CN102094029A - 一种制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术中荧光蛋白质材料领域，具体涉及一种制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白质的方法。首先将别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因与藻胆素生物合成酶基因hol和pcyA克隆到一个表达载体中；其次将别藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白基因与色基裂合酶基因cpcS和cpcU克隆到另一个载体上，将两个表达载体同时转化大肠杆菌，筛选出同时表达上述基因的工程菌，即为别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白。本发明不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产重组光活性蛋白，大肠杆菌易于培养，生长快，可以大大缩短生产周期；与藻类相比，大肠杆菌细胞壁易于破碎，纯化过程可以节约能源，利用率高。

Description

一种制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物技术中荧光蛋白质材料领域，具体涉及一种制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白质的方法。

背景技术

藻胆蛋白主要存在于原核的蓝藻、真核的红藻、隐藻和甲藻(Pyrrophyta)中。根据吸收光谱的不同，可将藻胆蛋白分为4大类：藻红蛋白(phycoerythrin，PE)，藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，PEC)，藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)。藻胆蛋白脱辅基蛋白含有α和β亚基，藻胆蛋白中结合的色基称为藻胆素(phycobilin)，藻胆素的A或D环，或A、D两环同时与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基通过硫醚键共价连接。藻胆素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得不同种类的藻胆蛋白呈现不同的光学特性。藻红蛋白主要吸收约560nm的可见光，发射光约580nm的荧光；藻红蓝蛋白吸收约570nm的可见光，发射光约630nm的荧光；藻蓝蛋白吸收约620nm的可见光，发射光约640nm的荧光；别藻蓝蛋白吸收约650～660nm的可见光，发射光约660～670nm的荧光。

别藻蓝蛋白是藻胆蛋白中结构较为简单的蛋白，由α和β亚基紧密结合构成异二聚体(通常称为单体)，每个亚基只结合一个色基。三个单体通过非共价作用结合为三聚体(αβ)₃。别藻蓝蛋白由单体结合为三聚体，其光谱特性经历巨大的变化。通常其单个亚基或单体的可见光吸收光谱峰值为620nm左右，而三聚体则红移至650nm，并在620nm处出现肩峰。同时其荧光发射光谱也发生变化，峰值由单体的640nm红移至三聚体的660nm。目前认为别藻蓝蛋白的单体和三聚体光谱学特性的变化是由于三聚体结合后引起其色基的周围环境变化引起的。

藻胆蛋白具有提高人体免疫力，促进动物细胞再生的功能；可以抑制癌细胞生长，减轻肿瘤化疗的副作用；同时也是一种无毒副作用的理想的光敏剂；藻胆蛋白作为一种天然色素，也可以应用于食品和化妆品中。由于有强烈的荧光特性，藻胆蛋白还可以制备成荧光探针，在免疫学、细胞生物学和分子生物学研究中有着广泛的应用。

目前，中国专利“一种制备别藻蓝蛋白荧光蛋白质的方法，200710029673.X，2007.8.9”，提供了一种利用基因工程方法生产重组别藻蓝蛋白的方法，但得到的荧光类蛋白质仅为别藻蓝蛋白的α亚基。别藻蓝蛋白的α亚基的光谱性质与天然存在的别藻蓝蛋白有明显差别，并且荧光强度较低，得到的重组荧光类藻蓝蛋白水溶性和稳定性也较差，不利于进一步的开发研究。

发明内容

本发明目的在于，提供一种制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白质的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白的方法：首先将别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因与藻胆素生物合成酶基因ho1和pcyA克隆到一个表达载体中；其次将别藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白基因与色基裂合酶基因cpcS和cpcU克隆到另一个载体上，将两个表达载体同时转化大肠杆菌，筛选出同时表达上述基因的工程菌，即为别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白。

所述别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因与藻胆素生物合成酶基因ho1和pcyA克隆载体为pCDFDuet；别藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白基因与色基裂合酶基因cpcS和cpcU克隆载体为pRSFDuet。所述别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白采用Ni柱亲和吸附，凝胶色谱法脱盐，蛋白浓缩及凝胶色谱分离，即得到纯化后的别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白。所述别藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因是指Synechocystis sp.PCC6803或与其同源的基因。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产重组光活性蛋白，大肠杆菌易于培养，生长快，可以大大缩短生产周期；与藻类相比，大肠杆菌细胞壁易于破碎，纯化过程可以节约能源，利用率高。

