CN116183903A - 一种用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物及其制备方法。包括：将生物素化抗体和抗体标记受体球用稀释液分别稀释至所需浓度，将所得两种溶液混合得到检测试剂A及将链霉亲和素偶联供体微球用稀释液稀释至所需浓度得到检测试剂B；向A、B中分别加入冻干保护剂，混匀；转移至滴珠机中，使试剂在液氮中速冻形成冰球，将带有液氮的速冻试剂球真空干燥，得到检测试剂A和B的冻干珠小球，即可。加入冻干保护剂并采用液氮速冻干燥处理，冻干后的试剂呈小球状，圆形效果好，形状及体积均匀，大小一致，水分含量低，可以长时间稳定储存，不影响检测信号值，且相较常规冻干处理用时更短。

Description

一种用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物及其制备方法。
背景技术
AlphaLISA(amplified luminescent proximity homogeneous assay linkedimmunosorbent assay)检测方法，不需要洗涤，操作简便，灵敏度高，动态范围宽(3-4个数量级)，亲和范围大(高低亲和力的抗体均可应用)，抗干扰能力强，可用于替换传统的ELISA检测方法。目前AlphaLISA检测方法已被成功地应用于酶检测、相互作用检测(包括受体/配体、蛋白/蛋白、蛋白/DNA等)、免疫检测、GPCR功能检测(cAMP，IP3)等热点领域。目前商业化试剂盒均为液态试剂，AlphaLISA检测体系中含有抗体、生物素和链霉亲和素等蛋白成分需要在低温条件下保存，使用时需要恢复室温，不仅操作繁琐，而且AlphaLISA反应对温度比较敏感，实验温度差异会导致信号值波动，进而影响试剂的重复性。另外，低温保存也会增加储存、运输方面的成本以及能耗。
冷冻干燥技术是生物制品科研和生产中保存蛋白质最为常用的技术。它既可以保持产品的生物学特性，又能延长生物制品在常温保存的有效期。冷冻干燥是利用冰晶升华的原理，在高度真空的环境下，将已冻结了的生物制品的水分不经过冰的融化直接从冰固体升华为蒸汽。冷冻干燥技术具有较多的优点，干燥后的生物制品的生物学活性和体积保持不变，排除了95％～99％以上的水分，能够长期保存而不变质，冻干形成的疏松多孔结构，极易吸水恢复原状。因此极其适合应用于免疫检测试剂的研发，既有利于试剂的储存和运输，也不影响试剂的检测。但常规冷冻干燥技术，预冻时间比较长，而AlphaLISA检测体系的供体球和受体球的稳定性在长时间冷冻时易受破坏，导致常规冷冻干燥不适宜AlphaLISA体系。
而与常规的冻干相比，液氮速冻，具有预冻时间快的优势，减少了检测试剂暴露在常温环境的时间。除此之外，液氮冻干还可形成冻干珠小球，具有节省冻干空间(不需要将试剂条等包装一起放入冻干机进行冻干，提高了冻干机的利用率)、方便转移(一人份试剂一个小球，前期研发和小批量生产时，可以通过人工手动来分装小球；产能提升后，可通过自动化设备进行自动化分装)、复溶迅速(冻干珠小球没有与管壁的接触面，整个球形体都是疏松网状结构)等优点。但是冻干珠小球同时也具备易破碎等特性，因此需要找到一种AlphaLISA检测试剂所需的冻干保护体系，制备出更易长期保存的完整、圆滑、不易破碎的冻干珠小球。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物及其制备方法。
本发明所提供的用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物包括AlphaLISA检测试剂和冻干保护剂，
所述AlphaLISA检测试剂包括用于AlphaLISA反应的检测试剂A和检测试剂B，其中检测试剂A包括生物素化抗体、抗体标记受体球和稀释液，检测试剂B包括链霉亲和素偶联供体微球和稀释液；
具体地，所述检测试剂A的组成为：0.05-1.0μg/mL的生物素化抗体、5-50μg/mL的抗体标记受体球和稀释液，其中，所述稀释液的组成为：50mM磷酸缓冲液，pH7.4，50mM氯化钠，2mM二乙基三胺五乙酸，1mg/mL葡聚糖500,0.5％牛血清白蛋白，0.1％Tween-20，0.01％proclin300；
所述检测试剂B的组成为：5-50μg/mL的链霉亲和素偶联供体微球和稀释液，其中，所述稀释液的组成为：50mM磷酸缓冲液，pH7.4，50mM氯化钠，2mM二乙基三胺五乙酸，1mg/mL葡聚糖500,0.5％牛血清白蛋白，0.1％Tween-20，0.01％proclin300。
