CN104805111A

CN104805111A - 一种海鞘多肽cs5931的制备方法

Info

Publication number: CN104805111A
Application number: CN201510263148.9A
Authority: CN
Inventors: 郑兰红; 林秀坤; 许焕丽; 吕梅
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2015-05-21
Filing date: 2015-05-21
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2035-05-21
Also published as: CN104805111B

Abstract

一种海鞘多肽CS5931的制备方法，属于药学科学领域，包括重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵、海鞘多肽CS5931的分离纯化和变性复性。在发酵过程中IPTG添加的终浓度为0.4mM-0.7mM；所述的活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养的接种量在3-6％；所述的工程菌活化后接种入LB培养基中的装液量在20-45％；所述IPTG加入后的发酵培养温度为23℃-30℃。优化后表达收率达到0.703g/L，与现有技术相比提高了2.01倍。纯化后的多肽对人结肠癌细胞HCT116的抑制作用增强，IC₅₀值由现有技术的1.94μM降低到了1.41μM。

Description

一种海鞘多肽CS5931的制备方法

技术领域

本发明属于药学科学领域，具体地涉及一种海鞘多肽CS5931的制备方法

背景技术

玻璃海鞘广泛分布于山东沿海地区，它是发育与进化生物学研究的重要生物，且近年来研究发现它具有抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、免疫调节以及生物催化等作用，因而引起人们广泛关注。玻璃海鞘具有广泛的应用价值，因此被《Science》杂志称为生物学研究的后起之秀，具有良好的应用前景。

从萨氏海鞘(Ciona savignyi)中分离出的一种新型多肽CS5931具有显著的抗肿瘤活性，N-末端序列分析发现，CS5931与人颗粒体蛋白(granulin，GRN)有同源性。本课题组已成功通过大肠杆菌原核表达系统表达了重组萨氏海鞘多肽CS5931，其同样具有显著的抗肿瘤活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种海鞘多肽CS5931的制备方法，本发明方法对现有的通过大肠杆菌原核表达系统表达了重组萨氏海鞘多肽CS5931的发酵、分离纯化和变性复性方法进行了进一步改进，从IPTG的浓度、IPTG添加时间、诱导时间、接种量、装液量、培养温度等方面优化表达体系的发酵条件，发酵条件优化后表达收率达0.703g/L，与优化前相比提高了2.01倍，且抗肿瘤活性增强。

一种海鞘多肽CS5931的制备方法，包括重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵、海鞘多肽CS5931的分离纯化和变性复性；

所述的重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵：克隆编码多肽CS5931的基因连接入含有分子伴侣pG-KJE8的质粒PET-21a载体上，导入表达菌BL21(DE3)构成工程菌BL21(DE3)/pET21a-CS5931(简称pET21a-CS5931,下同)，将pET21a-CS5931接种在含有氨苄的培养基上进行活化，活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养，接种后4-5h时加入L-阿拉伯糖、四环素及IPTG进行诱导，继续发酵培养4.5-8.5h；

所述的IPTG添加的终浓度为0.4mM-0.7mM；所述的活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中的接种量在3-6％；所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基中发酵的装液量在20-45％；所述IPTG加入后的发酵温度为23℃-30℃；

所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化：通过镍离子金属螯合层析方法纯化重组萨氏海鞘多肽CS5931的可溶性表达组分；利用组氨酸侧链上的咪唑基与金属离子Ni²⁺螯合的特性，使带有His标签的重组萨氏海鞘多肽CS5931得到分离，并利用60-75mM咪唑缓冲液洗涤杂蛋白，优选为65mM，250-350mM咪唑缓冲液洗脱目的多肽CS5931，优选为300mM；使目的蛋白得到纯化；

所述的变性复性：向洗脱得到的目的蛋白溶液中分次缓慢加入8M尿素，1-3mM L-半胱氨酸，0.3-0.6mM L-精氨酸，0.3-0.6mM EDTA，反应3-5h；多肽样品变性完成后，将变性样品放于透析袋中，在复性液中透析24-30h，期间换1次复性液；复性完成后，将复性液更换为透析液，透析3-5h，将透析完成的样品加入1-2倍于样品多肽的甘露醇后冻干得到纯化后的多肽CS5931。