2.菌种较稳定。得到的重组蛋白含有His-tag标记，体系中没有类似蛋白，通过离子螯合色谱一步纯化便可获得目的蛋白，且纯度较高。

3.可以规模化发酵生产一种新型重组光活性蛋白，最大吸收波长为650nm，最大发射光波660nm，具有优良的荧光性质，可用于新型荧光探针领域；为藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域提供了一种简单有效的新方法。

附图说明

图1本发明制备别藻蓝蛋白的示意图；

图2本发明别藻蓝蛋白诱导表达及纯化的SDS-PAGE电泳图(其中(上)：考马斯亮蓝染色。M：蛋白Maker，分子量由上至下为116.0，66.2，45.0，35.0，25.0，18.4，14.4kDa。1：诱导前；2：仅含有pCDF-apcA-ho1-pcyA质粒菌株的诱导表达，可见α亚基的大量表达；3：仅含有pRSF-apcB-cpcS-cpcU质粒菌株的诱导表达，可见β亚基的大量表达；4：含有两个质粒的菌株的诱导表达，可见α和β亚基的大量表达；5：通过Ni亲和色谱柱纯化后样品；6：纯化得到的三聚体样品。(下)：ZnSO₄染色。)；

图3本发明别藻蓝蛋白的吸收光谱图；

图4本发明别藻蓝蛋白的荧光发射光谱图。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明：

a.基因的克隆

从美国国立生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取Synechocystissp.PCC6803的apcA、apcB、cpcS、cpcU、ho1、pcyA基因的序列，由此设计分别构建apcA、apcB、cpcS、cpcU、ho1或pcyA基因片段的引物(参见表1)，而后以Synechocystis sp.PCC6803基因组DNA为模板，以上述构建不同基因片段所设计的相应引物进行PCR扩增，分别克隆apcA、apcB、cpcS、cpcU、ho1或pcyAPCR产物。所述PCR反应体系均为双蒸水14.4μl，含Mg²⁺的缓冲液20μl，dNTP 4μl，引物(正向)1μl，引物(反向)1μl，Taq酶0.2μl，Synechocystis sp.PCC 6803基因组1μl。

所述克隆apcA、apcB、cpcS、cpcU、ho1或pcyA基因片段所采用的PCR反应条件参见表1.

表1PCR反应引物、酶切位点及反应条件

b.重组质粒的构建

将上述构建所得的apcA基因片段进行电泳并回收apcA的PCR产物片段，而后用限制性内切酶BamH I和Sac I进行双酶切，同时把载体pCDFDuet(购自Novagen公司)用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收酶切后apcA PCR产物片段和酶切后的载体pCDFDuet；酶切后的apcAPCR产物片段和酶切后的载体pCDFDuet按3μl∶1μl混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(16℃下16小时)，即得到质粒pCDFDuet-apcA；把质粒pCDFDuet-apcA转化进入大肠杆菌，利用含有抗生素(壮观霉素)的平板筛选出圆形单菌落，挑取单克隆，进行目的片段PCR克隆、琼脂糖凝胶电泳和测序验证。片段PCR克隆的琼脂糖凝胶电泳结果显示目的片段条带为500bp，与apcA的大小一致，随后的序列测序结果证实该片段与apcA在NCBI数据库的序列一致。

而后将上述通过PCR构建所得藻胆素生物合成酶基因ho1用限制性内切酶NdeI和EcoR V进行双酶切，同时将构建所得藻胆素生物合成酶基因pcyA用限制性内切酶Xho I和EcoR V进行双酶切，两段酶切后片段分别与pCDFDuet-apcA载体以3μl∶1μl混合，在T4连接酶作用下以16℃，16小时连接到pCDFDue t-apcA载体的第二个表达框中，所得质粒叫做pCDF-apcA-ho1-pcyA，如图1所示。

