CN114369590B - 一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶质控品的制备方法 - Google Patents
一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶质控品的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物制品技术领域，公开了一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶质控品的制备方法，具体公开了一种GPDA质控品稳定剂，包括以下成分：物质A、EDTA、BSA、保护剂和防腐剂，所述物质A为双甘肽、N，N‑二羟乙基甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸和N‑三(羟甲基)甲基‑3‑氨基丙磺酸中的一种或几种。本发明提供一种GPDA质控品的稳定剂，添加至GPDA质控品中，可有效提高GPDA质控品的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶质控品的制备方法。
背景技术
甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(Glycyl proline dipeptidyl aminopeptidas，GPDA)是一种肽键水解酶，该酶能水解肽链N-末端的甘氨酰脯氨酸残基，在人体血清、唾液腺、颌下腺及各种结缔组织中均有发现。在肝胆疾病中，原发性肝癌病人血清GPAD平均活性多在对照参考值的2倍以上，继发性肝癌病人血清GPDA活性均值在对照参考值3倍以上，急性肝炎时不管有无黄疸，血清GPDA仅轻度升高，且恢复正常的时间快。慢性肝炎或肝硬变时异常率低于急性肝炎患者。酒精性肝炎时的酶活性和异常率高于肝硬变者。药物性肝损害或原发性肝汁性肝硬变引起肝内胆汁郁积的病人，其血清GPDA明显升高，阳性率也显著高于其它肝病。临床上检测人血清GPDA活性可用于肝胆疾病的辅助诊断。
GPDA在临床上属于生化检测项目，现临床上主要采用市售的检测试剂盒用适用的生化分析仪检测GPDA的活性。GPDA质控品在试剂出厂检验，检验室内、室间质量控制，日常仪器状态、试剂质量监测等过程都是必不可以的。根据GPDA的发现相关报道，其他哺乳动物的组织中也含有丰富的GPDA，如各种动物的血清、鼠肝、鼠肾、猪肾等，其中，人源性样本公认为是最佳的质控品来源，但在实际应用中血清样本不易大量获取，有生物安全性风险，且不易长期保存；Hopsu-Havu等(1968)通过自消化增溶、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素层析等过程从猪肾组织匀浆中获得纯度较高的GPDA，并对其自身的特性进行分析，但所得到GPDA活性较低，且其制备过程复杂，不适合用以批量生产制备质控品；现有利用基因工程菌制备GPDA质控品，工艺要求高，常规生化实验室不易实现。目前市售的GPDA质控品大多制备成冻干粉，使用前需进行复溶，且复溶后的GPDA质控品的稳定性较差，不利于重复使用。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种GPDA质控品稳定剂。
本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的GPDA质控品稳定剂在制备化学试剂中的应用。
本发明的第三方面的目的，在于提供在于提供一种GPDA质控品的制备方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种GPDA质控品稳定剂，包括以下成分：物质A、EDTA、BSA、保护剂和防腐剂。
优选地，所述物质A为双甘肽、N，N-二羟乙基甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸和N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸中的一种或几种。
优选地，所述GPDA质控品稳定剂包括10～50g/L物质A，1～5g/L EDTA，10～100g/LBSA，10～150g/L保护剂和0.1～10g/L防腐剂。
进一步优选地，所述GPDA质控品稳定剂包括10～25g/L物质A、1～2.5g/L EDTA、10～25g/L BSA，10～25g/L保护剂和0.2～0.9g/L防腐剂。
更进一步优选地，所述GPDA质控品稳定剂包括13～20g/L物质A、1～2g/L EDTA、10～20g/L BSA，10～20g/L保护剂和0.2～0.5g/L防腐剂。
优选地，所述保护剂为乙二醇、甘油、甘露醇、蔗糖和海藻糖中的一种或几种。
