JP3160868B2 - ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法 - Google Patents
ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ミエロペルオキシダー
ゼの抗原性を安定化する方法に関し、特に固相化された
ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法に関
する。
ゼの抗原性を安定化する方法に関し、特に固相化された
ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ミエロペルオキシダーゼは、ヘムａ類似
のヘムを持つ酵素であって、白血球の主に好中球に存在
し、ハロゲン化物イオンを介してバクテリア等の解毒作
用を担っている。１９８２年、蛍光抗体間接法（ＩＩＦ
法）により、Daviesらが抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣ
Ａ）を報告し、その染色パターンからCytoplasmic-ANCA
（C-ANCA）とperinuclear-ANCA（P-ANCA）の２つのサブ
セットに分けられた。このP-ANCAの対応抗原の一つがミ
エロペルオキシダーゼであり、免疫学的作用における抗
原として用いられるようになった。
のヘムを持つ酵素であって、白血球の主に好中球に存在
し、ハロゲン化物イオンを介してバクテリア等の解毒作
用を担っている。１９８２年、蛍光抗体間接法（ＩＩＦ
法）により、Daviesらが抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣ
Ａ）を報告し、その染色パターンからCytoplasmic-ANCA
（C-ANCA）とperinuclear-ANCA（P-ANCA）の２つのサブ
セットに分けられた。このP-ANCAの対応抗原の一つがミ
エロペルオキシダーゼであり、免疫学的作用における抗
原として用いられるようになった。
【０００３】近年、血液検査において、P-ANCAのような
抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を測定することが腎疾患
の診断に有用であることに注目され、ミエロペルオキシ
ダーゼを抗原抗体反応における抗原として用いられた酵
素免疫測定（ＥＩＡ）による試薬が市販されている。こ
れは、合成樹脂製のプレート等の表面にミエロペルオキ
シダーゼを吸着などによって付着させ、乾燥状態にした
ものに検体を入れ、発色剤等を加えてその吸光度を測定
するものである。
抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を測定することが腎疾患
の診断に有用であることに注目され、ミエロペルオキシ
ダーゼを抗原抗体反応における抗原として用いられた酵
素免疫測定（ＥＩＡ）による試薬が市販されている。こ
れは、合成樹脂製のプレート等の表面にミエロペルオキ
シダーゼを吸着などによって付着させ、乾燥状態にした
ものに検体を入れ、発色剤等を加えてその吸光度を測定
するものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ミエロ
ペルオキシダーゼは抗原性（免疫学的作用）が不安定で
あり、すぐにその作用を失ってしまうため、長期間保存
しておくことは不可能であった。そのため、試薬調製後
は一度に使いきるか、余ったミエロペルオキシダーゼは
廃棄せざるをえず、試薬を浪費してしまうという欠点が
あった。
ペルオキシダーゼは抗原性（免疫学的作用）が不安定で
あり、すぐにその作用を失ってしまうため、長期間保存
しておくことは不可能であった。そのため、試薬調製後
は一度に使いきるか、余ったミエロペルオキシダーゼは
廃棄せざるをえず、試薬を浪費してしまうという欠点が
あった。
【０００５】本発明者等は、かかる問題を解決するため
鋭意研究した結果、ミエロペルオキシダーゼがヘムを持
つため、その安定性に酸素が関与することを見出し、本
発明に到達した。すなわち本発明は、固相化ミエロペル
オキシダーゼを実質的に酸素の存在しない状態で保存
し、長期保存ができるようにしたミエロペルオキシダー
ゼの抗原性を安定化する方法を提供することを目的とす
る。
鋭意研究した結果、ミエロペルオキシダーゼがヘムを持
つため、その安定性に酸素が関与することを見出し、本
発明に到達した。すなわち本発明は、固相化ミエロペル
オキシダーゼを実質的に酸素の存在しない状態で保存
し、長期保存ができるようにしたミエロペルオキシダー
ゼの抗原性を安定化する方法を提供することを目的とす
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、固相化ミエロ
ペルオキシダーゼを実質的に酸素の存在しない状態で保
存することを特徴とするミエロペルオキシダーゼの抗原
性を安定化する方法である。
ペルオキシダーゼを実質的に酸素の存在しない状態で保
存することを特徴とするミエロペルオキシダーゼの抗原
性を安定化する方法である。
【０００７】
【作用】本発明は、固相化ミエロペルオキシダーゼを実
質的に酸素の存在しない状態で保存することによって、
ヘムが空気中や、包材内に残存する酸素と反応して酸化
されるのを防ぐことができる。そのため、長期間保存し
ておいても品質が変化することはなく、抗原としての働
きを失うことはない。