另，将上述构建所得的apcB基因片段进行电泳并回收apcB的PCR产物片段，而后用限制性内切酶BamH I和Sac I进行双酶切，同时把载体pRSFDuet(购自Novagen公司)用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收酶切后apcB PCR产物片段和酶切后的载体pRSFDuet；酶切后的apcBPCR产物片段和酶切后的载体pRSFDuet按3μl∶1μl混合，在T4连接酶作用下以16℃、16小时连接，即得到质粒pRSFDuet-apcB；把质粒pRSFDuet-apcB转化进入大肠杆菌，利用含有抗生素(壮观霉素)的平板筛选出圆形单菌落，挑取单克隆，目的片段PCR克隆、琼脂糖凝胶电泳和测序验证。片段PCR克隆的琼脂糖凝胶电泳结果显示目的片段条带为500bp，与apcB的大小一致，随后的序列测序结果证实该片段与apcB在NCBI数据库的序列一致。

而后将上述通过PCR构建所得色基裂合酶基因cpcS用限制性内切酶NdeI和EcoR V进行双酶切，同时将构建所得色基裂合酶基因cpcU用限制性内切酶Xho I和EcoR V进行双酶切，两段酶切后片段分别与pRSFDuet-apcB载体以3μl∶1μl混合，在T4连接酶作用下以16℃，16小时连接到pRSFDuet-apcB载体的第二个表达框中，所得质粒叫做pRSF-apcB-cpcS-cpcU，如图1所示。

c.重组质粒的转化与重组菌的筛选

将质粒pCDF-apcA-ho1-pcyA和pRSF-apcB-cpcS-cpcU同时转化大肠杆菌BL21，质粒转化入大肠杆菌的转化方式如下：从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21的单菌落，接种于5ml LB液体培养基，37℃震荡培养过夜；取100μl饱和培养物，无菌转接至5ml LB液体培养基，37℃震荡培养至OD₆₀₀为0.6左右，冰上放置10分钟；离心5分钟(5000g，4℃)弃去上清，收集沉淀菌体；用1ml 0.1mol/L CaCl₂无菌溶液重悬菌体，离心30s(10000g，4℃)弃去上清，菌体沉淀用100μl预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬，加入步骤b)所得的两个质粒(即pCDF-apcA-ho1-pcyA和pRSF-apcB-cpcS-cpcU)各1μl，混匀后冰浴30分钟，42℃热激90s，冰浴5分钟后加入400μl LB液体培养基，37℃低速震荡培养1h，转速梯度增加至正常，涂布菌液在含有两种抗生素(卡那霉素和壮观霉素)的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱至形成可见的单克隆菌斑。挑取单克隆，经测序验证即得到大肠杆菌工程菌。

挑取20个菌落，分别接种于5ml含有相应抗生素(卡那霉素和壮观霉素)的LB液体培养基中，震荡培养至饱和；分别从中取出100μl转接至5ml含有相应抗生素的液体培养基中；37℃震荡培养至OD₆₀₀为0.8-1.0，加入IPTG(终浓度为1mM)诱导表达，避光，28℃，150转/分，表达8-10小时。取2ml诱导表达液离心(5000rpm，10min)，收集菌体，菌体用50μl蒸馏水分散均匀，加入50μl 2×SDS-PAGE上样缓冲液，于沸水中煮10min，离心(10000rpm，10min)取上清10μl进行SDS-PAGE电泳。即为别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白。电泳后取分离胶浸泡于20mMZnSO₄溶液中10min，于紫外光下观察，亮带为结合色基的别藻蓝蛋白α和β亚基(参见图2下)，随后取分离胶进行考马斯亮蓝染色(参见图2上)，由图可见，诱导前没有目的蛋白表达，诱导后目的蛋白表达明显。

d.重组菌的5L规模发酵

5L发酵罐表达融合藻蓝蛋白的程序如下：取保存的菌种100μl无菌接种于5ml液体LB培养基，37℃震荡培养12小时，然后转接于含200ml液体LB培养基的三角瓶，37℃震荡培养6小时。工程菌的发酵在5L自动发酵罐中进行，体积比5％的接种量，诱导前培养温度设为37℃，转速随发酵时间由300-500rpm递增，pH均自动控制；发酵开始4h后，菌体生长至对数期，原培养基中的碳源接近耗尽时，以0.08g/L·min^-1的速率进行葡萄糖补料。发酵开始约7h时，先将罐内温度缓慢降至25℃，然后加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，降低转速至150rpm，诱导培养10h以上。

