내, 비강내 또는 근육내 수단에 의해 투여될 수 있다. 단백질 약물의 가장 전형적인 투여 경로는 혈관내, 피하, 또는 근육내 투여이나, 다른 경로들도 유효할 수 있다. 일부 방법들에서, 제제는 침착물이 축적된 특별한 조직으로 직접, 예를 들어 두개내 주사에 의해 주사된다. 일부 방법들에서, 항체는 지연 방출성 조성물 또는 장치, 예컨대 메디패드(Medipad)^TM 장치로서 투여된다. 단백질 약물은 또한 호흡기 관을 통해, 예를 들어 건조 분말 흡입 장치를 이용하여 투여될 수 있다.

본 발명의 제제는 임의적으로 본 발명이 표적으로 하는 장애의 치료에 있어 적어도 부분적으로 효과적인 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 임의의 특허, 특허 출원, 특허 공보(국내 및 국제), (특별히 서열 목록 포함) 및 참고문헌은 전체적으로 본원에 참고로 인용된다.

실증

실시예 전반에 걸쳐, 달리 명시되지 않은 한, 하기 물질 및 방법이 사용되었다.

물질 및 방법

일반적으로, 본 발명의 수행은 달리 명시되지 않는 한, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술 및 종양학, 신경학 및 면역학, 특히 예컨대 항체 기술에 있어 통상적 기법을 이용한다. 예컨대, [Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Method in Molecular Biology), 510, Paul, S., humana Pr(1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr(1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow 등, C. S. H. L. Press, Pub.(1999); 및 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel 등, John Wiley & Sons(1992)]를 참고한다.

진핵 세포로의 선택적 스플라이싱 벡터의 도입

진핵 세포에서의 폴리펩티드 발현을 위해, 본 발명의 벡터는 전형적으로 0.28 kV 및 950 uF에서 0.4 cm 큐벳(바이오래드(BioRad), 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재)을 이용하여, 0.8 ml의 HEBS(20 mM 헤페스(Hepes) pH 7.05, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na₂HP0₄, 6 mM 덱스트로스)에서 천공에 의해 CHO 세포에 도입되었다. 각 천공을 위해 약 5×10⁶ 세포를 사용하였다. 전기천공 후, 세포를 실온에서 5 내지 10분 동안 큐벳에서 배양한 후, 10 ml의 혈청 비함유 CHO 배지를 함유하는 원심분리관에 옮겨, 5분 동안 1,000 rpm에서 펠렛화하였다. 이어서, 세포 펠렛을 10 ml의 혈청 비함유 CHO 배질에 재현탁시키고, T75 플라스크에 접종하여, 습윤화 인큐베이터에서 5% C0₂ 하에 36℃에서 인큐베이션하였다. 트랜스펙션한지 3 내지 5일 후에, 컨디셔닝된 배지를 수확하고, 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하였다. 트랜스펙션을 중복 수행하였다.

폴리펩티드 다량체 발현 분석

발현 분석은 전형적으로 DHFR 선택을 이용하여 수행되었다. 안정하게 트랜스펙션된 세포를 트랜스펙션 후 대략 2주 동안 뉴클레오시드가 결핍된 혈청 비함유 CHO 배지에서 성장시켰다. DNA가 트랜스펙션되지 않은 세포(대조군)는 죽었고, 반면 선택가능한 마커를 함유하는 세포는 성장하였다. 세포의 특정 폴리펩티드 다량체 생산성을, 배지를 교환하고, 세포를 2×10⁵ 내지 3×10⁵ 생육성 세포/ml를 접종하여, 세포를 2 내지 3일 동안 성장하도록 한 후, 항체 역가 및 세포 밀도 결정함으로써 평가하였다.