所述冻干保护剂为以下试剂中的一种或几种的复合物：葡聚糖、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、酪蛋白。
所述冻干保护剂与AlphaLISA检测试剂的重量体积比浓度为1％-10％，即每100mlAlphaLISA检测试剂中含有1-10g冻干保护剂。
具体地，每100ml检测试剂A中含有1-10g冻干保护剂，且每100ml检测试剂B中也含有1-10g冻干保护剂；
更具体地，每100ml检测试剂A或B中含有1-10g的蔗糖、葡聚糖、海藻糖中的至少一种和1-5g的牛血清白蛋白和/或酪蛋白。
在本发明的实施方式中，每100ml检测试剂A中含有5g蔗糖和2g牛血清白蛋白(BSA)；每100ml检测试剂B中含有5g蔗糖和2g牛血清白蛋白(BSA)。
通过大量的实验研究发现，该冻干保护剂可使得冻干试剂形态较好，试剂性能较好且可长期稳定储存。
所述AlphaLISA检测试剂为冻干珠小球，稳定性好。
本发明还提供上述用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物的制备方法。
本发明所提供的用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物的制备方法，包括如下步骤：
1)将生物素化抗体和抗体标记受体球用稀释液分别稀释至所需浓度，将所得两种溶液混合得到检测试剂A；加入冻干保护剂，混匀，得到含冻干保护剂的检测试剂A；转移至滴珠机中，使试剂在液氮中速冻形成冰球，将带有液氮的速冻试剂球真空干燥，得到检测试剂A冻干珠小球；
2)将链霉亲和素偶联供体微球用稀释液稀释至所需浓度得到检测试剂B；加入冻干保护剂，混匀，得到含冻干保护剂的检测试剂B；转移至滴珠机中，使试剂在液氮中速冻形成冰球，将带有液氮的速冻试剂球真空干燥，得到检测试剂B冻干珠小球，即可。
上述方法步骤1)、2)中，设置滴珠体积为10-20μL/滴，具体可为20μL/滴；
液氮速冻后真空干燥的条件如下：
1)预冻阶段：液氮1-10min，压强为1atm；
2)升华阶段：控制温度-50℃～-40℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-2h；
3)升华阶段：控制温度-40℃～-30℃，压强0.1-2.0Pa，维持3-5h；
4)升华阶段：控制温度-30℃～-20℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-2h；
5)升华阶段：控制温度-20℃～-10℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-2h；
6)解析阶段：控制温度0℃～10℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h；
7)解析阶段：控制温度10℃～20℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h。
在本发明的实施方式中，液氮速冻后真空干燥的条件如下：
1)预冻阶段：液氮1-10min，压强为1atm；
2)升华阶段：控制温度-50℃～-40℃，压强0.1-2.0Pa，维持1h；
3)升华阶段：控制温度-40℃～-30℃，压强0.1-2.0Pa，维持4h；
4)升华阶段：控制温度-30℃～-20℃，压强0.1-2.0Pa，维持1h；
5)升华阶段：控制温度-20℃～-10℃，压强0.1-2.0Pa，维持1h；
6)解析阶段：控制温度0℃～10℃，压强0.1-2.0Pa，维持3h；
7)解析阶段：控制温度10℃～20℃，压强0.1-2.0Pa，维持3h。
通过大量的实验研究发现，采用上述液氮速冻干燥处理，冻干后的试剂呈小球状，圆形效果好，形状及体积均匀，大小一致，水分含量低，可以长时间稳定储存，不影响检测信号值，且相较常规冻干处理用时更短。
附图说明
图1为采用本发明的液氮速冻干燥制得的AlphaLISA检测试剂和采用常规预冻干燥制得的AlphaLISA检测试剂照片(均为检测试剂A)。
图2为本发明的液氮速冻干燥和常规预冻干燥的所得试剂稳定性的比较。