質的に酸素の存在しない状態で保存することによって、
ヘムが空気中や、包材内に残存する酸素と反応して酸化
されるのを防ぐことができる。そのため、長期間保存し
ておいても品質が変化することはなく、抗原としての働
きを失うことはない。
【０００８】
【実施例】次に本発明の実施例を説明する。本発明のミ
エロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法は、例
えば、ミエロペルオキシダーゼをプレート状の不溶性担
体に付着させ、固相化したものを包材で密封する。その
際、包材内の酸素を除去し、無酸素状態にすることによ
ってミエロペルオキシダーゼの抗原性を顕著に安定化す
ることができる。
エロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法は、例
えば、ミエロペルオキシダーゼをプレート状の不溶性担
体に付着させ、固相化したものを包材で密封する。その
際、包材内の酸素を除去し、無酸素状態にすることによ
ってミエロペルオキシダーゼの抗原性を顕著に安定化す
ることができる。
【０００９】不溶性担体には、ガラス、アガロース、デ
キストラン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリス
チレン、ホモポリペプチド、ラテックス、ニトロセルロ
ース、ナイロン、磁性担体等が使用され、その表面に共
有結合法、イオン結合法、物理的吸着等によりミエロペ
ルオキシダーゼを付着させた後乾燥させて固相化されて
いる。包材としては、アルミニウム、ポリビニルアルコ
ール等の酸素透過度の低い材質のもの及びそれらのラミ
ネートが使用される。
キストラン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリス
チレン、ホモポリペプチド、ラテックス、ニトロセルロ
ース、ナイロン、磁性担体等が使用され、その表面に共
有結合法、イオン結合法、物理的吸着等によりミエロペ
ルオキシダーゼを付着させた後乾燥させて固相化されて
いる。包材としては、アルミニウム、ポリビニルアルコ
ール等の酸素透過度の低い材質のもの及びそれらのラミ
ネートが使用される。
【００１０】酸素除去方法は、窒素（またはアルゴン、
ヘリウム）置換、あるいは脱酸素剤を用いるなどの方法
が挙げられ、これらを併用することもできる。特に、酸
素吸収速度が速い脱酸素剤を使用するのが好ましい。
ヘリウム）置換、あるいは脱酸素剤を用いるなどの方法
が挙げられ、これらを併用することもできる。特に、酸
素吸収速度が速い脱酸素剤を使用するのが好ましい。
【００１１】実施例１〜５ タンパク濃度５μg/mlのミエロペルオキシダーゼ（カミ
ヤバイオケミカル社製）をマイクロタイタープレートに
２００μl/wellずつ分注し、４℃で１８時間放置後、洗
浄し、乾燥させた。乾燥させたミエロペルオキシダーゼ
プレートをアルミニウムとポリエチレンのラミネートフ
ィルムで密封包装した。包装の際、窒素置換したもの
（実施例１）、速攻型脱酸素剤（エージレスＳ５０Ｐ
Ｕ、三菱瓦斯化学社製）を封入したもの（実施例２）、
低水分用脱酸素剤（エージレスＺ５０ＰＫ、三菱瓦斯化
学社製）を封入したもの（実施例３）、窒素置換後脱酸
素剤（エージレスＳ５０ＰＵ）を封入したもの（実施例
４）、窒素置換後脱酸素剤（エージレスＺ５０ＰＫ）を
封入したもの（実施例５）の５種の検査用具を各々６個
作成した。それらを密封直後（０日）、１日後、２日
後、７日後、１４日後、２１日後に開封し、各々のプレ
ートに検体を５０倍に希釈して２００μl/wellずつ分注
した。２５℃で６０分間反応後、洗浄を行い、アルカリ
ホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（シグマ社製）を
２００μl/well分注した。２５℃で６０分反応後、発色
剤としてニトロフェニルリン酸２ナトリウム塩（シグマ
社製）を加え、０分と６０分との吸光度差を測定した。
密封直後に開封したものの値を１００％として各々の相
対値を％で求め、安定性を調べた。その結果を表１に示
す。
ヤバイオケミカル社製）をマイクロタイタープレートに
２００μl/wellずつ分注し、４℃で１８時間放置後、洗
浄し、乾燥させた。乾燥させたミエロペルオキシダーゼ
プレートをアルミニウムとポリエチレンのラミネートフ
ィルムで密封包装した。包装の際、窒素置換したもの
（実施例１）、速攻型脱酸素剤（エージレスＳ５０Ｐ
Ｕ、三菱瓦斯化学社製）を封入したもの（実施例２）、
低水分用脱酸素剤（エージレスＺ５０ＰＫ、三菱瓦斯化
学社製）を封入したもの（実施例３）、窒素置換後脱酸
素剤（エージレスＳ５０ＰＵ）を封入したもの（実施例
４）、窒素置換後脱酸素剤（エージレスＺ５０ＰＫ）を
封入したもの（実施例５）の５種の検査用具を各々６個
作成した。それらを密封直後（０日）、１日後、２日
後、７日後、１４日後、２１日後に開封し、各々のプレ
ートに検体を５０倍に希釈して２００μl/wellずつ分注
した。２５℃で６０分間反応後、洗浄を行い、アルカリ
ホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（シグマ社製）を
２００μl/well分注した。２５℃で６０分反応後、発色
剤としてニトロフェニルリン酸２ナトリウム塩（シグマ
社製）を加え、０分と６０分との吸光度差を測定した。
密封直後に開封したものの値を１００％として各々の相
対値を％で求め、安定性を調べた。その結果を表１に示
す。