进一步，所述IPTG添加的终浓度为0.6mM时诱导表达效果最好；所述IPTG的添加时间为接种后4.5h；所述活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中接种量在4％，加入IPTG后发酵培养温度30℃，所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基发酵的装液量在20％；

进一步，所述的复性液的成份及其终浓度为0.3-0.6mM L-精氨酸、0.5M尿素、1-3mM L-半胱氨酸或还原型谷胱甘肽作为还原剂，0.1-0.3mM L-胱氨酸或氧化型谷胱甘肽作为氧化剂，还原剂和氧化剂两者摩尔比为10:1，上述物质溶解在TGE缓冲液中。

TGE缓冲液的成份及其终浓度为是：0.05-0.15M Tris，0.25-0.75mM EDTA，0.05-0.15M NaCl，加1.0L蒸馏水，1M盐酸调pH到8.0，加20-100mL甘油，混匀后定容至2L。透析液的成份及其终浓度为：0.05-0.15MTris，0.3-0.6mM L-精氨酸、加600mL蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，溶解后定容到1000mL。

进一步，重组多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵：取-80℃保存的甘油菌pET21a-CS5931于含100μg/mL Amp的3mL LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜后涂平板，37℃倒置培养12h，从平板上挑含有目的基因的表达菌BL21(DE3)的单菌落接于含100μg/mL Amp的10mL LB培养基中，37℃，200r/min活化培养12h，将活化的种子液以4％的接种量转接入50mL LB培养基中，培养基中含有100μg/mL的Amp和20μg/mL的氯霉素，装液量为20％，37℃，200r/min培养，待OD₆₀₀达到0.6左右时加入500μg/mL的L-阿拉伯糖、1μg/mL的四环素及IPTG进行诱导，继续培养6.5h；

进一步，所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化：

(1)将发酵所得菌体离心，收集菌体沉淀，称量菌重；

(2)冰上融解菌体沉淀，按每克菌加3-5mL细菌裂解液的比例加细菌裂解液，冰上裂解40-60min；超声波破碎菌体后，离心，取上清，用滤膜过滤；

(3)利用蛋白纯化系统，安装镍柱后用超纯水洗10-15个柱床体积，流速为3-5mL/min；

(4)用结合缓冲液平衡10-15个柱床体积，流速为3-5mL/min；

(5)将细菌裂解液上清液以流速为1-2mL/min上柱；

(6)用10mM咪唑缓冲液洗10-15个柱床体积，洗去未结合蛋白，流速为3-5mL/min，直至基线水平；

(7)用60-75mM咪唑缓冲液洗涤杂蛋白，流速为1-2mL/min，比较各洗涤峰的大小，直至基线水平；

(8)用250-350mM咪唑缓冲液对目的蛋白进行梯度洗脱，收集洗脱峰，用12％SDS-PAGE胶检测目的蛋白的纯度，将达到纯度要求的蛋白样品变性；

进一步，所述的细菌裂解液的成分及终浓度是：15-25mM Tris，0.5-1.5MNaCl，5-15mM咪唑，0.5-1g溶菌酶，加600mL蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，溶解后定容到1000mL。

本发明与现有技术相比的有益效果

本发明人通过研究发现影响发酵条件的3个关键因素是IPTG浓度、IPTG加入时间和诱导温度，IPTG浓度0.6mM，添加IPTG时间在接菌后4.5h，诱导温度30℃。优化后表达收率达到0.703g/L，与现有技术相比提高了2.01倍。