모든 역가들을, FRET 검정, 또는 항체의 가변 영역에 대해 특이적인 ELISA 및/또는 항체의 Fc 영역에 대해 특이적인 ELISA를 이용하여 결정하였다. 간략히, 플레이트를 50 ㎕/아피니퓨어(AffiniPure) 염소 항인간 IgG Fcγ 단편(카달로그 번호 109-005-098, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch), 미국 펜실베니아주 웨스트그루브 소재)의 웰, 또는 PBS 중 10 ㎍/ml의 특이적 항원으로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤동안 인큐베이션하였다. 사용 전, 코팅 용액을 제거하고, PBS, 0.05% 트윈(Tween) 20으로 3회 세정한 후, 200 ㎕/웰 PBS, 0.05 % 트윈 20, 1% BSA (PBST/BSA)으로 1시간 이상 동안 블로킹하였다. 블로킹 용액을 제거하고, 샘플을 표준 곡선과 대비하여 분석하였다. 표준 물질 및 미지 물질 모두를 전형적으로 PBST/BSA 중에 희석하였고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 상술한 바대로 세정하였다. 분취량의 50 ㎕/웰의 퍼옥시다제 접합 아피니퓨어 당나귀 항인간 IgG(H+L) (잭슨 이뮤노리서치 카달로그 번호 709-035-149)를 사용하여, 항체의 존재를 검출하였다. 접합물을 PBST/BSA 중에 1:10,000로 희석하고, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션한 후, 상기한 바와 같이 제거하고 세정하였다. 이어서, 분취량의 100 ㎕/웰의 기질(420 mM 테트라메틸 벤지딘 및 0.1 M 아세트산나트륨 완충액 pH 4.9 중 0.05 % 과산화수소)을 첨가하여, 2분 동안 기질과 함께 인큐베이션한 후, 중단 완충액 100 ㎕/웰 2 N 황산으로 고정함으로써 결합된 항원을 분해시켰다. 수득된 흡광도는, 소프트맥스(Softmax) 소프트웨어(몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)를 이용하여 몰레큘러 디바이시스 플러스 플레이트 리더 상에 450 nm에서 읽혀진다.

FRET 검정을 위해, 50 ㎕의 컨디셔닝된 배지 샘플을, 1% BSA(둘베코 인산염 완충 염액, 카달로그 번호 9280, 어빈 사이언티픽(Irvine Scientific), 미국 캘리포니아주 산타 아나 소재; BSA, 시그마(Sigma), 카달로그 번호 CA-7906)를 갖는 PBS 중에 희석된 75 ㎕의 1.67 ㎍/mL 랜스(Lance)TM Eu-IDEC-152(유로퓸으로 표지된 IgG1 단클론성 항체) 퍼어킨 엘머(Perkin Elmer)(미국 매사츄세츠주 보스톤 소재)와 혼합하였다. 표지된 항체를 첨가한 후, 1% BSA를 갖는 PBS 중에 희석된 6.67 ㎍/mL 파이콜린크(Phycolink)R 염소 항인간 IgG (Fc 특이적)-_XL알로파이코시아닌(APC) 접합물(카달로그 번호 PJ253, 프로자임(Prozyme), 미국 캘리포니아주 샌 린드로 소재)을 함유하는 75 ㎕의 검정 믹스를 첨가한다. 샘플 및 믹스를 뚜껑이 있는 풀 웰 비처리 96웰 블랙 플레이트 내에서 인큐베이션하였고(카달로그 번호 237105, 날지누크 인터내셔널(NalgeNunc International), 미국 뉴욕주 로체스터 소재), 티터 플레이트 쉐이커(카달로그 번호 4625(VWR# 57019-600), 반슈테드(Barnstead)/랩-라인(Lab-Line), 미국 일리노이주 멜로스 파크 소재)를 이용하여 15분 초과 동안 교반하였다. 337 nM에서의 방출 및 665 nM에서의 방출에서 여기되는 시간 분해 형광 방식으로 1420 멀티라벨 카운터(Multilabel Counter)(왈락(Wallac), 미국 미들랜드주 케이더스버르크 소재)를 이용하여 플레이트를 읽는다. 소프트맥스(Softmax) 소프트웨어(몰레큘러 디바이시스)를 이용하여 데이터를 분석하였다.

실시예 1

선택적 스플라이싱을 이용한 다중 폴리펩티드의 발현을 위한 벡터의 공학처리 방법

하기 실시예는 진핵 세포에서 선택적 스플라이싱에 의해 2개 이상의 유전자 산물을 발현하기에 적당한 벡터를 구축하는 방법을 기재한다.