优选地，所述防腐剂为叠氮化钠、甲基异噻唑啉酮、咪唑啉基脲和2-氯乙酰胺中的一种或几种。
本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的GPDA质控品稳定剂在制备化学试剂中的应用。
优选地，所述化学试剂为通用试剂、分析试剂、仪器分析试剂、体外诊断试剂、生化试剂和无机离子显色试剂中的一种或多种。
进一步优选地，所述化学试剂为标准品、质控品和/或参考品。
更进一步优选地，所述化学试剂为GPDA质控品。
本发明的第三个方面，提供一种GPDA质控品的制备方法，包括以下步骤：
S1.肾脏组织与提取液混合研磨，抽提；
S2.提纯；
S3.加入本发明第一方面的GPDA质控品稳定剂，即得到GPDA质控品。
优选地，所述肾脏组织来源于哺乳动物肾脏组织。
进一步优选地，所述肾脏组织来源于猪肾脏组织。
优选地，对所述猪肾脏组织进行清洗。
进一步优选地，所述清洗包括如下步骤：去除猪肾脏组织上的脂肪和结缔组织，用预冷的生理盐水清洗。
优选地，所述提取液包括物质A、EDTA和防腐剂。
优选地，所述提取液包括10～22g/L物质A、0.5～2.5g/L EDTA和0.1～0.7g/L防腐剂。
进一步优选地，所述提取液包括10～20g/L物质A、1～2.5g/L EDTA和0.2～0.7g/L防腐剂。
更进一步优选地，所述提取物液包括13～20g/L物质A、1～2g/L EDTA和0.2～0.5g/L防腐剂。
优选地，所述物质A为双甘肽、N，N-二羟乙基甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸和N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸中的一种或几种。
优选地，所述防腐剂为叠氮化钠、甲基异噻唑啉酮、咪唑啉基脲和2-氯乙酰胺中的一种或几种。
优选地，所述肾脏组织与提取液的质量体积比为1:(2～5)。
进一步优选地，所述肾脏组织与提取液的质量体积比为1:(2～4)。
更进一步优选地，所述肾脏组织与提取液的质量体积比为1:(2～3)。
优选地，所述提取液与肾脏组织混合前对所述提取液进行预冷处理。
优选地，所述研磨的条件为：8000～15000r/min，10～20s/次，每次间隔20～30s，连续研磨3～6次。
进一步优选地，所述研磨的条件为：9000～12000r/min，10～15s/次，每次间隔20～25s，连续研磨4～5次。
优选地，所述抽提时间为1～3h。
进一步优选地，所述抽提时间为1～2h。
优选地，所述抽提在冰浴条件下进行。
优选地，所述提纯包括粗滤，去油脂，离心和微滤。
进一步优选地，所述粗滤为多层纱布过滤。
进一步优选地，所述去油脂包括如下步骤：粗滤后的提取液于2～8℃放置8～14h，用纱布过滤最上层悬浮的物质。
进一步优选地，所述离心的条件为3～6℃，4000～8000rpm离心20～30min。
进一步优选地，所述微滤包括如下步骤：将离心得到提取液依次经过滤纸过滤、1～2μm微孔滤膜抽滤、0.3～0.45μm微孔滤膜抽滤、0.1～0.22μm的微孔滤膜抽滤。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种GPDA质控品的稳定剂，添加至GPDA质控品中，可有效提高GPDA质控品的稳定性。
本发明提供一种不经酶纯化过程，利用肾脏组织制备GPDA质控品的方法，该方法利于常规生化实验室实现GPDA质控品的制备，相比于血清或微生物培养来源的GPDA质控品，本发明所用原料价格低廉、来源充足、易于获得，可大量制备，工艺简单，周期短，得率高。
通过本发明的制备方法制备得到的GPDA提取液，纯度高，酶活性高，1个重约120g的猪肾，经过提取后，可以配制成酶活为100～120U/L的质控品约8～10L，可实现质控品的批量化制备。
通过本发明的制备工艺得到的GPDA质控品具有较好的储存稳定性以及开瓶稳定性，对医疗临床检验科，特别是业务量较小的基层医院，在GPDA检测的质控工作中，质控品开瓶后保持时间长，可以减少试剂浪费，降低检测成本，给工作带来方便。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1
一种GPDA质控品稳定剂，包括以下成分：13.2g/L双甘肽、1.45g/L EDTA、10g/LBSA、10g/L乙二醇和0.5g/L NaN3，pH8.0。
实施例2
一种GPDA质控品稳定剂，包括以下成分：13.2g/L双甘肽、1.45g/L EDTA、10g/LBSA、10g/L甘露醇、0.5g/L NaN3，pH8.0。
实施例3
一种GPDA质控品稳定剂，包括以下成分：20g/L双甘肽、2g/L EDTA、20g/L BSA、20g/L海藻糖、0.2g/L NaN3，pH8.4。
实施例4