本发明经分离纯化条件优化实验得出，最佳分离纯化条件是65mM咪唑缓冲液洗涤杂蛋白、300mM咪唑缓冲液洗脱目的多肽CS5931；将纯化得到的多肽样品使用本发明复性液进行透析复性，可得到具有较好的肿瘤细胞体外增殖抑制作用的重组多肽CS5931，对人结肠癌细胞HCT116的抑制作用增强，IC₅₀值由现有技术的1.94μM(Zhao jin,Cloning,characterization and expression of aacDNA encoding agranulin-like polypeptide in Ciona savignyi.Biochimie)降低到了1.41μM，对人胰腺癌细胞Panc28、人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人肝癌细胞BEL-7402等也具有增殖抑制作用

附图说明

图1不同IPTG浓度诱导的菌体电泳：M：蛋白marker；1-6：IPTG浓度分别为0、0.1、0.4、0.7、1.0、1.3mM时菌体电泳图，方框中为目的蛋白条带；

图2不同IPTG浓度的表达收率；(表达收率＝干菌重*表达率)

图3不同IPTG添加时间的表达收率量；(表达收率＝干菌重*表达率)

图4不同诱导时间的表达收率量；(表达收率＝干菌重*表达率)

图5不同接种量的表达收率；(表达收率＝干菌重*表达率)

图6不同装液量的表达收率；(表达收率＝干菌重*表达率)

图7不同诱导温度表达收率；(表达收率＝干菌重*表达率)

图8不同浓度咪唑洗涤杂蛋白峰形：A、75mM咪唑缓冲液洗杂蛋白峰形图；B、70mM咪唑缓冲液洗杂蛋白峰形图；C、65mM咪唑缓冲液洗杂蛋白峰形图

图9重组萨氏海鞘多肽CS5931的SDS-PAGE；

图10重组萨氏海鞘多肽CS5931对人结肠癌细胞HCT116的抗瘤谱图。

具体实施方式

实施例1重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵条件优化

克隆编码多肽CS5931的基因连接入含有分子伴侣pG-KJE8的质粒PET-21a载体上，导入表达菌BL21(DE3)。取-80℃保存的甘油菌pET21a-CS5931于含100μg/mL Amp的3mL LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜后涂平板，37℃倒置培养12h。从平板上挑单菌落接于含100μg/mL Amp的10mL LB培养基中，37℃，200r/min活化培养12h。实验在250mL摇瓶中进行，将活化的种子液转接入50mL LB培养基中，培养基中含有100μg/mL的Amp和20μg/mL的氯霉素，待培养至OD₆₀₀达到0.6左右时加入500μg/mL的L-阿拉伯糖、1μg/mL的四环素及IPTG进行诱导，继续培养7h。

保持其他发酵条件不变，分别依次改变IPTG的浓度、IPTG添加时间、诱导时间、接种量、装液量、加入IPTG后的培养温度来确定各因素的最佳水平。每个实验重复3次，每次设3个平行，通过取各组数据的平均值来评价各因素对目的蛋白表达收率的影响。

1、IPTG浓度的确定

接菌培养至OD₆₀₀达到0.6左右时加入IPTG进行诱导，继续培养7h。分别设定IPTG终浓度为0.1mM、0.4mM、0.7mM、1.0mM、1.3mM，培养结束后测定OD₆₀₀值、湿菌重、干菌重和蛋白表达率(图1，表1)，计算表达收率(图2)。

表1 不同IPTG浓度的菌体密度和表达率

注：表中菌种为1L发酵液的重量，表1-表6同

实验结果表明，IPTG浓度在0.4mM-0.7mM时诱导表达效果较好，菌密度也处于较高水平，因而表达收率较高。随着IPTG浓度的增大，表达收率有所下降。

2、IPTG添加时间的确定

分别在接菌培养不同时间时加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，培养结束后测定OD₆₀₀值、湿菌重、干菌重和蛋白表达率(表2)，计算表达收率(图3)。

