CN103656612A - 海鞘多肽药物组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海鞘多肽药物组合物及其制备方法与应用。该组合物由重量份数的海鞘多肽0.001～0.01份（氨基酸序列为Lys Gly Lys Ile Glu His）；叶下珠醇提物5～8份组成；本发明进一步公开了海鞘多肽药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。本发明的海鞘多肽药物组合物从多点位的药理功能发挥其较好的药物协同作用，弥补了其单方的不足。

Description

海鞘多肽药物组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及抗病毒药物领域，具体涉及一种抗乙型肝炎病毒的海鞘多肽药物组合物。 

背景技术

乙型肝炎是严重危害国民身体健康的疾病之一。目前，对于乙型肝炎病毒(HBV)感染 疾病的西药主要是拉米夫定等核苷药物及干扰素等生物类药物，这些药物都存在副作用大、 容易产生耐药性和治疗后反跳等缺点。 

　 叶下珠Phyllanthus urinaria L.为大戟科Euphorbiaceae叶下珠属phyllanthus的全草，最早收载于《生草药性备要》中，具有平肝清热、利水解毒之效，用于治疗肠炎、痢疾、 尿路感染、无名肿痛等。叶下珠属植物在全世界约有600多个品种，我国有6亚属、7组、 33种、4变种，叶下珠属植物可为草本、灌木或乔木，广泛分布于热带、亚热带与温带。印 度学者Thyagarajan报告用苦味叶下珠(Phyllanthus amarus)治疗乙肝病毒携带者，可使 59％患者的乙肝表面抗原(HBsAg)转阴；王荣国(叶下珠抗乙肝病毒研究概况，中医药研究， 2001，17(1)：58-60)也做了叶下珠抗乙肝病毒相关方面的研究，证明其有抑制乙肝病毒复 制的功效；罗德辉等(叶下珠治疗慢性乙肝研究进展，新疆中医药，2004，22(2)：58-60) 描述了叶下珠治疗慢性乙肝方面所取得的进展；国知局2002年8月14日公开了一项发明专 利申请“利用叶下珠治疗慢性炎性和纤维化过程”(公告号为：CN1364085)公开了一种叶 下珠提取物，该提取物具有预防和治疗肝脏纤维化和维持还原性谷胱甘肽水平的作用；国知 局1999年10月11日公开了一项“包含乌苏里叶下珠和/或叶下珠之提取物的用于治疗乙型 肝炎的药物组合物”(申请号CN1234741)，该组合物具有治疗乙型肝炎的作用。 

　  苦味叶下珠经临床应用研究结果显示，其具有抑制乙肝病毒复制、改善肝功能和抗肝纤 维化等疗效。叶下珠对HBeAg阴转率较高，但对HBsAg阴转率不高。从临床应用情况看，肝 康对慢性乙肝HBeAg、HBV-DNA阳性的患者，具有促复制指标阴转的作用，能反映出其抗病毒 效果，而对HBsAg阴转率不高。 

　海鞘(Ascidia)是尾索动物亚门(Uronordata)纲的尾索动物，第一军医大学胡文军硕士毕 业论文“皱瘤海鞘抗乙肝病毒有效成分的研究”公开了两种从皱瘤海鞘中分离出来的多肽具 有抗乙肝病毒活性，这两种多肽的氨基酸序列分别为Lys-Gly-Lys-Ile-Glu-His和Ser-Ser- Leu-Ser-Lys-Ala-Ala，这两种海鞘多肽对HBsAg阴转率较高，但是对HBeAg作用效果较弱， 且保肝降酶等作用有待进一步研究。 

发明内容

本发明的目的是提供一种新的抗乙肝病毒药物组合物。 

　本发明实现上述目的的技术方案是： 

　一种抗乙型肝炎病毒的海鞘多肽药物组合物，该组合物由下述重量配比的组分组成： 

　海鞘多肽        0.001～0.01份 

　叶下珠醇提物            5～8份 

　其中，海鞘多肽的氨基酸序列为Lys Gly Lys Ile Glu His(SEQ NO.1)，式中Lys是赖氨酸，Gly是甘氨酸，Ile是异亮氨酸，Glu是谷氨酸，His是组氨酸。 本发明所述的叶下珠是: Common Leafflower Herb Herba Phyllanthi Urinariae。 