图3为本发明实施例2中加入冻干保护剂或不加冻干保护剂对试剂外型的影响(均为检测试剂A)。
图4为本发明实施例2中加入冻干保护剂或不加冻干保护剂制得的冻干珠小球试剂的重复性实验。
图5为本发明实施例3中单独糖保护剂、单独蛋白保护剂和组合保护剂对试剂(均为检测试剂A)外型的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1)AlphaLISA检测试剂A的配制，液氮速冻干燥
采用重组表达的金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原免疫小鼠，取小鼠脾细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选获得效价高的细胞株，再进行抗体纯化获得SEB1#和SEB6#，金黄色葡萄球菌肠毒素B特异性抗体。抗体的生物素标记参见Thermo公司生物素标记试剂盒说明书。受体微球和链霉亲和素偶联供体微球购自Perkin Elmer公司，抗体偶联方法参见Perkin Elmer公司微球标记说明书。
采用稀释液(50mM磷酸缓冲液，pH7.4，50mM氯化钠，2mM二乙基三胺五乙酸，1mg/mL葡聚糖500,0.5％牛血清白蛋白，0.1％Tween-20，0.01％proclin300)将生物素化金黄色葡萄球菌肠毒素B抗体(SEB6#)和金黄色葡萄球菌肠毒素B抗体(SEB1#)标记的受体球，分别稀释至0.25μg/mL和25μg/mL，将所得两种溶液混合，通过涡旋或是上下颠倒方式将试剂混合均匀得到检测试剂A。再按照重量体积比将冻干保护剂(5％蔗糖和2％BSA)加入到上述检测试剂A中，混合均匀，再将加入冻干保护剂的试剂转移至滴珠机，调整滴珠体积为20μL/滴，试剂在液氮中速冻形成大小均一的冰球，倾倒多余的液氮，将带有少量液氮的速冻试剂球转移到西林瓶内，在冻干机中进行真空干燥。具体程序如下：
1)预冻阶段：液氮1-10min，压强为1atm；
2)升华阶段：控制温度-50℃～-40℃，压强0.1-2.0Pa，维持1h；
3)升华阶段：控制温度-40℃～-30℃，压强0.1-2.0Pa，维持4h；
4)升华阶段：控制温度-30℃～-20℃，压强0.1-2.0Pa，维持1h；
5)升华阶段：控制温度-20℃～-10℃，压强0.1-2.0Pa，维持1h；
6)解析阶段：控制温度0℃～10℃，压强0.1-2.0Pa，维持3h；
7)解析阶段：控制温度10℃～20℃，压强0.1-2.0Pa，维持3h。
从冻干机中取出装有冻干珠小球的西林瓶，封存备用。
2)AlphaLISA检测试剂B的配制，液氮速冻干燥
采用稀释液(50mM磷酸缓冲液，pH7.4，50mM氯化钠，2mM二乙基三胺五乙酸，1mg/mL葡聚糖500,0.5％牛血清白蛋白，0.1％Tween-20，0.01％proclin300)将链霉亲和素偶联供体微球稀释至10μg/mL，通过涡旋或是上下颠倒方式将试剂混合均匀。再按照重量体积比将冻干保护剂(5％蔗糖和2％BSA)加入到上述检测试剂B中，混合均匀，再将加入冻干保护剂的试剂转移至滴珠机，调整滴珠体积为20μL/滴，试剂在液氮中速冻形成大小均一的冰球，倾倒多余的液氮，将带有少量液氮的速冻试剂球转移到西林瓶内，在冻干机中进行真空干燥。具体程序如下：
1)预冻阶段(液氮速冻)：液氮1-10min，压强为1atm；
2)升华阶段：控制温度-50℃～-40℃，压强0.1-2.0Pa，维持1h；
3)升华阶段：控制温度-40℃～-30℃，压强0.1-2.0Pa，维持4h；
4)升华阶段：控制温度-30℃～-20℃，压强0.1-2.0Pa，维持1h；
5)升华阶段：控制温度-20℃～-10℃，压强0.1-2.0Pa，维持1h；
6)解析阶段：控制温度0℃～10℃，压强0.1-2.0Pa，维持3h；
7)解析阶段：控制温度10℃～20℃，压强0.1-2.0Pa，维持3h。
从冻干机中取出装有冻干珠小球的西林瓶，封存备用。
对比例1
1)AlphaLISA检测试剂A的配制和常规预冻干燥
AlphaLISA检测试剂A的配制同上，将加入了冻干保护剂的试剂按照20μL/管分装到0.2mLEp管中，放入冻干机中进行常规冷冻真空干燥。将液氮速冻改成冻干机中预冻，控制冻干机温度-50℃，压强为1atm，维持2h。预冻完成后继续升华和解析阶段，升华和解析阶段程序同上。冻干完成后盖好0.2mLEp管盖，封存备用。
2)AlphaLISA检测试剂B的配制和常规预冻干燥