表2 不同IPTG添加时间菌密度和表达率

从表中可以看出，IPTG添加较早时，表达量较高，但菌密度较小，而由图3中看出，选IPTG添加时间为接种后4-5h，即对数生长中后期时添加IPTG较好。

3、诱导时间的确定

接菌培养4-5h后此时紫外分光光度计测定OD₆₀₀值在1左右,加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，分别在诱导不同时间时测定OD₆₀₀值、湿菌重、干菌重和蛋白表达率(表3)，计算表达收率(图4)。从图4中可以看出，诱导时间为6.5h左右时表达收率达到较好水平。

表3 不同诱导时间菌密度和表达率

4、接种量的确定

按不同接种量接菌培养4.5h后加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，培养结束后测定OD₆₀₀值、湿菌重、干菌重和蛋白表达率(表4)，计算表达收率(图5)。从图5中可以看出，接种量在4％左右时，菌密度和表达收率达到较大水平。

表4 不同接种量菌密度和表达率

5、装液量的确定

在250mL摇瓶中实验，摇瓶中按不同装液量装液，按4％接种量接菌培养4.5h后加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，培养结束后测定OD₆₀₀值、湿菌重、干菌重和蛋白表达率(表5)，计算表达收率(图6)。由图6表明，装液量在40％左右时，表达收率达到较高水平。但应注意此时菌生长速率减慢。

表5 不同装液量菌密度和表达率

6、发酵温度的确定

按4％接种量接菌培养4.5h后加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，选用不同的诱导温度，培养结束后测定OD₆₀₀值、湿菌重、干菌重和蛋白表达率(表6)，计算表达收率(图7)。从图7中可以看出，在23℃-30℃左右时，表达收率达到最大。

表6 不同诱导温度菌密度和表达率

实施例2重组萨氏海鞘多肽CS5931的分离纯化条件优化

(1)将发酵所得菌体离心，收集菌体沉淀，称量菌重。

(2)冰上融解菌体沉淀，按每克菌加3mL细菌裂解液的比例加细菌裂解液，冰上裂解40min。超声波破碎菌体后，10000r/min离心90min，取上清，用0.45μm滤膜过滤。

(3)利用AKTA-purifier蛋白纯化系统，安装镍柱后用超纯水洗10个柱床体积，流速为3mL/min。

(4)用结合缓冲液平衡10个柱床体积，流速为3mL/min。

(5)将细菌裂解液上清以流速为1mL/min上柱。

(6)用结合缓冲液洗10个柱床体积，洗去未结合蛋白，流速为3mL/min，直至基线水平。

(7)调整结合缓冲液与高盐洗脱缓冲液的进样体积，从而改变洗杂蛋白缓冲液的咪唑浓度，洗杂蛋白，流速为1mL/min，比较各洗涤峰的大小，直至基线水平。

(8)用咪唑洗脱缓冲液对目的蛋白进行梯度洗脱，收集洗脱峰。用12％SDS-PAGE胶检测目的蛋白的纯度。将达到纯度要求的蛋白样品变性。调节结合缓冲液与高盐洗脱缓冲液的进样比例，从而改变洗杂蛋白缓冲液的咪唑浓度，根据洗涤峰的大小与SDS-PAGE图的样品条带确定洗涤杂蛋白的缓冲液的咪唑浓度。

所述细菌裂解液的配制方法是：15-25mM Tris，0.5-1.5MNaCl，5-15mM咪唑，0.5-1g溶菌酶，加600mL蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，溶解后定容到1000mL。

所述的结合缓冲液的配方是：15-25mMTris，0.5-1.5M NaCl，5-15mM咪唑，加600mL蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，溶解后定容到1000mL。

所述的高盐洗脱液的配制方法是：15-25mM Tris，0.5-1.5M NaCl，300-500mM咪唑，加600mL蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，溶解后定容到1000mL。

从图8、9中可以看出，当洗杂蛋白的咪唑浓度为65mM时，杂蛋白峰形较小，目标蛋白峰形较大，说明目标蛋白损失较小。而经SDS-PAGE验证，此时目标蛋白达到纯度要求。

因此确定使用咪唑浓度为65mM的缓冲液洗涤杂蛋白，使用咪唑浓度为300mM的缓冲液洗脱目标蛋白

实施例3重组萨氏海鞘多肽CS5931的复性冻干

方法1：稀释法复性，即向完成变性的蛋白样品中缓慢加入其15倍体积的复性液，使尿素浓度降到0.5M，待复性24后，二次上柱得目的蛋白；

方法2：梯度复性，蛋白样品变性完成后，向变性样品中缓慢加入复性液，使尿素浓度降为7M，然后每隔2h向样品中加入复性液，使尿素浓度依次降为6M、5M、4.5M、4M、3.5M、3M、2.5M、2M、1.5M，反应结束后二次上柱得目的蛋白；

方法3：透析复性，蛋白样品变性完成后，将变性样品放于透析袋中，在复性液中透析24h，期间换1次复性液。

最后将上述方法1-2得到的目的蛋白样品放入透析袋中，在透析液中透析，过夜，方法3透析3h，除去样品中的盐等杂质。

将透析完成的样品加入1-2倍于样品蛋白的甘露醇后冻干。测定蛋白浓度通过BCA法进行，具体操作按照试剂盒说明书进行。

不同复性液种类所得CS5931对人大细胞肺癌细胞NCI-H460的抑制率见表7、8，本次实验使用人大细胞肺癌细胞NCI-H460测定IC₅₀值。

表7 不同复性液种类所得CS5931对人大细胞肺癌细胞NCI-H460的抑制率

从表7中可以看出，通过复性液1、2和3对样品复性后，对NCI-H460细胞的IC₅₀值分别为4.28μM，说明复性液3对样品的复性效果较好，因此选用复性液3进行复性。

表8 不同复性方式所得CS5931对人大细胞肺癌细胞NCI-H460的抑制率

从表8中可以看出，在复性液均为复性液3时，采用低温发酵不变复性、梯度法复性、透析法复性、包涵体等不同的复性方式，复性后MTT检测发现多肽对NCI-H460细胞的IC₅₀值分别为11.43、33.50、4.28、4.96μM，而用稀释法复性无活性，说明透析法复性得到的目标多肽活性较好，且透析操作简单，是一种较好的复性方法。

所述复性液1的配方为：10mL PBS缓冲液，NaCl 8.766g，加蒸馏水600mL充分溶解后加CaCl₂0.147g，盐酸调pH到8.0，加蒸馏水至1000mL。复性液2的配方为含有2mM CaCl₂的PBS缓冲液，CaCl₂最后加入，禁止加热。复性液3的配方为所述的复性液的配制方法为0.5mM L-精氨酸、0.5M尿素、2mM L-半胱氨酸，0.2mM L胱氨酸(或2mM还原型谷胱甘肽，0.2mM氧化型谷胱甘肽，两者摩尔比为10:1)，用TGE缓冲液定容至2L。TGE缓冲液的配方为24.2gTris，0.244g EDTA，5.85g NaCl，加1.0L蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，加20mL甘油，混匀后定容至2L。

实施例4一种海鞘多肽CS5931的制备方法

一种海鞘多肽CS5931的制备方法，它包括重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵、海鞘多肽CS5931的分离纯化和变性复性；

1、重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵

为克隆编码多肽CS5931的基因连接入含有分子伴侣pG-KJE8的质粒PET-21a载体上，导入表达菌BL21(DE3)。取-80℃保存的甘油种子于含100μg/mLAmp的3mL LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜后涂平板，37℃倒置培养12h。从平板上挑单菌落接于含100μg/mL Amp的10mL LB培养基中，37℃，200r/min活化培养12h。将活化的种子液以4％的接种量转接入50mL LB培养基中，培养基中含有100μg/mL的Amp和20μg/mL的氯霉素，装液量为40％，37℃，200r/min培养，待OD₆₀₀达到0.6左右时加入500μg/mL的L-阿拉伯糖、1μg/mL的四环素及IPTG进行诱导，诱导时间为6.5h；