　本发明所述的药物组合物的制备方法是按配比将叶下珠醇提物和海鞘多肽混合即可。 

　所述的叶下珠醇提物的制备方法为公知的渗漉法(姜计划，孙琦，高秀英.叶下珠提取工艺 探讨.中成药.1999，21：1-2)，具体为：将叶下珠打成粗粉，按渗漉法用55％乙醇提取渗漉液 为药材的6-8倍量，过滤，减压回收乙醇并浓缩为1∶1，得叶下珠醇提物。 

　本发明所述的海鞘多肽的制备方法见国知局2006年8月16日公开的发明专利申请“一种海鞘多肽及其制备方法”(公告号为：CN1817899)，具体步骤为：首先用与海鞘等重量95 ％乙醇浸泡海鞘2周，回收乙醇得到浸膏，将浸膏用2～3倍体积的水溶解，然后用与水等体 积的有机溶剂萃取，取水层，最后使用色谱法分离提纯，取薄层色谱紫外光检识Rf为0.5～ 0.6的洗脱液。其中，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油 醚、正己烷、环己烷其中一种或两种以上；所述的色谱法为大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、 Sephadex LH-20色谱法其中一种或两种以上，最好是依次使用大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、 Sephadex LH-20色谱法；所述的薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂 是5％硫酸乙醇液。 

　 本发明所述的药物组合物可以用于制备治疗乙型肝炎的制剂，技术人员可以根据不同剂型的要求添加较味剂或/和赋型剂等辅料，制备成各种剂型，最好是口服液。 

　 利用本发明所述的药物组合制备的抗乙型肝炎病毒口服液，含有以下重量配比的组分： 海鞘多肽0.001～0.01份、叶下珠醇提物5～8份、防腐剂2～3份、甜味剂适量、水800～ 1000份。 

　  上述组分中，甜味剂可以是甜蜜素或和蔗糖，防腐剂可以是苯甲酸或/和尼泊金乙酯。 本发明所述的抗乙型肝炎病毒口服液，该口服液还含有薄荷20～50份。 

本发明所用到的辅料指的是药学上可接受的载体、赋形剂及其它添加剂形成的化合物，可采用乳糖或淀粉做载体，明胶，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等是合适的结合剂或成颗剂。作为崩解剂可选用淀粉或微晶纤维素，常以滑石粉，胶体硅胶，硬脂酸甘油酯，硬脂酸钙或镁等作为合适的抗粘合剂和润滑剂。例如，可通过压制湿颗粒来制备片剂。活性成分与载体以及选择性的与一份崩解添加剂组成混合物，该混合物与粘合剂的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合适的设备中进行颗粒化，干燥颗粒随后加入其它的崩解剂，润滑剂和抗粘剂将此混合物压片。 

本发明抗乙型肝炎病毒的海鞘多肽药物组合物具有较高的抗乙肝病毒活性，其中所述的 叶下珠醇提物具有抑制乙肝病毒复制、改善肝功能和抗肝纤维化等疗效，对HBeAg阴转率较 高，但对HBsAg阴转率不高；海鞘多肽具有抑制乙肝病毒复制，对HBsAg阴转率较高，但对 HBeAg作用效果较弱；二者配伍后，对抑制HBeAg、HBsAg的分泌和乙肝病毒DNA的复制的药 理活性都有所提高，同时还有抗癌、抗菌、抗纤溶和保肝降酶等作用。本发明药物组合物可用于制备治疗乙型肝炎的药物。 

　下面将通过实验来说明本发明具有的效果。 下述实验中的海鞘多肽的氨基酸序列均为： Lys-Gly-Lys-Ile-Glu-His(SEQ NO.1)。 

　1.体外血清学实验 

　供试液A的制备：取海鞘多肽(广东大亚湾皱瘤海鞘)10mg，加生理盐水至1000mL， 配成浓度为10μg·mL^-1的供试液。 

　 供试液B的制备：取叶下珠醇提物(陕西省苦味叶下珠)5g，加生理盐水至1000mL，配 成浓度为5mg·mL^-1的供试液。 

　 供试液C的制备：取海鞘多肽10mg与叶下珠醇提物5g，加生理盐水至1000mL，配成 混合溶液。 

　 取A、B、C供试液分别与备用血清在37℃条件下按体积比1∶2作用8h，然后取其中的 小三阳血清反应液做ELISA测定HBsAg、取大三阳血清反应液做ELISA测定HBeAg，同时以正 常人血清按相同条件与生理盐水作用的反应液为阴性对照，以生理盐水为空白对照。操作方 法按试剂盒说明书进行，但孵育时间延长至60min。 

　 HBsAg、HBeAg的检测采用ELISA测定盒进行检测。抑制率(％)＝[(对照孔P/N值-实验 孔P/N值)/(对照孔P/N值-空白孔P/N值)]×100％。 

　 1供试品对HBsAg及HBeAg抗原的抑制作用(n＝5，X±S) 

　各实验组与相应的阴性对照组比较，P＜0.05。 

　结果：经体外血清学实验研究，将供试品各组与相应的阴性对照组作单项方差分析比较， HBsAg组中P＜0.05、HBeAg组中P＜0.05，表明供试品A、B、C均对血清中HBsAg及HBeAg 抗原有一定的抑制作用；分析1我们可以得出，抗HBV组合物C对血清中HBsAg及HBeAg 抗原的抑制作用比其单方A、B都要好，从多点位的药理功能发挥其较好的药物协同作用，弥 补了其单方的不足。 

　2.体外HepG2 2.2.15细胞抑制乙肝病毒(HBV)抗原分泌试验 

　HepG2 2.2.15细胞(由南方医院感染内科赠)：是将含有HBV基因组(2个HBV头对尾二 聚体，以尾对尾方向串联)的重组载体质粒转染HepG2细胞，经G418筛选，得到的克隆能 HBsAg、HBeAg及Dane颗粒，可检测到细胞DNA和RNA，但无cccDNA。 

　供试液A的制备：取海鞘多肽(广东大亚湾皱瘤海鞘)1mg，加细胞培养液至1000mL， 配成浓度为1μg·mL^-1的供试液。 

　供试液B的制备：取叶下珠醇提物(陕西省苦味叶下珠)0.5g，加细胞培养液至1000mL， 配成浓度为0.5mg·mL^-1的供试液。 

　供试液C的制备：取海鞘多肽1mg与叶下珠醇提物0.5g，加细胞培养液至1000mL，配 成混合溶液。 

　将2.2.15细胞接种至25cm培养瓶中，每瓶加入DMEM培养液(含10％胎牛血清，10000u/ml 青链霉素，200μg/ml G418)5ml，置37℃、5％CO₂恒温培养箱中，每隔3～4天传代。 

　 用0.25％胰蛋白酶将2.2.15细胞消化分散成单个细胞悬液，按3×10⁴细胞/孔分种于96 孔板，2天后换用含药培养液，每个浓度加4孔。供试液A、B、C分别与细胞作用12天后， 吸取细胞上清液，用ELISA法测定HBsAg、HBeAg滴度。实验以未加任何药物的细胞作为细胞 对照组。将药物组试验数据与细胞对照组进行对照，考察其差异。 

　ELISA法测HBsAg、HBeAg：每孔加入待测标本50μl，设阴性、阳性对照各2孔，并设 空白对照1孔。每孔加入酶结合物50μl(除空白对照外)，充分混匀后封板，置37℃孵育半 小时。手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液储满各孔，静置5秒后甩干，重复5次后拍干。每 孔依次加入显色剂A液、B液各50μl，充分混匀，封板，置37℃孵育15分钟；每孔加入终 止液50μl，混匀；用酶标仪测定。取波长450nm，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值， 阴性对照OD值低于0.05作为0.05计算，高于0.05按照实际OD计算。 

　 2供试品对2.2.15细胞HBsAg及HBeAg抗原的抑制率(n＝5，X±S) 

　　各组与相应的阴性对照组比较，P＜0.05。 

　 结果：经体外2.2.15细胞实验研究，将供试品各组与相应的阴性对照组作单项方差分析 比较，HBsAg组中P＜0.05、HBeAg组中P＜0.05，表明供试品A、B、C均对2.2.15细胞中 HBsAg及HBeAg抗原有一定的抑制作用；分析2我们可以得出，抗HBV组合物C对2.2.15 细胞中HBsAg及HBeAg抗原的抑制率比其单方A、B都要高，从多点位的药理功能发挥其较好 的药物协同作用，弥补了其单方的不足。 