【００１２】比較例１ 実施例１〜５と同様に固相化ミエロペルオキシダーゼプ
レートを作成し、酸素除去処理を行わずに空気中の状態
で包装した。以下、同様な測定を行って安定性を調べ
た。その結果を表１に示す。
レートを作成し、酸素除去処理を行わずに空気中の状態
で包装した。以下、同様な測定を行って安定性を調べ
た。その結果を表１に示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】表１の結果より、密封後０〜７日目までは
あまり差がないが、７日目以降では比較例１の値が著し
く低下している。このことから、ミエロペルオキシダー
ゼの安定性には酸素が関与していることがわかった。即
ち、ミエロペルオキシダーゼに酸素が負の因子として働
き、その抗原性を低下させている。酸素除去方法として
は、脱酸素剤が有効であり、窒素置換と併用すれば更に
その効果が向上する。脱酸素剤は、速効型のものが低水
分用のものより比較的効果があった。このことから、ミ
エロペルオキシダーゼの安定化には酸素除去速度の速い
ものが好ましい。
あまり差がないが、７日目以降では比較例１の値が著し
く低下している。このことから、ミエロペルオキシダー
ゼの安定性には酸素が関与していることがわかった。即
ち、ミエロペルオキシダーゼに酸素が負の因子として働
き、その抗原性を低下させている。酸素除去方法として
は、脱酸素剤が有効であり、窒素置換と併用すれば更に
その効果が向上する。脱酸素剤は、速効型のものが低水
分用のものより比較的効果があった。このことから、ミ
エロペルオキシダーゼの安定化には酸素除去速度の速い
ものが好ましい。
【００１５】
【発明の効果】本発明の固相化ミエロペルオキシダーゼ
の抗原性を安定化する方法は、ミエロペルオキシダーゼ
の周囲から酸素を除去することによってその抗原性を維
持することができるので、長期間保存しておいたもので
も使用可能であり、正確な検査結果が得られる。従っ
て、試薬を浪費せず、有効に利用することができる。
の抗原性を安定化する方法は、ミエロペルオキシダーゼ
の周囲から酸素を除去することによってその抗原性を維
持することができるので、長期間保存しておいたもので
も使用可能であり、正確な検査結果が得られる。従っ
て、試薬を浪費せず、有効に利用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−228272（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−135090（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−212286（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−9181（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−62547（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−29033（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/531 G01N 33/53
Claims (1)
- 【請求項１】 固相化ミエロペルオキシダーゼを実質的
に酸素の存在しない状態で保存することを特徴とするミ
エロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26327092A JP3160868B2 (ja) | 1992-09-04 | 1992-09-04 | ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26327092A JP3160868B2 (ja) | 1992-09-04 | 1992-09-04 | ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0688820A JPH0688820A (ja) | 1994-03-29 |
| JP3160868B2 true JP3160868B2 (ja) | 2001-04-25 |
Family
ID=17387131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26327092A Expired - Fee Related JP3160868B2 (ja) | 1992-09-04 | 1992-09-04 | ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3160868B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108107210B (zh) * | 2017-12-18 | 2019-01-04 | 广州市进德生物科技有限公司 | 一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液 |
-
1992
- 1992-09-04 JP JP26327092A patent/JP3160868B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0688820A (ja) | 1994-03-29 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |