CN101469332B - 链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，通过应用藻胆蛋白beta裂合酶催化藻红胆素与链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备链霉亲和素标记的结合PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。藻蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。
Description
技术领域
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及链霉亲和素标记的结合藻红胆素(PEB)的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法。
背景技术
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650～660nm的可见光，发射约660～670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB)；PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB)；PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)；CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。
链霉亲和素可以跟生物素特异结合，通过链霉亲和素-生物素系统，可以实现信号放大作用，提高检测灵敏度。目前链霉亲和素-生物素系统已经广泛应用于生物学检测和医疗检测等领域。目前主要是通过化学交联实现链霉亲和素对目标的标记。
CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley A J，Cai Y A，GlazerA N.Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunitin a heterologous host[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(19)：10560～10565)。与前人的方法不同，我们发现Anabaena sp.PCC7120中alr0617基因编码beta裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源的beta裂合酶。这类beta裂合酶不仅能催化藻蓝胆素PCB与CPC的beta亚基及其同源蛋白质的84位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成藻蓝蛋白类荧光蛋白质，还能催化藻红胆素PEB与CPC的beta亚基及其同源蛋白质的84位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成一种新型的结合了PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
藻红胆素PEB可由HO1、PebA、PebB协同催化生成(Alvey，R.M.，Karty，J.A.etc.Lesionsin Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon RevealCoordinated Light Regulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme GeneExpression.Plant Cell 15(10)，2448-2463(2003))。通过基因工程技术，把链霉亲和素基因和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于表达载体，可以在大肠杆菌内表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，直接实现链链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的连接，而不需要通过化学交联等方法实现链霉亲和素标记。
藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。藻蓝蛋白类荧光蛋白质具有优良的荧光性质，通过直接实现链链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的连接，可用于生物学检测以及医疗检测领域。这种结合PEB的新型藻蓝蛋白，为开发新型荧光探针提供了更多的选择。本方法为藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法。它是应用beta裂合酶催化PEB与链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，从而制备新型藻蓝蛋白类荧光蛋白质(天然状态下藻蓝蛋白类脱辅基蛋白是与PCB结合)。将含有beta裂合酶基因、链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接的基因、PEB生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过如此设计的基因工程菌生产新型链霉亲和素标记的结合PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
本发明的技术方案是这样的：一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，包括下述步骤：
(1)用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta裂合酶表达质粒；
(2)用基因工程方法，将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因与链霉亲和素基因拼接后克隆于第二个表达载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；
(3)用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到hol和pebB表达质粒；
(4)用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四个表达载体中，得到pebA表达质粒；
(5)将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、hol和pebB表达质粒及pebA表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程生产链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
本发明的技术方案也可以是这样的：一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，包括下述步骤：
(1)用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因、藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因与链霉亲和素基因拼接后同时克隆于表达载体中，得到beta裂合酶和链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白表达质粒；
(2)用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到hol和pebB表达质粒；
(3)用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到pebA表达质粒；
(4)将beta裂合酶和链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、hol和pebB表达质粒及pebA表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程生产链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
上述链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法中，所述的宿主菌为大肠杆菌；所述的beta裂合酶基因是指与Anabaena sp.PCC7120中alr0617基因同源的基因；所述的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指与Anabaena sp.PCC7120或M.laminosussp.PCC7603中cpcB基因同源的基因。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质，大肠杆菌繁殖快，可以大大缩短周期；
2、与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；
3、通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质类似的蛋白，提取方便；
4、生成结合PEB的新型藻蓝蛋白，具有与天然藻蓝蛋白不同的光谱特性，为发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料提供更多选择。
附图说明
图1为本发明中Alr0617催化下生成的链霉亲和素标记的结合PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的吸收与荧光光谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-sa-cpcB，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa在pET30中在Kpn I和BglII两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基因cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因alr0617在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点BglII和XhoI之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-alr0617、pET30-sa-cpcB、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。其吸收与荧光光谱见附图1中所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下：
从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养基，37℃振荡培养过夜；取100μL饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37℃振荡培养至OD600＝0.3～0.4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10min；离心1min(10000g，4℃)弃去上清，收集沉淀菌体；用1mL预冷的0.1mol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体，离心30s(10000g，4℃)去上清，菌体沉淀用100μL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬，放置于冰上，加入一定量的构建好的质粒，混匀后冰浴放置30min，42℃热休克90s，冰浴5min后加入300μL LB培养基，37℃低速振荡培养45min，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基平板上，倒置于37℃培养箱至形成可见的单克隆菌斑。
提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和；分别从中取100μL转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37℃振荡培养至OD600＝0.5-0.7时，冰浴约30min，加入IPTG诱导表达；避光、20℃、150转/分，表达约12小时。离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株进行大量表达。
实施例2
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-sa-cpcB(C155I)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa在pET30中在Kpn I和Bgl II两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因alr0617在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点BglII和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-alr0617、pET30-sa-cpcB(C155I)、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例3
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得质粒叫pCOLADuet-sa-cpcB，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcB拼接后连接到pCOLADuet的EcoR I和PstI之间；裂合酶基因alr0617在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点BglII和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-alr0617、pCOLADuet-sa-cpcB、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例4