　3.HBV转基因小鼠的体内实验 

　HBV转基因小鼠模型：利用广州空军医院成功培育出的适合HBV研究应用的HBV转基因小 鼠进行实验。 

　实验分组及用药：取6周龄HBV转基因小鼠32只，雌雄不限，随机分为4组，每组8 只，每只均单独笼养。①空白对照组：以普通饲料进行喂养；②A海鞘多肽剂量组：剂量为 5mg·kg^-1·d^-1；③B叶下珠醇提物剂量组：剂量为300mg·kg^-1·d^-1；④C本发明所述的组 合物(制备例1所述的组合物)剂量组：剂量为50mg·kg^-1·d^-1。 

　检测方法：实验用药时间为12周，分别于用药前，用药4周、8周、12周用荧光PCR检 测血清HBV DNA含量，并进行疗效评估。结果见3。 

　 3用药前后血清HBV DNA滴度变化情况(n＝8，X±S) 

　同一组处理前后比较(即与T0比较)，^bP＜0.05，^cP＜0.01；各治疗组与对照组比较， ^fP＜0.01。 

　  结果：经体内HBV转基因小鼠模型实验研究，实验各组经治疗后均呈现出了血清HBV DNA 滴度降低的现象，重复测定方差分析显示，A组经治疗后，从给药第4周到第12周，其血清 HBV DNA滴度与给药前相比出现了显著下降；B组经治疗后，从给药第8周到第12周，其血 清HBV DNA滴度与给药前相比出现了显著下降；C组经治疗后，从给药第4周到第12周，其 血清HBV DNA滴度与给药前相比出现了显著下降。分析3-1可得出C组比其单方A、B组血清HBV DNA滴度下降更为明显，从多点位的药理功能发挥其较好的药物协同作用，弥补了其单方的不足。 

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。下述实施例中的海鞘多肽的氨基酸序列均为：LysGlyLysIleGluHis。 

实施例1 

　处方：海鞘多肽1mg，叶下珠醇提物8g。 

　制备方法： 

　(1)将叶下珠打成粗粉，按渗漉法用55％乙醇提取渗漉液为药材的8倍量，过滤，减压 回收乙醇并浓缩为1∶1，得叶下珠醇提物。 

　(2)用与海鞘等重量95％乙醇浸泡海鞘2周，回收乙醇得到浸膏，将浸膏用2倍体积 的水溶解，然后用与水等体积的乙酸乙酯萃取，取水层，最后使用大孔树脂色谱法分离提纯， 取薄层色谱紫外光检识Rf为0.5～0.6的洗脱液，挥尽溶剂，得海鞘多肽。所述的薄层色谱 条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液。 

　(3)取海鞘多肽1mg，叶下珠醇提物8g混合，即可。 

实施例2 

　处方：海鞘多肽3mg，叶下珠醇提物7g。 

　(1)将叶下珠打成粗粉，按渗漉法用55％乙醇提取渗漉液为药材的7倍量，过滤，减压 回收乙醇并浓缩为1∶1，得叶下珠醇提物。 

　(2)用与海鞘等重量95％乙醇浸泡海鞘2周，回收乙醇得到浸膏，将浸膏用3倍体积 的水溶解，然后用与水等体积的氯仿萃取，取水层，最后使用硅胶色谱法分离提纯，取薄层 色谱紫外光检识Rf为0.5～0.6的洗脱液，挥尽溶剂，得海鞘多肽。所述的薄层色谱条件： 展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液。 

　(3)取海鞘多肽3mg，叶下珠醇提物7g混合，即可。 

实施例3 

　处方：海鞘多肽6mg，叶下珠醇提物7g。 

　制备方法： 

　(1)将叶下珠打成粗粉，按渗漉法用55％乙醇提取渗漉液为药材的6倍量，过滤，减压 回收乙醇并浓缩为1∶1，得叶下珠醇提物。 

　(2)用与海鞘等重量95％乙醇浸泡海鞘2周，回收乙醇得到浸膏，将浸膏用3倍体积 的水溶解，然后用与水等体积的正丁醇萃取，取水层，最后依次使用硅胶色谱法和Sephadcx LH20色谱法分离提纯，取薄层色谱紫外光检识Rf为0.5～0.6的洗脱液，挥尽溶剂，得海鞘 多肽。所述的薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液。 

