CN116731865A - 高活性高稳定性益生菌低温冷冻干燥的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高活性高稳定性益生菌低温冷冻干燥的方法，属于益生菌制品制备技术领域，该方法包括将益生菌与冻干保护剂混匀并冻干的步骤；该冻干保护剂包括羟乙基淀粉10‑40wt％、氨基葡萄糖5‑25wt％、低聚龙胆糖1‑7wt％和谷胱甘肽1‑5wt％，余量为水。本发明采用的羟乙基淀粉相比于原料淀粉，其耐酸、耐碱、水中溶解度及生物活性明显增强，可调节益生菌细胞内外的渗透压，抑制细胞过度脱水形成冰晶保护菌株；氨基葡萄糖具有修复细胞损伤，并刺激细胞生长的活性；将低聚龙胆糖和谷胱甘肽与羟乙基淀粉、氨基葡萄糖协同配伍，共同保护益生菌减少冻干损害，提高保存稳定性，延长产品货架期，利于益生菌产品的推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌制品制备技术领域，特别是涉及高活性高稳定性益生菌低温冷冻干燥的方法。
背景技术
益生菌寄居在人体肠道内能抑制有害微生物和食品中病原微生物如沙门氏菌等的生长，维持肠道菌群平衡，治疗肠道功能紊乱。益生菌在体内发酵糖类，产生大量乙酸和乳酸，使肠道内的pH下降，抑制了致病菌的生长。益生菌可黏附于肠黏膜上皮细胞，能产生胞外糖苷酶，可降解肠黏膜上皮细胞的复杂多糖，而这些糖是潜在致病菌和结合细菌毒素的受体，可以阻止潜在致病菌及其毒素在肠黏膜上皮细胞的黏附和侵入。益生菌产生D-半乳糖苷酶，缓解乳糖不耐症患者的症状；提高人的免疫功能；有文献报道益生菌也具有降血压，降低血清胆固醇、延缓机体衰老的能力。
益生菌对人体的健康大有裨益已为众人所共知，并已广泛应用于食品生产。然而，益生菌自身比较脆弱，容易受周围环境的影响而导致食品中益生菌菌数的快速下降，严重影响了益生菌的益生作用，也使常温下益生菌食品货架期缩短，影响了益生菌系列产品的生产、销售和应用。因此，提高益生菌在食品中的稳定性和存活能力是当前研究的热点。
冷冻干燥是先将干燥物料中的水冻成冰，然后使冰升华而除去水的一种干燥方法。由于其对细胞损伤小，特别适用于菌种干燥保存，而且保护剂的使用会进一步减少损伤，成为有效的菌株保存手段。但是不同的保护剂各有优缺点，筛选和优化冻干保护剂成分组成，是提升益生菌对环境耐受性最为直接和有效的手段。
氨基葡萄糖简称氨糖，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的产物，在生物体的生长过程中起着重要的作用。此外，氨基葡萄糖还是组成黏膜分泌物、结缔组织、皮肤、肌腱、韧带和软骨等必不可少的成分，广泛应用于食品、化妆品以及医药行业。目前为止，尚未有采用氨基葡萄糖作为冻干保护剂成分应用于益生菌冻干制品中的报道。
发明内容
本发明的目的是提供高活性高稳定性益生菌低温冷冻干燥的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明采用羟乙基淀粉、氨基葡萄糖、低聚龙胆糖和谷胱甘肽为冻干保护剂成分，保护益生菌减少冻干损害，提高保存稳定性，延长益生菌冻干产品的货架期，有助于益生菌产品的推广应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明还提供一种益生菌冻干保护剂，所述益生菌冻干保护剂由以下重量配比组分组成：
羟乙基淀粉10-40wt％、氨基葡萄糖5-25wt％、低聚龙胆糖1-7wt％和谷胱甘肽1-5wt％，余量为水。
进一步地，所述益生菌冻干保护剂由以下重量配比组分组成：
羟乙基淀粉30wt％、氨基葡萄糖25wt％、低聚龙胆糖5wt％和谷胱甘肽3wt％，余量为水。
本发明还提供一种所述的益生菌冻干保护剂在制备益生菌冻干制品中的应用。
本发明提供一种益生菌低温冷冻干燥的方法，包括将益生菌与冻干保护剂混匀并冻干的步骤；所述冻干保护剂由以下重量配比组分组成：
羟乙基淀粉10-40wt％、氨基葡萄糖5-25wt％、低聚龙胆糖1-7wt％和谷胱甘肽1-5wt％，余量为水。
进一步地，将所述益生菌的菌泥与所述冻干保护剂以1：4的重量比混匀。
进一步地，所述益生菌包括植物乳杆菌。
本发明还提供一种所述的方法制备获得的益生菌冻干制品。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用羟乙基淀粉、氨基葡萄糖、低聚龙胆糖和谷胱甘肽为冻干保护剂成分，其中羟乙基淀粉是以玉米淀粉为原料，经水解、醚化变性而制成的高分子复合物，相比于原料淀粉，其耐酸、耐碱、水中溶解度及生物活性明显增强，并且羟乙基淀粉能够产生渗透压作用，可调节益生菌细胞内外的渗透压，改善细胞膜流动性，抑制细胞过度脱水形成冰晶保护菌株；氨基葡萄糖由葡萄糖的一个羟基被氨基取代形成，易结合水分子，发挥水合作用，减少游离水的含量并增加溶液的粘性，从而减缓晶核的生长过程，达到保护细胞的目的；氨基酸葡萄糖还作为菌体细胞的保护骨架，具有修复细胞损伤，并刺激细胞生长的活性，氨基葡萄糖同时具有抗氧化抑菌作用，能够抑制损伤细胞的超氧化物自由基的产生，保护细胞不被氧化损害，促进益生菌生长并抑制有害菌的影响；本发明采用低聚龙胆糖和谷胱甘肽与羟乙基淀粉、氨基葡萄糖协同配伍，共同保护益生菌减少冻干损害，提高保存稳定性，延长益生菌冻干产品的货架期，有助于高活性高稳定性益生菌产品的推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为各组植物乳杆菌的冻干存活率统计结果；
图2为各组冻干菌体在常温保存的稳定性统计结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所用的羟乙基淀粉购自上海麦克林生化科技有限公司，氨基葡萄糖购自四川绿骋生物科技有限公司，低聚龙胆糖和谷胱甘肽购自上海甄准生物科技有限公司，上述制剂可参照相关文献自行制备，也可以通过其他商业途径购买获得。
本发明选择的植物乳杆菌为植物乳杆菌CQPC02(保藏编号为CGMCCNO.14491，已在CN110699271B和CN114774302B专利文献公开)。
实施例1
高活性高稳定性益生菌低温冷冻干燥的方法，包括以下步骤：
S1.制备冻干保护剂：羟乙基淀粉10wt％、氨基葡萄糖5wt％、低聚龙胆糖1wt％和谷胱甘肽0.6wt％，余量为无菌水；
S2.益生菌低温冷冻干燥：选择植物乳杆菌经MRS固体斜面培养基传代活化恢复活力后，接入灭菌后的MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱培养12h，以此作为植物乳杆菌的种子液。以1％的量再次接种入灭菌后MRS液体培养基中，使植物乳杆菌处于对数生长期后期，然后分装于50mL无菌离心管中，置于高速冷冻离心机(10000r/min)，4℃离心10min，弃去上清液，将菌泥称重后按照1：1的比例加入灭菌生理盐水(0.9％的浓度)，快速混合均匀后，制成植物乳杆菌的菌悬液，取2mL菌悬液进行计数(作为冻干前的活菌总数)，再将剩余的菌悬液分装于无菌的10mL冻干管中，每管2mL菌悬液，按照菌泥：冻干保护剂重量比为1：4加入冻干保护剂，制成混合液，之后将制备好的混合液置于-20℃的温度下预冻，使其完全冻结后，迅速将冻结样品移入真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h，得到冻干菌体。
实施例2
与实施例1相同，区别仅在于，步骤S1中冻干保护剂为：羟乙基淀粉15wt％、氨基葡萄糖20wt％、低聚龙胆糖1wt％和谷胱甘肽1wt％，余量为无菌水。
实施例3
与实施例1相同，区别仅在于，步骤S1中冻干保护剂为：羟乙基淀粉20wt％、氨基葡萄糖16wt％、低聚龙胆糖3wt％和谷胱甘肽2wt％，余量为无菌水。
实施例4
与实施例1相同，区别仅在于，步骤S1中冻干保护剂为：羟乙基淀粉30wt％、氨基葡萄糖25wt％、低聚龙胆糖5wt％和谷胱甘肽3wt％，余量为无菌水。
实施例5
与实施例1相同，区别仅在于，步骤S1中冻干保护剂为：羟乙基淀粉40wt％、氨基葡萄糖20wt％、低聚龙胆糖7wt％和谷胱甘肽5wt％，余量为无菌水。
对比例1
与实施例1相同，区别仅在于，将步骤S1中冻干保护剂的羟乙基淀粉替换成玉米淀粉。
对比例2
与实施例1相同，区别仅在于，将步骤S1中冻干保护剂的羟乙基淀粉替换成羟甲基淀粉。
对比例3
与实施例1相同，区别仅在于，将步骤S1中冻干保护剂的氨基葡萄糖替换成葡萄糖。
对比例4
与实施例1相同，区别仅在于，将步骤S1中冻干保护剂的氨基葡萄糖省略。
对比例5
与实施例1相同，区别仅在于，步骤S1中冻干保护剂为：玉米淀粉10wt％、海藻糖5wt％、甘露醇1wt％和谷胱甘肽0.6wt％，余量为无菌水。
效果验证
以未添加冻干保护剂的植物乳杆菌进行低温冷冻干燥处理的样本为对照组，参照国家标准GB4789.35-2016乳酸菌检测方法，分别测定实施例1-5、对比例1-5和对照组的植物乳杆菌冻干前和冻干后的菌落总数。存活率计算公式为：
存活率(％)＝(冻干后2mL菌悬液活菌总数/冻干前2mL菌悬液活菌总数)×100％。
计算结果如图1和表1所示：
表1各组植物乳杆菌在冷冻干燥前后的活菌数及冻干存活率
从表1中可以看出，实施例1-5采用的冻干保护剂制备的益生菌冻干菌体，相比于调整冻干保护剂组分种类的对比例1-4及采用常规冻干保护剂的对比例5均取得更高的菌体冻干后存活率，并且显著高于对照组。
分别将实施例1-5、对比例1-5和对照组制备的益生菌冻干菌体在常温下存放1个月、3个月、6个月，测定各个时期的活菌数，结果如图2和表2所示：
表2各组冻干菌体在常温保存的稳定性
从表2的结果中可以看出，实施例1-5采用的冻干保护剂制备的益生菌冻干菌体在常温下存放的稳定性显著高于对照组，也明显比调整冻干保护剂组分种类的对比例1-5稳定性更佳，实施例1-5的冻干菌体在常温存放6个月后仍能保证70％以上的菌体存活率，延长菌体产品货架期，利于益生菌产品的推广应用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种益生菌冻干保护剂，其特征在于，所述益生菌冻干保护剂由以下重量配比组分组成：
羟乙基淀粉10-40wt％、氨基葡萄糖5-25wt％、低聚龙胆糖1-7wt％和谷胱甘肽1-5wt％，余量为水。
2.根据权利要求1所述的益生菌冻干保护剂，其特征在于，所述益生菌冻干保护剂由以下重量配比组分组成：
羟乙基淀粉30wt％、氨基葡萄糖25wt％、低聚龙胆糖5wt％和谷胱甘肽3wt％，余量为水。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的益生菌冻干保护剂在制备益生菌冻干制品中的应用。
4.一种益生菌低温冷冻干燥的方法，其特征在于，包括将益生菌与冻干保护剂混匀并冻干的步骤；所述冻干保护剂由以下重量配比组分组成：
羟乙基淀粉10-40wt％、氨基葡萄糖5-25wt％、低聚龙胆糖1-7wt％和谷胱甘肽1-5wt％，余量为水。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述益生菌的菌泥与所述冻干保护剂以1：4的重量比混匀。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述益生菌包括植物乳杆菌。
7.一种如权利要求4-6任一项所述的方法制备获得的益生菌冻干制品。
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