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得质粒叫pCOLADuet-sa-cpeB(C155I)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)拼接后连接到pCOLADuet的EcoRI和Pst I之间；裂合酶基因alr0617在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点BglII和XhoI之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-alr0617、pCOLADuet-sa-cpcB(C155I)、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例5
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位点，藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第一位点，所得质粒叫pETDuet-sa-cpcB-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶以及链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PebB。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcB拼接后连接到pETDuet的EcoR I和Pst I之间，alr0617处于第二个多克隆位点BglII和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pETDuet-sa-cpcB-alr0617、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例6
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位点，藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第一位点，所得质粒叫pETDuet-sa-cpcB(C155I)-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶以及链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PebB。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)拼接后连接到pETDuet的EcoRI和Pst I之间，alr0617处于第二个多克隆位点BglII和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pETDuet-sa-cpcB(C155I)-alr0617、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例7
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-sa-cpcB，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa在pET30中在Kpn I和BglII两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基因cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因alr0617在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点BglII和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-alr0617、pET30-sa-cpcB、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例8
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-sa-cpcB(C155I)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa在pET30中在Kpn I和BglII两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因alr0617在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点BglII和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-alr0617、pET30-sa-cpcB(C155I)、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例9
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得质粒叫pCOLADuet-sa-cpcB，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcB拼接后连接到pCOLADuet的EcoR I和PstI之间；裂合酶基因alr0617在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点BglII和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点Bgl II和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-alr0617、pCOLADuet-sa-cpcB、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例10
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2)将M.laminosus sp.PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得质粒叫pCOLADuet-sa-cpcB(C155I)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)拼接后连接到pCOLADuet的EcoRI和Pst I之间；裂合酶基因alr0617在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点BglII和XhoI之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-alr0617、pCOLADuet-sa-cpcB(C155I)、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例11
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位点，将M.laminosussp.PCC7603中藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第一位点，所得质粒叫pETDuet-sa-cpcB-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶以及链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PebB。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcB拼接后连接到pETDuet的EcoR I和Pst I之间，alr0617处于第二个多克隆位点BglII和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pETDuet-sa-cpcB-alr0617、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例12
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB、alr0617、hol)；M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因(cpcB)；Calothrix sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基因工程方法，将Anabaenasp.PCC7120中的alr0617基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位点，将M.laminosussp.PCC7603中藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第一位点，所得质粒叫pETDuet-sa-cpcB(C155I)-alr0617，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶以及链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2)将藻红胆素生物合成酶基因(hol和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PebB。
(3)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)拼接后连接到pETDuet的EcoRI和Pst I之间，alr0617处于第二个多克隆位点BglII和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hol在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点BglII和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pETDuet-sa-cpcB(C155I)-alr0617、pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
上述制备方法适用于采用各种蓝藻中的beta裂合酶、藻蓝蛋白类脱辅基蛋白、藻红胆素生物合成酶基因或其同源基因来制备链霉亲和素标记的结合PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开的问题，本发明只选用了GenBank中已公开全序列的蓝藻Anabaenasp.PCC7120和已经部分测序的M.laminosus sp.PCC7603和Calothrix sp.PCC7601为例对本发明方法加以说明，本领域的技术人员可以根据上述公开的内容采用其它原料实施本发明。
Claims (2)
1.一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)用基因工程方法，将beta裂合酶基因克隆于pETDuet-1载体中，得到beta裂合酶表达质粒；
(2)用基因工程方法，将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因与链霉亲和素基因拼接后克隆于pET30载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；
(3)用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因ho1和pebB克隆于pCDFDuet-1载体中，得到ho1和pebB表达质粒；
(4)用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因pebA克隆于pACYCDuet-1载体中，得到pebA表达质粒；
(5)将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、ho1和pebB表达质粒及pebA表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程生产链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；
以上各步骤中所述的宿主菌为大肠杆菌，所述的beta裂合酶基因是指Anabaena sp.PCC7120中alr0617基因，所述的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指Anabaena sp.PCC7120或M.laminosus sp.PCC7603中cpcB基因，所述的藻红胆素生物合成酶基因ho1是指Anabaena sp.PCC7120中的ho1基因，所述的藻红胆素生物合成酶基因pebA和pebB分别是指Calothrix sp.PCC7601中pebA和pebB基因。
2.一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)用基因工程方法，将beta裂合酶基因、藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因与链霉亲和素基因拼接后同时克隆于pETDuet-1载体中，得到beta裂合酶和链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；
(2)用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因ho1和pebB克隆于pCDFDuet-1载体中，得到ho1和pebB表达质粒；
(3)用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因pebA克隆于pACYCDuet-1载体中，得到pebA表达质粒；
(4)将beta裂合酶和链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、ho1和pebB表达质粒及pebA表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌， 应用此工程菌通过发酵工程生产链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；
以上各步骤中所述的宿主菌为大肠杆菌，所述的beta裂合酶基因是指Anabaena sp.PCC7120中alr0617基因，所述的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指Anabaena sp.PCC7120或M.laminosus sp.PCC7603中cpcB基因，所述的藻红胆素生物合成酶基因ho1是指Anabaena sp.PCC7120中的ho1基因，所述的藻红胆素生物合成酶基因pebA和pebB分别是指Calothrix sp.PCC7601中pebA和pebB基因。
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