CN108107210B - 一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液，所述冻干保护液包括牛血清白蛋白、甘露醇、蛋白稳定剂、聚乙二醇和乙二胺四乙酸二钠。髓过氧化物酶(MPO)校准品利用本发明的冻干保护液冻干后不缩水，能维持冻干前形状；不粘瓶；韧性较好；瓶塞不粘冻干粉；冻干品能够完全溶解，溶液澄清，无块状及泡沫产生；冻干前后活性基本保持不变；可以显著提高髓过氧化物酶校准品的稳定性，有利于冻干抗原的运输，延长MPO校准品的保存时间，延长MPO检测试剂盒的保存时间。

Description

一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液

技术领域

本发明涉及生化试剂技术领域，具体涉及一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液。

背景技术

目前国内髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒中的校准品多为液体，MPO抗原在液态下容易发生变性，虽然加入一些保护剂(如一些蛋白、糖类及抗氧化剂等)能够延长MPO抗原在液态下的保存时间，但MPO抗原在保护剂存在的情况下放置2-8℃保质期一般为6-12个月。

国内外有部分MPO校准品也有冻干形式存在，冻干后的MPO抗原稳定时间长，准确度高，但价格较高；有部分试剂盒使用的是一个高浓度的MPO冻干校准品，复溶后的高浓度MPO校准品稳定性相对较好，但实验过程为获得不同浓度的MPO校准品需要增加稀释过程，增加了实验误差；还有些试剂盒中虽然用到冻干的MPO校准品，但复溶后储存时间短，2-8℃只能存放2天，-20℃保存30天。

因此总体上，现有技术存在的缺点：

1)MPO抗原中加入的保护剂本身在液态条件下会存在不稳定现象，不能很好地保护MPO抗原；

2)液体的MPO校准品储存时间相对较短，限制了MPO试剂盒的有效期。

3)液体MPO校准品储存温度一般为2-8℃，运输过程需要使用冰袋或冷链运输，增加了运输过程的成本。

4)冻干MPO校准品复溶稳定性差；

5)冻干MPO校准品仅在较高浓度下稳定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供了一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液，以解决髓过氧化物酶校准品储存时间短、运输不便；冻干品复溶性差的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，所述冻干保护液包括牛血清白蛋白、甘露醇、蛋白稳定剂、聚乙二醇和乙二胺四乙酸二钠。

上述冻干保护液中牛血清白蛋白(BSA)具有低温保护剂和脱水保护剂的作用，能够对MPO抗原起到很好的保护作用。甘露醇可以作为填充剂，也含有多个羟基，可以替代水与MPO抗原的亲水基团形成氢键，保护好MPO抗原的空间结构及避免凝聚。蛋白稳定剂对蛋白类的抗原均有保护作用，避免冻干过程及复溶后的活性损失。聚乙二醇能够提供框架结构，提高冻干后的韧性，有利于维持冻干后的形态。乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)相对于EDTA具有较好的溶解性，能够鳌合一些金属离子，避免金属离子对MPO抗原中氨基酸的氧化。

作为本发明所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述聚乙二醇的平均分子量为10000～40000，优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为20000。

作为本发明所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述冻干保护液包括下述重量百分数的组分：牛血清白蛋白0.5％～3％、甘露醇0.5％～5％、蛋白稳定剂0.1％～1％、聚乙二醇0.2％～2％和乙二胺四乙酸二钠0.05％～0.4％。

作为本发明所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述冻干保护液包括下述重量百分数的组分：牛血清白蛋白1.0％、甘露醇0.5％、蛋白稳定剂0.5％、聚乙二醇0.5％和乙二胺四乙酸二钠0.2％。

作为本发明所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述冻干保护剂还包括缓冲液、色素和防腐剂，所述缓冲液的浓度为10～50mM，所述色素的重量百分数为0.002％～0.01％，所述防腐剂的重量百分数为0.01％～0.2％。

上述技术方案中缓冲液可提供一个较为稳定的pH，避免MPO抗原的凝聚。防腐剂对细菌和霉菌均有抑制生长作用，能够提高冻干抗原复溶后的稳定性。色素对MPO检测没有干扰，将色素添加在MPO校准品中能够与其它试剂区分，可以避免在实验操作过程中加样误差。

