CN101475949B - 链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素(PEB)的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的制备方法，是通过应用藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶催化藻红胆素(PEB)与链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白共价结合，制备链霉亲和素标记的结合PEB的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产链霉亲和素标记的结合PEB的藻蓝蛋白类alpha亚基荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质能应用于生物学和医药功能材料领域，特别是应用为生物学和医学检测领域的荧光探针。
Description
技术领域
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种链霉亲和素标记的结合PEB藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的制备方法。
技术背景
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650～660nm的可见光，发射约660～670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB)；PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB)；PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)；CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。
链霉亲和素可以跟生物素特异结合，通过链霉亲和素-生物素系统，可以实现信号放大作用，提高检测灵敏度。目前链霉亲和素-生物素系统已经广泛应用于生物学检测和医疗检测等领域。目前主要是通过化学交联实现链霉亲和素对目标的标记。
CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley A J，Cai Y A，GlazerA N.Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunitin a heterologous host[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(19)：10560～10565)。我们发现，藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶不仅可以催化PCB与藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白结合，还能催化藻红胆素PEB与藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白结合。通过基因工程技术，把链霉亲和素基因和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于表达载体，可以在大肠杆菌内表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白的融合蛋白，直接实现链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的连接，而不需要通过化学交联等方法来实现链霉亲和素标记；把藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因、PEB生物酶合成基因克隆于表达载体。利用以上表达载体，通过基因工程菌，可以直接生成链霉亲和素标记的结合PEB的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质。
藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。藻蓝蛋白类荧光蛋白质具有优良的荧光性质，通过直接实现链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的连接，可用于生物学检测以及医疗检测领域。本发明为藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于医药和生物工程领域，特别是检测领域奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的制备方法，它是应用藻蓝蛋白alpha亚基裂合催化藻红胆素(PEB)与链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白共价结合，制备链霉亲和素标记的结合PEB的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质。将含有藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因、链霉亲和素基因和藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白基因拼接的基因、藻红胆素生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过这种方法得到的基因工程菌生产链霉亲和素标记的结合PEB的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质。
本发明的技术方案是这样的：一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的制备方法，包括下述步骤：
(1)用基因工程方法，将alpha亚基裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到alpha亚基裂合酶表达质粒；
(2)用基因工程方法，将链霉亲和素基因和藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；
(3)用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到hol和pebB表达质粒；
(4)用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四个表达载体中，得到pebA表达质粒；
(5)将alpha亚基裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、hol和pebB表达质粒及pebA表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程生产链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质。
上述一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的制备方法中，所述的宿主菌为大肠杆菌；所述的alpha亚基裂合酶基因是指与Anabaena sp.PCC7120中cpcE和cpcF基因或M.laminosus sp.PCC7603中cpcE和cpcF基因同源的基因；所述的藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白基因是指与Anabaena sp.PCC7120或M.laminosus sp.PCC7603中cpcA同源的基因。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质，大肠杆菌繁殖快，可以大大缩短周期；
2、与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；
3、通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质类似的蛋白，提取方便；
4、生成结合PEB的新型藻蓝蛋白alpha亚基类色素蛋白，具有与天然藻蓝蛋白alpha亚基类色素蛋白不同的光谱特性，为发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料提供更多选择；
5、产物中链霉亲和素与荧光藻蓝蛋白alpha亚基类色素蛋白质直接结合，不需额外进行处理，有利于发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质在检测领域的应用。
附图说明
图1为本发明中CpcE/CpcF催化下生成的链霉亲和素标记的结合PEB藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的吸收光谱和荧光光谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcE和cpcF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcE-cpcF，在大肠杆菌中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将链霉亲和素基因(简称sa)和Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-sa-cpcA，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HOl和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cpcA在pET30中是在EcoRV和XhoI两个酶切位点之间，链霉亲和素基因sa在KpnI和BglII两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是NcoI和PstI之间，裂合酶基因cpcF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoRV和XhoI之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点NcoI和PstI之间，pebB在第二个多克隆位点NdeI和xhoI之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和XhoI之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-cpcE-cpcF、pET30-sa-cpcA、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A。其吸收与荧光光谱见附图1中所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下：
从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养基，37℃振荡培养过夜；取100μL饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37℃振荡培养至OD600＝0.3～0.4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟(10000g，4℃)弃去上清，收集沉淀菌体；用1mL预冷的0.1mol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体，离心30s(10000g，4℃)去上清，菌体沉淀用100μL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬，放置于冰上，加入一定量的构建好的质粒，混匀后冰浴放置30分钟，42℃热休克90s，冰浴5分钟后加入300μL LB培养基，37℃低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基平板上，倒置于37℃培养箱至形成可见的单克隆菌斑。
提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和；分别从中取100μL转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37℃振荡培养至OD600＝0.5-0.7时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、20℃、150转/分，表达约12小时。离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株进行大量表达。
实施例2
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcE和cpcF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcE-cpcF，在大肠杆菌中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶CpeE/CpcF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将链霉亲和素基因(简称sa)和Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-sa-cpcA，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HOl和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cpcA在pET30中是在EcoRV和XhoI两个酶切位点之间，链霉亲和素基因sa在KpnI和BglII两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是NcoI和PstI之间，裂合酶基因cpcF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoRV和XhoI之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点NcoI和PstI之间，pebB在第二个多克隆位点NdeI和XhoI之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和XhoI之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-cpcE-cpcF、pET30-sa-cpcA、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例3