所述的IPTG的终浓度为0.7mM；所述IPTG添加时间为接种后4h，所述的加入IPTG后的发酵温度为30℃；

本实施例的表达收率达到0.703g/L，与现有技术相比提高了2.01倍

在优化之前的发酵条件为重组pET21a-CS5931活化后接种入含有氨苄的LB培养基发酵的装液量在20％，接种量为4％，添加IPTG的终浓度为0.1mM,IPTG的添加时间为接种后3.5h，加入IPTG后发酵培养温度37℃，诱导时间为7h，表达收率为0.35g/L。

2、海鞘多肽CS5931的分离纯化

(1)将发酵所得菌体离心，收集菌体沉淀，称量菌重。

(2)冰上融解菌体沉淀，按每克菌加5mL细菌裂解液的比例加细菌裂解液，冰上裂解40min；超声波破碎菌体后，10000r/min离心90min，取上清，用0.45μm滤膜过滤；

(3)利用蛋白纯化系统，安装镍柱后用超纯水洗10个柱床体积，流速为5mL/min；

(4)用10mM咪唑结合缓冲液平衡10个柱床体积，流速为-5mL/min；

(5)将细菌裂解液上清液以流速为2mL/min上柱；

(6)用结合缓冲液洗10个柱床体积，洗去未结合蛋白，流速为3mL/min，直至基线水平；

(7)调整结合缓冲液与高盐洗脱缓冲液的进样体积，使用咪唑浓度为65mM的缓冲液洗涤杂蛋白洗杂蛋白，流速为1mL/min，比较各洗涤峰的大小，直至基线水平；

(8)调整结合缓冲液与高盐洗脱缓冲液的进样体积，用300mM咪唑缓冲液对目的蛋白进行梯度洗脱，收集洗脱峰，用12％SDS-PAGE胶检测目的蛋白的纯度，将达到纯度要求的蛋白样品变性；

所述的结合缓冲液：2.42g Tris碱，29.3g NaCl，0.68g咪唑，加600mL蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，溶解后定容到1000mL。

所述的细菌裂解液：2.42g Tris碱，29.3g NaCl，0.68g咪唑，0.5g溶菌酶，加600mL蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，溶解后定容到1000mL。

3、变性和复性

向纯化得到的目的多肽溶液中分次缓慢加入8M尿素，2mM L-半胱氨酸，0.5mM L-精氨酸，0.5mM EDTA，反应4h；蛋白样品变性完成后，将变性样品放于透析袋中，在复性液中透析24h，期间换1次复性液；然后更换透析液，在透析液中透析3-5h，除去样品中的盐等杂质。将透析完成的样品加入1-2倍于样品多肽的甘露醇后冻干得到纯化后的多肽CS5931。

复性液3的配方为所述的复性液的配制方法为0.5mM L-精氨酸、0.5M尿素、2mM L-半胱氨酸，或2mM还原型谷胱甘肽，0.2mM L胱氨酸或0.2mM氧化型谷胱甘肽，两者摩尔比为10:1，用TGE缓冲液定容至2L。TGE缓冲液的配方为24.2gTris，0.244g EDTA，5.85g NaCl，加1.0L蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，加20mL甘油，混匀后定容至2L。

实施例5重组萨氏海鞘多肽CS5931抗肿瘤细胞的活性检测

将实施例4制备的海鞘多肽CS5931样品用PBS缓冲液溶解成均一溶液，无菌滤膜过滤除菌，用PBS缓冲液稀释成多个浓度梯度。取对数生长期的细胞，去除原细胞培养液，用PBS缓冲液冲洗2次，加入适量胰蛋白酶液进行消化，离心收集细胞。去除上清液，加入适量新鲜的细胞培养液，轻轻吹打细胞制成单细胞悬液。对细胞计数，按每孔180μL接种于96孔细胞培养板中，调整细胞密度，使每孔中的细胞数目在5000个左右。细胞培养箱中培养过夜，细胞覆盖微孔50％左右的面积时，每孔加入20μL待测样品，设置3个平行孔。阴性空白对照每孔加入20μLPBS。