본원에 기재된 발현 벡터는 고유 CMV 스플라이스 도너 및 스플라이스 어셉터와 함께 고유 CMV 인트론을 함유하는, U.S. 출원 No. 10/237,067에 기재된 발현 벡터 pV80의 유도체이다. 간략히, CMV IE1 인트론(인간 거대세포바이러스 균주 AD169)에 선행하는 5' 비번역 영역, 및 고유 스플라이스 도너 서열(SD)을 포함한 CMV IE1 인트론의 5' 절반을 포함하는(5'에서 3'으로, 또는 하향류 방향으로) 거대세포 바이러스 중간체 조기 1(CMV IE1) 프로모터를 포함하는 DNA 구축물을 제조하였다. CMV IE1 인트론의 변형된 3' 부분은 편리하게 교환되는 선택적 스플라이스 어셉터(SA1)에 대한 클로닝 폴리링커(SwaI-BstBI)를 포함하였다. 또한, 인간화 경쇄 유전자가 클로닝되어 들어가는 제1 코딩 서열을 위한 클로닝 부위(AscI)를 변종 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 영역과 함께 SA1의 바로 하향류에서 첨가하였다. 더 하향류에서, 고유 스플라이스 어셉터(SA2) 서열을 포함한 CMV IE1 인트론의 3' 부분을 벡터에 혼입하였다. 인간화 IgGI 중쇄 유전자가 클로닝되어 들어가는 제2 코딩 서열을 위한 클로닝 부위(BamHI)를 변종 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 영역과 함께 SA2의 바로 하향류에서 첨가하였다. 벡터 내 별도의 다른 한 위치에서, 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 선택가능한 마커를 도입하였다. 선택가능한 마커가 pSI(유전자은행, 등록 번호 U47121, 프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 유래되고, SV40 프로모터/인핸서, (선택적 스플라이싱 벡터와 분리된) 인공적 인트론 및 SV40 후 폴리아데닐화 서열에 의해 전사적으로 조절된다. 원핵 세포에서 선택적 스플라이싱 벡터를 클로닝하고 전파하기 위해, 베타 락타마제 유전자를 포함하는 pUCl9로부터 유래된 서열을 부가하였다.

상기 공학처리 단계로부터의 수득된 벡터(즉, pHL005)가 도 3에 나와 있다(또한, AscI 및 BamHI 부위에 삽입된 엑손 코딩 서열이 없는 벡터 골격 서열을 제공하는 서열번호 29 참고). 이 실시예에서, 인간화 항체 경쇄 및 중쇄 서열이 각기 AscI 및 BamHI 부위에 클로닝되었다. 이 벡터는 또한 제1 코딩 서열의 바로 상향류에 있는 제한 부위(SwaI - BstB1)에 다양한 스플라이스 어셉터가 삽입되어, 임의적으로 경쇄 및 중쇄 발현의 비를 변화시키도록 한다.

스플라이스 어셉터의 바로 5'에 있는 인트론의 부분이 결실되어 pHLP005의 벡터 골격을 발생시키는 부가적 발현 벡터를 제조하였다. pHLP005의 인트론 서열은 SwaI 부위의 5'에 있는 PflMI 부위 및 BspEI 부위 대략 310 염기쌍 및 110 염기쌍을 각기 포함한다. 이 결실을 발생시키기 위해, pHLP005 플라스미드를 PflMI 또는 BspEI로 부분 소화시켜 선형화한 후, BspEI으로 완전 소화시키고, 겔 정제하였다.

상이한 제1 스플라이스 어셉터(SA1)를 갖는 발현 벡터를 발생시키기 위해, PflMI 및 BspEI 또는 BspEI 및 BspEI 상용성 부위를 갖는 올리고-뉴클레오티드(서열번호 1-28)를 각각의 pHLP005 소화 벡터에 접합시켜, 새로운 벡터 명칭을 얻었다(도 4). 이어서, 모든 구축물들을 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.

수득된 벡터는 5'에서 3'으로, 또는 하향류 배향으로 고유 CMV 스플라이스 도너(SD), 서열번호 1-28로부터 선택된 제1 스플라이스 어셉터(SA1), 제1 폴리펩티드의 삽입을 위한 제1 제한 부위(AscI), 고유 CMV 스플라이스 어셉터인 제2 스플라이스 어셉터(SA2), 및 제2 폴리펩티드의 도입을 위한 제2 제한 부위(BamHI)를 포함한다.

프라이머를 이용하는 중합효소 사슬 반응(PCR)을 이용하여 항체 경쇄 및 중쇄 서열을 제조하였고, 수득된 산물을 표준 유전공학 기법을 이용하여 벡터에 도입하였다. 사용된 프라이머는 AscI 및 BamHI 부위로의 삽입을 위한 코딩 영역에 인접하는 제한 부위를 포함하였다. 예를 들어, 5' 프라이머는 경쇄에 대해서는 TTTTGGCGCGCC ATGN(20)(서열번호 32)일 수 있고, 중쇄에 대해서는 TTTTGGATCC ATGN(20)(서열번호 33)일 수 있다. 3' 프라이머는 경쇄에 대해서는 GCACGGCGCGCC CTAN(20)(서열번호 34)일 수 있고, 중쇄에 대해서는 GCAGGGATCC TCAN(20)(서열번호 35)일 수 있다. 이 프라이머를 위해, N(20)은 원하는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 DNA에 대해 특이적인 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

실시예 2

선택적 스플라이싱 효율의 결정 방법

이 실시예에서, 상이한 스플라이스 어셉터에 인접한 엑손에 의해 코딩된 2개의 상이한 유전자 산물을 발현하기 위한 선택적 스플라이싱의 이용 효율을 결정하는 방법 및 구축물이 기재된다.

스플라이싱이 엑손/인트론 접합부에서 일치 서열에 의해 매개되나, 스플라이싱 효능의 정확한 예측은 단독 이 서열만으로 결정될 수 없다. 이 이유로 인해, 생성된 다량체형 단백질의 총양으로서 여기에서 측정될 수 있는, 산물의 적절한 비를 발생시키게 되는 스플라이스 어셉터 서열을 확인하기 위해 실험적 방법이 필요하다. 따라서, 본 발명은 임의의 소정의 세포주 내의 바람직한 스플라이스 부위의 효율적인 선별 조합을 위한 편리한 벡터를 제공한다.

선택적 스플라이스 부위를 갖는 다양한 발현 벡터를 발생시키기 위해, pHLP005 벡터 내의 SwaI 및 BstBI 부위로 삽입하기 위한 BstBI 상용성 말단 및 블런트 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드를 발생시켰다. DNA 서열 분석에 의해 모든 구축물들을 확인하였다. 피험 스플라이스 부위의 서열이 도 4 및 서열목록(즉, 서열번호 1-28)에 나와 있다.

각종 스플라이스 어셉터들로 발생된 벡터들을 전기천공에 의해 일시적 또는 안정한 트랜스펙션을 이용하여 비교하였다. 트랜스펙션을 위해 사용된 숙주 세포는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 결핍 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주 DG44(Urlaub 등, Cell 33, 405-412(1983))였다. 메가프레프(Megaprep) 키트(키아겐(Qiagen), 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 이용하여, 모든 DNA를 제조하였다. 트랜스펙션 전에, DNA를 에탄올(EtOH)로 석출시켰고, 70% EtOH 중에 세정하고 건조시켜, HEBS 에 재현탁시켰으며, 정량화한 후, 트랜스펙션하였다. 음성 대조군은 DNA 트랜스펙션을 가지지 않았고, 트랜스펙션 대조군으로서 사용되었다. mAb 특이적 ELISA 및IgG 특이적 ELISA 모두는 세포 배양 배지로 분비된 총 항체를 측정한다. 일시적으로 트랜스펙션된 세포에 대한 총 항체 발현 수준이 표 1에 나와 있다.

결과는, 특정 스플라이스 부위, 예컨대 pHLP0015 및 pHLP0018이 CHO 세포 중에 일시적으로 시험할 때, 다른 것들보다 더욱 효율적이고, 이에 보다 높은 총 항체 수준을 생성시킴을 입증한다.

실시예 3

진핵 세포에서의 선택적으로 스플라이싱된 유전자 산물의 발현

이 실시예에서, 선택적으로 스플라이싱된 유전자 산물, 특히 조립된 IgG 항체의 발현이 기재된다.

간략히, CHO 세포를 전기천공에 의해 본 발명의 선택적 스플라이싱 벡터로 트랜스펙션하였고, 상기된 바와 같이 선택적 배지에서 약 2주 동안 회수하여, 안정하게 트랜스펙션된 세포를 생성시켰다. 3 내지 5일 후, 컨디셔닝된 배지를 수확하여, ELISA에 의해 항체 역가를 결정하였다.

첫 번째 실험에서, 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 분리된 벡터의 50 ㎍의 DNA, 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 50 ㎍의 선택적으로 스플라이싱된 벡터, 또는 무 DNA를 진핵 세포(CHO)에 도입하였고, 항체 결합 활성의 함수로서의 세포에 의해 생산된 기능적 폴리펩티드 다량체의 양을 결정하였다(표 2).

첫 번째 실험으로부터의 결과는 선택적 스플라이싱 벡터로부터 기능적 폴리펩티드 다량체, 예컨대 단클론성 항체로부터의 산물을 생산할 수 있다는 원칙을 입증한다.

부가적 실험들에서, 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 분리된 벡터의 25 ㎍의 DNA, 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 50 ㎍의 선택적으로 스플라이싱된 벡터, 또는 무 DNA를 진핵 세포(CHO)에 도입하였고, 항체 결합 활성의 함수로서의 세포에 의해 생성된 기능적 폴리펩티드 다량체의 양을 결정하였다(표 3 내지 6).

실험들로부터의 결과는 선택적 스플라이싱 벡터로부터 기능적 폴리펩티드 다량체, 예컨대 단클론성 항체 산물을 생산시킬 수 있음을 입증한다. 데이터는 pHLP015가 높은 수준의 기능적 항체를 생성시킬 수 있는 능력으로 인해 다른 것들보다 양호한 선택적 스플라이싱 벡터임을 제시한다.

따라서, 기능적 폴리펩티드 다량체, 예컨대 항체는 진핵 세포에서 일시적이고도 안정하게, 선택적 스플라이싱 벡터를 이용하여 생산될 수 있는 것으로 결론지어졌다. 그러므로, 선택적 스플라이싱을 통해 1개 초과의 폴리펩티드를 발현하는 하나의 벡터 시스템의 용이성 및 유용성이 입증되었다.

실시예 4

벡터가 양호한 발현 잠재능을 갖는 세포주를 생산할 수 있음의 입증

본 발명의 벡터는 항체 발현을 위한 경쇄 및 중쇄의 비를 최적화하기 위해 설게되었다. 면역글로불린 중쇄는 경쇄와 조립되지 않을 경우 분비되지 않고, 한편 대부분의 경쇄들은 자유 분자로서 분비될 수 있다. 따라서, 과량의 자유 경쇄는 경쇄 생산에 대한 중쇄의 비를 증가시키기 위해 벡터를 더 최적화할 필요가 있음을 나타낸다. 자유 경쇄의 생산을 평가하기 위해, 발명의 벡터들 중 하나를 함유하는 세포주를 생성시키고, 분비된 재조합 자유 경쇄 및/또는 조립된 항체 다량체 산물을 함유하는 컨디셔닝된 배지를 평가하였다(표 7).

벡터 생성

실시예 1 및 2에 기재된 바대로 pHLP015계 벡터를 제조하였다. 이 벡터를 CHO 세포에 삽입하였고, 전술된 바와 같이 안정한 트랜스펙션을 위해 선택되었다. 전술된 바와 같이 FRET 분석에 의해 측정될 때, 1일, 1 세포당, 과량의 10 피코그램의 생산 단백질에서의 특이적 생산성의 산업적 표준을 표적으로 하여 증폭된 세포주가 유도되었다. 이하 제공된 결과는 항체 생산을 위해 허용가능한 세포주를 제조함에 있어 이 발현 벡터의 유용성을 입증한다.

RT- PCR 결과는 예측된 스플라이스 부위를 확인함

세포 RNA의 역전사, 및 그에 이은 cDNA의 중합효소 사슬 반응(RT-PCR)을 수행하여, 발현 벡터 설계로부터 예측되는 접합부에 대한 경쇄 및 중쇄 mRNA의 스플라이스 접합부를 확인하였다. 안정하게 트랜스펙션된 세포주를 플라스미드 pHLP015를 이용하여 한 트랜스펙션으로부터 단리하였고, 총 RNA를 제조하였다(RNAwiz, 앰비온, 미국 텍사스주 오스틴 소재). 중쇄 mRNA의 대략적 중심에 대해 상보적인 프라이머를 이용하여, 역전사효소(수퍼스크립트(Superscript) III 역전사효소, 인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 이용하여 cDNA를 생성시켰다. 이어서, CMV 5' 비번역 영역(스플라이스 도너의 5') 내의 프라이머, 및 코딩 영역(중쇄 코딩 서열 중 스플라이스 어셉터의 3') 내의 프라이머를 이용하여, cDNA를 PCR용 주형(Vent DNA 중합효소, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 메사츄세츠주 비벌리 소재)으로 사용하였다. 이 PCR 산물을 시퀀싱하였고, CMV 인트론 내의 스플라이스 도너와 중쇄 코딩 서열의 바로 5'에 있는 스플라이스 어셉터 사이의 예측된 스플라이스 산물을 확인하였다.

프라이머로서 올리고(dT) 15를 이용하여, 역전사효소(역전사 시스템, 프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 이용하여 세포 DNA로부터 cDNA를 생성시켰다. CMV 5' 비번역 영역(스플라이스 도너의 5') 내의 프라이머, 및 코딩 영역(경쇄 코딩 서열 중 스플라이스 어셉터의 3') 내의 프라이머를 이용하여, 상기 cDNA를 PCR용 주형(Vent DNA 중합효소, 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 메사츄세츠주 비벌리 소재)으로 사용하였다. 이 PCR 산물을 시퀀싱하였고, CMV 인트론 내의 스플라이스 도너와 경쇄 코딩 서열의 바로 5'에 있는 스플라이스 어셉터 사이의 예측된 스플라이스 산물을 확인하였다.

컨디셔닝된 배지의 SDS-PAGE 분석

안정하게 트랜스펙션된 세포주를 실시예 1 내지 3으로부터의 플라스미드 pHLP015(표 7에서의 mAb#1-1)를 이용하여 트랜스펙션으로부터 단리하였다. 또한, 다른 한 pHLP015계 벡터(이 실시예에서 생성된 것, 표 7에서의 mAb#2-1 내지 5)를 이용하여, 수많은 안정하게 트랜스펙션된 세포주를 생성시켰다.

전체 mAb 및 자유 경쇄를 정제하기 위해, 대략 50 ml의 컨디셔닝된 배지를 단백질 L-아가로스(카달로그 번호 P3351, 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich), 미국 미조리주 세인트루이스 소재)의 1.3 mL 칼럼에 적용하였고, 칼럼을 15 mL 3×PBS및 5 mL 1×PBS로 차례로 세정한 후, 및 100 mM NaH₂PO₄(pH 2.8, 0.3 mL 분취량)으로 용리하여, 75 ㎕ 1 M 헤페스(pH 8)로 바로 중화하였다. 280 nm에서의 UV 흡광도에 의해 단백질 피크의 위치를 결정하였고, 1.5 A280/mg/mL의 소광 계수를 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 한 적절한 부피의 피크 샘플을 샘플 완충액으로 희석하여, 15 ㎕ 중 1.5 ㎍의 단백질을 로딩하였다.

램리(Laemmli)계 샘플 완충액(0.25 M 트리스-HCl, pH 6.8, 8% SDS, 40% 글리세롤, 및 0.01% 브로모페놀 블루)의 4× 원액을 비환원 겔에 대해 프레쉬 100 mM NEM로 제조하였다. 샘플을 100℃에서 5분 동안 가열하고, 15 ㎕을 PAGEr 골드 프레캐스트(Gold Precast) 4 내지 20% 트리스-글리신 겔(카달로그 번호 59517, 캄브렉스(Cambrex), 미국 뉴저지주 이스트 루더포드 소재)에 로딩하였다. 겔을 램리 완충액 중에 40분 동안 45 mA에서 운용하였다. 운용 후, 1분 동안 마이크로파처리하고, 10분 동안 쉐이킹함으로써, 겔을 대략 100 mL 쿠마씨 블루 클레브랜드 염색(Coomassie Blue Cleveland Stain)(50% 메탄올, 10% 아세트산, 0.1% 쿠마씨 블루)으로 염색하였다. 이어서, 겔을 2분 동안 마이크로파처리하고, 하룻밤 동안 흡수성 폼과 함께 쉐이킹함으로써, 대략 100 mL 10% 메탄올, 10% 아세트산 중에서 탈색시켰다. 겔을 바이오래드(Biorad) GS-800 보정 밀도계로 스캐닝하였고, 전체 항체 및 자유 경쇄 밴드를 바이오래드 퀀터티 원(Biorad Quantity One) 소프트웨어로 이용하여 정량화하였다. 전체 분비 단백질(전체 항체 + 자유 경쇄)의 백분율로서의 자유 경쇄의 양이 표 7에 나와 있다.

pHLP015계 세포주로부터의 컨디셔닝된 배지 내의 전체 항체 및 자유 경쇄의 상대량의 평가

세포주	% 자유 LC
mAb#1-1	비검출
mAb#2-1	14
mAb#2-2	14
mAb#2-3	16
mAb#2-4	비검출
mAb#2-5	비검출

표 7에서 보는 바와 같이, 자유 경쇄의 높은 수준이 검출되지 않았으며, 이는 벡터가 중쇄에 대한 경쇄의 발현에 균형이 잘 이루어짐을 가리킨다.

실시예 5

다량체형 단백질 생산 벡터

본 발명의 벡터 및 발현 카세트 또는 구축물을 사용하여, 상기 발명의 상세한 설명에 기재된 다량체형 단백질들을 비제한적으로 포함한 임의의 다량체형 단백질을 발현할 수 있다. 그러한 많은 단백질들이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 벡터, 및 발현 카세트 또는 구축물에 사용하기에 적당하다. 발현되는 폴리펩티드의 수는 다양할 수 있다. 예를 들어, 2개 폴리펩티드가 전술한 바와 같이 발현될 수 있다. 부가적 폴리펩티드는 폴리펩티드 코딩 엑손을 벡터에, 바람직하게는 제1 엑손과 제2 스플라이스 어셉터 사이에 삽입함으로써 발현될 수 있다. 각각의 부가적 엑손은 엑손에 대해 5'에 있는 스플라이스 어셉터를 가져, 단일 스플라이스 도너와 개별 스플라이스 어셉터 사이에 스플라이싱이 일어날 때 엑손이 전사를 제어하도록 한다. 따라서, 1개 초과의 폴리펩티드가 동일한 스플라이스 도너 및 상이한 스플라이스 어셉터를 사용하여 발현되어, 원하는 단백질 또는 단백질들의 발현을 최적화하는 비로 폴리펩티드를 발현할 수 있다.