　(3)取海鞘多肽6mg和叶下珠醇提物7g混和即可。 

实施例4 

　处方：海鞘多肽10mg，叶下珠醇提物5g。 

　制备方法： 

　(1)将叶下珠打成粗粉，按渗漉法用55％乙醇提取渗漉液为药材的8倍量，过滤，减压 回收乙醇并浓缩为1∶1，得叶下珠醇提物。 

　(2)用与海鞘等重量95％乙醇浸泡海鞘2周，回收乙醇得到浸膏，将浸膏用3倍体积 的水溶解，然后用与水等体积的正己烷萃取，取水层，最后依次使用依次使用大孔树脂色谱 法、硅胶色谱法、Sephadex LH-20色谱法分离提纯，取薄层色谱紫外光检识Rf为0.5～0.6 的洗脱液，挥尽溶剂，得海鞘多肽。所述的薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1； 显色剂是5％硫酸乙醇液。 

　(3)取海鞘多肽10mg和叶下珠醇提物5g混和即可。 

应用实施例 

　实施例5 

　抗乙型肝炎病毒口服液：海鞘多肽10mg，叶下珠醇提物8g，甜蜜素1g，蔗糖60g，薄荷 40g，尼泊金乙酯0.5g，苯甲酸钠2g，水加至1000g。 

　制备方法：取制备例1所述的组合物加蒸馏水溶解，再加入尼泊金乙酯、苯甲酸钠溶液， 最后加入甜蜜素、蔗糖、薄荷搅拌使溶解，再加蒸馏水至全量，灌装，灭菌即得。 

实施例6 

　抗乙型肝炎病毒口服液：海鞘多肽7mg，叶下珠醇提物6g，蔗糖70g，尼泊金乙酯1g， 水加至1000g。 

　制备方法：取制备例2所述的组合物加蒸馏水溶解，再加入尼泊金乙酯搅拌溶解，最后 加入蔗糖搅拌使溶解，再加蒸馏水至全量，灌装，灭菌即得。 

实施例7 

　抗乙型肝炎病毒口服液：海鞘多肽5mg，叶下珠醇提物5g，甜蜜素1.5g，薄荷30g，苯 甲酸钠2.5g，水加至1000g。 

　制备方法：取制备例3所述的组合物加蒸馏水溶解，再加入苯甲酸钠溶液，最后加入甜 蜜素、薄荷搅拌使溶解，再加蒸馏水至全量，灌装，灭菌即得。 

　实施例8 

　抗乙型肝炎病毒口服液：海鞘多肽1mg，叶下珠醇提物5g，甜蜜素1.2g，蔗糖90g，薄 荷25g，尼泊金乙酯1g，水加至1000g。 

　制备方法：取制备例4所述的组合物加蒸馏水溶解，再加入尼泊金乙酯，最后加入甜蜜 素、蔗糖、薄荷搅拌使溶解，再加蒸馏水至全量，灌装，灭菌即得。 

SEQUENCE LISTING

 

<110>  天津拓飞生物科技有限公司

<120>  海鞘多肽药物组合物及其制备方法与应用

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  6

<212>  PRT

<213> 海鞘多肽

<400>  1

Lys Gly Lys Ile Glu His

1               5       　

 

Claims (4)

1. 一种抗乙型肝炎病毒的海鞘多肽药物组合物，该组合物由下述重量配比的组分组成： 

　海鞘多肽           0.001～0.01份； 

　叶下珠醇提物            5～8份； 

　海鞘多肽的氨基酸序列为Lys Gly Lys Ile Glu His；所述的叶下珠是 Common Leafflower Herb Herba Phyllanthi Urinariae。

2.权利要求1所述的抗乙型肝炎病毒药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

3.权利要求2所述的应用，其中所述的药物是含有以下重量配比的组分的抗乙型肝炎病毒口服液：海鞘多肽0.001～0.01份、叶下珠醇提物5～8份、防腐剂2～3份、甜味剂适量、水800～1000份，上述组分中，甜味剂是甜蜜素或/和蔗糖，防腐剂是苯甲酸或/和尼泊金乙酯。

4.权利要求3所述的应用，其特征是所述的抗乙型肝炎病毒口服液中还含有薄荷 20～50份。