细胞培养箱中孵育48h，并在倒置显微镜下对细胞状态进行观察并拍照记录。每孔加入MTT溶液20μL，继续孵育4h。终止培养，小心吸除150μL培养基，每孔加入二甲亚砜150μL，置多功能微孔板检测仪中低速振荡10min，使蓝紫色结晶完全溶解。用多功能微孔板检测仪测定490nm/562nm波长处各孔的吸光值。取三个平行孔的平均OD值，按照如下公式计算细胞抑制率，当细胞抑制率为50％时，所对应的药物浓度为半数抑制浓度IC₅₀。

细胞抑制率(％)＝(OD对照组-OD实验组)/OD对照组×100％

重组多肽CS5931对人结肠癌细胞HCT116、人胰腺癌细胞Panc28、人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人肝癌细胞BEL-7402等均有增殖抑制作用，IC₅₀值分别为1.41、2.04、4.28、11.71μM。

Claims

1.一种海鞘多肽CS5931的制备方法，包括重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵、海鞘多肽CS5931的分离纯化和变性复性，其特征在于：

所述的重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵：克隆编码多肽CS5931的基因连接入含有分子伴侣pG-KJE8的质粒PET-21a载体上，导入表达菌BL21构成工程菌BL21/pET21a-CS5931，简称pET21a-CS5931，将pET21a-CS5931接种在含有氨苄的LB培养基中进行活化，活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养，接种后4-5h时加入L-阿拉伯糖、四环素及IPTG进行诱导，继续发酵培养4.5-8.5h；

所述的IPTG添加的终浓度为0.4mM-0.7mM；所述的活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中的接种量在3-6％；所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基中发酵的装液量在20-45％；所述加入IPTG后的发酵温度为23℃-30℃；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述IPTG添加的终浓度为0.6mM时诱导表达效果最好；所述IPTG的添加时间为接种后4.5h；所述活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中的接种量在4％(体积比)，加入IPTG后发酵培养温度30℃，所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基中发酵的装液量在20％(体积比)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化杂蛋白的咪唑缓冲液的浓度为65mM，洗脱目的多肽CS5931的咪唑缓冲液的浓度为300mM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的复性液的成份及其终浓度为0.3-0.6mM L-精氨酸、0.5M尿素、1-3mM L-半胱氨酸或还原型谷胱甘肽作为还原剂，0.1-0.3mM L-胱氨酸或氧化型谷胱甘肽作为氧化剂，还原剂和氧化剂两者摩尔比为10:1，上述物质溶解在TGE缓冲液中。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵：取-80℃保存的甘油菌pET21a-CS5931于含100μg/mL Amp的3mL LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜后涂平板，37℃倒置培养12h，从平板上挑含有目的基因的表达菌BL21的单菌落接于含100μg/mL Amp的10mL LB培养基中，37℃，200r/min活化培养12h，将活化的种子液以4％的接种量转接入50mL LB培养基中，培养基中含有100μg/mL的Amp和20μg/mL的氯霉素，装液量为20％，37℃，200r/min培养，待OD₆₀₀达到0.6左右时加入500μg/mL的L-阿拉伯糖、1μg/mL的四环素及IPTG进行诱导，继续培养6.5h，发酵培养温度为23℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化：

(1)将发酵所得菌体离心，收集菌体沉淀，称量菌重；

(4)用结合缓冲液平衡10-15个柱床体积，流速为3-5mL/min；

(5)将细菌裂解液上清液以流速为1-2mL/min上柱；

(8)用250-350mM咪唑缓冲液对目的蛋白进行梯度洗脱，收集洗脱峰，用12％SDS-PAGE胶检测目的蛋白的纯度，将达到纯度要求的蛋白样品变性。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的细菌裂解液的成分及终浓度是15-25mM Tris，0.5-1.5M NaCl，5-15mM咪唑，0.5-1g溶菌酶，加600mL蒸馏水，1M盐酸调pH到8.0，溶解后定容到1000mL。