다량체형 단백질의 발현을 최적화하는 비로 폴리펩티드 사슬의 스플라이싱 및 후속 번역을 허용하는 스플라이스 어셉터를 포함하는, 상시 실시예들에 기재된 바와 같은 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 제조한다. 먼저, 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 유전자를 클로닝하거나, 표준 기법, 예컨대 사슬에 특이적인 프라이머 및 원하는 폴리펩티드. 유전자를 발현하는 유전자를 포함한 적절한 라이브러리를 이용하는 RT-PCR에 의해 증폭시킨다. 이어서, 유전자를 높은 수준의 다량체형 단백질을 발현하기에 충분한 적절한 비로 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 본 발명의 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물에 삽입한다. 이 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물은 스플라이스 부위, 엑손 및 기타 원하는 요소의 삽입을 촉진하는 편리한 제한 부위를 가질 수 있다. 예를 들어, pHLP0015이 사용될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드 코딩 유전자를, 상이한 제1 스플라이스 어셉터를 각기 가지는, 1개 초과의 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물에 삽입하여, 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이 적절한 발현 수준을 허용하는 스플라이스 어셉터에 대해 선별한다. 마지막으로, 폴리펩티드를 코딩하는 벡터 또는 벡터, 또는 발현 카세트 또는 구축물을 적절한 세포주, 예컨대 포유동물 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포에 삽입하여 발현시킨다. 이어서, 다량체형 단백질을, 분비된 경우에는 세포 배양 배지로부터, 또는 단백질이 세포내에 있거나 막에 결합된 경우에는 용해된 세포로부터 수집할 수 있다.

본원에 인용된 모든 참고문헌들은 전체적으로 본원에 참고로 인용된다.

균등물

당업자들에 대해, 단지 일상적 실험을 이용함으로써 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 많은 균등물들이 있다. 그러한 균등물은 하기 특허청구범위에 의해 포괄되도록 의도된다.

[서열목록]

Claims (46)

1. 프로모터;

   5' UTR;

   단일 스플라이스 도너;

   인트론;

   제1 스플라이스 어셉터;

   제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 엑손;

   제2 스플라이스 어셉터; 및

   제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 엑손

   을 포함하고,

   프로모터가 제1 및 제2 엑손에 작용적으로 연결되어 있고,

   상기 단일 스플라이스 도너가 세포에 도입될 때, 상기 제1 스플라이스 어셉터와 스플라이싱하여 상기 제1 엑손의 전사를 허용하는 스플라이싱된 전사체를 형성하고, 상기 제2 스플라이스 어셉터와 스플라이싱하여 상기 제2 엑손의 전사를 허용하는 스플라이싱된 전사체를 형성하며,

   상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드가 상기 스플라이싱된 전사체로부터 발현되는 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터인 벡터.
3. 제1항에 있어서, 상기 제1 엑손 또는 제2 엑손에 작용적으로 연결된 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는 벡터.
4. 제1항에 있어서, 상기 벡터가 하나 이상의 부가적 스플라이스 어셉터 및 부가적 폴리펩티드를 코딩하는 부가적 엑손을 추가로 포함하고,

   상기 단일 스플라이스 도너가 세포에 도입될 때, 상기 부가적 스플라이스 어셉터와 스플라이싱하여 상기 부가적 엑손의 전사를 허용하는 부가적 스플라이싱된 전사체를 형성하고,

   상기 부가적 폴리펩티드가 상기 부가적 스플라이싱된 전사체로부터 발현되는 벡터.
5. 제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 엑손, 또는 양자 모두가 선택가능한 마커를 코딩하는 벡터.
6. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 다량체를 형성하는 벡터.
7. 제6항에 있어서, 상기 다량체형 단백질이 이종이량체, 이종삼량체 또는 이종사량체인 벡터.
8. 제1항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 상기 제2 폴리펩티드에 대해 약 10:1 내지 약 1:10의 빈도로 발현되는 벡터.
9. 제1항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 상기 제2 폴리펩티드에 대해 약 3:1 내지 약 1:3의 빈도로 발현되는 벡터.
10. 제1항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 상기 제2 폴리펩티드에 대해 약 1:1의 빈도로 발현되는 벡터.
11. 제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 스플라이스 어셉터가 서열번호 1-28로 구성된 군으로부터 선택되는 서열들 중 어느 하나를 포함하는 벡터.
12. 제11항에 있어서, 상기 스플라이스 도너 및 상기 제2 스플라이스 어셉터가 CMV로부터 유래되고, 상기 제1 스플라이스 어셉터가 서열번호 1-28로 구성된 군으로부터 선택되는 서열들 중 어느 하나를 포함하는 벡터.
13. 제1항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스성 벡터인 벡터.
14. 제1항에 있어서, 서열번호 29를 포함하는 벡터.
15. 제1항의 벡터를 포함하는 진핵 세포.
16. 제15항에 있어서, 벡터가 상기 세포의 염색체 DNA에 통합되는 세포.
17. 제15항에 있어서, 벡터가 염색체외(episomal)인 세포.
18. 제1항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포 또는 효모 세포인 세포.
19. 제18항에 있어서, 상기 세포가 베이비 햄스터 신장 세포, 섬유아세포, 골수종 세포, NS0 세포, PER.C6 세포 또는 CHO 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 세포.
20. 제19항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포인 세포.
21. 배양액 중에 제15항의 세포를 배양하고, 배양액으로부터 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
22. 제21항의 방법에 의해 제조된 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드.
23. 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 제22항의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
24. 제23항의 조성물을 이용하여 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법.
25. 프로모터;