一种GPDA质控品稳定剂，包括以下成分：19g/L N，N-二羟乙基甘氨酸、1.9g/LEDTA、10g/L BSA、20g/L乙二醇和0.5g/L甲基异噻唑啉酮，pH8.0。
实施例5
一种GPDA质控品稳定剂，包括以下成分：15g/L N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、1.45g/L EDTA、10g/L BSA、20g/L乙二醇和4g/L 2-氯乙酰胺，pH8.2。
实施例6
一种GPDA质控品稳定剂，包括以下成分：35g/L N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、2g/L EDTA、30g/L BSA、10g/L蔗糖和5g/L 2-氯乙酰胺，pH8.0。
实施例7
一种GPDA质控品的制备方法，包括以下步骤：
1)猪肾脏组织清洗：猪肾脏组织除去脂肪和结缔组织，用预冷的生理盐水洗2次，用滤纸拭干，称重；
2)匀浆破碎：剪碎肾脏组织，转移至高速组织捣碎机(上海比朗仪器制造有限公司，BILON-J1500)，加入预冷的提取液(肾脏组织与提取液1:2(w/v)混合)，冰浴下充分研磨(9500r/min，10秒/次，每次间隔30s，连续5次)；所用提取液的组分为13.2g/L双甘肽、1.45g/L EDTA和0.5g/L NaN3，pH8.0；
3)抽提：组织匀浆在冰浴条件下抽提2h；
4)粗滤：抽提液用六层纱布过滤，除去明显的固体残渣；
5)去除油脂：粗滤后的抽提液放置于2～8℃冰箱，保存过夜，然后用纱布将抽提液的最上面悬浮的一层白色物体(实为凝固的油脂)过滤去除；
6)离心：4℃，8000rpm离心20min，吸取上清；再用相同条件离心一次，吸取上清(最上面悬浮的一层白色物体为油脂，尽量不吸出)；
7)微滤：先用滤纸过滤一遍，再依次用1.2μm、0.45μm、0.22μm的微孔滤膜抽滤，除去细微的不溶性杂质，得到GDPA提取液；
8)测定GDPA提取液中GPDA的酶活力(利用日立7180全自动生化分析仪测定其酶活力，酶活力为9800U/L)，向GPDA提取液中加入实施例1的稳定剂，获得酶活为100U/L的GPDA质控品。
实施例8
一种GPDA质控品的制备方法，包括以下步骤：
1)猪肾脏组织清洗：猪肾脏组织除去脂肪和结缔组织，用预冷的生理盐水洗2次，用滤纸拭干，称重；
2)匀浆破碎：剪碎肾脏组织，转移至高速组织捣碎机(上海比朗仪器制造有限公司，BILON-J1500)，加入预冷的提取液(肾脏组织与提取液1:3(w/v)混合)，冰浴下充分研磨(9500r/min，10秒/次，每次间隔30s，连续5次)；所用提取液的组分为13.2g/L双甘肽、1.45g/L EDTA和0.5g/L NaN3，pH8.0；
3)抽提：组织匀浆在冰浴条件下抽提2h；
4)粗滤：抽提液用六层纱布过滤，除去明显的固体残渣；
5)去除油脂：粗滤后的抽提液放置于2～8℃冰箱，保存过夜，然后用纱布将抽提液的最上面悬浮的一层白色物体(实为凝固的油脂)过滤去除；
6)离心：4℃，6000rpm离心30min，吸取上清；再用相同条件离心一次，吸取上清(最上面悬浮的一层白色物体为油脂，尽量不吸出)；
7)微滤：先用滤纸过滤一遍，再依次用1.2μm、0.45μm、0.22μm的微孔滤膜抽滤，除去细微的不溶性杂质，得到GDPA提取液；
8)测定GDPA提取液中GPDA的酶活力(利用日立7180全自动生化分析仪测定其酶活力，酶活力为6683U/L)，向GPDA提取液中加入实施例2的稳定剂，得到酶活力为40U/L和120U/L的GPDA质控品。
实施例9
一种GPDA质控品的制备方法，包括以下步骤：
1)猪肾脏组织清洗：猪肾脏组织除去脂肪和结缔组织，用预冷的生理盐水洗2次，用滤纸拭干，称重；
2)匀浆破碎：剪碎肾脏组织，转移至高速组织捣碎机(上海比朗仪器制造有限公司，BILON-J1500)，加入预冷的提取液(肾脏组织与提取液1:2(w/v)混合)，冰浴下充分研磨(9500r/min，10秒/次，每次间隔30s，连续5次)；所用提取液的组分为20g/L双甘肽、2g/LEDTA和0.2g/L NaN3，pH8.4；
3)抽提：组织匀浆在冰浴条件下抽提2h；
4)粗滤：抽提液用六层纱布过滤，除去明显的固体残渣；
5)去除油脂：粗滤后的抽提液置于2～8℃冰箱，保存过夜，然后用纱布将抽提液的最上面悬浮的一层白色物体(实为凝固的油脂)过滤去除；
6)离心：4℃，8000rpm离心25min，吸取上清；再用相同条件离心一次，吸取上清(最上面悬浮的一层白色物体为油脂，尽量不吸出)；
7)微滤：先用滤纸过滤一遍，再依次用1.2μm、0.45μm、0.22μm的微孔滤膜抽滤，除去细微的不溶性杂质，得到GDPA提取液；
8)测定GDPA提取液中GPDA的酶活力(利用日立7180全自动生化分析仪测定其酶活力，酶活力为10200U/L)，向GPDA提取液中加入实施例3的稳定剂，得到酶活力为100U/L的GPDA质控品。
效果实施例
1.加热稳定性测定
将实施例7制得的GDPA质控品置于37℃条件下保存，测定GDPA质控品的加热稳定性。
将实施例7制得的GDPA提取液与GDPA质控品(实验组：实施例7制得的酶活性约为100U/L的GDPA质控品，对照组：利用生理盐水将实施例7制得的GDPA提取液稀释至酶活约100U/L的GDPA质控品)密封后放置在37℃恒温生化培养箱中，连续放置14天；利用GPDA试剂盒(GPDA底物法)(北京九强生物技术股份有限公司)检测第7天和第14天的GDPA质控品的酶活力；每次检测时，随机取出保存的GDPA提取液、GDPA质控品各2瓶，每瓶检测3次，取平均值。
结果如表1所示，利用生理盐水稀释的GDPA质控品在37℃条件下，酶活力迅速下降，在第7天已下降至85U/L，酶活力下降17.5％，在第14天时，酶活力几乎丧失一半，稳定性不佳。而加入稳定剂的GDPA质控品在37℃条件下14放置天，其酶活力下降不足7％，保存前后其酶活力的相对偏差较小，可见实施例7制得的GPDA质控品稳定性较好。
对实施例8～9制得的GDPA质控品进行如上述加热稳定性测试，可以得出实施例8～9制得的GDPA质控品具有较好稳定性。
表1加速热稳定性
2.长期稳定性测定
将实施例7制备得到的GDPA质控品(酶活力约100U/L)按1mL/L分装，密封储存于2～8℃的环境中；使用GPDA试剂盒(GPDA底物法)(北京九强生物技术股份有限公司)分别检测储存第0、1、3、6、9、12、15个月后的GDPA质控品的酶活力；每次检测随机取出两瓶质控品进行检测，每瓶测定三次，取均值；对测试结果进行方差分析，计算F值和概率值(p)(表3)。
由表2和表3可以看出，实施例7制备得到的GDPA质控品在2～8℃条件储存15个月稳定性好(P＞0.05)，有利于商品化生产。
对实施例8～9制得的GDPA质控品进行如上述长期稳定性测试，可以得出实施例8～9制得的GDPA质控品在15个月内可稳定保存。
表2实施例7制得的GDPA质控品长期稳定性测试结果
表3方差分析结果
3.开瓶稳定性
随机抽取2瓶实施例9制得的GDPA质控品(酶活力约100U/L)，开盖后置于2～8℃条件下，利用GPDA试剂盒(GPDA底物法)(北京九强生物技术股份有限公司)分别检测放置0、1、2、3、4、5、7天后的GDPA质控品酶活力，每个时间点重复测试3次，取平均值。对检测结果进行方差分析，计算F值和概率值(p)。
由表4和表5可以看出，实施例9制得的GDPA质控品在开瓶后7天内的酶活力无显著性变化(P＞0.05)，表明实施例9制得的GDPA质控品开瓶后置于2～8℃，7天内酶活性变化不显著，能满足实验要求。
同理，对实施例7和实施例8制得的GDPA质控品在进行上述开瓶稳定性测试，可以得出实施例7和实施例8制得的GDPA质控品在开瓶后7天内变化不大，无显著性差异(P＞0.05)，满足实验要求。在GPDA检测的质控工作中，可以减少试剂浪费，降低检测成本。
表4实施例9制得的GDPA质控品开瓶稳定性测试结果
表5方差分析结果
4.批间差检测
不同实验员在不同时间、不同地点重复采用实施例8提供的制备方法5次，制备得到5组GDPA质控品，按制备的先后顺序依次记为1～5。利用日立7180全自动生化分析仪测定5次制备得到的GDPA质控品的酶活力。测试结果如表6所示，按实施例8所提供的方法得到的GDPA质控品批间差小于5％，符合要求。
表6利用实施例8方法制得的GDPA质控品的批间差检测结果
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (4)
1.一种GPDA质控品的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下所示：
S1. 肾脏组织与提取液混合研磨，抽提；
S2. 提纯；
S3. 加入稳定剂，即得到GPDA质控品；
所述提取液由以下成分组成：物质A、EDTA和防腐剂，余量为水；
所述稳定剂由以下成分组成：物质A，EDTA，BSA，保护剂和防腐剂，余量为水；
所述物质A为双甘肽；
所述防腐剂为叠氮化钠；
所述保护剂为乙二醇、甘露醇或海藻糖；
所述提纯为粗滤，去油脂，离心和微滤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肾脏组织为猪肾脏组织。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述肾脏组织与提取液的质量体积比为1:2~5。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述研磨的条件为：8000~15000r/min，10~20s/次，每次间隔20~30s，连续研磨3~6次；所述抽提的时间为1~3h。
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