AlphaLISA检测试剂B的配制同上，将加入了冻干保护剂的试剂按照20μL/管分装到0.2mLEp管中，放入冻干机中进行冷冻真空干燥。将液氮速冻改成冻干机中预冻，控制冻干机温度-50℃，压强为1atm，维持2h。预冻完成后继续升华和解析阶段，升华和解析阶段程序同上。冻干完成后盖好0.2mLEp管盖，封存备用。
由图1所示两种冻干方式对照可知，采用本发明的液氮速冻干燥制得的AlphaLISA检测试剂A呈小球状，圆形效果好，形状及体积均匀，大小一致。而采用常规预冻干燥制得的AlphaLISA检测试剂A外型受冻干容器影响，且表面粗糙不光滑。同时，采用本发明的液氮速冻干燥制得的AlphaLISA检测试剂B与检测试剂A的形貌一致，也呈小球状，圆形效果好，形状及体积均匀，大小一致。而采用常规预冻干燥制得的AlphaLISA检测试剂B外型也受冻干容器影响，且表面粗糙不光滑。
AlphaLISA检测试剂A和B的复溶和检测
将实施例1液氮速冻真空干燥或对比例1常规冷冻干燥制得的检测试剂A和B分取出，分别加入20μL复溶液(0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液)进行复溶。采用复溶液将金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原稀释至100ng/mL，取10μL抗原加入20μL复溶好的AlphaLISA检测试剂A中，37℃恒温箱中反应15min后，再将抗原和检测试剂A混合液，转移至检测试剂B中，37℃恒温箱中反应10min，在多功能酶标仪SPECTRAMAXi3(MolecularDevices公司)进行AlphaLISA检测。
液氮速冻干燥或常规预冻干燥的检测试剂的加速稳定实验
将液氮速冻干燥或常规预冻干燥的检测试剂A和B置于37℃恒温箱中，分别于0天，1天，7天和14天取出，进行复溶和检测，比较两种冻干方法冻干试剂的稳定性。在37℃恒温箱中存放0天，1天，7天和14天的液氮速冻干燥试剂检测100ng/mL金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原的信号值基本保持不变，而常温预冻干燥的试剂在37℃恒温箱中存放7天后信号值下降明显，14天后信号值降低50％以上(图2)。说明相较于常规预冻方法，液氮速冻干燥能够更好地保证试剂的稳定。
实施例2、冻干保护剂对液氮冻干珠小球外型的影响
参照实施例1的操作，配制AlphaLISA检测试剂A和检测试剂B，按照重量体积比(5％蔗糖和2％BSA)加入冻干保护剂，调整滴珠体积为20μL/滴，液氮速冻干燥。或是不加冻干保护剂，调整滴珠体积为20μL/滴，液氮速冻干燥，比较加入和不加冻干保护剂的液氮冻干珠小球的外型差异。加入冻干保护剂后，制备出的冻干珠小球更完整，圆滑，不易破(见图3，检测试剂A。加入冻干保护剂和不加冻干保护剂的检测试剂B的外型同检测试剂A)。两种冻干珠小球复溶后，检测0.1ng/mL金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原，计算6次重复检测结果的变异系数(CV)，相较于未加冻干保护，加入冻干保护剂后CV更小(<5％)，冻干外型更均一，试剂浓度均一，更能获得一致性结果(图4)。
实施例3、冻干保护剂组合物对液氮冻干珠小球外型的影响
参照实施例1的操作，配制AlphaLISA检测试剂A和检测试剂B，按照重量体积比加入5％蔗糖和2％BSA作为冻干保护剂，调整滴珠体积为20μL/滴，液氮速冻干燥。或只加5％蔗糖，调整滴珠体积为20μL/滴，液氮速冻干燥。或只加2％BSA，调整滴珠体积为20μL/滴，液氮速冻干燥。
比较三种方式液氮冻干珠小球的外型差异。单独的糖或蛋白都会影响液氮冻干珠小球的外型，只加蔗糖会导致冻干球吸水严重、变小，而只加BSA会导致冻干球呈球效果不好(图5，检测试剂A)。至少一种糖与至少一种蛋白的组合的冻干保护剂同样最适合检测试剂B。因此，冻干保护剂优选为至少一种糖与至少一种蛋白的组合。
我们根据实验测试发现，糖和蛋白起的作用不同，任何单独成分都不能获得较好的外型，即使增加浓度也不能替代另外一种组分的作用，蛋白增加过高的浓度反而影响检测信号。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (8)