    5' UTR;

    단일 스플라이스 도너;

    인트론;

    제1 스플라이스 어셉터;

    제1 항체 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 코딩하는 제1 엑손;

    제2 스플라이스 어셉터; 및

    제2 항체 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 코딩하는 제2 엑손

    을 포함하고,

    프로모터가 제1 및 제2 엑손에 작용적으로 연결되어 있고,

    상기 단일 스플라이스 도너가 세포에 도입될 때, 상기 제1 스플라이스 어셉터와 스플라이싱하여 상기 제1 엑손의 전사를 허용하는 스플라이싱된 전사체를 형성하고, 상기 제2 스플라이스 어셉터와 스플라이싱하여 상기 제2 엑손의 전사를 허용하는 스플라이싱된 전사체를 형성하며,

    상기 제1 항체 폴리펩티드 또는 그것의 단편 및 상기 제2 항체 폴리펩티드 또는 그것의 단편이 상기 스플라이싱된 전사체로부터 발현되고 연합하여, 항체 또 는 항체 단편을 형성하는 발현 벡터.
26. 제25항에 있어서, 상기 제1 엑손 또는 상기 제2 엑손, 또는 양자 모두가 항체 단편을 코딩하는 벡터.
27. 제25항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드가 항체 중쇄 또는 그것의 단편이고, 상기 제2 폴리펩티드가 항체 경쇄 또는 그것의 단편인 벡터.
28. 제25항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드가 항체 경쇄 또는 그것의 단편이고, 상기 제2 폴리펩티드가 항체 중쇄 또는 그것의 단편인 벡터.
29. 제27항에 있어서, 경쇄 또는 중쇄, 또는 양자 모두가 설치류, 키메라, 인간화, 인간 또는 합성의 것인 벡터.
30. 제28항에 있어서, 경쇄 또는 중쇄, 또는 양자 모두가 설치류, 키메라, 인간화, 인간 또는 합성의 것인 벡터.
31. 제25항에 있어서, 제1 항체 폴리펩티드 또는 그것의 단편이 상기 제2 항체 폴리펩티드 또는 그것의 단편에 대해 약 3:1 내지 약 1:3의 빈도로 발현되는 벡터.
32. 제25항에 있어서, 제1 항체 폴리펩티드 또는 그것의 단편이 상기 제2 항체 폴리펩티드 또는 그것의 단편에 대해 약 1:1의 빈도로 발현되는 벡터.
33. 제25항에 있어서, 상기 제1 스플라이스 어셉터 또는 상기 제2 스플라이스 어셉터가 서열번호 1-28로 구성된 군으로부터 선택되는 서열들 중 어느 하나를 포함하는 벡터.
34. 제33항에 있어서, 상기 스플라이스 도너 및 상기 제2 스플라이스 어셉터가 CMV로부터 유래되고, 상기 제1 스플라이스 어셉터가 서열번호 1-28로 구성된 군으로부터 선택되는 서열들 중 어느 하나를 포함하는 벡터.
35. 제25항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스성 벡터인 벡터.
36. 제25항에 있어서, 서열번호 29를 포함하는 벡터.
37. 제25항의 벡터를 포함하는 진핵 세포.
38. 제37항에 있어서, 상기 벡터가 상기 세포의 염색체 DNA로 통합되는 세포.
39. 제37항에 있어서, 상기 벡터가 염색체외인 세포.
40. 제37항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포 또는 효모 세포인 세포.
41. 제40항에 있어서, 상기 세포가 베이비 햄스터 신장 세포, 섬유아세포, 골수종 세포, NS0 세포, PER.C6 세포 또는 CHO 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 세포.
42. 제41항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포인 세포.
43. 배양액 중에 제37항의 세포를 배양하고, 배양액으로부터 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는 항체 또는 항체 단편의 제조 방법.
44. 제43항의 방법에 의해 제조된 항체 또는 항체 단편.
45. 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 제44항의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물.
46. 제45항의 조성물을 이용하여 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법.

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