作为本发明所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液或MOPS缓冲液。

作为本发明所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述色素为亮蓝、胭脂红、日落黄、柠檬黄、焦糖色、β-胡萝卜素、葡萄皮红、胭脂虫红或栀子蓝。

作为本发明所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述防腐剂为山梨酸钾、亚硝酸钠、苯甲酸钠、生物防腐剂中的至少一种。

作为本发明所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述缓冲液的pH为7.2～7.6。

本发明还提供了一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法，包括以下步骤：

(1)将髓过氧化物酶校准品与权利要求1～9任一项所述的冻干保护液混合，作为髓过氧化物酶校准品的冻干液，所述冻干液中髓过氧化物酶校准品的浓度不低于5ng/mL；

(2)将步骤(1)的冻干液置于真空冷冻干燥机，设置冻干曲线，冷冻干燥；所述冷冻干燥包括预冻、升华干燥和解吸干燥阶段；

预冻阶段：温度降至-30℃并维持3～4h；

升华干燥：温度由-30℃升至-15℃，升温时间为1h，在-15℃干燥12～15h，真空度维持在30Pa以下；

解吸干燥：温度由-15℃升至25℃，升温时间为2h，在25℃干燥3～5h，真空度维持在15Pa以下；

(3)冻干完毕后充入惰性气体，取出冻干样本，得到所述髓过氧化物酶冻干校准品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)冻干外形：冻干后不缩水，能维持冻干前形状；不粘瓶；韧性较好；瓶塞不粘冻干粉。

2)复溶性：加入纯化水后静止10s，冻干品能够完全溶解，溶液澄清，无块状及泡沫产生。

3)冻干前后活性及复溶后活性：MPO校准品冻干前后活性基本保持不变，与冻干前活性差异在5％以内。冻干品在37℃放置30天和开瓶4℃放置30天检测结果偏差在5％以内。

4)冻干MPO校准品可以显著提高MPO校准品的稳定性，有利于冻干抗原的运输，延长MPO校准品的保存时间，从而延长MPO检测试剂盒的保存时间。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

HEPES为羟乙基呱嗪乙硫磺酸，非离子两性缓冲液，能较长时间控制恒定的pH范围；

TAPS为三羟甲基甲胺基丙磺酸；

MOPS为3-(N-吗啉)丙磺酸。

实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的蛋白稳定剂购自科跃中凯；生物防腐剂KY100购自科跃中楷。

实施例1

作为本发明所述髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的一种实施例，本实施例的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液包括如下浓度和重量百分数的组分：

磷酸缓冲液20mM(pH为7.4)、牛血清白蛋白1.0wt％、甘露醇1.0wt％、蛋白稳定剂0.5wt％、聚乙二醇20000 0.5wt％、乙二胺四乙酸二钠0.2wt％、柠檬黄0.005wt％和KY1000.1wt％。

实施例2

作为本发明所述髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的一种实施例，本实施例的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液包括如下浓度和重量百分数的组分：

MOPS缓冲液10mM(pH为7.2)、牛血清白蛋白0.5wt％、甘露醇5wt％、蛋白稳定剂1wt％、聚乙二醇10000 0.2wt％、乙二胺四乙酸二钠0.4wt％、亮蓝0.002wt％、ProClin3000.005wt％和KY100 0.005wt％

实施例3

作为本发明所述髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的一种实施例，本实施例的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液包括如下浓度和重量百分数的组分：Tris-HCl缓冲液50mM(pH为7.6)、牛血清白蛋白3wt％、甘露醇0.5wt％、蛋白稳定剂0.1wt％、聚乙二醇30000 2wt％、乙二胺四乙酸二钠0.05wt％、β-胡萝卜素0.01wt％、ProClin300 0.1wt％和KY100 0.1wt％。

实施例4

作为本发明所述髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的一种实施例，本实施例的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液包括如下浓度和重量百分数的组分：TAPS缓冲液30mM(pH为7.4)、牛血清白蛋白2wt％、甘露醇3wt％、蛋白稳定剂0.8wt％、聚乙二醇1.2wt％、乙二胺四乙酸二钠0.1wt％、日落黄0.004wt％和山梨酸钾0.1wt％。