1.一种用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物，包括AlphaLISA检测试剂和冻干保护剂，
所述AlphaLISA检测试剂包括用于AlphaLISA反应的检测试剂A和检测试剂B，其中检测试剂A包括生物素化抗体、抗体标记受体球和稀释液，
检测试剂B包括链霉亲和素偶联供体微球和稀释液；
所述冻干保护剂为以下试剂中的一种或几种的复合物：葡聚糖、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、酪蛋白。
2.根据权利要求1所述的用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物，其特征在于：所述冻干保护剂与AlphaLISA检测试剂的重量体积比浓度为1％-10％。
3.根据权利要求1或2所述的用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物，其特征在于：每100ml检测试剂A或B中含有1-10g的蔗糖、葡聚糖、海藻糖中的至少一种和1-5g的牛血清白蛋白和/或酪蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物，其特征在于：所述检测试剂A的组成为：0.05-1.0μg/mL的生物素化抗体、5-50μg/mL的抗体标记受体球和稀释液，其中，所述稀释液的组成为：50mM磷酸缓冲液，pH7.4，50mM氯化钠，2mM二乙基三胺五乙酸，1mg/mL葡聚糖500,0.5％牛血清白蛋白，0.1％Tween-20，0.01％proclin300。
5.根据权利要求1或2所述的用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物，其特征在于：所述检测试剂B的组成为：5-50μg/mL的链霉亲和素偶联供体微球和稀释液，其中，所述稀释液的组成为：50mM磷酸缓冲液，pH7.4，50mM氯化钠，2mM二乙基三胺五乙酸，1mg/mL葡聚糖500,0.5％牛血清白蛋白，0.1％Tween-20，0.01％proclin300。
6.制备权利要求1-5中任一项所述的用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物的方法，包括如下步骤：1)将生物素化抗体和抗体标记受体球用稀释液分别稀释至所需浓度，将所得两种溶液混合得到检测试剂A；加入冻干保护剂，混匀，得到含冻干保护剂的检测试剂A；转移至滴珠机中，使试剂在液氮中速冻形成冰球，将带有液氮的速冻试剂球真空干燥，得到检测试剂A冻干珠小球；
2)将链霉亲和素偶联供体微球用稀释液稀释至所需浓度得到检测试剂B；加入冻干保护剂，混匀，得到含冻干保护剂的检测试剂B；转移至滴珠机中，使试剂在液氮中速冻形成冰球，将带有液氮的速冻试剂球真空干燥，得到检测试剂B冻干珠小球，即可。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤1)、2)中，设置滴珠体积为10-20μL/滴。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：液氮速冻后真空干燥的条件如下：
1)预冻阶段：液氮1-10min，压强为1atm；
2)升华阶段：控制温度-50℃～-40℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-2h；
3)升华阶段：控制温度-40℃～-30℃，压强0.1-2.0Pa，维持3-5h；
4)升华阶段：控制温度-30℃～-20℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-2h；
5)升华阶段：控制温度-20℃～-10℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-2h；
6)解析阶段：控制温度0℃～10℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h；
7)解析阶段：控制温度10℃～20℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h。
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