e.别藻蓝蛋白的分离纯化

上述发酵液离心(5000rpm，10min)得到已表达目的蛋白的菌体，按照每升结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠，0.5mol/L氯化钠，20mmol/L咪唑，pH7.4)加入湿菌体50g的比例将菌体重悬，超声破碎细菌30分钟，12000rpm，4℃条件下离心，收集上清液，上样于Ni²⁺亲和色谱柱，用5倍柱体积的缓冲液(20mmol/L磷酸钠，0.5mol/L氯化钠，50mmol/L咪唑，pH7.4)冲洗色谱柱后，用洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠，0.5mol/L氯化钠，500mmol/L咪唑，pH 7.4)洗脱，洗脱液经G-25柱用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)脱盐后即得到脱盐蛋白。脱盐蛋白采用PEG20000浓缩至目的蛋白浓度大于0.5mg/ml，取出离心(10000rpm，10min，4℃)，上清液上Superdex 200凝胶色谱柱，用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗脱，洗脱速度为10ml/h，收集A_650nm/A_620nm＞1.3的流出液，为目的蛋白，即纯化后别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白。别藻蓝蛋白为两个亚基α和β的N端重叠呈“弯月”形单体结构，三个单体(αβ)围绕中心轴形成一个具有中央空洞的圆盘状三聚体结构，该圆盘状厚度约为

圆盘外周直径约为

内部中空的直径为

取目的蛋白50μl与50μl 2×SDS-PAGE上样缓冲液，于沸水中煮10min，离心(10000rpm，10min)取上清10μl进行SDS-PAGE电泳。电泳后取分离胶浸泡于20mMZnSO₄溶液中10min，于紫外光下观察，亮带为结合色基的别藻蓝蛋白α和β亚基，见图2下；随后取分离胶进行考马斯亮蓝染色，见图2上。目的蛋白分子量均为20K左右，与预期一致。

f、别藻蓝蛋白的光谱学性质

别藻蓝蛋白的光谱学测定包括可见光光谱和荧光光谱测定。可见光光谱测定采用DU650分光光度计(Beckman，美国)，样品在50mM磷酸钠缓冲液中，于500-700nm进行扫描。本发明所得别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白在500-700nm波长的吸收图谱中，在650nm处有最大吸收峰，在620nm处有一肩峰，A650nm/A620nm为1.4左右(参见图3)。

荧光光谱测定采用F-4500荧光分光光度计(Hitachi，日本)，样品在50mM磷酸钠缓冲液中，激发波长为600nm，于600-800nm进行扫描。别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白在600-800nm波长的荧光发射图谱，激发波长为600nm时，发射光峰值为660nm(参见图4)。

光谱学试验结果表明，本发明所得别藻蓝蛋白与天然别藻蓝蛋白有相似的光谱学特征(张少斌，刘慧，刘国琴，商数田.螺旋藻别藻蓝蛋白的纯化、理化性质与结晶.微生物学通报，2006，33(5)：31-34.)，明显不同于别藻蓝蛋白单体和亚基的光谱学特征。

g、重组别藻蓝蛋白三聚体的分子量测定

分子量测定采用HPLC法。分离色谱柱为Waters Ultrahydroge Linear(7.8×300mm)，流动相为50mM磷酸盐缓冲液(pH6.9)和0.3MNaCl，柱温35℃，检测器为紫外检测器，检测波长220nm。标准品为溶菌酶(14000Da)，牛血清白蛋白(66000Da)，IgG(150000Da)。结果测得本发明所得别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白的分子量为122211Da，证明所得到的目的别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白是以三聚体的形式存在，即别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白(αβ)₃。

Claims (4)

1.一种制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白的方法，其特征在于：首先将别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因与藻胆素生物合成酶基因ho1和pcyA克隆到一个表达载体中；其次将别藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白基因与色基裂合酶基因cpcS和cpcU克隆到另一个载体上，将两个表达载体同时转化大肠杆菌，筛选出同时表达上述基因的工程菌，即为别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白。

2.按权利要求1所述的制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白的方法，其特征在于：所述别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因与藻胆素生物合成酶基因ho1和pcyA克隆载体为pCDFDuet；别藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白基因与色基裂合酶基因cpcS和cpcU克隆载体为pRSFDuet。

3.按权利要求1所述的制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白的方法，其特征在于：所述别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白采用Ni柱亲和吸附，凝胶色谱法脱盐，蛋白浓缩及凝胶色谱分离，即得到纯化后的别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白。

4.按权利要求1所述的制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白的方法，其特征在于：所述别藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因是指Synechocystis sp.PCC6803或与其同源的基因。

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