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcE和cpcF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcE-cpcF，在大肠杆菌中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将链霉亲和素基因(简称sa)和M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-sa-cpcA，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HOl和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cpcA在pET30中是在EcoRV和XhoI两个酶切位点之间，链霉亲和素基因sa在KpnI和BglII两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是NcoI和PstI之间，裂合酶基因cpcF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoRV和XhoI之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点NcoI和PstI之间，pebB在第二个多克隆位点NdeI和XhoI之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和XhoI之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-cpcE-cpcF、pET30-sa-cpcA、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例4
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcE和cpcF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcE-cpcF，在大肠杆菌中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将链霉亲和素基因(简称sa)和M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-sa-cpcA，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HOl和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cpcA在pET30中是在EcoRV和XhoI两个酶切位点之间，链霉亲和素基因sa在KpnI和BglII两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是NcoI和PstI之间，裂合酶基因cpcF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoRV和XhoI之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点NcoI和PstI之间，pebB在第二个多克隆位点NdeI和XhoI之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和XhoI之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-cpcE-cpcF、pET30-sa-cpcA、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例5
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcE和cpcF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcE-cpcF，在大肠杆菌中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将链霉亲和素基因(简称sa)和Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司购买的pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-sa-cpcA，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HOl和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcA拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第一个多克隆位点的FcoRI和PstI两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcF在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是NcoI和PstI之间，裂合酶基因cpcF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoRV和XhoI之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点NcoI和PstI之间，pebB在第二个多克隆位点NdeI和XhoI之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和XhoI之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-cpcE-cpcF、pCOLADuet-sa-cpcA、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例6
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcE和cpcF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcE-cpcF，在大肠杆菌中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将链霉亲和素基因(简称sa)和Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司购买的pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-sa-cpcA，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HOl和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcA拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第一个多克隆位点的EcoRI和PstI两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是NcoI和PstI之间，裂合酶基因cpcF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoRV和XhoI之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点NcoI和PstI之间，pebB在第二个多克隆位点NdeI和XhoI之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和XhoI之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-cpcE-cpcF、pCOLADuet-sa-cpcA、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例7
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcE和cpcF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcE-cpcF，在大肠杆菌中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将链霉亲和素基因(简称sa)和M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司购买的pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-sa-cpcA，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HOl和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcA拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第一个多克隆位点的EcoRI和PstI两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是NcoI和PstI之间，裂合酶基因cpcF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoRV和XhoI之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点NcoI和PstI之间，pebB在第二个多克隆位点NdeI和XhoI之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和XhoI之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-cpcE-cpcF、pCOLADuet-sa-cpcA、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例8
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcE和cpcF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcE-cpcF，在大肠杆菌中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将链霉亲和素基因(简称sa)和M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司购买的pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-sa-cpcA，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HOl和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcA拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第一个多克隆位点的EcoRI和PstI两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是NcoI和PstI之间，裂合酶基因cpcF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoRV和XhoI之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点NcoI和PstI之间，pebB在第二个多克隆位点NdeI和XhoI之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和XhoI之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-cpcE-cpcF、pCOLADuet-sa-cpcA、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
上述制备方法适用于采用各种蓝藻中的alpha亚基裂合酶、藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白和PEB生物合成酶基因或其同源基因以及链霉亲和素基因及其同源基因来制备链霉亲和素标记的结合PEB的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开的问题，本发明只选用了GenBank中已公开全序列的蓝藻Anabaena sp.PCC7120和已公开部分序列的蓝藻M.laminosus sp.PCC7603、Calothrix sp.PCC7601为例对本发明方法加以说明，本领域的技术人员可以根据上述公开的内容采用其它原料实施本发明。
Claims (2)
1.一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)用基因工程方法，将alpha亚基裂合酶基因：Anabaena sp.PCC7120中cpcE和cpcF基因或M.laminosus sp.PCC7603中cpcE和cpcF基因克隆于表达载体中，得到alpha亚基裂合酶表达质粒；
(2)用基因工程方法，将链霉亲和素基因：GeneBank中编号为AF283893的基因和藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白基因：Anabaena sp.PCC7120或M.laminosus sp.PCC7603中cpcA基因克隆于第二个表达载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；
(3)用基因工程方法，将来自Calothrix sp.PCC7601的pebA和pebB藻红胆素生物合成酶基因hol和pebB克隆于第三个表达载体中，得到hol和pebB表达质粒；
(4)用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因pebA克隆于第四个表达载体中，得到pebA表达质粒；
(5)将alpha亚基裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、hol和pebB表达质粒及pebA表达质粒依次转入同一个宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程生产链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌。
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