实施例5

作为本发明所述髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的一种实施例，本实施例的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液包括如下浓度和重量百分数的组分：HEPES缓冲液40mM(pH为7.4)、牛血清白蛋白1wt％、甘露醇4wt％、蛋白稳定剂0.6wt％、聚乙二醇200001.5wt％、乙二胺四乙酸二钠0.09wt％、胭脂红0.004wt％和苯甲酸钠0.12wt％。

实施例6

作为本发明所述髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法的一种实施例，本实施例的所述髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法包括以下步骤：

(1)将髓过氧化物酶校准品与权利要求1所述的冻干保护液混合，作为髓过氧化物酶校准品的冻干液，所述冻干液中髓过氧化物酶校准品的浓度为5ng/mL；

(2)将步骤(1)的冻干液置于真空冷冻干燥机，设置冻干曲线，冷冻干燥；所述冷冻干燥包括预冻、升华干燥和解吸干燥阶段；

1)预冻阶段：将冻干液放置于真空冷冻干燥机中，开始降温，当隔板温度达到-30℃时再维持3h；

2)升华干燥：隔板温度由-30℃升至-15℃，升温时间为1h，在-15℃干燥12h，真空度维持在30Pa以下；

3)解吸干燥：隔板温度由-15℃升至25℃，升温时间2h，在25℃干燥4h，真空度维持在15Pa以下；

(3)冻干完毕后充氮气，压盖后取出冻干样本，得到所述髓过氧化物酶冻干校准品。

实施例7

作为本发明所述髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法的一种实施例，本实施例的所述髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法包括以下步骤：

(1)将髓过氧化物酶校准品与权利要求5所述的冻干保护液混合，作为髓过氧化物酶校准品的冻干液，所述冻干液中髓过氧化物酶校准品的浓度为50ng/mL；

(2)将步骤(1)的冻干液置于真空冷冻干燥机，设置冻干曲线，冷冻干燥；所述冷冻干燥包括预冻、升华干燥和解吸干燥阶段；

1)预冻阶段：将冻干液放置于真空冷冻干燥机中，开始降温，当隔板温度达到-30℃时再维持3.5h；

2)升华干燥：隔板温度由-30℃升至-15℃，升温时间为1h，在-15℃干燥13h，真空度维持在30Pa以下；

3)解吸干燥：隔板温度由-15℃升至25℃，升温时间2h，在25℃干燥3h，真空度维持在15Pa以下；

(3)冻干完毕后充氮气，压盖后取出冻干样本，得到所述髓过氧化物酶冻干校准品。

实施例8

作为本发明所述髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法的一种实施例，本实施例的所述髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法包括以下步骤：

(1)将髓过氧化物酶校准品与权利要求2所述的冻干保护液混合，作为髓过氧化物酶校准品的冻干液，所述冻干液中髓过氧化物酶校准品的浓度为200ng/mL；

(2)将步骤(1)的冻干液置于真空冷冻干燥机，设置冻干曲线，冷冻干燥；所述冷冻干燥包括预冻、升华干燥和解吸干燥阶段；

1)预冻阶段：将冻干液放置于真空冷冻干燥机中，开始降温，当隔板温度达到-30℃时再维持3h；

2)升华干燥：隔板温度由-30℃升至-15℃，升温时间为1h，在-15℃干燥15h，真空度维持在30Pa以下；

3)解吸干燥：隔板温度由-15℃升至25℃，升温时间2h，在25℃干燥5h，真空度维持在15Pa以下；

(3)冻干完毕后充氮气，压盖后取出冻干样本，得到所述髓过氧化物酶冻干校准品。

实施例9

作为本发明所述髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法的一种实施例，本实施例的所述髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法包括以下步骤：

(1)将髓过氧化物酶校准品与权利要求3所述的冻干保护液混合，作为髓过氧化物酶校准品的冻干液，所述冻干液中髓过氧化物酶校准品的浓度为600ng/mL；

(2)将步骤(1)的冻干液置于真空冷冻干燥机，设置冻干曲线，冷冻干燥；所述冷冻干燥包括预冻、升华干燥和解吸干燥阶段；

1)预冻阶段：将冻干液放置于真空冷冻干燥机中，开始降温，当隔板温度达到-30℃时再维持4h；

2)升华干燥：隔板温度由-30℃升至-15℃，升温时间为1h，在-15℃干燥14h，真空度维持在30Pa以下；

3)解吸干燥：隔板温度由-15℃升至25℃，升温时间2h，在25℃干燥4h，真空度维持在15Pa以下；

(3)冻干完毕后充氮气，压盖后取出冻干样本，得到所述髓过氧化物酶冻干校准品。

实施例10

作为本发明所述髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法的一种实施例，本实施例的所述髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法包括以下步骤：

(1)将髓过氧化物酶校准品与权利要求4所述的冻干保护液混合，作为髓过氧化物酶校准品的冻干液，所述冻干液中髓过氧化物酶校准品的浓度为1000ng/mL；

(2)将步骤(1)的冻干液置于真空冷冻干燥机，设置冻干曲线，冷冻干燥；所述冷冻干燥包括预冻、升华干燥和解吸干燥阶段；

1)预冻阶段：将冻干液放置于真空冷冻干燥机中，开始降温，当隔板温度达到-30℃时再维持3h；

2)升华干燥：隔板温度由-30℃升至-15℃，升温时间为1h，在-15℃干燥12h，真空度维持在30Pa以下；

3)解吸干燥：隔板温度由-15℃升至25℃，升温时间2h，在25℃干燥5h，真空度维持在15Pa以下；

(3)冻干完毕后充氮气，压盖后取出冻干样本，得到所述髓过氧化物酶冻干校准品。

对比例

本对比例的冻干保护液包括如下浓度和重量百分数的组分：PBS缓冲液20mM、蔗糖5wt％、BSA 1wt％、右旋糖酐40 2wt％和ProClin300 0.045wt％。

冻干性能评价

将髓过氧化物酶校准品分别与实施例1～5的冻干保护液混合，作为髓过氧化物酶校准品的冻干液，并设置两组对照组，对照组1将髓过氧化物酶校准品与超纯水混合，作为髓过氧化物酶校准品的冻干液；对照组2将髓过氧化物酶校准品与对比例所述冻干保护液混合，作为髓过氧化物酶校准品的冻干液；所述冻干液中髓过氧化物酶校准品的浓度分别为60ng/mL和600ng/mL，将冻干液置于真空冷冻干燥机，设置冻干曲线，冷冻干燥；所述冷冻干燥包括预冻、升华干燥和解吸干燥阶段；

1)预冻阶段：将冻干液放置于真空冷冻干燥机中，开始降温，当隔板温度达到-30℃时再维持3h；

2)升华干燥：隔板温度由-30℃升至-15℃，升温时间为1h，在-15℃干燥12h，真空度维持在30Pa以下；

3)解吸干燥：隔板温度由-15℃升至25℃，升温时间2h，在25℃干燥4h，真空度维持在15Pa以下；

(3)冻干完毕后充氮气，压盖后取出冻干样本，得到所述髓过氧化物酶冻干校准品。

一、性状、剩余水分和活性

将各组髓过氧化物酶冻干校准品分别放置2～8℃和25℃环境下保存，定期观察髓过氧化物酶校准品的性状、剩余水分。

髓过氧化物酶校准品的冻干粉的性状结果如表1所示。

表1

由表1结果可知，采用实施例1～5的冻干保护液制备的髓过氧化物酶校准品冻干后不缩水，能维持冻干前性状，不粘瓶，韧性较好，瓶塞不粘冻干粉，分别放置2～8℃和25℃环境下性状性能保持稳定；对照组的髓过氧化物酶校准品冻干后易团聚，分别放置2～8℃和25℃环境下冻干粉团聚粘在瓶壁上。

髓过氧化物酶校准品的冻干粉的剩余水分结果如表2所示。

表2

表2结果表明，髓过氧化物酶冻干校准品的剩余水分较低，且长期保存后剩余水分量变化不大，有利于长期保存。

二、复溶性评价

将采用实施例1～5的冻干保护液得到的各组髓过氧化物酶冻干校准品作为实验组，采用超纯水和对比例冻干保护液的髓过氧化物酶校准品作为对照组，将实验组和对照组加入超纯水后静止10s。结果表明，实施例1～5的冻干品能够完全溶解，溶液澄清，无块状及泡沫产生；对照组的冻干品仅部分溶解，且有大量泡沫产生。

检测各组冻干前后的活性，结果如表3所示。

表3

由表3结果可知，对照组1和对对照组2复溶性差，冻干后活性明显下降；采用本发明的制备方法得到MPO校准品冻干前后活性基本保持不变，与冻干前活性差异在5％以内。本发明通过牛血清白蛋白、甘露醇、蛋白稳定剂、聚乙二醇和乙二胺四乙酸二钠多种组分复配，能够有效保持MPO校准品的活性。

三、稳定性评价

将采用实施例1～5的髓过氧化物酶冻干校准品作为实验组，采用超纯水和对比例冻干保护液的髓过氧化物酶校准品作为对照组，将实验组和对照组冻干品在37℃放置30天和开瓶4℃放置30天检测活性，结果如表4所示。

表4

由表4结果可知，实施例1～5的髓过氧化物酶冻干校准品与对照组相比，对照组的冻干MPO校准品仅在较高浓度下稳定，在低浓度下稳定性差；而本发明的髓过氧化物酶校准品采用600ng/mL和60ng/mL不同的浓度的冻干保护液冻干均能保持良好的活性，具有良好的稳定性。本发明的冻干保护液显著提高MPO校准品的稳定性，有利于冻干抗原的运输，延长MPO校准品的保存时间，延长MPO检测试剂盒的保存时间。

综上，采用本发明的冻干保护液，髓过氧化物酶校准品冻干后不缩水，能维持冻干前形状；不粘瓶；韧性较好；瓶塞不粘冻干粉；加入纯化水后静止10s，冻干品能够完全溶解，溶液澄清，无块状及泡沫产生；MPO校准品冻干前后活性基本保持不变；可以显著提高MPO校准品的稳定性，有利于冻干抗原的运输，延长MPO校准品的保存时间，延长MPO检测试剂盒的保存时间。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述冻干保护液包括下述重量百分数的组分：牛血清白蛋白0.5％～3％、甘露醇0.5％～5％、蛋白稳定剂0.1％～1％、聚乙二醇0.2％～2％和乙二胺四乙酸二钠0.05％～0.4％。

2.根据权利要求1所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述聚乙二醇的平均分子量为10000～40000。

3.根据权利要求2所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述聚乙二醇的平均分子量为20000。

4.根据权利要求1所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述冻干保护液包括下述重量百分数的组分：牛血清白蛋白1.0％、甘露醇0.5％、蛋白稳定剂0.5％、聚乙二醇0.5％和乙二胺四乙酸二钠0.2％。

5.根据权利要求1～4任一项所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述冻干保护剂还包括缓冲液、色素和防腐剂；所述缓冲液的浓度为10～50mM，所述色素的重量百分数为0.002％～0.01％，所述防腐剂的重量百分数为0.01％～0.2％。

6.根据权利要求5所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液或MOPS缓冲液。

7.根据权利要求5所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述色素为亮蓝、胭脂红、日落黄、柠檬黄、焦糖色、β-胡萝卜素、葡萄皮红、胭脂虫红或栀子蓝。

8.根据权利要求5所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述防腐剂为山梨酸钾、亚硝酸钠、苯甲酸钠、生物防腐剂中的至少一种。

9.根据权利要求5所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述缓冲液的pH为7.2～7.6。

10.一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将髓过氧化物酶校准品与权利要求1～9任一项所述的冻干保护液混合，作为髓过氧化物酶校准品的冻干液，所述冻干液中髓过氧化物酶校准品的浓度不低于5ng/mL；

(2)将步骤(1)的冻干液置于真空冷冻干燥机，设置冻干曲线，冷冻干燥；所述冷冻干燥包括预冻、升华干燥和解吸干燥阶段；

预冻阶段：温度降至-30℃并维持3～4h；

升华干燥：温度由-30℃升至-15℃，升温时间为1h，在-15℃干燥12～15h，真空度维持在30Pa以下；

解吸干燥：温度由-15℃升至25℃，升温时间为2h，在25℃干燥3～5h，真空度维持在15Pa以下；

(3)冻干完毕后充入惰性气体，取出冻干样本，得到所述髓过氧化物酶冻干校准品。